JP2025525886A - Ｃｄ２８に対する多機能性分子 - Google Patents

Ｃｄ２８に対する多機能性分子

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Abstract

本発明は、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する別の結合部分に共有結合されたアゴニスト抗CD28結合ドメインを含む多機能性分子、及びその使用を提供する。

Description

本発明は、医学、特に免疫療法の分野に関する。本発明は、免疫細胞表面に特異的に発現される標的に結合する結合部分に共有結合された単一の抗CD28結合ドメインを含む多機能性分子を提供する。
T細胞がその細胞標的を認識して死滅させる能力は、協調的な相互作用のセットに依存する。これらの指示の主要な例は、T細胞受容体(TCR)複合体による標的細胞の認識及び結合である。T細胞活性化は、CD28等の更なる相互作用によって更に促進され得る。T細胞は、その表面上にCD28を提示し、これは、TCR複合体を介して活性化を増強するための共刺激シグナルを提供することができる。T細胞がそのTCR複合体を介してその標的細胞を認識し、次いでその標的細胞へのCD28結合を介して共刺激シグナルにも関与する場合、T細胞活性化が増強される。
アゴニスト抗CD28 mAbは、培養T細胞の持続的エクスビボ増殖に適用することができる。しかしながら、抗CD28抗体の使用は、スーパーアゴニスト抗CD28 mAbが全身的に試験された第I相臨床試験における一連の急性及び重篤な有害事象の結果として、推奨されていない(HGnig(Barton)、Nature Reviews Immunology. 2012;12:317-318)。抗腫瘍免疫を促進するリスクがより低い抗CD 28 mAbの局所的又は標的化使用を使用することができる(Jungら、Int J Cancer. 2001 Jan 15;91(2):225-30)。
したがって、ヒトCD28を標的とする安全な免疫療法のための、特に癌の処置のための改善された薬剤を開発する必要がある。
先行技術において研究された治療の軸は、非特異的標的化を低減することであり、より具体的には、CD28とPD-L1等の腫瘍特異抗原との両方に対する二重特異性抗体を調製することによって非特異的標的化を低減することである。これにより、CD28の共刺激効果と組み合わせて腫瘍の直接標的化が達成され、PD-1/PD-L1の腫瘍標的化チェックポイント阻害効果を遮断することが可能になる。そのような抗体の例は、国際公開第2022/094299号及び国際公開第2022/081886号に見出すことができる。
国際公開第2022/094299号 国際公開第2022/081886号 国際公開第2009/080251号 国際公開第2009/080252号 国際公開第2009/080253号 国際公開第2009/080254号 国際公開第2017/024465号 国際公開第2017/025016号 国際公開第2017/132825号 国際公開第2017/133540号 国際公開第2006/121168号 国際公開第2020/127366号 国際公開第2013006490号 国際公開第2016/161270号 国際公開第2018/085469号 国際公開第2018/129553号 国際公開第2011/155607号 米国特許第8,552,156号 欧州特許出願公開第2581113号 米国特許出願公開第2014/044728号 国際公開第18025178号 国際公開第19179388号 国際公開第19179391号 国際公開第19174603号 国際公開第19148444号 国際公開第19120232号 国際公開第19056281号 国際公開第19023482号 国際公開第18209701号 国際公開第18165895号 国際公開第18160536号 国際公開第18156250号 国際公開第18106862号 国際公開第18106864号 国際公開第18068182号 国際公開第18035710号 国際公開第18025178号 国際公開第17194265号 国際公開第17106372号 国際公開第17084078号 国際公開第17087588号 国際公開第16196237号 国際公開第16130898号 国際公開第16015675号 国際公開第12120125号 国際公開第09100140号 国際公開第07008463号 国際公開第2008132601号 欧州特許出願公開第2320940号 国際公開第19152574号 国際公開第08076560号 国際公開第10106051号 国際公開第11014438号 国際公開第17096017号 国際公開第17144668号 国際公開第19232484号 国際公開第16028656号 国際公開第16106302号 国際公開第16191643号 国際公開第17030823号 国際公開第17037707号 国際公開第17053748号 国際公開第17152088号 国際公開第18033798号 国際公開第18102536号 国際公開第18102746号 国際公開第18160704号 国際公開第18200430号 国際公開第18204363号 国際公開第19023504号 国際公開第19062832号 国際公開第19129221号 国際公開第19129261号 国際公開第19137548号 国際公開第19152574号 国際公開第19154415号 国際公開第19168382号 国際公開第19215728号 国際公開第06015886号 国際公開第1000607号 国際公開第10084158号 国際公開第18077926号 国際公開第2014/145806号 米国特許第8,216,805号 米国特許出願公開第2012/0149876号 国際公開第01/58957号 国際公開第96/34103号 国際公開第94/04678号 国際公開第2018/053106号 国際公開第2020/127366号 国際公開第2008156712号 国際公開第2006050949号 国際公開第2021260064号
HGnig(Barton)、Nature Reviews Immunology. 2012;12:317-318 Jungら、Int J Cancer.2001年1月15日;91(2):225-30 Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Department of Health and Human Services、1991 Schaefer, W.ら、PNAS、108(2011)11187-1191 Huang K、Tu H、Adler A S.、BMC Biotechnology. 2013:13:55 Soding, J. (2005)「Protein homology detection by HMM HMM comparison」Bioinformatics 21、951-960 Kabatら、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、United States Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda Edelmanら、1969、Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85 Siddiquiら、2019、Immunity、50、195-211 Jadhavら、2019、PNAS、116、14113-14118 Scheffら、Pharm Res. 2011年5月;28(5):1081-9 Si-Yang Liuら、J. Hematol. Oncol.10:136(2017) Aruffo,A.