JP2562539B2 - シトケラチン２０又はシトケラチン２０の蛋白質分解による切断によりえられたそのαーラセン状中央部片の免疫学的同定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組織切片上の、組織均質物及び体液中のシト
ケラチン20又はシトケラチン20の蛋白質分解による切断
によりえられたそのα−ラセン状中央部片の免疫学的同
定法に関する。

シトケラチン類の中間フィラメント（1F）蛋白質が上
皮細胞の種類及び分化の状態の分析に関して有効なマー
カであることが確認された。少なくとも19の異なるポリ
ペプチドの類を包含する上皮シトケラチンは細胞分化の
経過に依存して種々の異なる組合わせで発現される。シ
トケラチンの合成は悪性形質転換の間一般に保持され、
かつこの事実は膀胱管の腫瘍も含む上皮細胞派生腫瘍の
検出基準の１つとして使用することを可能にするであろ
う。特に、原発腫瘍に効果的に処置することができるよ
うに、転移組織の原発腫瘍の位置を確認するための容易
に実施可能で、かつ確実な検出法に対する要求がある。
従って、本願発明の課題は種々異なる腫瘍の種類を区別
し、同様に種々異なる転移組織に関する由来の場所の検
出を容易にかつできるだけ正確に行なうことへの可能性
を提供することである。

一定の細胞中にのみ存在し、従って一定の細胞及び組
織の識別のためのマーカーとして使用することのできる
新規シトケラチンを確認した。これをシトケチン20と名
付けた。

従って、本発明の課題はシトケラチン（CK）20の精製
法であり、この精製法において細胞骨格（Cytoskelet
t）フラクションをCK20を含有する組織又は細胞から製
造し、この中に含有される蛋白質をゲル電気泳動法及び
／又はクロマトグラフィーにより分離し、ゲル又はCK20
含有クロマトグラフィーフラクションからCK20を獲得す
る。

蛋白質CK20は分子量約46,000、9.5mol尿素中の等電点
約6.1を有し、かつそれはCK8の非ホスホリル化変種より
わずかに酸性である。第１図はCK20の部分アミノ酸配列
を示す（図においてIT:A〜Ｄで示した部分アミノ酸配列
はCK20のフラグメントをスタフィロコッカスV8プロテア
ーゼで消化することにより得られた）。

本発明により、シトケラチン20は例えば特異的抗体を
製造することが可能であるように純粋な形で得ることが
可能である。本発明の実施形の１つにおいては細胞骨格
フラクションを特に人の組織の、十二指腸粘膜絨毛から
製造する。本発明の他の実施例においては培養細胞から
細胞骨格フラクションが得られ、この際大腸癌、膀胱癌
又は胃癌から誘導された培養細胞が有利である。ゲル電
気泳動の実施の際に、本発明の有利な実施形においては
第１のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を高めた
塩濃度を有する緩衝液系中で実施し、その後CK20を含有
する帯域を切断し、そこから蛋白質を溶離し、第２のポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を低い塩濃度の緩衝液系
中で実施し、かつゲル中の相応する帯域から今や精製し
たCK20を単離する。

本発明の更なる実施形において、すなわちクロマトグ
ラフィー法での分離はまずアニオン変換クロマトグフィ
ー、次いで転相HPLC−クロマトグラフィーで実施する。
このDEAE−セルロース上のアニオン変換クロマトグラフ
ィーを尿素の存在下に、かつ塩酸グアニジン０〜100mmo
l/lの線状傾斜溶液での溶離の使用下に実施すること、
そして次でCK20を含有するフラクションをHPLCにかける
ことが、ここでも有利である。この際、塩酸グアニジン
38〜50mmol/lを含有するフラクションをHPLCにかけるの
が有利である。

本発明の更なる課題は標準蛋白質材料であり、この標
準蛋白質材料はCK20及びシトケラチン１〜８の群から選
択された塩基性シトケラチンを含有する再構成シトケラ
チン複合体から、もしくは蛋白質加水分解により製造さ
れた相応する該蛋白質のα−ラセン状中央部片からな
る。この際標準蛋白質材料がCK20及びCK8を含有する複
合体もしくはそのα−ラセン状中央部片からなるのが有
利である。

この種の標準蛋白質材料は、例えば追い出し原理又は
その他の競合免疫アッセイの適用下に実施すべき免疫テ
ストに使用するために好適な材料である。

本発明の更なる課題はCK20及び塩基性シトケラチンを
含有する標準蛋白質材料の製法でもあり、この方法にお
いては精製したCK20及びシトケラチン１〜８の群からの
精製した塩基性シトケラチンを等量比で一緒に尿素含有
緩衝液に溶かし、かつこの混合物をはじめに尿素及びDD
Tを含有する緩衝液に対して、次いで尿素を含有しない
緩衝液に対して透析する。この方法により再構成フィラ
メント材料が得られ、これは尿素の除去の際に緩衝液か
ら形成される。本発明の有利な実施形においては標準蛋
白質材料の製造に続いて生じたシトケラチン複合体を蛋
白質分解する。これにより再構成標準蛋白質材料のα−
ラセン状中央部片が得られる。この蛋白質分解は有利に
キモトリプシンを用いて、かつ酵素対基質比6:1000〜1
0:1000及び消化時間30〜60分間で実施する。

本発明により、標準蛋白質材料の製造の際に塩基性シ
トケラチンとしてCK8を使用することは特に有利であ
る。本発明方法により精製した精製CK20を使用すること
は特に有利である。本発明の有利な実施形においては標
準蛋白質材料の製造のために、蛋白質を8.5〜10mol/l尿
素及び1.5〜3mmol/l DTTを含有する緩衝液中に溶かし、
第１の透析を3.5〜4.5mol/l尿素及び1.5〜3mmol/l DTT
を含有する緩衝液に対して実施する。

本発明の更なる課題はCK20に特異的な抗体の製法であ
り、この方法においては好適な動物の免疫のために精製
したCK20を使用し、次いで、自体公知法によりポリクロ
ーナル又はモノクロナール抗体を形成する。ポリクロナ
ール抗体の原則的な形成はモノクローナル抗体と同様専
門家には公知であり、モノクローナル抗体の製造は例え
ば文献に記載されている（Koehler及びMilstein、Natur
e256（1975）495〜497）。ポリクローナル抗体を獲得す
るためには精製CKでモルモットを免疫にするのが有利で
ある。

