JP2544177B2 - セルラ―ゼ遺伝子を含むｄｎａ断片 - Google Patents
セルラ―ゼ遺伝子を含むｄｎａ断片Info
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- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はセルラーゼ遺伝子に関するものであり、特
に、アルカリ側pHに於いて最適な増殖を示す所謂好アル
カリ性（alkalophilic）バチルス（Bacillus）属細菌由
来のアルカリセルラーゼ遺伝子、並びに当該遺伝子を含
むDNA分子、更には当該DNA分子を有する微生物に関す
る。
に、アルカリ側pHに於いて最適な増殖を示す所謂好アル
カリ性（alkalophilic）バチルス（Bacillus）属細菌由
来のアルカリセルラーゼ遺伝子、並びに当該遺伝子を含
むDNA分子、更には当該DNA分子を有する微生物に関す
る。
従来、セルラーゼはセルロースをグルコース、又はセ
ロビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵素反応
を触媒する複雑な酵素群として理解されており、その作
用機構により、C1酵素、CX酵素とβ−グルコシダーゼ、
或いはエキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカ
ナーゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素を含有
すると言われる。過去数十年のセルラーゼの研究は主と
してバイオマス資源の有効利用を図るという観点から、
例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレモニ
ウム属、フミコーラ属等のカビの類にそ供給源を求めら
れてきた。
ロビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵素反応
を触媒する複雑な酵素群として理解されており、その作
用機構により、C1酵素、CX酵素とβ−グルコシダーゼ、
或いはエキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グルカ
ナーゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素を含有
すると言われる。過去数十年のセルラーゼの研究は主と
してバイオマス資源の有効利用を図るという観点から、
例えばトリコデルマ属、アスペルギルス属、アクレモニ
ウム属、フミコーラ属等のカビの類にそ供給源を求めら
れてきた。
また、セルラーゼの新規な産業的用途として、衣料用
洗浄剤組成物に関するものが挙げられる。しかしなが
ら、上記のカビを含めて微生物が生産するセルラーゼ
は、その大部分が中性乃至酸性pHにおいて最適且つ安定
な酵素活性を有する、所謂中性若しくは酸性セルラーゼ
と称されるものであつた。即ち、衣料用洗浄剤組成物と
しての必要条件であるアルカリ性pH領域で最高活性を示
し、且つ安定な、所謂アルカリセルラーズの存在は僅か
に、バチルス属及びストレプトマイセス属の細菌由来の
ものが知られているのみである。そこで、本発明者ら
が、アルカリセルラーゼわ生産する微細物の探索を行つ
たところ、好アルカリ性細菌の一種であるバチルス エ
スピー（Bacillus sp.）KSM−635（FERM BP−1485）が
衣料用洗浄剤組成物として適したアルカリセルラーゼを
著量に生産することを見出した（特願昭61−257775
号）。
洗浄剤組成物に関するものが挙げられる。しかしなが
ら、上記のカビを含めて微生物が生産するセルラーゼ
は、その大部分が中性乃至酸性pHにおいて最適且つ安定
な酵素活性を有する、所謂中性若しくは酸性セルラーゼ
と称されるものであつた。即ち、衣料用洗浄剤組成物と
しての必要条件であるアルカリ性pH領域で最高活性を示
し、且つ安定な、所謂アルカリセルラーズの存在は僅か
に、バチルス属及びストレプトマイセス属の細菌由来の
ものが知られているのみである。そこで、本発明者ら
が、アルカリセルラーゼわ生産する微細物の探索を行つ
たところ、好アルカリ性細菌の一種であるバチルス エ
スピー（Bacillus sp.）KSM−635（FERM BP−1485）が
衣料用洗浄剤組成物として適したアルカリセルラーゼを
著量に生産することを見出した（特願昭61−257775
号）。
一方、近年になつて、細菌由来のセルラーゼ遺伝子、
具体的には、クロストリジウム属、セルロモナス属、バ
チルス属、ストレプトマイセス属及びルミノコツカス属
等の遺伝子が遺伝子操作技術を用いて単離されている。
これらの遺伝子のうち、クロストリジウム サーモセラ
ム（Clostridium thermocellum（Beguin,P.,Cornet,P.,
and Aubert,J.P.,J.Bacteriol.,162,102,（1985）、Jol
iff,G、,Beguin,P.,and Anbert,J.P.,Nucleic Acids Be
s.,14,8605,（1986）及びGrepinet,O.,and Beguin,P.,N
ucleic Acids Res.,14,1791,（1986）），セルロモナス
フイミ（Cellulomonas fimi（Wong,W.K.R.,Gerhard,
B.,Guo,Z.M.,Kilbun,D.G.,Anthony R.,Warren,J.,and M
iller,R.C.J.,Gene,44,315,（1986））、セルロモナス
ウダ（Cellulmonas uda（Nakamura,K.,Misawa,N.,and
Kitamura,K.,J.Biotechol.,4,247,（1986）））、枯草
菌（バチルス スブチリス Bacillus subtilis（Murph
y,N.,Mcconnell,D.J.,and Cantwell,B.A.,Nucleic Acid
s Res.,12,5355,（1984）、Bobson,L.M.,and Chamblis
s,G.H.,J.Baceriol.,169,2017,（1987）、Maskay,R.M.,
Lo,A.,Willick,G.,Znker,M.,Baird,S.,Dove,M.,Moranel
li,F.,and Seligy,V.,Nucleic AcidS Res.,14,9159,（1
986）Nakamura,A.,Uozumi,T.and Beppu,T.,Eur,J.Bioch
em.,164,317,（1987）））、及び好アルカリ性バチルス
属細菌（Fukumori,F.,Sashihara,N.,Kudo,T.and Horiko
shi,K.,J.Bacteriol.,168,479,（1986）及びFukumori,
F.,Kudo,T.,Narahashi,Y.and Horikoshi,K.,J.Gen.Micr
obiol.132,2329,（1986））由来の遺伝子に関しては既
にヌクレオチド配列が決定され、コードするアミノ酸配
列も知られている。
具体的には、クロストリジウム属、セルロモナス属、バ
チルス属、ストレプトマイセス属及びルミノコツカス属
等の遺伝子が遺伝子操作技術を用いて単離されている。
これらの遺伝子のうち、クロストリジウム サーモセラ
ム（Clostridium thermocellum（Beguin,P.,Cornet,P.,
and Aubert,J.P.,J.Bacteriol.,162,102,（1985）、Jol
iff,G、,Beguin,P.,and Anbert,J.P.,Nucleic Acids Be
s.,14,8605,（1986）及びGrepinet,O.,and Beguin,P.,N
ucleic Acids Res.,14,1791,（1986）），セルロモナス
フイミ（Cellulomonas fimi（Wong,W.K.R.,Gerhard,
B.,Guo,Z.M.,Kilbun,D.G.,Anthony R.,Warren,J.,and M
iller,R.C.J.,Gene,44,315,（1986））、セルロモナス
ウダ（Cellulmonas uda（Nakamura,K.,Misawa,N.,and
Kitamura,K.,J.Biotechol.,4,247,（1986）））、枯草
菌（バチルス スブチリス Bacillus subtilis（Murph
y,N.,Mcconnell,D.J.,and Cantwell,B.A.,Nucleic Acid
s Res.,12,5355,（1984）、Bobson,L.M.,and Chamblis
s,G.H.,J.Baceriol.,169,2017,（1987）、Maskay,R.M.,
Lo,A.,Willick,G.,Znker,M.,Baird,S.,Dove,M.,Moranel
li,F.,and Seligy,V.,Nucleic AcidS Res.,14,9159,（1
986）Nakamura,A.,Uozumi,T.and Beppu,T.,Eur,J.Bioch
em.,164,317,（1987）））、及び好アルカリ性バチルス
属細菌（Fukumori,F.,Sashihara,N.,Kudo,T.and Horiko
shi,K.,J.Bacteriol.,168,479,（1986）及びFukumori,
F.,Kudo,T.,Narahashi,Y.and Horikoshi,K.,J.Gen.Micr
obiol.132,2329,（1986））由来の遺伝子に関しては既
にヌクレオチド配列が決定され、コードするアミノ酸配
列も知られている。
ところで、遺伝子操作技術を用いてセルラーゼ遺伝子
を単離し、そのヌクレオチド配列を決定する試みは、遺
伝学的アプローチによる生産菌の育種及びプロテイン
エジニアリングの手法によるセルラーゼ機能及び特性の
改良等を考慮した場合、極めて意義のあることである。
しかしながら、これまでのところセルラーゼ一般につい
ての立体構造や活性中心に関する知見は殆ど皆無であ
り、前述の目的を達成する為には機能や特性が異なる、
より多くのセルラーゼに関するヌクレオチド配列及びア
ミノ酸配列の情報が必要とされている。
を単離し、そのヌクレオチド配列を決定する試みは、遺
伝学的アプローチによる生産菌の育種及びプロテイン
エジニアリングの手法によるセルラーゼ機能及び特性の
改良等を考慮した場合、極めて意義のあることである。
しかしながら、これまでのところセルラーゼ一般につい
ての立体構造や活性中心に関する知見は殆ど皆無であ
り、前述の目的を達成する為には機能や特性が異なる、
より多くのセルラーゼに関するヌクレオチド配列及びア
ミノ酸配列の情報が必要とされている。
本発明者は、先に遺伝子操作の手法を用いてアルカリ
セルラーゼを著量に生産する組換えエシエリヒア（Esch
erichia）属菌８株を調製した。当該菌株のうち１株よ
りアルカリセルラーゼ遺伝子の活性必須領域を含む約4.