及びSeed,B.、1987、「Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high efficiency COS cell expression system」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:8573 Poirierら(2012)American Journal of Transplantation 12(7):1682-1690、Cell Immunol. 2005 Jul-Aug;236(1-2):154-60 Angal Sら(1993)Mol. Immunol.、30:105-8 Ridgwayら、Protein Engineering 9(7):617(1996) Atwellら、J. Mol. Biol. 1997 270:26 Merchantら、Nature Biotech. 16:677(1998) Gunasekaranら、J. Biol. Chem. 285(25):19637(2010) Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott Williams&Wilkins、第21版(2005) Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A編(1980) Antoniaら、Immuno-oncology combinations:a review of clinical experiences and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20、6258-6268、2014
本発明者らは、一方でCD28に、他方でヒトT細胞に特異的に発現される別の標的、特にPD-1に結合することができる多機能性分子を初めて提供した。驚くべきことに、この多機能性分子は、CD28のアゴニストと別のT細胞特異的抗原結合ドメインとの組合せであるにもかかわらず、この組合せが、抗CD28スーパーアゴニストを用いた先行する試験の結果を考慮して一見して有害であると考えられる場合でさえ、予想される問題を引き起こさない。
更に、この多機能性分子は、シス標的化及びシス活性化能力を示す。実際、多機能性分子は、2つの結合ドメインを介して単一のT細胞に結合し、それによって、いかなる形態の過剰刺激のリスクも伴わずに、T細胞の効率的であるが制御された刺激を引き起こす。
更に、腫瘍特異的結合能力の欠如にもかかわらず、腫瘍内又は腫瘍の近傍に位置するT細胞を標的化することができ、ここでも、腫瘍に対するいかなる特異性も伴わないT細胞の全身活性化を回避する。
本発明の分子は、いくつかの疾患、特に癌の予防及び/又は処置に特に適している。
したがって、本発明者らは、多数の処置用途のための、特に癌の処置のための、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する結合部分に共有結合された単一の抗CD28結合ドメインを含む多機能性分子を提供する。
本発明の多機能性分子は、T細胞にシス結合することができる。このシス標的化能力は、CD28とPD-1等の別のT特異的抗原の両方を発現するT細胞を特異的に活性化し、ナイーブ非特異的T細胞を活性化しないので、非特異的活性化を回避し、本発明の分子の毒性を制限する。
更に、本発明の多機能性分子は、トランス活性を示さず、すなわち、腫瘍細胞及びT細胞を同時に標的化し、潜在的な望ましくない副作用を回避する。
したがって、本発明の多機能性分子は、癌を含むいくつかの状態の処置に有効であるが、副作用がほとんどないか又は全くない多機能性分子を提供するという目標を達成する。
第1の態様では、本発明は、
(a)第1の結合部分であって、PD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3からなる群から選択される、T細胞表面上に特異的に発現される標的に結合する、第1の結合部分と、
(b)第2の結合部分であって、CD28に対してアゴニスト効果を有し、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)並びに任意に重鎖定常ドメイン(CH1)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含む抗CD28抗原結合ドメインである、第2の結合部分とを含むか又はそれらから本質的になる多機能性分子に関し、
(i)重鎖可変ドメイン(VH)は、相補性決定領域(CDR)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、
(ii)軽鎖可変ドメイン(VL)は、相補性決定領域(CDR)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、
ここで、
- 重鎖CDR1(HCDR1)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号30のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR2(HCDR2)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号31のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR3(HCDR3)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号32のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR1(LCDR1)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号33のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR2(LCDR2)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号34のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR3(LCDR3)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号35のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
当該多機能性分子は、単一の抗CD28抗原結合ドメインを含む。
好ましくは、T細胞表面に特異的に発現される標的はPD-1である。
いくつかの実施形態では、第1の結合部分は、VH及びVL、並びに任意に軽鎖定常ドメイン(CL)及び重鎖定常ドメイン(CH1)を含む第1の抗原結合ドメインであり、当該第1の抗原結合ドメインは、第1のFc鎖のN末端に連結され、分子は、第1のFc鎖と共にFcドメインを形成する第2のFc鎖を更に含む。
好ましくは、抗CD28抗原結合は、VH及びVL、並びに任意にCL及びCH1を含み、好ましくは、
(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変ドメイン(VH)、並びに
(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、
ここで、