本発明の有利な実施形においては本発明により精製し
たCK20を使用する。

ポリクローナル抗体の製造の際にCK20に対するモノ特
異的抗体を得るために、この特異的抗体の単離のために
免疫グロブリンフラクションに他のシトケラチンに対す
る抗体の免疫沈降及び分離及び／又はCK20に特異的な抗
体の免疫沈降及び分離を行なうことが本発明により有利
である。この際、専門家に公知のすべての免疫沈降法が
好適であり、かつ最終的にはCK20とだけ免疫学的に反応
する抗体が得られる。本発明の有利な実施形において
は、CK20に特異的な抗体の免疫沈降及び分離を実験動物
から得られた免疫グロブリンフラクションとCK20が結合
した固相とを恒温保持することにより実施する。他のシ
トケラチンに対する抗体の免疫沈降及び分離の際には、
有利に得られた免疫グロブリンフラクションと電気泳動
で精製したシトケラチン８、18及び19又はこれらを含有
する細胞からの全蛋白質が結合した固相との恒温保持を
実施する。本発明により、免疫沈降工程を有利に複数回
実施し、こうしてCK20に反応しないすべての抗体を完全
にモノ特異的抗体から分離する。本発明において、固相
としてニトロセルローステープを使用するのが有利であ
る。

本発明の更なる課題は組織切片上、組織均質物及び抗
体中のCK20又は蛋白質分解により得られたα−ラセン状
中央部片の免疫学的同定のための、CK20に対して反応す
る抗体の使用である。この際、組織試料から均質物を形
成し、均質物中に含有される中間フィラメント蛋白質を
蛋白質分解し、かつこれから遊離するα−ラセン状中央
部片を可溶性相中で分離し、かつ抗体を用いて同定し、
かつ定量的に測定することが有利である。

更に、本発明の有利な実施形によれば、体液、例えば
血液、血清及び尿中で、その中に含有される可溶性中間
−フィラメント蛋白質フラグメントを抗体を用いて免疫
学的に同定し、定量的に測定することが可能である。

CK20に対する抗体の本発明による使用によりこの蛋白
質が組織、組織均質物又は体液中に存在するかどか確認
可能である。この蛋白質の存在は一定の組織中のCK20の
由来に相応する細胞もしくは組織の区別を可能にする。
こうして、例えば胃腸管の腺癌、膀胱の腺癌そして皮膚
のメルケル細胞の腺癌を他の腺癌から区別することを可
能にし、同様に転移の細胞に関する決定の証明を可能と
するが、その際多分全く身体の位置と独立して見い出さ
れる転移をCK20蛋白質の検出により前記範囲の原発腫瘍
に関係づけることができる。この際、原発腫瘍の確定に
より、しばしば従来公知の方法により見つけだすことが
著しく困難であったか又は全く見つけだすことができな
かった本当の腫瘍の発生源を治療することが可能とな
り、このことにより患者の生存率を著しく改善すること
が可能となる。従って、胃腸管の腺癌、膀胱の腺癌及び
メルケル細胞の腺癌を他の腺癌から区別するためのこの
ような方法又はCK20に特異的な本発明による抗体により
検査すべき組織中でのCK20の存在に関する検査による転
移の細胞的由来の証明も本発明の更なる課題である。

本発明の更なる課題は本発明による標準蛋白質材料を
血液又は血清中のCK20に対する自家抗体の検出のめに使
用することである。CK20に対する自家抗体は例えば腫瘍
の化学療法の際に生じ、治療の経過に関する判断基準と
して評価される。更に、そのような自家抗体は他の疾患
の際に、例えばクローン（Crohn）病においても生じ、
これにより標準蛋白質材料を用いて疾患に関する示唆を
得ること、又は誤っていることを証明することが可能で
ある。

更に、例えばイムノアッセイを希釈原理により実施す
る場合、すでに前記のように標準蛋白質材料を免疫学的
テストにおいて本発明により抗体の使用下にCK20の検出
のために使用することができる。

本発明による抗体又は標準蛋白質材料で実施可能なイ
ムノアッセイは専門家に公知であり、ここでは更に詳説
する必要はない。もちろん、この検出は、抗体又は標準
蛋白質のすべての種類の標識付けにより実施され、この
際すべての公知の実際のテスト法がここでは可能と思わ
れる。

例えばヨーロッパ特許公開第0057043号公報に記載さ
れているような細胞障害の検出も本発明による抗体を用
いて相応する形で実施することができる。同様にしてヨ
ーロッパ特許公開第0057076号公報に記載されているよ
うな方法を実施するために、本発明による抗体をシトケ
ラチン20に関すると同様にして使用することもできる。
この際、本発明による抗体を明らかに免疫学的に反応す
る抗体として使用する。

次に実施例を本発明の図面と関連させて更に説明す
る。

ここで第１図はCK20−フラグメントの部分アミノ酸配
列を示し、これはスタフィロコッカスV8プロテアーゼで
の消化及び転相−HPLCによる分離により得られた。この
配列を種々の人のタイプＩ−シトケラチンの相応する配
列と比較する。同一のアミノ酸を大字にする。点は相関
性をより良く示すためになされた省略を意味する。

例１ 細胞骨格調製物の製造 十二指腸粘膜絨毛から細胞骨格フラクションを大規模
に調製した。凍結絨毛材料を氷解し、ポリトロン（Poly
tron）−ホモジナイザー（Kinematica、Luzern、スイ
ス）により均質化し、緩衝液Ａ（1.5mol/l KCl、0.5％
トライトン−Ｘ−100、5mmol/lEDTA、0.4mmol/lフェニ
ルメチルスルホニル−フッ化物（PMSF）、10mmol/lトリ
ス−HCl、pH7.2）５倍容量と20分間氷中で撹拌下に抽出
する。遠心分離（13000g、４℃で10分間）及び緩衝液Ｂ
（5mmol/lEDTA、0.4mmol/lPMSF、10mmol/lトリス−HC
l、pH7.2）中での沈殿物の２回の洗浄（Dounce−ホモジ
ナイザーによる再懸濁及びあらたな遠心分離）により細
胞骨格−ペレットが得られ、これは−80℃で保持され
た。同様にして、他の組織及び腫瘍からの細胞骨格フラ
クションも調製された；これらの場合組織をポリトロン
均質化の前にはさみまたはスカルペルで小さな切片に刻
んだ。