0KbのDNK断片を単離し、解析を行つた結果、独自の制限
地図を有する新規なDNA断片であることが判明した（特
願昭61−259923号）。また、別の１株からは上述のDNA
断片を含み、且つ、当該遺伝子の全領域を含む約6.6Kb
のDNA断片を単離した。そこで、更に当該遺伝子の全ヌ
クレオチド配列及びコードされるアルカリセルラーゼの
アミノ酸配列を決定し、これらをこれまでに知られてい
るバチルス属細菌由来の他のセルラーゼ遺伝子のヌクレ
オチド配列及びコードするアミノ酸配列と比較した結
果、本発明のDNA断片は独自のヌクレオチド配列を有し
ており、且つ、コードするアルカリセルラーゼのアミノ
酸配列も他と異なることを見出し、本発明を完成した。
セルラーゼを著量に生産する組換えエシエリヒア（Esch
erichia）属菌８株を調製した。当該菌株のうち１株よ
りアルカリセルラーゼ遺伝子の活性必須領域を含む約4.
0KbのDNK断片を単離し、解析を行つた結果、独自の制限
地図を有する新規なDNA断片であることが判明した（特
願昭61−259923号）。また、別の１株からは上述のDNA
断片を含み、且つ、当該遺伝子の全領域を含む約6.6Kb
のDNA断片を単離した。そこで、更に当該遺伝子の全ヌ
クレオチド配列及びコードされるアルカリセルラーゼの
アミノ酸配列を決定し、これらをこれまでに知られてい
るバチルス属細菌由来の他のセルラーゼ遺伝子のヌクレ
オチド配列及びコードするアミノ酸配列と比較した結
果、本発明のDNA断片は独自のヌクレオチド配列を有し
ており、且つ、コードするアルカリセルラーゼのアミノ
酸配列も他と異なることを見出し、本発明を完成した。
従つて、本発明はアルカリセルラーゼ遺伝子を提供す
るものであり、更に当該遺伝子を含むDNA分子を提供す
るものである。また、本発明はアルカリセルラーゼ遺伝
子を含有する微生物を提供するものである。
るものであり、更に当該遺伝子を含むDNA分子を提供す
るものである。また、本発明はアルカリセルラーゼ遺伝
子を含有する微生物を提供するものである。
本発明において、アルカリセルラーゼ遺伝子の供与体
となる微生物としては、例えば、好アルカリ性バチルス
属細菌の一種、バチルス エスピー KSM−635を用いる
ことができる。本菌株は本発明者らが、菌体外に著量の
アルカリセルラーゼＫを生産する菌株として栃木県芳賀
郡の土壌より分離したものであり、微工研条寄第1485号
として寄託されている。KSM−635分類的性質は、本発明
者らによる昭和61年10月28日付出願の昭和61年特許願第
257775号に詳述されている。
となる微生物としては、例えば、好アルカリ性バチルス
属細菌の一種、バチルス エスピー KSM−635を用いる
ことができる。本菌株は本発明者らが、菌体外に著量の
アルカリセルラーゼＫを生産する菌株として栃木県芳賀
郡の土壌より分離したものであり、微工研条寄第1485号
として寄託されている。KSM−635分類的性質は、本発明
者らによる昭和61年10月28日付出願の昭和61年特許願第
257775号に詳述されている。
供与菌株から染色体DNAを得る方法としては、例え
ば、マーマーの方法（Marmur J.,Mol.Biol.,3,208,（19
61））や斉藤と三浦の方法（Saito,H.and Miura,K.I.,B
iochim,Biophys,Acta,7d,619,（1961））等が挙げられ
ているが、他の類似な方法を用いることもできる。斯く
して得られた染色体DNAを制限酵素で切断することよつ
て、アルカリセルラーゼ遺伝子を含むDNA断片を調製す
るが、用いる制限酵素の種類としては、当該遺伝子を分
断しないものであれば、如何なるものでも使用できる。
このような制限酵素の例として、EcoR I、EcoR V或いは
BamH I等の制限酵素が挙げられる。また、用いる制限酵
素が当該遺伝子による酵素活性発現に必須な領域を分断
しなければ、当該遺伝子の一部を含むDNA断片を調製で
きる。更に、当該遺伝子或いは活性必須領域を切断する
制限酵素を用いる場合においても、部分切断の条件を用
いることによつて目的を達成できる。例えば、制限酵素
Hid IIIを用いる場合、完全切断条件を用いれば、当該
遺伝子の活性必須領域を含む約4.0KbのDNA断片を調製す
ることができ、また、部分切断の場合には、当該遺伝子
の全領域を含む、約6.6KbのDNA断片を調製することが可
能である。
ば、マーマーの方法（Marmur J.,Mol.Biol.,3,208,（19
61））や斉藤と三浦の方法（Saito,H.and Miura,K.I.,B
iochim,Biophys,Acta,7d,619,（1961））等が挙げられ
ているが、他の類似な方法を用いることもできる。斯く
して得られた染色体DNAを制限酵素で切断することよつ
て、アルカリセルラーゼ遺伝子を含むDNA断片を調製す
るが、用いる制限酵素の種類としては、当該遺伝子を分
断しないものであれば、如何なるものでも使用できる。
このような制限酵素の例として、EcoR I、EcoR V或いは
BamH I等の制限酵素が挙げられる。また、用いる制限酵
素が当該遺伝子による酵素活性発現に必須な領域を分断
しなければ、当該遺伝子の一部を含むDNA断片を調製で
きる。更に、当該遺伝子或いは活性必須領域を切断する
制限酵素を用いる場合においても、部分切断の条件を用
いることによつて目的を達成できる。例えば、制限酵素
Hid IIIを用いる場合、完全切断条件を用いれば、当該
遺伝子の活性必須領域を含む約4.0KbのDNA断片を調製す
ることができ、また、部分切断の場合には、当該遺伝子
の全領域を含む、約6.6KbのDNA断片を調製することが可
能である。
一方、用いる宿主・ペクター系としては、宿主菌株が
アルカリセルラーゼ遺伝子を発現させることができ、ま
た、組換えDNA分子が宿主菌中で複製可能であり、組み
込んだ当該遺伝子を安定に保持できるものであれば、如
何なるものも使用することができる。例えば、エシエリ
ヒア コリ（Eacherichia coli）Ｋ−12株を宿主とする
EK系やバチルス ズブチリス（Bacillus subtilis）Mar
burg株を宿主とするBM系が挙げられるが、好適には、遺
伝学的に最もよく研究されており、ベクターの種類が豊
富であるEK系を用いると良い結果が得られる。宿主菌株
の具体例として、EK系ではHB101株、C600株、JM109株
等、BM系ではBD170株、MI112株等が挙げられる。ベクタ
ーとしては、上記の記述に加えて、染色体DNAを切断し
た制限酵素によつて唯一ケ所で切断されるプラスミドベ
クターを用いれば染色体DNA断片との結合の際に便利で
ある。具体的には、染色体DNAをHind IIIで切断し、EK
系ではpBR32やpUC12、pUC18等のベクター、またBM系で
はpC194やpBD8等のベクターを用いることができる。ま
た、供与染色体DNAを切断する制限酵素が用いるベクタ
ーを切断しない場合についても、合成リンカーを用いる
方法やホモポリマー結合法（Nelson,T.and Brutlag,D.,
Mathods in Enzymology,68,41,Academic Press,New Yor
k（1980））等を用いることによつて、実施することが
できる。
アルカリセルラーゼ遺伝子を発現させることができ、ま
た、組換えDNA分子が宿主菌中で複製可能であり、組み
込んだ当該遺伝子を安定に保持できるものであれば、如
何なるものも使用することができる。例えば、エシエリ
ヒア コリ（Eacherichia coli）Ｋ−12株を宿主とする
EK系やバチルス ズブチリス（Bacillus subtilis）Mar
burg株を宿主とするBM系が挙げられるが、好適には、遺
伝学的に最もよく研究されており、ベクターの種類が豊
富であるEK系を用いると良い結果が得られる。宿主菌株
の具体例として、EK系ではHB101株、C600株、JM109株
等、BM系ではBD170株、MI112株等が挙げられる。ベクタ
ーとしては、上記の記述に加えて、染色体DNAを切断し
た制限酵素によつて唯一ケ所で切断されるプラスミドベ
クターを用いれば染色体DNA断片との結合の際に便利で
ある。具体的には、染色体DNAをHind IIIで切断し、EK
系ではpBR32やpUC12、pUC18等のベクター、またBM系で
はpC194やpBD8等のベクターを用いることができる。ま
た、供与染色体DNAを切断する制限酵素が用いるベクタ
ーを切断しない場合についても、合成リンカーを用いる
方法やホモポリマー結合法（Nelson,T.and Brutlag,D.,
Mathods in Enzymology,68,41,Academic Press,New Yor
k（1980））等を用いることによつて、実施することが
できる。
上記の染色体DNA断片と制限酵素によつて切断したベ
クターDNA分子を結合させ、組換えDNA分子を作製する
が、結合の方法としては、例えば、DNAリガーゼを使用
する方法やホモポリマー結合法等を用いることができ
る。
クターDNA分子を結合させ、組換えDNA分子を作製する
が、結合の方法としては、例えば、DNAリガーゼを使用
する方法やホモポリマー結合法等を用いることができ
る。
組換えDNA分子による宿主菌株の形質転換の方法は特
に限定されないが、例えば、EK系宿主菌株の場合、塩化
カルシウム法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,
159,（1970））や塩化リビジウム法（Bolivar,F.and Ba
ckman,K.,Method in Enzymology,68,253,Academic Pres
s（1979））等、またBM系宿主菌株の場合には、コンプ
テント・セル法（Contente,S.and Dabuan,D、,Mol.Gen.