- 重鎖CDR1(HCDR1)は、配列番号30のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR2(HCDR2)は、配列番号31のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR3(HCDR3)は、配列番号32のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR1(LCDR1)は、配列番号33のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR2(LCDR2)は、配列番号34のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR3(LCDR3)は、配列番号35のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
更により好ましくは、(a)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号44のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVH、並びに(b)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号45のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVLを含む。
特に、抗CD28抗原結合ドメインは、(i)第1の結合部分のCLのC末端、(ii)第1の結合部分のCH1のC末端、(iii)第1の結合部分のVHのN末端、又は(iii)第1の結合部分のVLのN末端に、任意にペプチドリンカーを介して共有結合されている。
いくつかの実施形態では、分子は、一緒になってFcドメインを形成する第1のFc鎖及び第2のFc鎖を含み、任意にペプチドリンカーを介して、抗CD28抗原結合ドメインは、Fc鎖の一方のC末端に、好ましくは、第1の抗原結合ドメインにN末端で共有結合された第1のFc鎖のC末端に共有結合されている。
いくつかの実施形態では分子は、Fcドメインを一緒に形成する第1のFc鎖及び第2のFc鎖を含み、任意にペプチドリンカーを介して、抗CD28抗原結合ドメインは、そのC末端で第2のFc鎖のN末端に共有結合され、第1の抗原結合ドメインは、そのC末端で第1のFc鎖のN末端に共有結合されている。
好ましくは、抗CD28抗原結合ドメインは、Fab、CrossMAb又はscFv、好ましくはscFvである。
特に、本発明による多機能性分子では、
- 抗CD28抗原結合ドメインは、N末端からC末端に向かって、好ましくはペプチドリンカーによってVLに連結されたVHを有するscFvであるか、又は
- 抗CD28抗原結合ドメインは、N末端からC末端に向かって、好ましくはペプチドリンカーによってVHに連結されたVLを有するscFvである。
いくつかの実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインは、Fab又はCrossMAbである。
特に、抗CD28抗原結合ドメインでは、(i)重鎖可変ドメイン(VH)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号36、37、38及び39のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域フレームワーク領域(HFR)HFR1、HFR2、HFR3及びHFR4を更に含み、
(ii)軽鎖可変ドメイン(VL)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号40、41、42及び43のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域フレームワーク領域(LFR)LFR1、LFR2、LFR3及びLFR4を更に含む。
より具体的には、抗CD28抗原結合ドメインは、(a)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せ、好ましくは置換から選択される1、2又は3つのアミノ酸修飾を任意に有する、配列番号44、83、84、85及び88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変領域(VH)、並びに(b)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せ、好ましくは置換から選択される1、2又は3つのアミノ酸修飾を任意に有する、配列番号45、86、87、89及び90からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含む。
好ましくは、抗CD28抗原結合ドメインは、(a)好ましくはフレームワーク領域に、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号44のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVH、並びに(b)好ましくはフレームワーク領域に、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号45のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVLを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の多機能性分子において、第1の結合部分は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、セミプリマブ、カムレリズマブ、AUNP12、AMP-224、AGEN-2034、チスレリズマブ、PDR001、MK-3477、PF-06801591、JNJ-63723283、ゲノリムズマブ、LZM-009、BCD-100、SHR-1201、BAT-1306、AK-103、MEDI-0680、JS001、BI-754091、CBT-501、INCSHR1210、TSR-042、GLS-010、AM-0001、STI-1110、MGA012、又はIBI308、好ましくはペンブロリズマブ又はニボルマブからなる群から選択される抗PD-1抗体であるか又はそれに由来する。
いくつかの実施形態では、第1の結合部分は、抗PD-1抗原結合ドメイン、好ましくは、
(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH、並びに(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVLを含む抗PD-1抗原結合ドメインであり、
ここで、
- 重鎖CDR1(HCDR1)は、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR2(HCDR2)は、配列番号2のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR3(HCDR3)は、配列番号3のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR1(LCDR1)は、配列番号4のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR2(LCDR2)は、配列番号5のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR3(LCDR3)は、配列番号6のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