培養細胞の細胞骨格フラクションは類似の方法で得ら
れた。プラスチック培養瓶の床に付着して成長した細胞
を培養液を注ぎ出し、かつゴムスパーテルでかき取りな
がら、燐酸塩緩衝塩溶液（PBS）で２回洗浄し、緩衝液
Ａ中に抽出し、更に緩衝液Ｂで洗浄する（Achtstaetter
等著、Methods Enzymol.134（1986）355〜371）。

培養細胞 次の確立した人癌から由来する細胞培養系列を実験に
おいて使用した： １ 膀胱癌細胞列RT−112、RT−４、Ｔ−24及びEJ（Mol
l等、Am.J.Pathol.132（1988）123〜144参照）。

２ 多くの米国寄託機関（ATCC）に関連させ、かつ報告
された培養結腸癌細胞系列:HT−29（ATCC HTB38;LoVo
（ATCC CCL229;SW1116（ATCC CCL233）;LDL−１（ATCC
CCL221）;COLO320DM（ATCC CCL220）。

３ 人乳癌−細胞列MCF−７の細胞をモル（Moll）及び
共同研究者、Cell 31（1982）11〜24）に記載されてい
るように培養した。いくつかの実験において、培養細胞
を³⁵Sメチオニンで代謝的に標識付けした（Franke及び
共同研究者、Knapp及びFranke、Cell 59（1989）、67〜
79“Spontaneouslosses of control of cytokeratin ge
ne expression in trnsformed、non−epithelial human
cells occurring at different levels of regulatio
n"）。

例２ 純粋なCK20の調製 CK−20蛋白質の獲得のためには２つの異なる蛋白質単
離法が適用された。第１に分取ゲル電気泳動法を使用し
た（Achtstaetter及び共同研究者、1986、例１参照）、
この際十二指腸粘膜絨毛から得られた細胞骨格蛋白質を
一次元電気泳動（SDS−PAGE）中で分離し、かつ酢酸ナ
トリウム染色により可視とした。切断した帯状物からの
蛋白質溶離は電気泳動によるか、または0.05％SDS−水
溶液中での微細に均質にしたゲル材料の恒温保持により
行なわれた。この溶離した蛋白質を真空透析により濃縮
し、かつアセトンで沈殿させた。SDS−PAGE−システム
としてはラエムリーシステム（Laemmli、U.K.、Nature2
27（1970）680−685）又は高めた塩濃度を有する緩衝液
システム（Achtstaetter及び共同研究者、1986（前
記））を適用し、多くの場合両方を順次適用した。

第２の方法としては同じ出発材料からDEAE−セルロー
ス−アニオン交換体クロマトグラフィー及び“転相”−
HPLC−クロマトグラフィーの組合わせを使用した（Acht
staetter及び共同研究者、1986年前記）。蛋白質フラク
ションの純度はSDS−PAGEにより検査した。クロマトグ
ラフ法はSDS−変性を回避し、従って試験管内複合体形
成試験及び再構成試験に関して選ばれる方法であった。

例３ CK20に対する特異的ポリクローナル抗体の製造 分取ゲル電気泳動により精製したCK20−蛋白質はマウ
ス及びモルモットの免疫のために使用された、この際フ
ランケ及びその共同研究者（Franke、Denk、Kalt及びSc
hmid（1981）Biochemical and immunological identifi
cation of cytokeratin proteins in hepatocytes of m
ammalian liver−tissues.Exp.Cell Res.131、299〜31
8）の免疫工程法を適用した。CK20−蛋白質に対する抗
体の高い滴定量を有し、しかしながらCK18に対する抗体
も有する抗血清を単離することができた。この血清から
CK20−蛋白質に対するモノ特異的抗体（CK18との反応性
なし）を単離することができた、この際１％牛血清アル
ブミン及び0.1％ナトリウムアジドを有するPBS中に希釈
した血清（又はそれから硫酸アンモニウム−沈殿により
製造した免疫グロブリンフラクション）を複数回ニトロ
セルローステープに吸収した、このニトロセルローステ
ープにはMCF−７−細胞又はMCF−７−細胞総蛋白質から
の、SDS−PAGEにより分離し、かつ電子移動したシトケ
ラチン８、18及び19が結合していた。この吸収はそのつ
ど連続的に回転する袋状シート中で30分間恒温保持する
ことにより行なわれた。吸収工程と吸収工程との間、ニ
トロセルローステープをPBS中の3mol/l KSCN中で恒温保
持し、かつ引き続きPBS中で洗浄することにより再生し
た。順次約４〜８回の吸収工程を実施した。多くの実験
においてはこの逆吸収の前にニトロセルローステープへ
のプラスの親和性精製工程をSDS−PAGE−分離CK20−蛋
白質で実施した；この際このテープに結合した抗体をPB
S中の3mol/l KSCNにより溶離し、PBSに対して真空透析
した（Krone及び共同研究者（J.Cell Biol.94（1982）7
49〜754）。精製した抗体調製品の特異性は免疫ブロッ
ト分析により二次元電気泳動分離により確実なものとし
た。

例４ ヘテロ型シトケラチン複合体及び中間フィラメントの試
験管内再構成 十二指腸粘膜−絨毛の細胞骨格材料から得られた、ク
ロマトグラフィーにより精製した蛋白質（CK8、18及び2
0）を2.5mmol/l DTT及び9.5mol/l尿素を含有する10mmol
/lトリス−HCl−緩衝液（pH8.0）中に溶かし、かつ（不
溶性の残分を13000gで遠心分離した後）単独又は一定の
ほぼ化学量論量の混合物（CK8＋CK18;CK8＋CK20）をDTT
は含有するが、4mol/l尿素のみを含有する同じ緩衝液に
対して透析した。これにより、Ｉ型及びII型−シトケラ
チン間のヘテロ型複合体形成が可能となるべきであっ
た。4mol/l尿素にした溶液の部分量を（遠心分離の後）
直接電気泳動の試料として非解離条件下に4mol/l尿素中
で使用し、第２の次元でSDS−PAGEと組み合わさせた。