Genet.,177,459,（1979））やプロトプラスト法（Ghan
g,S.and Cohen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111,（197
8））等を用いることができる。組換え微生物の選択
は、先ずベクターDNA分子上にコードされている抗生物
質耐性等の物質のうち、外来染色体DNA断片の挿入によ
つて失活しない形質を指標として、ベクター由来のDNA
断片を含むDNA分子によつて形質転換されたものを一次
選択する。具体的には、例えばベクターとしてEK系のpB
R322を用い、このHind III切断部位に染色体DNAのHind
III断片を挿入した場合には、テトラサイクリン耐性遺
伝子が失活するので、遺伝子中にHind III切断部位を持
たないアンピシリン耐性を指標として一次選択を行えば
良い。
に限定されないが、例えば、EK系宿主菌株の場合、塩化
カルシウム法（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,
159,（1970））や塩化リビジウム法（Bolivar,F.and Ba
ckman,K.,Method in Enzymology,68,253,Academic Pres
s（1979））等、またBM系宿主菌株の場合には、コンプ
テント・セル法（Contente,S.and Dabuan,D、,Mol.Gen.
Genet.,177,459,（1979））やプロトプラスト法（Ghan
g,S.and Cohen,S.N.,Mol.Gen.Genet.,168,111,（197
8））等を用いることができる。組換え微生物の選択
は、先ずベクターDNA分子上にコードされている抗生物
質耐性等の物質のうち、外来染色体DNA断片の挿入によ
つて失活しない形質を指標として、ベクター由来のDNA
断片を含むDNA分子によつて形質転換されたものを一次
選択する。具体的には、例えばベクターとしてEK系のpB
R322を用い、このHind III切断部位に染色体DNAのHind
III断片を挿入した場合には、テトラサイクリン耐性遺
伝子が失活するので、遺伝子中にHind III切断部位を持
たないアンピシリン耐性を指標として一次選択を行えば
良い。
次にこれを２％のカルポキシメチルセルロース（CM
C）を含む適当な寒天培地にレプリカ法によつて移植し
て、培養を行い、コロニーが出現した後に、例えばコン
ゴー・レツド法（Teather,R.M.and Wood,P.J.,Appl.Env
iron.Microbiol.,43,777,（1982））等によつてコロニ
ー周辺のCMCを分解した菌株を目的の組換え微生物とし
て選択することができる。
C）を含む適当な寒天培地にレプリカ法によつて移植し
て、培養を行い、コロニーが出現した後に、例えばコン
ゴー・レツド法（Teather,R.M.and Wood,P.J.,Appl.Env
iron.Microbiol.,43,777,（1982））等によつてコロニ
ー周辺のCMCを分解した菌株を目的の組換え微生物とし
て選択することができる。
斯くして得られた組換え微生物が保持する組換えDNA
分子は通常のプラスミド調製法或いはフアージDNA調製
法（Maniatis,T.,Fritach E.F.,and Sambrook,J.,Molec
ular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,New Yor
k（1982）等）を用いて抽出し、各種制限酵素による切
断パターンを電気泳動法等によつて解析することによ
り、組換えDNA分子がベクターDNA分子とアルカリセルラ
ーゼ遺伝子を含むDNA断片が結合したものであることを
確認できる。
分子は通常のプラスミド調製法或いはフアージDNA調製
法（Maniatis,T.,Fritach E.F.,and Sambrook,J.,Molec
ular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,New Yor
k（1982）等）を用いて抽出し、各種制限酵素による切
断パターンを電気泳動法等によつて解析することによ
り、組換えDNA分子がベクターDNA分子とアルカリセルラ
ーゼ遺伝子を含むDNA断片が結合したものであることを
確認できる。
本発明に於けるアルカリセルラーゼ遺伝子は、第３図
に示した制限地図を有する約6.6KbのDNA断片に含まれて
おり、特にその中の太線で示した約3.5Kbの部分に存在
している。また、約6.6KbのDNA断片を構成しており、そ
の両端がHind III切断点である２つのDNA断片のうち、
一方の約4.0Kb断片中に当該遺伝子の活性必須領域が含
まれており、これは更に細線で示した約2.4Kbにまで切
り縮めることができる。これら約4.0Kb及び約2.4KbのDN
A断片は第４図及び第５図に示した制限地図を有してい
る。
に示した制限地図を有する約6.6KbのDNA断片に含まれて
おり、特にその中の太線で示した約3.5Kbの部分に存在
している。また、約6.6KbのDNA断片を構成しており、そ
の両端がHind III切断点である２つのDNA断片のうち、
一方の約4.0Kb断片中に当該遺伝子の活性必須領域が含
まれており、これは更に細線で示した約2.4Kbにまで切
り縮めることができる。これら約4.0Kb及び約2.4KbのDN
A断片は第４図及び第５図に示した制限地図を有してい
る。
次いで、アルカリセルラーゼ遺伝子を含む約3.5Kbの
部分のヌクレオチド配列をM13フアージベクター（Messi
ng,J.,Methods in Enzymol.,101,20,（1983））を用い
たサンガー法（Sanger,F.,Nicklen,S.and Coulson,A.
B.,Puoc.Natl.Acad.Sei.USA,74,5463,（1977））によつ
て決定したところ、第６図に示した配列を有することが
明らかとなつた。本配列は第３図に示した約3.5Kb部分
の右側から左側に向けての配列を５′から３′の方向に
示したものであり、またヌクレオチド番号１番から７番
までの配列はサブクローニングの際に用いた合成リンカ
ー（フアルマシア社製）由来のものである。従つて、こ
れを除いた3498bのヌクレオチド配列がKSM−635株の染
色体DNA由来のものであるが、本配列中にヌクレオチド
番号612番のATGから翻訳を開始し、第２図に記載のアミ
ノ酸941残基の配列をコードするオープン・レーデイン
グ・フレームが認められた。オープン・リーデイング・
フレームの5b（ベース）上流に枯草菌（Bacillus subti
lis）の16SリポゾームRMAの３′未満の配列（McLaughli
n,J.R.,Murray,C.L.and Rabinowitz,J.C.,J.Biol.Che
m.,256,11283,（1981））と相補性が高いGGGAGG配列が
存在し、更に上流には、制限酵素Sap Iによる切断点近
傍に643型プロモーターの共通配列（Gitt,M.,Wang,J.F.
and Doi,R.H.,J.Bio1,Chem.,260,7178,（1985）等）と
相同性の高いTAGACG−−17b−−TATTAT配列が認められ
た。また、ヌクレオチド番号3435番の翻訳終止コドンTA
Aの下流には転写ターミネーター思われるインバーテイ
ツド・リピート配列（第６図中 の箇所）が存在した。
部分のヌクレオチド配列をM13フアージベクター（Messi
ng,J.,Methods in Enzymol.,101,20,（1983））を用い
たサンガー法（Sanger,F.,Nicklen,S.and Coulson,A.
B.,Puoc.Natl.Acad.Sei.USA,74,5463,（1977））によつ
て決定したところ、第６図に示した配列を有することが
明らかとなつた。本配列は第３図に示した約3.5Kb部分
の右側から左側に向けての配列を５′から３′の方向に
示したものであり、またヌクレオチド番号１番から７番
までの配列はサブクローニングの際に用いた合成リンカ
ー（フアルマシア社製）由来のものである。従つて、こ
れを除いた3498bのヌクレオチド配列がKSM−635株の染
色体DNA由来のものであるが、本配列中にヌクレオチド
番号612番のATGから翻訳を開始し、第２図に記載のアミ
ノ酸941残基の配列をコードするオープン・レーデイン
グ・フレームが認められた。オープン・リーデイング・
フレームの5b（ベース）上流に枯草菌（Bacillus subti
lis）の16SリポゾームRMAの３′未満の配列（McLaughli
n,J.R.,Murray,C.L.and Rabinowitz,J.C.,J.Biol.Che
m.,256,11283,（1981））と相補性が高いGGGAGG配列が
存在し、更に上流には、制限酵素Sap Iによる切断点近
傍に643型プロモーターの共通配列（Gitt,M.,Wang,J.F.