好ましくは、当該抗PD-1抗原結合ドメインは、F(ab')2、Fab又はCrossMAbである
好ましくは、第1の結合部分は、抗PD-1抗原結合ドメイン、好ましくは、(a)好ましくはフレームワーク領域に、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号15のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVH、並びに(b)好ましくはフレームワーク領域に、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号16のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVLを含むPD-1抗原結合ドメインである。
好ましくは、抗PD-1抗原結合ドメインは、F(ab')2、Fab又はCrossMAbである。
いくつかの実施形態では、第1の結合部分は、
a)(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH、並びに(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVLであって、ここで、重鎖CDR1(HCDR1)が、配列番号65のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、重鎖CDR2(HCDR2)が、配列番号66のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、重鎖CDR3(HCDR3)が、配列番号67のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、軽鎖CDR1(LCDR1)が、配列番号68のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、軽鎖CDR2(LCDR2)が、配列番号69のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、軽鎖CDR3(LCDR3)が、配列番号70のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる、VH及びVL、又は
b)i)配列番号71のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるVH、及びii)配列番号72のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるVL、又は
c)(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH、並びに(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVLであって、ここで、重鎖CDR1(HCDR1)が、配列番号73のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、重鎖CDR2(HCDR2)が、配列番号74のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、重鎖CDR3(HCDR3)が、配列番号75のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、軽鎖CDR1(LCDR1)が、配列番号76のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、軽鎖CDR2(LCDR2)が、配列番号77のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、軽鎖CDR3(LCDR3)が、配列番号78のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる、VH及びVL、又は
d)i)配列番号79のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるVH、及びii)配列番号80のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるVL
を含む抗PD-1抗原結合ドメインである。
第2の態様では、本発明は、本発明による多機能性分子をコードする単離された核酸配列若しくは単離された核酸配列の群、又は当該単離された核酸配列若しくは単離された核酸配列の群を含むベクターに関する。
第3の態様では、本発明は、本発明のベクター又は単離された核酸若しくは単離された核酸分子の群を含む宿主細胞に関する。
第4の態様では、本発明は、本発明による多機能性分子を産生するための方法であって、本発明による宿主細胞を培養する工程及び多機能性分子を単離する工程を含む方法に関する。
第5の態様では、本発明は、本発明による多機能性分子、本発明による核酸若しくは核酸分子の群若しくはベクター、又は本発明による宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
特に、本発明による医薬組成物、多機能性分子、核酸、核酸分子の群、ベクター、宿主細胞は、医薬として使用するためのものである。
特に、本発明による医薬組成物、多機能性分子、核酸、核酸分子の群、ベクター、宿主細胞は、癌の処置又は感染性疾患の処置に使用するためのものである。
好ましくは、疾患は、脳腫瘍、癌腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、消化器癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、リンパ種、神経膠腫、中皮種、黒色腫、胃癌(stomach cancer)、尿道癌、環境的に誘発された癌及び当該癌の任意の組合せからなる群から選択される癌である。
或いは、疾患は、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、リノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、おたふくかぜウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ヒトTリンパ球向性ウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス及びアルボウイルス脳炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる感染性疾患である。
いくつかの実施形態では、本発明による医薬組成物、多機能性分子、核酸、核酸分子の群、ベクター、宿主細胞は、放射線療法と、又は追加の治療剤、特に化学療法剤若しくは抗感染剤と併用して使用するためのものである。