中間−（シトケラチン）−フィラメントの試験管内再
構成のためにはクロマトグラフィーにより精製したCK8
及びCK20蛋白質をそれぞれ1mg/mlの濃度に（Bradfordに
よる蛋白質測定（Bradford M.M.、Anal.Biochem.72（19
76）、248〜254））溶かし（緩衝液前記）、かつ等モル
比で混合する。この混合物（及びコントロールとして個
々の蛋白質の溶液）を浮かんでいる膜フィルター（Mill
ipore VS 0.025）上で2.5mmol/lDTTを含有する10mmol/l
トリス−HCl中の4mol/l尿素に対して１時間透析し、引
き続き２時間2.5mmol/l DTTを含有するが尿素は含有し
ない10mmol/lトリス−HCl（pH7.6）に対して透析する。
引き続き、マイナス染色及び電子顕微鏡検査を実施した
（Quinlan等、J.Mol.Biol.178（1984）、365〜388）。

例５ 蛋白質分解による切断実験 十二指腸粘膜絨毛からの天然細胞骨格材料に部分蛋白
質分解（キモトリプシンによる）切断を行なう（Hatzfe
ld及び共同研究者、J.Mol.Biol.197（1987）237〜25
5）。この際、6.6:1000又は9:1000の酵素基質比及び30
分〜60分の消化時間を適用した。切断生成物はSDS−PAG
E、引き続き銀染色又は免疫ブロット−分析により又は
二次元ゲル電気泳動により、トリプシンペプチド地図に
関連づけて分析した。

例６ 免疫細胞化学、免疫蛍光のために使用した方法、 低温槽組織切片及び培養細胞の免疫ペルオキシダーゼ
及び免疫電子顕微鏡検査を記載されたように適用した
（Bader等著、Eur,J.Cell Biol.47（1988）300〜319;Fr
anke等著、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75、（1978）5034
〜5038;Franke等著、Exp.Cell Res.116（1978）429〜44
5;Franke等著、Eur.J.Cell Biol.19（1979）255〜268;F
ranke等著、Exp.Cell Res.131（1981）299〜318;Franke
等著、J.Cell Biol.90（1981）116〜127;Franke等著、C
ell 30（1982）103〜113;Franke等著、Virchows′s Arc
hiv A、Pathol.Anat.411（1987）137〜147;Jahn等著、D
ifferentiation 36（1987）234〜254;Knapp及びFranke,
Cell 59、（1989）67〜79、Moll等著、Am.J.Pathol.132
（1988）123〜144）。

例７ 標準品の獲得法 適用した方法はシトケラチンの例で記載されている；
しかしながら処理の種類はすべてのIF−蛋白質に転用す
ることができる。

7.1 完全ポリペプチドの精製 人シトケラチン（例えば８）を主にアハトシュテッタ
ー等によって記載されたように（Achtstaetter等;Metho
ds Enzymol.134:355〜371（1986））、人培養細胞列MCF
−７から得た。削り取った細胞層を均質にする（主にAc
htstaetter等によって記載されている、前記）。個々の
シトケラチン−ポリペプチドをDEAE−セルロース上のア
ニオン−交換体クロマトグラフィー（DE52;Whatman Che
mical Separation Inc.,Clifton,NJ,USA）8mol/l（シト
ケラチン８用）もしくは9.5mol/l（シトケラチン20用）
により尿素−緩衝液（８もしくは9.5mol/l尿素、2.5mmo
l/lジチオエリトリット、30mmol/lトリス−HCl（pH8.
0））中でクロマトグラフィーにより精製したが、これ
は主に文献（Hatzfeld及びFranke,J.Cell.Biol.101（19
85）1826〜1841;Achtstaetter等、1986（前記）;Bader
等、EMBO J.5（1986）1865〜1875）;Quinlan等、J.Mol.
Biol 192（1986）337〜349）に記載されている。短く記
載すると、細胞骨格材料を２時間9.5mol/l尿素（5mmol/
lジチオエリトリトール、10mmol/lトリス−HCl（pH8.
0））中で抽出し、100,000xg（ｇ＝重力定数）で遠心分
離することにより得られた上澄む抽出液を８もしくは9.
5mol/l尿素−緩衝液に対して透析し、かつこの緩衝液で
平衡にしたDEAE−セルロースカラム上に担持した。結合
した蛋白質を０〜100mmol/lグアニジン−HCl傾斜液で溶
離した。ポリペプチド−組成物をSDS/ポリアクリルアミ
ドーゲル電気泳動（PAGE）により検査した。合したフラ
クションを転相を有する高圧−液体クロマトグラフィー
にかけ、この際0.01％（v/v）トリフルオル酢酸（TFA）
（Fluka,Buchs,スイス）を水性溶剤Ａとして、アセトニ
トリル（クロマトグラフィー用品質、メルク・ダルムシ
ュタット（西独）中の0.07％（v/v）TFAを有機相（溶剤
Ｂ）として、かつ転相を有するBioRad−RP−304−カラ
ム（BioRad Laboratories,Richmond,CA,USA）を使用し
た。ピークフラクションを集め、アセトニトリルを真空
蒸発により除去し、かつフラクションを凍結乾燥した。

7.2 精製したポリペプチオのプロトフィラメント及びI
F−蛋白質への再構成 精製したシトケラチンを9.5mol/l尿素を含有する緩衝
液中に溶かした。等モル量のＩ型及びII型シトケラチン
を約0.5mg.mlの最終濃度で混合し、プロトフィラメント
及びシトケラチンフィラメントが得られた、この際ポリ
ペプチド溶液を低いイオン強度の緩衝液に対して透析し
た。（Hatzfeld,M.及びFranke,J.Cell Biol.101:1826〜
1841（1985）において記載されている緩衝液を使用し
た。）プロトフィラメント及びシトケラチンフィラメン
トの形成を試料のネガティブ・コントラストによる電子
顕微鏡検査により検査した（Hatzfeld及びFrankeに比
較、前記）。