and Doi,R.H.,J.Bio1,Chem.,260,7178,（1985）等）と
相同性の高いTAGACG−−17b−−TATTAT配列が認められ
た。また、ヌクレオチド番号3435番の翻訳終止コドンTA
Aの下流には転写ターミネーター思われるインバーテイ
ツド・リピート配列（第６図中 の箇所）が存在した。
本発明のアルカリセルラーゼ遺伝子をこれまでにDNA
配列及びコードするセルラーゼのアミノ酸配列が決定さ
れた細菌由来のセルラーゼ遺伝子と比較したところ、本
遺伝子は独自のDNA配列を有しており、且つコードされ
るアミノ酸の配列も上記のセルラーゼのものとは異なつ
ており新規なものであつた。
配列及びコードするセルラーゼのアミノ酸配列が決定さ
れた細菌由来のセルラーゼ遺伝子と比較したところ、本
遺伝子は独自のDNA配列を有しており、且つコードされ
るアミノ酸の配列も上記のセルラーゼのものとは異なつ
ており新規なものであつた。
アルカリセルラーゼ遺伝子の全領域を含む組換えDNA
分子の好適な例として、プラスミドpBC100（第７図）等
が挙げられる。本プラスミドはベクタープラスミドpBR3
22のHind III切断部位にKSM−635株由来であり、第３図
に示した約6.6KbのDNA断片を挿入したものである。尚、
KSM−635株の染色体DNA上において、この約6.6KbのDNA
断片を構成する２つのHind III断片が隣接して存在する
ことは、２つのHind III断片をプローブとしたサザン・
ハイブリダイゼーシヨン法を用いて確認されている。ま
た、当該遺伝子の活性必須領域を含む組換えDNA分子の
好適な例としては、組換えプラスミドpBC101、pBC102、
pBC111、及びpBC112、等が挙げられる。これらのプラス
ミドはいずれもベクタープラスミドpBR322のHind III切
断部位にKSM−635株由来のDNA断片を挿入したものであ
り、それぞれの挿入DNA断片はpBC10及びpBC102の場合は
第４図に示した約4.0Kbの、また、pBC111及びpBC112で
は第５図に示した約2.5KbのDNA断片である。約2.4KbのD
NA断片の場合、それらの一端にはHind III切断部位が存
在しない為、ベクタープラスミドと結合の際に合成Hind
IIIリンカーを付与した。第８図、第９図、第10図及び
第11図にそれぞれ示した様に、pBC101とpBC102及びpBC1
1とpBC112ではそれぞれベクタープラスミドpBR322に対
する挿入DNA断片の方向が逆向きである。いずれの場合
も、宿主菌株中で当該遺伝子を発現させることができ
る。
分子の好適な例として、プラスミドpBC100（第７図）等
が挙げられる。本プラスミドはベクタープラスミドpBR3
22のHind III切断部位にKSM−635株由来であり、第３図
に示した約6.6KbのDNA断片を挿入したものである。尚、
KSM−635株の染色体DNA上において、この約6.6KbのDNA
断片を構成する２つのHind III断片が隣接して存在する
ことは、２つのHind III断片をプローブとしたサザン・
ハイブリダイゼーシヨン法を用いて確認されている。ま
た、当該遺伝子の活性必須領域を含む組換えDNA分子の
好適な例としては、組換えプラスミドpBC101、pBC102、
pBC111、及びpBC112、等が挙げられる。これらのプラス
ミドはいずれもベクタープラスミドpBR322のHind III切
断部位にKSM−635株由来のDNA断片を挿入したものであ
り、それぞれの挿入DNA断片はpBC10及びpBC102の場合は
第４図に示した約4.0Kbの、また、pBC111及びpBC112で
は第５図に示した約2.5KbのDNA断片である。約2.4KbのD
NA断片の場合、それらの一端にはHind III切断部位が存
在しない為、ベクタープラスミドと結合の際に合成Hind
IIIリンカーを付与した。第８図、第９図、第10図及び
第11図にそれぞれ示した様に、pBC101とpBC102及びpBC1
1とpBC112ではそれぞれベクタープラスミドpBR322に対
する挿入DNA断片の方向が逆向きである。いずれの場合
も、宿主菌株中で当該遺伝子を発現させることができ
る。
組換えDNA分子を含有する組換え微生物の好適な例と
しては、エシエリヒア コリHB101（pBC100）、HB101
（pBC101）、HB101（pBC102）、HB101（pBC111）、及び
HB101（pBC112）の各株当が挙げられる。これらの菌株
はエシエリヒア コリHB101株に上述の組換えプラスミ
ドを通常の形質転換法を用いて挿入したものであり、エ
シエリヒア属細菌の培養に通常用いられる培地で培養す
ることにより菌体内にアルカリセルラーゼを生産する。
生産された当該酵素の最適反応pHは９〜10であり、遺伝
子の供与菌株であるバチルス エスピ−KSM−635（FERM
P−8872）が生産さるアルカリセルラーゼＫの値と良く
一致し、加えて、両者の生産する当該酵素の免疫学的同
一性が免疫拡散試験によつて確認された。
しては、エシエリヒア コリHB101（pBC100）、HB101
（pBC101）、HB101（pBC102）、HB101（pBC111）、及び
HB101（pBC112）の各株当が挙げられる。これらの菌株
はエシエリヒア コリHB101株に上述の組換えプラスミ
ドを通常の形質転換法を用いて挿入したものであり、エ
シエリヒア属細菌の培養に通常用いられる培地で培養す
ることにより菌体内にアルカリセルラーゼを生産する。
生産された当該酵素の最適反応pHは９〜10であり、遺伝
子の供与菌株であるバチルス エスピ−KSM−635（FERM
P−8872）が生産さるアルカリセルラーゼＫの値と良く
一致し、加えて、両者の生産する当該酵素の免疫学的同
一性が免疫拡散試験によつて確認された。
上記の組換えプラスミドからアルカリセルラーゼ遺伝
子の全領域或いは活性必須領域を含むDNA断片を単離す
る方法としては、組換えプラスミドを制限酵素Hind III
によつて部分的に或いは完全に切断した後、アガロース
ゲル電気泳動法によつて、DNA断片を分離し、ゲルより
抽出・精製することによつて実施できる。ゲルからDNA
断片を抽出・精製する方法としては、電気溶出法（McDo
nnell,M.W.,Simon,M.N.and Studier,F.W.,J.Mol.Biol.,
110,119,（1977）や低融点アガロースゲルを用いる方法
（Weislander,L.,Anal.Bioshem.,98,305,（1979））な
どが挙げられる。
子の全領域或いは活性必須領域を含むDNA断片を単離す
る方法としては、組換えプラスミドを制限酵素Hind III
によつて部分的に或いは完全に切断した後、アガロース
ゲル電気泳動法によつて、DNA断片を分離し、ゲルより
抽出・精製することによつて実施できる。ゲルからDNA
断片を抽出・精製する方法としては、電気溶出法（McDo
nnell,M.W.,Simon,M.N.and Studier,F.W.,J.Mol.Biol.,
110,119,（1977）や低融点アガロースゲルを用いる方法
（Weislander,L.,Anal.Bioshem.,98,305,（1979））な
どが挙げられる。
以下、実施例で具体的に本発明を説明する。なお、ア
ルカリセルラーゼ（CMCアーゼ）活性は以下の様に測定
した。即ち、CMC（2.5％）0.2ml、0.5Mグリシン緩衝液
（pH9.0）0.1ml及び脱イオン水0.1mlからなる基質溶液
に酵素液0.1mlを加え、40℃反応した後、生成した還元
糖を3.5−ジニトロサリチル酸（3.5−dinitro salicyli
c acid（DNS））法（Summer,J.R.and Somers,G.F.,Labo
ratory Experiments in Biological Chemistry,Academi
c Press,New York,pp.34,（1944））によつて定量し
た。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのグ
ルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と
した。また、蛋白定量はパイオ・ラド プロテイン ア
ツセイ キツト（バイオ・ラド社製）を用いて行い、牛
血漿アルブミンを標準蛋白として算出した。
ルカリセルラーゼ（CMCアーゼ）活性は以下の様に測定
した。即ち、CMC（2.5％）0.2ml、0.5Mグリシン緩衝液
（pH9.0）0.1ml及び脱イオン水0.1mlからなる基質溶液
に酵素液0.1mlを加え、40℃反応した後、生成した還元
糖を3.5−ジニトロサリチル酸（3.5−dinitro salicyli
c acid（DNS））法（Summer,J.R.and Somers,G.F.,Labo
ratory Experiments in Biological Chemistry,Academi
c Press,New York,pp.34,（1944））によつて定量し
た。酵素力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのグ
ルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位と
した。また、蛋白定量はパイオ・ラド プロテイン ア
ツセイ キツト（バイオ・ラド社製）を用いて行い、牛
血漿アルブミンを標準蛋白として算出した。
実施例１ アルカリセルラーゼＫを生産するアルカリ性バチルス
エスピー KSM−635（FERM BP−1485）を、5mlのMYG
培地（肉エキス（ラブ・レムコパウダー オキソイド社
製）1.0％、酵母エキス（デイフコ社製）0.5％、NeCl1.
0％、KH2PO40.1％、Na2CO21.0％（別減菌））に接種
し、30℃で２日間振盪培養を行つた後、これを500mlの
同培地に接種し、更に30時間30℃で振盪培養した。この
後、遠心分離によつて菌体を集め、斉藤と三浦の方法
（Saito,H.and Miura,K.I.,Biochim.Biophys.Acta,72,6
19,（1963））に従つて約300μｇの精製染色体DNAを得
た。
エスピー KSM−635（FERM BP−1485）を、5mlのMYG
培地（肉エキス（ラブ・レムコパウダー オキソイド社
製）1.0％、酵母エキス（デイフコ社製）0.5％、NeCl1.
0％、KH2PO40.1％、Na2CO21.0％（別減菌））に接種
し、30℃で２日間振盪培養を行つた後、これを500mlの
同培地に接種し、更に30時間30℃で振盪培養した。この
後、遠心分離によつて菌体を集め、斉藤と三浦の方法
（Saito,H.and Miura,K.I.,Biochim.Biophys.Acta,72,6
19,（1963））に従つて約300μｇの精製染色体DNAを得
た。
実施例２ 実施例１で得られた染色体DNA10μｇを制限酵素反応
液（10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl2、5
0mA NaCl、1mMジチオスレイトール）に溶解し、これに
制限酵素Hind III（ベーリンガー マンハイム社製）10
単位を加えて37℃で２時間インキユベーシヨンし、染色
体DNの切断を行つた。フエノール処理によつて制限酵素
を除去したのち、同じくHind IIIで切断したベクタープ
ラスミドpBR322（ベーリンガー マンハイム社製）１μ
ｇを加え、エタノール沈澱を行つた。得られたDNAの沈
澱をリガーゼ反応液（20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP）
50μに溶解した。これにT4DNAリガーゼ（ベーリンダ
ー マンハイム社製）２単位を加え、16℃で12時間反応
を行い、染色体DNA断片とベクタープラスミドを結合さ
せて組換えプラスミドを作製した。
液（10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl2、5
0mA NaCl、1mMジチオスレイトール）に溶解し、これに
制限酵素Hind III（ベーリンガー マンハイム社製）10
単位を加えて37℃で２時間インキユベーシヨンし、染色
体DNの切断を行つた。フエノール処理によつて制限酵素
を除去したのち、同じくHind IIIで切断したベクタープ
ラスミドpBR322（ベーリンガー マンハイム社製）１μ
ｇを加え、エタノール沈澱を行つた。得られたDNAの沈
澱をリガーゼ反応液（20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP）
50μに溶解した。これにT4DNAリガーゼ（ベーリンダ
ー マンハイム社製）２単位を加え、16℃で12時間反応
を行い、染色体DNA断片とベクタープラスミドを結合さ
せて組換えプラスミドを作製した。
実施例３ 実施例２で作製した組換えプラスミドによる大腸菌の
形質転換は塩化カルシウム法（Mandel,M.and Higa,A.,
J.Mol.Biol.,53,159,（1970））に従つて行つた。宿主
菌株としては大腸菌（Escheriohia coli）HB101株（le
n,pro,thi,lacy,ara14,galK2,xy15,mtl1,strA,recA,sup
E44,hsdR,hsdM,endI）を用いた。形質転換処理を行つた
菌懸濁液をアンピシリン（ナトリウム塩、シグマ社製）
50μg/mlを含むLB寒天培地（トリプトン（デイフコ社
製）1.0％、酵母エキス（デイフコ社製）0.5％、NaCl1.
0％、バクト寒天（デイフコ社製）1.5％）に塗抹し37℃
で24時間培養した。出現した約10000個の形質転換体の
コロニーをアンピシリン50μg/mlとCMC2％を含むLB寒天
培地にレプリカ法によつて移植し、更に37℃で48時間培
養した。培養液、集落周辺のCMCを分解する菌株をコン
ゴー・レツド法（Teather,R.M.and Wood,P.J.,Appl.Env
iron.Microbiol.,43,777,（1982））を用いて選択し、
目的の組換え微生物を８株分離した。
形質転換は塩化カルシウム法（Mandel,M.and Higa,A.,
J.Mol.Biol.,53,159,（1970））に従つて行つた。宿主
菌株としては大腸菌（Escheriohia coli）HB101株（le
n,pro,thi,lacy,ara14,galK2,xy15,mtl1,strA,recA,sup
E44,hsdR,hsdM,endI）を用いた。形質転換処理を行つた
菌懸濁液をアンピシリン（ナトリウム塩、シグマ社製）
50μg/mlを含むLB寒天培地（トリプトン（デイフコ社
製）1.0％、酵母エキス（デイフコ社製）0.5％、NaCl1.
0％、バクト寒天（デイフコ社製）1.5％）に塗抹し37℃
で24時間培養した。出現した約10000個の形質転換体の
コロニーをアンピシリン50μg/mlとCMC2％を含むLB寒天
培地にレプリカ法によつて移植し、更に37℃で48時間培
養した。培養液、集落周辺のCMCを分解する菌株をコン
ゴー・レツド法（Teather,R.M.and Wood,P.J.,Appl.Env
iron.Microbiol.,43,777,（1982））を用いて選択し、
目的の組換え微生物を８株分離した。
実施例４ 実施例３で得られた８株の組換え微生物を、アンピシ
リン（50μg/ml）を含む10mlのLB培地（トリプトン（デ
イフコ社製）1.0％、酵母エキス（デイフコ社製）0.5
％、NaCl1.0％）にそれぞれ接種し、37℃で一夜静置培
養した後、これを500mlのM9CA培地（Na2HPO40.6％、KH2
PO40.3％、NaCl0.05％、NH4Cl0.1％、カザミノ酸（デイ
フコ社製）0.2％、MgCO42mM（別滅菌）、CaCl20.1mM
（別滅菌）、グルコース0.2％（別滅菌）、アンピシリ
ン50μg/ml（除菌））に移植し、37℃で４〜５時間盪培
養した。これにクロラムフエニコール170mgを添加し、
更に37℃で15時間振盪培養した。この培養液より遠心分
離によつて菌体を集め、アルカリ溶菌法（Birnboin,H.
C.and Doly,J.,Nucleic Acids Res.,7,1513,（1979））
とセシウム クロライド−エチジウム ブロマイド（ce
sium chloride−ethidium bromide）密度勾配遠心法（R
adloff,R.,Bauer,W.and Vinograd,J.,Proc.Natl.Acad.S
ci.,57,1514,（1967））を組み合わせた方法（Maniati
s,T.,Fritsch,E.F.,and Sambrook,J.,Molecular Clonin
g,Cold Spring Harbor Laboratory New York（1982））
に従つて、組換えプラスミドを調製した。得られた８種
の組換えプラスミドについえ常法（Maniatis,T.,Fritsc
h,E.F.,and Sambrook,J.,Molecular Cloning,Cold Spri
ng Hardor Laboratory New York（1982））に従つて、
制限酵素切断地図を作製したところ、いずれのプラスミ
ドにも第３図に示した約4.0KbのHind III断片が含まれ
ていることが明らかになつた。これらのうち、２つのプ
ラスミドがこの約4.0KbのNDA断片のみがベクタープラス
ミドpBR322と結合したものであり、第８図、及び第９図
に示した様に、両者でベクタープラスミドに対する挿入
方向が逆向きとなつていた。得られた組換えプラスミド
をそれぞれpBC101及びpBC102と命名した。また、pBC101
或いはpBC102によつて形質転換されたエシエリヒア コ
リ HB101株をHB101（pBC101）或いはHB101（pBC102）
と命名した。更に、別の１つのプラスミドは第７図に示
したように、約4.0Kbの断片の他に約2.6KbのHind IIIが
含まれており、これをpBC100と命名し、また、pBC100に
よつて形質転換されたHB101株をHB101（pBC100）と命名
した。
リン（50μg/ml）を含む10mlのLB培地（トリプトン（デ
イフコ社製）1.0％、酵母エキス（デイフコ社製）0.5
％、NaCl1.0％）にそれぞれ接種し、37℃で一夜静置培
養した後、これを500mlのM9CA培地（Na2HPO40.6％、KH2
PO40.3％、NaCl0.05％、NH4Cl0.1％、カザミノ酸（デイ
フコ社製）0.2％、MgCO42mM（別滅菌）、CaCl20.1mM
（別滅菌）、グルコース0.2％（別滅菌）、アンピシリ
ン50μg/ml（除菌））に移植し、37℃で４〜５時間盪培
養した。これにクロラムフエニコール170mgを添加し、
更に37℃で15時間振盪培養した。この培養液より遠心分
離によつて菌体を集め、アルカリ溶菌法（Birnboin,H.