7.3 制限蛋白質分解によるα−ラセン状シトケラチ
ン中央部片の製造 蛋白質分解を種々のプロテアーゼで実施した。典型的
な調製法においてはキモトリプシン（牛膵臓からのEC
3.4.21.1、例えばシグマ社、ミュンヘンのもの）をシト
ケラチン8:18対の場合6.6:1000、シトケラチン8:20対の
場合9:1000の酵素対基質比（重量／重量）で使用した。
各キモトリプシンチャージに関して消化時間を最適化し
なければならなかった。蛋白質分解を分解生成物をゲル
電気泳動分析によりコントロールし、棒状中央片（Mr＝
38000〜40000）の最大部分量に関して最適化した。最適
値は30℃で約20分にあった。相応する消化時間後、酵素
活性を5mMフェニルメチルスルホニルフルオリドを添加
することにより中断した。

7.4 α−ラセン状中央部片の精製 蛋白質分解による中央部片及びその単フラグメントを
セファロースCL6B（Pharmacia LKB、フライブルグ）カ
ラム上でクロマトグラフィーにより、又は直接転相−高
性能液体クロマトグラフィーを介して分離した、すなわ
ち前記の項7.1に記載した溶剤系の使用下に転相を有す
るBioRad RP304−カラム上で分離した。更なる精製のた
めに、メインフラクションをアセトニトリル濃縮物の約
20％（v/v）への低下のために溶剤Ａで希釈し、次いで
直接転相を有するマイ−ボンダパック（My−Bondapak）
C 18−カラム（Waters Associates,Milford,MA）上に担
持した。すべてのメインフラクションを凍結乾燥し、か
つ試料をラセン構造がそこで中断される短かい中央の切
片に切断位があるので、単にそれぞれ２つの中央部片フ
ラグメントに分離されているα−ラセン状中央部片の存
在に関して１−及び２次元ゲル電気泳動により試料を参
照材料もしくは標準材料として検出システムの較正のた
めに、かつ免疫のために使用した。

例８ 好適な抗体の選択及び製造 独自の増殖によって得られるか、又は市販の中間フィ
ラメント蛋白質に対する特異的抗体を例７により標準材
料として得られたようなα−ラセン状中央部片フラグメ
ントとの免疫活性に関して次の方法で調べた： 8.1 免疫ブロット法（ウェスタン−ブロット；変性抗
原との反応） 精製したフラグメント蛋白質（例えばシケラチン8:18
−、シトケラチン8:20−又はビメンチン（vimentin）−
フラグメント）及びキモトリプシンで蛋白質分解的消化
反応（例９参照）の前及び後の組織試料（例えばリンパ
節又は肝臓）からの細胞骨格−調製物をゲル電気泳動
（ナトリウム−ドデシル硫酸−ポリアクリルアミド−ゲ
ル電気泳動）により分離し、蛋白質をニトロセルロース
上で電気泳動により移動し、問題になっている特異的抗
体と恒温保持した。免疫反応を標識蛋白質Ａ又は標識抗
−マウス−抗体により検出した。α−ラセン状中央部片
（塩基性ケラチンの場合Mr38,000〜40,000;Mr20,000〜2
2,000）と免疫反応を示す抗体を選択した。

8.2 ドット−ブロット法（天然もしくは再天然化抗原
との反応） 精製したCK20−蛋白質約２×10^-6ｇ（50mmol/l Na₂HP
O₄−緩衝液、pH7.4 50×10^-6ｌ中に溶かす）もしくはキ
モトリプシン消化により均質化した組織試料の上澄フラ
クションを直接ニトロセルロースに結合し（例えばSRC9
6 Minifold I Dot−Blot−装置中、Schleicher及びSchu
ll,Kassel,BRD）、かつ問題になっている特異的な抗体
と恒温保持する。更なる作業行程は１に記載していると
同様である。

8.3 エリザ法（天然もしくは再天然化抗原との反応） 精製したフラグメント蛋白質500ng（10^-9ｇ）（50mmo
l/l NaHCO₃−緩衝液、pH9.6 100μｌ（10^-6ｌ）中に溶
かす）もしくはキモトリプシン消化により均質化した組
織試料の上澄フラクションの蛋白質２μｇ（10^-6ｇ）
（100μｌ［10^-6ｌ］中）を96穴マイクロ滴定プレート
の窪み毎に恒温保持し、かつ結合した蛋白質を問題にな
っている特異的な抗体と共に恒温保持する。更なる作業
行程は１に記載したように行なう。

8.4 免疫蛍光−鏡検標準法、例えばCiocca D.R.及びBj
ercke R.J.によりMethods Enzymol.121,562〜579（198
6）に詳しく記載されている。

前記方法によりプラスであった抗体及び抗血清はKs 1
9.2;Ks 18−9B1;Ks 18−27IV;Ks 8−17.2;Ks pan 1−8;
VIM 3B4;IT−モルモット抗血清（シトケラチン20に対す
るモルモット抗血清の製造（例３参照、IT−マウス抗血
清（製造例３参照）。

8.5 α−ラセン状中央部片に対するモノクロナール抗
体の製造 特異的抗体の製造のためには、その都度精製したポリ
ペプチドから構成された試験管中で再構成されたフィラ
メントだけを免疫化のために注射した。モノクロナール
抗体を製造するためにはメスの生後６〜８週のBALB/Cマ
ウスを免疫化するが、この際このマウスに蛋白質30〜30
0×10^-6ｇを含有する細胞骨格調製品又は再構成フィラ
メントを１回の注射あたり投与した。この抗原を燐酸塩
緩衝食塩溶液（PBS）中で懸濁し、かつ最初の注射のた
めにフロインドのアジュバンス（完全）で乳化した。す
べての後続の注射においてはフロインドのアジュバンス
（不完全）を使用した。動物に約３週間の間隔で３回皮
下注射し、かつこの動物は細胞融合の前３日間、抗原30
〜80×10^-6ｇの腹腔内反復−注射を受けた。免疫マウス
の脾臓細胞を系列Sp3/0Ag14、X63−Ag8、653及びNSO/U
（Schulmann等著、Nature276:269〜270（1978）;Kearne
y等著、J.Immunol.123:1548〜1550（1979）;Clark及びM
ilstein,Somatic Cell Genetics 7:657〜666（1981））
のマウス骨髄腫細胞と10:1の比で主にKoehler及びMilst
einによりNature256:495〜497（1975）に記載されたよ
うに、融合した。ハイブリッド上澄を人及び牛組織の凍
結切片上で（主にAchtstaetter等により、Differentiat
ion 31:206〜227（1986）に記載）又は特別に被覆した
スライドグラス又はカバーグラス上で培養された培養細
胞上で試験したか、又は酵素と組み合わせた免疫吸着法
（ELISA）で試験したが、この際マイクロ滴定プレート
の積層のためには精製した抗原を使用した。プラスのク
ローンを２回コントロールした希釈によりサブクローン
化した。Ig−サブクラスをOuchterlony及びNilsson,L.
A.（1978,Handbook of Experimental Immunology;Wei
著、第１巻、第19節、Blackwell Scientific Publicati
ons社、オックスフォード、第１〜19頁中）により決め
た。