C.and Doly,J.,Nucleic Acids Res.,7,1513,（1979））
とセシウム クロライド−エチジウム ブロマイド（ce
sium chloride−ethidium bromide）密度勾配遠心法（R
adloff,R.,Bauer,W.and Vinograd,J.,Proc.Natl.Acad.S
ci.,57,1514,（1967））を組み合わせた方法（Maniati
s,T.,Fritsch,E.F.,and Sambrook,J.,Molecular Clonin
g,Cold Spring Harbor Laboratory New York（1982））
に従つて、組換えプラスミドを調製した。得られた８種
の組換えプラスミドについえ常法（Maniatis,T.,Fritsc
h,E.F.,and Sambrook,J.,Molecular Cloning,Cold Spri
ng Hardor Laboratory New York（1982））に従つて、
制限酵素切断地図を作製したところ、いずれのプラスミ
ドにも第３図に示した約4.0KbのHind III断片が含まれ
ていることが明らかになつた。これらのうち、２つのプ
ラスミドがこの約4.0KbのNDA断片のみがベクタープラス
ミドpBR322と結合したものであり、第８図、及び第９図
に示した様に、両者でベクタープラスミドに対する挿入
方向が逆向きとなつていた。得られた組換えプラスミド
をそれぞれpBC101及びpBC102と命名した。また、pBC101
或いはpBC102によつて形質転換されたエシエリヒア コ
リ HB101株をHB101（pBC101）或いはHB101（pBC102）
と命名した。更に、別の１つのプラスミドは第７図に示
したように、約4.0Kbの断片の他に約2.6KbのHind IIIが
含まれており、これをpBC100と命名し、また、pBC100に
よつて形質転換されたHB101株をHB101（pBC100）と命名
した。
実施例５ 組換えプラスミドpBC1011μｇを50μの10mM MgCl2
と1mMジチオスレイトールを含む10mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）に溶解し、これに制限酵素Kpn I2単位を加え
て37℃で２時間反応させ、pBC101を直鎖状とした。フエ
ノール処理によつてKpn Iを除去し、エタノール沈澱を
行つた後、沈澱を10mM MgCl2と0.1mMジチオスレイトー
ルを含む50mMトリス塩酸緩衝液50μに溶解した。これ
に1.25単位のヌクレアーゼBal31を加えて22℃で15分間
反応後、フエノール処理によつて反応を停止し、更にエ
タノール沈澱を行つた。沈澱を50mM NaCl、10mM MgCl2
及び1mMジチオスレイトールを含む0mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）に溶解し、制限酵素Hind III単位を加えて、3
7℃で２時間反応した後、アグロースゲル電気泳動を行
い、ゲルから電気溶出法（McDonnell,M.W.,Simon,M.N.a
nd Studier,F.W.,J.Mol.Biol.,110,119,（1977））によ
つて第５図に示した約24KbのDNA断片を単離した。このD
NA断片0.2μｇ、Hind IIIによつて切断したpBR322 0.2
μｇ及び合成Hind IIIリンカー0.02OD260単位をリガー
ゼ反応液（20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM Mg
Cl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP）20μに溶解
した。これにT4DNAリガーゼ（ベーリガー マンハイム
社製）２単位を加え、16℃で12時間の結合反応を行つた
後、実施例３の方法によつて大腸菌HB101株の形質転換
を行い、得られた形質転換株のアルカリセルラーゼ生産
製の有無を調べた。また、形質転換株から、実施例４と
同様の方法を用いてブラスミドを抽出し、目的のDNA断
片がベクタープラスミドpBR322に挿入されていることを
確認した。この結果、第５図に示した約2.4KbのDNA断片
とベクタープラスミドを結合した組換えプラスミドを有
する組換え微生物は挿入DNA断片の挿入方向に関わら
ず、セルラーゼの生産性が認められた。約2.KbのDNA断
片に合成Hind IIIリンカーを付与した後、ベクタープラ
スミドpBR322のHind III切断部位に挿入した組換えプラ
スミドをpBC111及びpBC112と命名した（第10図及び第11
図）。また、それぞれの組換えプラスミドによつて形質
転換されたエシエリヒア コリ HB101株をHB101（pBC1
11）及びHB101（pBC112）とそれぞれ命名した。
と1mMジチオスレイトールを含む10mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）に溶解し、これに制限酵素Kpn I2単位を加え
て37℃で２時間反応させ、pBC101を直鎖状とした。フエ
ノール処理によつてKpn Iを除去し、エタノール沈澱を
行つた後、沈澱を10mM MgCl2と0.1mMジチオスレイトー
ルを含む50mMトリス塩酸緩衝液50μに溶解した。これ
に1.25単位のヌクレアーゼBal31を加えて22℃で15分間
反応後、フエノール処理によつて反応を停止し、更にエ
タノール沈澱を行つた。沈澱を50mM NaCl、10mM MgCl2
及び1mMジチオスレイトールを含む0mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）に溶解し、制限酵素Hind III単位を加えて、3
7℃で２時間反応した後、アグロースゲル電気泳動を行
い、ゲルから電気溶出法（McDonnell,M.W.,Simon,M.N.a
nd Studier,F.W.,J.Mol.Biol.,110,119,（1977））によ
つて第５図に示した約24KbのDNA断片を単離した。このD
NA断片0.2μｇ、Hind IIIによつて切断したpBR322 0.2
μｇ及び合成Hind IIIリンカー0.02OD260単位をリガー
ゼ反応液（20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM Mg
Cl2、10mMジチオスレイトール、1mM ATP）20μに溶解
した。これにT4DNAリガーゼ（ベーリガー マンハイム
社製）２単位を加え、16℃で12時間の結合反応を行つた
後、実施例３の方法によつて大腸菌HB101株の形質転換
を行い、得られた形質転換株のアルカリセルラーゼ生産
製の有無を調べた。また、形質転換株から、実施例４と
同様の方法を用いてブラスミドを抽出し、目的のDNA断
片がベクタープラスミドpBR322に挿入されていることを
確認した。この結果、第５図に示した約2.4KbのDNA断片
とベクタープラスミドを結合した組換えプラスミドを有
する組換え微生物は挿入DNA断片の挿入方向に関わら
ず、セルラーゼの生産性が認められた。約2.KbのDNA断
片に合成Hind IIIリンカーを付与した後、ベクタープラ
スミドpBR322のHind III切断部位に挿入した組換えプラ
スミドをpBC111及びpBC112と命名した（第10図及び第11
図）。また、それぞれの組換えプラスミドによつて形質
転換されたエシエリヒア コリ HB101株をHB101（pBC1
11）及びHB101（pBC112）とそれぞれ命名した。
実施例６ 10mlのLB培地で一晩静置培養したHB101（pBC100）及
びHB101（pBC102）各株の培養液1mlを100mlのLB培地
（アンビシリン50μg/mlを含む）に接種し、37℃で24時
間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離し、沈澱し
た菌体を10mlのリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁後、超音
波破砕を行つた。再度、遠心分離によつて不溶物を沈澱
として取り除き、得られた上清液のCMCアーゼ活性の作
用pH範囲及び最適作用pHを求めたところ（第12図）、本
酵素はpH4〜12の広い範囲で作用し、pH9〜10に最適作用
pHを有することが明らかとなり、アルカリセルラーゼ遺
伝子の供与体であるバチルス エスピーKSM−635（FERM
BP−1485）株が生産するアルカリセルラーゼＫの性質
と良く一致した。
びHB101（pBC102）各株の培養液1mlを100mlのLB培地
（アンビシリン50μg/mlを含む）に接種し、37℃で24時
間振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離し、沈澱し
た菌体を10mlのリン酸緩衝液（pH7.0）に懸濁後、超音
波破砕を行つた。再度、遠心分離によつて不溶物を沈澱
として取り除き、得られた上清液のCMCアーゼ活性の作
用pH範囲及び最適作用pHを求めたところ（第12図）、本
酵素はpH4〜12の広い範囲で作用し、pH9〜10に最適作用
pHを有することが明らかとなり、アルカリセルラーゼ遺
伝子の供与体であるバチルス エスピーKSM−635（FERM
BP−1485）株が生産するアルカリセルラーゼＫの性質
と良く一致した。
また、二重免疫拡散法（Ouchterlony,O.,Hendbook of
Experimental Immunology,Blackwell Sci.Publ.,Oxfor
d,（1967））によつてHB101（pBC100）株のアルカリセ
ルラーゼはKSM−635の培養液から精製されたCMCアーゼ
Ｉの抗血清（参考例参照）の間に沈降線を形成し、且つ
CMCアーゼ１による沈降線と完全に融合し、両酵素の免
疫学的同一性が示された（第13図）。
Experimental Immunology,Blackwell Sci.Publ.,Oxfor
d,（1967））によつてHB101（pBC100）株のアルカリセ
ルラーゼはKSM−635の培養液から精製されたCMCアーゼ
Ｉの抗血清（参考例参照）の間に沈降線を形成し、且つ
CMCアーゼ１による沈降線と完全に融合し、両酵素の免
疫学的同一性が示された（第13図）。
実施例７ 約５μｇのpBC100を制限酵素Hind IIIによつて切断
後、アガロースゲル電気及動を行い、実施例５と同様に
して約2.6Kb及び約4.0Kbの２つのHind III断片約0.5μ
ｇをそれぞれぞれ単離した。この２つのHind III断片を
〔α−32P〕dCTR（アマシャム社製）及びニツクトラン
スレーシヨンキツト（宝酒造社製）を用いてニツクトラ
ンセレーシヨン法（Rigby,P.W.J.,Dieckmanm,M.and Ber
g,P.,J.Mol.Biol.,113,237,（1977））によるラベル化
を行い、約2.0×108cpm/μｇのプローブDNAを調製し
た。一方、Xba I、及びPvu IIによつてそれぞれ単独に
切断したプラスミドpBC100（各0.5μｇ）及びKSM−635
株由来の染色体DNA（各３μｇ）をアガロースゲル電気
泳動後、DNAバンドをサザンの方法（Southern,E.M.,J.M
ol.Biol.,98,503,（1975））によつてゼータ・プローブ
膜（バイオ・ラド社製）に移し、前述のプローブDNAと
のハイブリダイゼーシヨンを行つた。
後、アガロースゲル電気及動を行い、実施例５と同様に
して約2.6Kb及び約4.0Kbの２つのHind III断片約0.5μ
ｇをそれぞれぞれ単離した。この２つのHind III断片を
〔α−32P〕dCTR（アマシャム社製）及びニツクトラン
スレーシヨンキツト（宝酒造社製）を用いてニツクトラ
ンセレーシヨン法（Rigby,P.W.J.,Dieckmanm,M.and Ber
g,P.,J.Mol.Biol.,113,237,（1977））によるラベル化
を行い、約2.0×108cpm/μｇのプローブDNAを調製し
た。一方、Xba I、及びPvu IIによつてそれぞれ単独に
切断したプラスミドpBC100（各0.5μｇ）及びKSM−635
株由来の染色体DNA（各３μｇ）をアガロースゲル電気
泳動後、DNAバンドをサザンの方法（Southern,E.M.,J.M
ol.Biol.,98,503,（1975））によつてゼータ・プローブ
膜（バイオ・ラド社製）に移し、前述のプローブDNAと
のハイブリダイゼーシヨンを行つた。
この結果、第14図に示したように、KSM−635株由来の
染色体DNAのXba I切断物及びPvu II切断後には約2.6Kb
と約4.0Kbの２つのプローブDNAの両方とハイブリダイズ
するそれぞれ約1.1Kb及び約0.7KbのDNA断片が存在する
ことが明らかとなつた。pBC100の挿入DNA断片においてX
ba I1.1Kb及びPvu II 0.7Kbは２つのHind III断片の接
点であるHind III切断部位を鋏む形で存在しており、更
に２つのHind III断片は互いにハイブリダイズしない。
以上のことから、pBC100の約6.6Kbの挿入DNA断片を構成
する２つのHind III断片はKSM−635株の染色体DNA上に
おいても隣接して存在することが明らかとなつた。
染色体DNAのXba I切断物及びPvu II切断後には約2.6Kb
と約4.0Kbの２つのプローブDNAの両方とハイブリダイズ
するそれぞれ約1.1Kb及び約0.7KbのDNA断片が存在する
ことが明らかとなつた。pBC100の挿入DNA断片においてX
ba I1.1Kb及びPvu II 0.7Kbは２つのHind III断片の接
点であるHind III切断部位を鋏む形で存在しており、更
に２つのHind III断片は互いにハイブリダイズしない。
以上のことから、pBC100の約6.6Kbの挿入DNA断片を構成
する２つのHind III断片はKSM−635株の染色体DNA上に
おいても隣接して存在することが明らかとなつた。
実施例８ 第３図において太線で示した約3.5Kbの部分のヌクレ
オチド配列をM13フアージベクター（Messing,J.,Method
s Enzymol.,10120,（1983））の１種mp18及びmp19（ベ
ーリンガー マンハイ社製）を用いたサイガーの方法
（Sanger F.,Nicklen,S.and Coulson,A.R.,Proc.Natl.A
cad.Sci.,U.S.A.,74,5463,（1977））によつて決定し
た。尚、M13フアージの宿主大腸菌としてはJM109株（re
cA1,ΔIac−pro,endA1,gyrA96,thi−1,hsdR17,relA1,
F′traD36,proAB+,lacIg gZΔM15）を用い、また、M13
シークエンスシングキツト（宝酒造社製）及び〔α−32
P〕dCTP（アマシヤム社製）を用いた。この結果、アル
カリセルラーゼ遺伝子はpBC100の挿入DNA断片を構成す
る２つのHind III断片の両方に跨がる様に存在し、第６
図に示したヌクレオチド配列を有することが明らかとな
つた。決定したヌクレオチド配列を解析すると、2823bp
から成り、第２図に示した941残基のアミノ酸配列をコ
ードしているオーブンリーデイングフレームが認められ
た。一方、プラスミドpBC101、pBC102、pBC111及びpBC1
12の場合、形質転換株のアルカリセルラーゼ生産性は認
められるものの、当該遺伝子の下流領域である約2.6Kb
のHind III断片を有していないことから、第４図及び第
５図に示した約4.0Kb及び約2.4KbのDNA断片は当該遺伝
子の粕製必須領域を含んでいることが明らかとなつと。
この活性必須領域は第１図記載の584残基のアミノ酸配
列をコードしていた。
オチド配列をM13フアージベクター（Messing,J.,Method
s Enzymol.,10120,（1983））の１種mp18及びmp19（ベ
ーリンガー マンハイ社製）を用いたサイガーの方法
（Sanger F.,Nicklen,S.and Coulson,A.R.,Proc.Natl.A
cad.Sci.,U.S.A.,74,5463,（1977））によつて決定し
た。尚、M13フアージの宿主大腸菌としてはJM109株（re
cA1,ΔIac−pro,endA1,gyrA96,thi−1,hsdR17,relA1,
F′traD36,proAB+,lacIg gZΔM15）を用い、また、M13
シークエンスシングキツト（宝酒造社製）及び〔α−32
P〕dCTP（アマシヤム社製）を用いた。この結果、アル
カリセルラーゼ遺伝子はpBC100の挿入DNA断片を構成す
る２つのHind III断片の両方に跨がる様に存在し、第６
図に示したヌクレオチド配列を有することが明らかとな
つた。決定したヌクレオチド配列を解析すると、2823bp
から成り、第２図に示した941残基のアミノ酸配列をコ
ードしているオーブンリーデイングフレームが認められ
た。一方、プラスミドpBC101、pBC102、pBC111及びpBC1
12の場合、形質転換株のアルカリセルラーゼ生産性は認
められるものの、当該遺伝子の下流領域である約2.6Kb
のHind III断片を有していないことから、第４図及び第
５図に示した約4.0Kb及び約2.4KbのDNA断片は当該遺伝
子の粕製必須領域を含んでいることが明らかとなつと。
この活性必須領域は第１図記載の584残基のアミノ酸配
列をコードしていた。
参考例１ 栃木県芳賀郡市貝町の土壌1gを滅菌生理食塩水10mlに
懸濁し、80℃で30分間熱処理した。この熱処理液を適当
に希釈してマスタープレート（肉エキス（オキソイド社
製）１％、バタトペプトン（デイフコ社製）１％、NaCl
1％、KH2PO40.1％、Na2CO30.5％（別滅菌）バクト寒天
1.5％）に塗抹し30℃で３日間培養し、集落を形成させ
た。レブリカ法により、マスタープレートと同じ組成の
培地に２％CMCを加えた滅菌寒天培地に移植し、30℃で
３〜４日間培養して集落を形成させた後、コンゴー・レ
ツド法によつて、集落周辺のCMCを分解する能力のある
菌株を検出した。当該する集落をマスタープレートによ
り選択し、CMCアーゼ生産菌を分離した。
懸濁し、80℃で30分間熱処理した。この熱処理液を適当
に希釈してマスタープレート（肉エキス（オキソイド社
製）１％、バタトペプトン（デイフコ社製）１％、NaCl
1％、KH2PO40.1％、Na2CO30.5％（別滅菌）バクト寒天
1.5％）に塗抹し30℃で３日間培養し、集落を形成させ
た。レブリカ法により、マスタープレートと同じ組成の
培地に２％CMCを加えた滅菌寒天培地に移植し、30℃で
３〜４日間培養して集落を形成させた後、コンゴー・レ
ツド法によつて、集落周辺のCMCを分解する能力のある
菌株を検出した。当該する集落をマスタープレートによ
り選択し、CMCアーゼ生産菌を分離した。
上述の手法により、バチルス エスビーKSM−635（FE
RM BP−1485）を取得した。
RM BP−1485）を取得した。
参考例２ バチルス エスビーKSM−635を1.5％肉エキス、0.5％
酵母エキス、１％CMC、0.1％KH2PO4、0.75％Na2CO2（別
滅菌）からなる液体培地中、34℃で２日間好気培養し
た。その培養上清液１に対して３の冷エタノール
（−10℃を徐々に加えて蛋白沈澱を生じさせ、得られる
沈澱物を最少量の滅菌脱イオン水に溶解し、希酢酸で中
和した後、流水に対して15時間透析し、凍結乾燥粉末と
してアルカリセルラーゼK9.6gを得た。
酵母エキス、１％CMC、0.1％KH2PO4、0.75％Na2CO2（別
滅菌）からなる液体培地中、34℃で２日間好気培養し
た。その培養上清液１に対して３の冷エタノール
（−10℃を徐々に加えて蛋白沈澱を生じさせ、得られる
沈澱物を最少量の滅菌脱イオン水に溶解し、希酢酸で中
和した後、流水に対して15時間透析し、凍結乾燥粉末と
してアルカリセルラーゼK9.6gを得た。
参考例３ KSM−635が培地中に生産したアルカリセルラーゼＫの
精製は以下の様に行つた。即ち、培養液から遠心分離に
よつて菌体を除いた上清液にストレプトマイシン処理、
硫安分面（30〜75％飽和沈澱画分）を行つた後、分取高
速液体クロマトグラフイー（SW3000Gカラム、東洋曹
達）DEAE−トヨパール（東洋曹達）クロマトグラフイ
ー、ビドロキシアパタイト（生化学工業）クロマトグラ
フイー、そして再度DEAE−トヨパールクロマトグラフイ
ーを行つた。２回目のDEAE−トヨパールクロマトグラフ
イーの際にNaClの直線濃度勾配（0.25M〜0.35M）よる溶
出を行うことによつて、２種のCMCアーゼ（CMCアーゼＩ
及びCMCアーゼII）に分画された。両酵素はデービスの
方法（Davis,D.J.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,121,404,（196
4））に従つて電気泳動を行い、コマシー プリリアン
ト ブルーで染色したところ、単一のバンドを与えた。
精製は以下の様に行つた。即ち、培養液から遠心分離に
よつて菌体を除いた上清液にストレプトマイシン処理、
硫安分面（30〜75％飽和沈澱画分）を行つた後、分取高
速液体クロマトグラフイー（SW3000Gカラム、東洋曹
達）DEAE−トヨパール（東洋曹達）クロマトグラフイ
ー、ビドロキシアパタイト（生化学工業）クロマトグラ
フイー、そして再度DEAE−トヨパールクロマトグラフイ
ーを行つた。２回目のDEAE−トヨパールクロマトグラフ