8.6 ディテクター抗体のペルオキシダーゼへの結合 ディテクター抗体と呼ばれるモノクローナル抗体及び
特異的なモルモット抗血清をB.Tijssen（Laboratory te
chniques in biochemistry and molecular biology,第1
5巻:Practice and theory of enzyme immunoassays、R.
H.Burdon及びP.H.van Knippenberg著、Elsevier Amster
dam,New York,Oxford;第238頁）により記載された方法
によりペルオキシダーゼに結合した： ペルオキシダーゼ5mgを炭酸ナトリウム（100mmol/l、
Ph9.2）0.5ml中に溶かし、かつこの酵素を２時間室温で
遮光下に10mmol/l NaIO₄−溶液0.5mlで酸化することに
より、結合の前準備をした。その後、所望の抗体（10mg
を100mmol/l炭酸ナトリウム、pH9.2 2ml中に溶かす）を
添加し、乾燥セファデックスＧ−25（Pharmacia社、Fre
iburg）0.5gを加え、更に３時間遮光下に恒温保持す
る。この際生じた複合体をセファデッス材料から炭酸ナ
トリウム緩衝液で溶離し、0.1mmol/l NaOH中の0.5％NaB
H₄−溶液1/20容量部と混合する。30分後に、同じ溶液1/
10容量部を加え、４℃で１時間恒温保持する。複合体を
PBSに対して真空透析し、かつ約0.5mlに濃縮し、かつ引
き続きセファデックス−Ｇ−200（Pharmacia社）カラム
（1.0×50cm）で分別する。このフラクション（約0.5ml
容量）を酵素活性及び抗体に関してその量を試験し、高
いIg−濃度と高い酵素活性を同時に示すフラクションを
まとめる。

例９ リンパ組織中の転移の検出及び測定 9.1 CK20−蛋白質、有利にそのα−ラセン状中央部片
の溶解化 まずリンパ節組織の湿潤時重量を調べる。この組織を
（湿潤時重量に対して）３倍容量の燐酸塩緩衝食塩溶液
（PBS）（10mmol/l燐酸ナトリウムpH7.4、150mmol/l塩
化ナトリウム）中にナイフホモジナイザーを用いてかゆ
状の粘調物になるまで微細に切断する（Kinematica社、
Luzern/スイスのPolytron−ホモジナイザーの使用が勧
められる）。この均質物をキモトリプシンと共に恒温保
持する。

この目的のためにあらかじめマトリックス（CNBr−活
性化セファロース4B、Pharmacia社、Freiburg）に結合
されているキモトリプシンを使用する:CNBr−活性化セ
ファロース4B1gを1mmol/lHCl中で15分間膨潤させ（ゲル
容量約3.5ml/g）、かつ全部で1mmol/l HCl 200mlで洗浄
する。塩酸溶液を吸引濾過し、かつマトリックス材料を
結合緩衝液（0.5mol/l NaCl、0.1mol/l NaHCO₃、pH8.
0）5mlで洗浄する。キモトリプシン10mgを結合緩衝液5m
l中に溶かし、かつマトリックス材料と共に常に動揺下
に室温で２時間恒温保持する。その後残った、飽和して
いない結合位を0.2mol/lグリシン溶液（pH8.0）5mlを添
加して遮断する。引き続き、ゲル材料を過剰の結合緩衝
液（約50ml）及び酢酸塩緩衝液（0.5mol/l NaCl、0.1mo
l/l酢酸ナトリウム、pH4.0）10mlで洗浄する。この条件
下に使用したキモトリプシン約60％を結合する、すなわ
ちセファロース4B−ゲルは結合したキモトリプシン1.7m
g.mlを含有する。より良好な取り扱かいやすさのために
このゲルをPBS中で２倍に希釈する（キモトリプシン−
濃縮物0.85mg/ml）。このかゆ状組織にキモトリプシン
（EC3.4.21.1、牛膵臓から例えばSigma社、ミュンヒェ
ン）を1:1000（組織の湿潤時重量に対して計算）の割合
で添加する。次いで30℃での恒温保持工程を行なう（有
利に熱ブロック、場合により水浴中）。この均質物を５
分間氷中に入れることにより、消化反応は30分後に止ま
る。この均質物２×10⁴ｇで30分間遠心分離し、かつす
ぐに遠心分離上澄を取り出す；結合したキモトリプシン
は沈殿物中に存在する。

この条件下になお、同定可能な状態でα−ラセン状中
央部片の材料の80〜95重量％がCK20−蛋白質から上澄フ
ラクション中に遊離し、いくらかの完全CK20−蛋白質が
可溶性の段階で同様に存在する。

9.2 ビメンチン含量の検査及び測定 遠心分離を行なった上澄中でビメンチンをサンドイッ
チ−エリザ法により免疫学的に測定する。このためには
第１の抗血清、GP−８をα−ラセン状中央部片に対する
捕獲−抗体として使用し、かつ第２のモノクロナール抗
体VIM−3B4を第１のエピトープから独立しかつ異なる他
のα−ラセン状中央部片のエピトープに対するディテク
ター抗体として使用する。捕獲−抗体（GP8）を50mmol/
l NaHCO₃（pH9.6）中に溶かし濃度10×10^-6g/mlで、マ
イクロ滴定プレート上に積層する（窪みあたり150×10
^-6ｌ）、標準曲線のためには精製したビメンチン−フラ
グメントを10ng/ml〜500ng/mlの濃度で（緩衝液:150mmo
l/l NaCl、10mmol/l Na₂HPO₄、pH7.4、0.05％ツウィー
ン20中に溶かす）使用する。遠心分離した上澄液中のビ
メンチン濃度の測定のためには、これを最後にあげた緩
衝液で1:100〜1:500に希釈する。ペルオキシダーゼで標
識したディテクター抗体VIM3B4を緩衝液（150mmol/l Na
Cl、10mmol/l Na₂HPO₄、pH7.4、１％牛血清アルブミ
ン、0.05％ツウィーン20）で希釈して濃度0.5×10^-6g/m
lとし、かつ窪みあたり150×10^-6g/mlの濃度にする。基
質としてはｏ−フェニレンジアミン又はABTS（2,2′−
アジノージ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホネー
ト（６）］）を使用する。次いで、このようにして得ら
れたビメンチン値を他の測定結果の定量評価のための基
準値として使用する。

9.3 シトケラチンの測定及びシトケラチン含量の調査 遠心分離上澄液中で存在するシトケラチンを免疫学的
にサンドウィッチ−エリザ法により測定する。このため
にはシトケラチン１〜８に典型的な第１のエピトープに
反応する第１のモノクローナル抗体Ks pan 1−８、いわ
ゆる捕獲−抗体を使用する。捕獲−抗体Ks pan1〜８を5
0mmol/l NaHCO₃（pH9.6）中に溶かし、濃度２×10^-6g/m
lでマイクロ滴定プレート上に積層する（窪みあたり150
×10^-6ｌ）。標準曲線に関しては例えば精製したシトケ
ラチン−フラグメントをシトケラチン8:18及び8:20の組
合わせで濃度5ng/ml〜500ng/ml（緩衝液:150mmol/l NaC
l、10mmol/l Na₂HPO₄、pH7.4、0.05％ツウィーン20中に
溶かす）で使用する。ペルオキシダーゼ結合ディテクタ
ー抗体としては、例えばKs 18−27IV及びKs 18−9B1
（シトケラチン18フラグメントに関して）及びIT−モル
モット抗血清（シトケラチン20フラグメントに関して）
を使用する。遠心分離上澄液中のシトケラチン濃度の測
定のためにはこれを緩衝液（150mmol/l NaCl、10mmol/l
Na₂HPO₄、pH7.4、0.05％ツウィーン20）で1:100希釈す
る。

標準化のためには例７により得られた既知量のシトケ
ラチン標準品をサンドウィッチ−エリザ法に使用する。
それぞれの標準化シトケラチンの濃度に相応する酵素活
性を濃度に対して記載し、標準曲線を得、この標準曲線
から各シトケラチンの未知量の濃度が補間法によって求
められる。

癌転移の規模は組織試料中の一定のシトケラチンと測
定したビメンチンの比によりはっきりと表示することが
できる。

例10 マイクロ滴定プレート上でのサンドウィッチ−エリザ
法におけるシトケラチン8:20の定量測定 10.1 マイクロ滴定プレートの積層 各窪みに捕獲抗体Ks pan1−８ 0.2×10^-6ｇ（50mmol
/l炭酸ナトリウム緩衝液pH9.6 100〜150×10^-6ｌ中に溶
かす）をピペットで挿入する。このプレートをおおっ
て、１夜４℃で恒温保持する。

10.2 洗浄及び遮蔽 各窪みから過剰の抗体溶液を吸引により除去する。各
窪みに３回順次洗浄緩衝液（PBS−ツウィーン:150mmol/
l NaCl、10mmol/l燐酸ナトリウム緩衝液pH7.4、0.05％
ツウィーン20）200×10^-6ｌをピペットで入れ、プレー
トを回転することにより除去する。残った湿り気を多層
のティッシュペーパー上でプレートを軽くたたくことに
より除く。

各々の窪みを遮蔽緩衝液（150mmol/l NaCl、10mmol/l
燐酸ナトリウム緩衝液pH7.4、0.05％ツウィーン20、１
％牛血清アルブミン、５％蔗糖、長い保存時間の場合、
更に0.01％ チメロサールを添加する）200×10^-6ｌで
満たし、少なくとも１時間室温で恒温保持する。

10.3 抗原もしくは血清試料との恒温保持 例７により濃度5ng/mlと500ng/mlの間（その都度のデ
ィテクター抗体に依存する）で得られたシトケラチン8:
20の標準蛋白質を対照血清（Herz＆DadeからのMonitrol
又はBehringからのKontrollogenL及びLU）中に取り込
む。この対照血清を1:10及び1:100希釈する。それぞれ
の窪みに標準蛋白質溶液又は血清試料（1:10及び1:100
希釈）100×10^-6ｌをピペットで挿入し、90分間室温で
恒温保持する。その後、洗浄緩衝液（PBS−ツウィー
ン、前記）200×10^-6ｌで４回洗浄する。

10.4 ディテクター抗体との恒温保持 ペルオキシダーゼと結合したディテクター抗体（CK20
−モルモット血清）を緩衝液（150mmol/l NaCl、10mmol
/l燐酸ナトリウム緩衝液pH7.4、１％牛血清アルブミ
ン）中で希釈し（最適濃度は0.2〜0.5U/ml）、そこから
ミクロ滴定プレートの各窪みに100×10^-6ｌをピペット
で入れ、90分間室温で恒温保持する。その後洗浄緩衝液
（PBS−ツウィーン、前記）200×10^-6ｌで２回、及び蒸
留水200μｌで４回洗浄する。

10.5 基質反応 マイクロ滴定プレートのために基質錠剤（10mg）ｏ−
フェニレンジアミン（Sigma社）１つ及び30％H₂O₂ 10×
10^-6ｌを0.1M燐酸カリウム緩衝液（pH6.0）10ml中又は
クエン酸塩−燐酸塩−緩衝液（0.0347mol/lクエン酸、
0.0667mol/l燐酸水素二ナトリウム;pH5.0）中に溶かす
（クエン酸塩−燐酸塩緩衝液の使用の際により高い吸着
が得られる）。各々の窪み中に基質溶液100×10^-6ｌ
（室温に温度調節済）をピペットで入れる。マイクロ滴
定プレートをカバーして光作用による反応を保護し（ア
ルミニウムシート等で）、かつ相応する色強度が生じる
まで恒温保持する（15〜30分）。

10.6 酵素反応の中断 12.5％H₂SO₄−溶液50×10^-6ｌの添加により、ペルオ
キシダーゼの反応を中断する。定量測定の場合には、標
準蛋白質とテスト血清に関して同じ時間の経過後に中断
するように注意するべきである。