イーの際にNaClの直線濃度勾配（0.25M〜0.35M）よる溶
出を行うことによつて、２種のCMCアーゼ（CMCアーゼＩ
及びCMCアーゼII）に分画された。両酵素はデービスの
方法（Davis,D.J.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,121,404,（196
4））に従つて電気泳動を行い、コマシー プリリアン
ト ブルーで染色したところ、単一のバンドを与えた。
CMCアーゼＩの抗血清は常法に従つて上記の精製CMCア
ーゼＩをウサギに注射（１回当たり1mg）することによ
つて調製した。
ーゼＩをウサギに注射（１回当たり1mg）することによ
つて調製した。
（アルカリセルラーゼＫの物理化学的性質） 本発明に於けるアルカリセルラーゼ遺伝子の供与体で
あるBacillus sp.KSM−635が生産するアルカリセルラー
ゼＫの物理化学的性質は次の通りである。
あるBacillus sp.KSM−635が生産するアルカリセルラー
ゼＫの物理化学的性質は次の通りである。
（１） 作用 カルボキシメチルセルロース水解活性（CX酵素活性）
を有するほか、弱いC1酵素活性、β−グルコシダーゼ活
性を有する。
を有するほか、弱いC1酵素活性、β−グルコシダーゼ活
性を有する。
（２） 基質特異性 カルボキシメチルセルロース、結晶性セルロース、ア
ビセル、セロビオース及びｐ−ニトロフエニルセロビオ
シドに対して作用する。
ビセル、セロビオース及びｐ−ニトロフエニルセロビオ
シドに対して作用する。
（３） 作用pH範囲及び最適作用pH 作用pH範囲は５〜12、最適作用pHは９〜10である。
（４） 安定pH範囲 ５℃で16時間放置した時の安定pH範囲は、6.0〜11.0
である。
である。
（５） 作用温度範囲及び最適作用温度 15〜60℃の広い範囲で作用するが、最適用温度は約40
℃に認められる。
℃に認められる。
（６） キレート剤の影響 EDTA、EGTA、NTA、STPP及びゼオライトは活性を阻害
しない。
しない。
（７） 界面活性剤の影響 線状アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（LA
S）、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（AS）、ポリ
オキシエチレンアルキル硫酸（ES）、α−オレフインス
ルホン酸ナトリウム（AUS）、α−スルホン化脂肪酸エ
ステルナトリウム塩（α−SEF）、アルキルスルホン酸
ナトリウム（SAS）、ポリオキシエチレンセカンダリー
アルキルエーテル、脂肪酸塩（ナトリウム塩）及びジメ
チルジアルキルアンモニウムクロライド等の界面活性剤
によつて殆ど活性阻害は受けない。
S）、アルキル硫酸エステルナトリウム塩（AS）、ポリ
オキシエチレンアルキル硫酸（ES）、α−オレフインス
ルホン酸ナトリウム（AUS）、α−スルホン化脂肪酸エ
ステルナトリウム塩（α−SEF）、アルキルスルホン酸
ナトリウム（SAS）、ポリオキシエチレンセカンダリー
アルキルエーテル、脂肪酸塩（ナトリウム塩）及びジメ
チルジアルキルアンモニウムクロライド等の界面活性剤
によつて殆ど活性阻害は受けない。
（８） プロテアーゼの影響 プロテアーゼに対し、強い耐性を有する。
第１図及び第２図はアルカリセルラーゼのアミノ酸配列
を示す図面である。 第３図はアルカリセルラーゼ遺伝子を含む約6.6KbのDNA
断片の制限地図である。太線部分にアルカリセルラーゼ
遺伝子の全領域、また細線部分に活性必須領域が含まれ
る。 第４図はアルカリセルラーゼ遺伝子の活性必須領域を含
む約4.0KbのDNA断片の制限地図である。 第５図はアルカリセルラーゼ遺伝子の活性必須領域を含
む約2.4KbのDNA断片のDNA配列である。 第６図は第３図において太線で示した約3.5Kbの部分の
ヌクレオチド配列である。 第７図、第８図、第９図、第10図及び第11図はそれぞれ
組換えプラスミドpBC100、pBC101、pBC102、pBC111及び
pBC112に制限地図であり、細線部分はベクターBR322由
来、太線部分はバチルスエスピーKSM−635由来のDNA断
片を示している。 第12図はHB101（pBC100）及びHB101（pBC101）各株が菌
体内に生産するアルカリセルラーゼの作用pH範囲及び最
適作用pHを示すグラフである。○はHB101（pBC100）、
●はHB101（pBC102）由来、また▲はバチルス エスピ
ーKSM−635由来のセルラーゼのデーターである。 第13図はHB101（pBC100）アルカリセルラーゼとバチル
ス エスピーKSM−635の精製CMCアーゼＩとの二重免疫
拡散試験であり、１は精製CMCアーゼＩの抗血清、２は
精製CMCアーゼＩ、３はHB101（pBC100）株が生産したア
ルカリセルラーゼである。 第14図は約2.6Kb（Ａ）及び約4.0Kb（Ｂ）のHind III断
片をブローブとしたサザンハイブリダイゼーシヨン後の
オートラジオグラフイーの結果である。各レーンは１が
KSM−635株由来の染色体DNAのPvu II切断物、２はpBC10
0のPvu II切断物、３は染色体DNAのXba I切断物及び４
はpBC100のXba I切断物である。
を示す図面である。 第３図はアルカリセルラーゼ遺伝子を含む約6.6KbのDNA
断片の制限地図である。太線部分にアルカリセルラーゼ
遺伝子の全領域、また細線部分に活性必須領域が含まれ
る。 第４図はアルカリセルラーゼ遺伝子の活性必須領域を含
む約4.0KbのDNA断片の制限地図である。 第５図はアルカリセルラーゼ遺伝子の活性必須領域を含
む約2.4KbのDNA断片のDNA配列である。 第６図は第３図において太線で示した約3.5Kbの部分の
ヌクレオチド配列である。 第７図、第８図、第９図、第10図及び第11図はそれぞれ
組換えプラスミドpBC100、pBC101、pBC102、pBC111及び
pBC112に制限地図であり、細線部分はベクターBR322由
来、太線部分はバチルスエスピーKSM−635由来のDNA断
片を示している。 第12図はHB101（pBC100）及びHB101（pBC101）各株が菌
体内に生産するアルカリセルラーゼの作用pH範囲及び最
適作用pHを示すグラフである。○はHB101（pBC100）、
●はHB101（pBC102）由来、また▲はバチルス エスピ
ーKSM−635由来のセルラーゼのデーターである。 第13図はHB101（pBC100）アルカリセルラーゼとバチル
ス エスピーKSM−635の精製CMCアーゼＩとの二重免疫
拡散試験であり、１は精製CMCアーゼＩの抗血清、２は
精製CMCアーゼＩ、３はHB101（pBC100）株が生産したア
ルカリセルラーゼである。 第14図は約2.6Kb（Ａ）及び約4.0Kb（Ｂ）のHind III断
片をブローブとしたサザンハイブリダイゼーシヨン後の
オートラジオグラフイーの結果である。各レーンは１が
KSM−635株由来の染色体DNAのPvu II切断物、２はpBC10
0のPvu II切断物、３は染色体DNAのXba I切断物及び４
はpBC100のXba I切断物である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 岡本 暉公彦 埼玉県越谷市七左町１―229―８
Claims (7)
- 【請求項１】第１図に示すアミノ酸配列を有するセルラ
ーゼをコードするDNA断片。 - 【請求項２】第２図に示すアミノ酸配列を有するセルラ
ーゼをコードするDNA断片。 - 【請求項３】特許請求の範囲第１項記載のアミノ酸配列
のカルボキシ末端にアミノ酸或いはポリペプチドを付加
した配列を有するセルラーゼをコードするDNA断片。 - 【請求項４】特許請求の範囲第１項、第２項及び第３項
のいずれか一項に記載のアミノ酸配列に対して、アミノ
酸の置換、欠失、逆位、及び挿入などによつて関連づけ
られており、且つセルラーゼ活性を有する蛋白をコード
する天然、合成、或いは半合成のDNA断片。 - 【請求項５】特許請求の範囲第１項、第２項、第３項及
び第４項のいずれか一項に記載のDNA断片が、遺伝子の
発現調節の為のDNA配列を含有することを特徴とするDNA
断片。 - 【請求項６】特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、
第５項及び第４項のいずれか一項に記載のDNA断片を分
子内に含むことを特徴とするDNA分子。 - 【請求項７】特許請求の範囲第５項記載のDNA断片を含
有する微生物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10954588A JP2544177B2 (ja) | 1988-05-02 | 1988-05-02 | セルラ―ゼ遺伝子を含むｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10954588A JP2544177B2 (ja) | 1988-05-02 | 1988-05-02 | セルラ―ゼ遺伝子を含むｄｎａ断片 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01281090A JPH01281090A (ja) | 1989-11-13 |
| JP2544177B2 true JP2544177B2 (ja) | 1996-10-16 |
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ID=14512964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP10954588A Expired - Fee Related JP2544177B2 (ja) | 1988-05-02 | 1988-05-02 | セルラ―ゼ遺伝子を含むｄｎａ断片 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2544177B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101310017B (zh) * | 2005-11-16 | 2013-03-20 | 诺维信公司 | 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸 |
-
1988
- 1988-05-02 JP JP10954588A patent/JP2544177B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01281090A (ja) | 1989-11-13 |
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