10.7 評価 マイクロ滴定プレートをエリザ−光度計中で492nmで
測定する。

例11 96穴マイクロ滴定プレート（例えば、M129A、Dynatec
h,Plochingen）の各々の窪み中で標準蛋白質（4mol/l尿
素、10mmol/lトリス−HCl pH7.6、2mmol/l ジチオエリ
トリット、5mmol/l EDTA中の原液0.5mg/mlからフィラメ
ントに再構成されたシトケラチン20及びシトケラチン
８）10μｇを燐酸塩緩衝食塩溶液（PBS;150mmol/l NaC
l、10mmol/l燐酸ナトリウムpH7.4）100μｌ中に溶かし
てピペットで入れ、室温（RT）で16時間恒温保持する。
その後窪みを空にし、それぞれPBS200μｌで１回洗浄
し、かつ飽和していない結合位を１％BSA−溶液（牛血
清アルブミン、PBS中に溶解）100μｌで室温で１時間恒
温保持することにより遮蔽する。引き続き窪みを３回そ
れぞれ洗浄液（0.05％ツウィーン20、PBS中に溶解）200
μｌで洗浄し、患者血清（PBS中で1:500に希釈）100μ
ｌと共にRTで１時間恒温保持し、洗浄溶液それぞれ200
μｌで３回洗浄し、特異的なIgM−抗体の検出のために
ペルオキシダーゼ結合抗−人−IgM抗血清（兎抗−人I
g、μ−鎖特異的:Dako P322）と共に並びに特異的なIgG
−抗体の検出のためにペルオキシダーゼ結合抗−人IgG
抗血清（兎抗−人Ig、σ−鎖特異的、DakoP214）と共に
1:1000で0.1％BSA−溶液（PBS中）中室温で１時間恒温
保持する。それぞれ洗浄溶液200μｌで３回及び蒸留水2
00μｌで２回洗浄した後、各々の窪みに基質溶液（ｏ−
フェニレンンジアミン10mg、30％H₂O₂ 10μｌ、クエン
酸塩−燐酸塩緩衝液10ml中:0.0347mol/lクエン酸、0.06
67mol/l燐酸水素二ナトリウム;pH5.0）100μｌをピペッ
トで入れる。遮光下に10〜30分（それぞれ色強度によ
り）展開させ、酵素反応を12.5％H₂SO₄−溶液50μｌの
添加により中断し、反応した基質を波長492nmでエリザ
−光度計により測定する。標準化のためにはシトケラチ
ン20自家抗体に関して低い、中程度の及び高い力価を有
する比較血清を同時に平行測定する。

例12 人の正常組織及び腫瘍組織中のCK20（蛋白質IT）の免
疫組織化学的局在限定 試験法は例えば例６に記載されているような公知方法
に相応して実施した。

1.正常組織 上皮： 胃粘膜（小窩上皮） ＋＋＋ 薄層腸粘膜 ＋＋＋ 厚層腸粘膜 ＋＋＋ 泌尿器系上皮 ＋＋＋ メルケル細胞 ＋ 胆嚢粘膜 ＋ 胸腺細網 ＋ 前立腺 ＋ 肝臓 − 膵臓 − 腎臓 − 表皮 − 汗腺 − 皮脂線 − 乳腺 − 口内唾液腺 − 口内粘膜 − 食道−粘膜 − 甲状腺 − 肺 − 中皮 − 子宮 − 卵管 − 精巣上体 − 非上皮組織：すべてマイナス 2.腫瘍 癌： 結腸の腺癌 ＋＋＋ 胃の腺癌 ＋＋ 膵臓の腺癌 ＋＋ 胆嚢の腺癌 ＋＋ 泌尿器系上皮癌 ＋＋＋ メルケル細胞癌 ＋＋＋ 肺の腺癌 −^＊ 乳癌 − 子宮内膜の腺癌 −^＊ 卵巣の腺癌 −^＊＊ 腎臓の腺癌 − 甲状腺の癌 − 口腔の扁平上皮癌 −^＊ 肺の扁平上皮癌 −^＊ 頸の扁平上皮癌 − 肺の小細胞癌 −^＊ すべての非上皮腫瘍はマイナスである − ＋ ＝プラス ＋＋ ＝強くプラス ＋＋＋ ＝非常に強くプラス − ＝マイナス −^＊ ＝マイナスだが、個々の細胞は場合により
プラス −^＊＊ ＝卵巣粘膜癌（＋＋）以外はマイナス 免疫組織化学をCK20に対する特異的抗体（モルモット
又はマウスから）及びペルオキシダーゼ結合第２次抗体
（羊からの抗−マウス−もしくは抗−モルモット−Ig）
又はペルオキシダーゼ結合蛋白質Ａを用いて低温槽−組
織切片で実施した。

原則的にはこの方法はマウス−抗体を使用する際にパ
ラフィン切片上でも適用可能である。

明細書中で例として挙げた細胞列ATCC HTB38、ATCC C
CC 229、ATCC CCC233、ATCC CCC 221及びATCC CCC 220
は米国寄託機関（American Type Culture Collectio
n）、Rockville、Maryland、USAの細胞列収集中にすべ
ての人に使用可能に提供されており、かつATCC−カタロ
グに記載されている。

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】シトケラチン20に特異的な抗体又はシトケ
   ラチン20の蛋白質分解による切断によりえられたそのα
   −ラセン状中央部片に特異的な抗体を使用することを特
   徴とする、組織切片上、組織均質物中及び体液中のシト
   ケラチン20又はシトケラチン20の蛋白質分解による切断
   によりえられたそのα−ラセン状中央部片の免疫学的同
   定法。
2. 【請求項２】組織試料から均質物を製造し、この均質物
   中に含有される中間フィラメント蛋白質を蛋白質分解的
   に切断し、かつこれから遊離するα−ラセン状中央部片
   を可溶性の相中で分離し、抗体を用いて同定し、かつ定
   量的に測定する請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】血液、血液血清及び尿のような体液中で、
   この中に含有される可溶性中間フィラメント蛋白質フラ
   グメントを抗体を用いて免疫学的に同定し、かつ定量的
   に測定する請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】胃腸管、膀胱及びメルケル細胞の癌を他の
   腫瘍から区別するために使用する請求項１記載の同定
   法。
5. 【請求項５】転移の細胞に関する由来を証明するために
   使用する請求項１記載の同定法。