特に、追加の治療剤は、化学療法剤、抗感染剤、アルキル化剤、血管形成抑制薬、抗体、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害薬、抗増殖剤、抗ウイルス剤、オーロラキナーゼ阻害剤、アポトーシス促進剤、デスレセプター経路活性化剤、Bcr-Ablキナーゼ阻害剤、二重特異性T細胞エンゲージャー抗体薬物コンジュゲート、ブルートンチロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ-2阻害剤、白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ受容体阻害剤、増殖因子阻害剤、熱ショックタンパク質-90阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ホルモン療法、アポトーシスタンパク質阻害剤、抗生物質、キナーゼ阻害剤、キネシン阻害剤、Jak2阻害剤、ラパマイシン阻害剤の哺乳動物標的、マイクロRNA、マイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤、多価結合タンパク質、非ステロイド性抗炎症薬、ポリA DP-リボースポリメラーゼ阻害剤、プラチナ製剤化学療法、ポロ様キナーゼ阻害剤、ホスホイノシチド-3キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド、低分子干渉リボ核酸(siRNA)、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤、低メチル化剤、チェックポイント阻害剤、ペプチドワクチン、癌ワクチン、腫瘍抗原由来のエピトープ又はネオエピトープ、並びにこれらの薬剤の1つ又は複数の組合せからなる群から選択される。
最後に、本発明は、癌又は感染性疾患などの疾患の処置を必要とする対象において癌又は感染性疾患などの疾患を処置する方法であって、本発明の多機能性分子又は医薬組成物を好ましくは有効量で投与することを含む方法に関する。
本発明はまた、癌又は感染性疾患などの疾患の処置のための医薬の製造のための、本発明による多機能性分子又は医薬組成物の使用に関する。
定義
本発明をより容易に理解するために、特定の用語を以下に定義する。更なる定義は、詳細な説明全体を通して記載される。
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記及び他の科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするために、及び/又は参照を容易にするために本明細書において定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野において一般に理解されるものとの差異を表すと解釈されるべきではない。本明細書に記載又は参照される技術及び手順は、一般的に十分に理解されており、当業者によって従来の方法論を使用して一般的に使用される。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の一種を表し、その最も広い意味で使用される。特に、抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片(すなわち、抗原結合部位を含む分子)を含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスであってもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。特に記載のない限り、「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリン、並びにFab、Fab'、F(ab')2、Fv、一本鎖(scFv)、CrossMAb、抗体部分を含む分子、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、及び抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアントを含む、必要な特異性を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体配置などの「抗体断片」又は「抗原結合断片」を含む。好ましくは、抗体という用語は、ヒト化抗体を指す。構造に関して、抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された重(H)鎖及び軽(L)鎖を有し得る。軽鎖には2つのタイプ、ラムダ(λ)及びカッパ(κ)がある。各重鎖及び軽鎖は、定常領域及び可変領域(又は「ドメイン」)を含有する。軽鎖及び重鎖可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」とも呼ばれる3つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域及びCDRの範囲は定義されている(参照により本明細書に組み込まれるKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S. Department of Health and Human Services、1991を参照されたい)。好ましくは、CDRは、Kabat又はIGMT法に従って、好ましくはKabat法によって定義される。フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的相互作用によってCDRを正しい方向に配置するための足場を形成するように作用する。CDRは、抗原のエピトープへの結合を主に担う。各鎖のCDRは、典型的には、N末端から開始して連続的に番号付けされた「相補性決定領域1」又は「CDR1」、「CDR2」、及び「CDR3」と呼ばれる。本発明による抗体のVL及びVHドメインは、4つのフレームワーク領域、すなわち「FR」を含んでもよく、これらは、当技術分野及び本明細書において、それぞれ「フレームワーク領域1」又は「FR1」、「FR2」、「FR3」、及び「FR4」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域及び相補性決定領域は、好ましくは、以下の順序:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(アミノ末端からカルボキシ末端へ)で作動可能に連結される。
「CrossMab技術」は、重鎖と軽鎖との間のドメイン交差に基づき、それによって、異なる特異性の重鎖及び軽鎖について異なるドメイン配置をもたらす。国際公開第2009/080251号、国際公開第2009/080252号、国際公開第2009/080253号、国際公開第2009/080254号及びSchaefer, W.ら、PNAS、108(2011)11187-1191(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)は、ドメインクロスオーバーを有する二価の二重特異性IgG抗体に関する。CrossMabでは、(i)定常ドメインCL及びCH1が互いに置き換えられており、並びに/又は(ii)定常ドメインVL及びVHが互いに置き換えられている。したがって、抗原結合ドメインは、VH及びCLを有する鎖と、VL及びCH1を有する別の鎖とを含む。本明細書で使用される場合、「CrossMAb」という用語は、特に抗体の1つの結合アームにおいて、CL及びCH1ドメインが逆転した抗原結合ドメインを指す。したがって、そのような結合ドメインは、CLドメインに連結されたVHドメインと、CH1ドメインに連結されたVLドメインとを含む。そのような形式は、第1の抗原に特異的に結合する第1の結合ドメインの軽鎖と、第2の抗原に特異的に結合する第2の結合ドメインの誤った重鎖とのミスマッチによって引き起こされる副生成物形成を低減する(そのようなCL-CH1ドメイン交換を伴わないアプローチと比較した場合)。CrossMAbは、典型的には、Fab立体配座を有するが、上記のCL及びCH1が反転している。それらは、例えば、国際公開第2009/080253号及びSchaefer, W.ら、PNAS、108(2011)11187-1191に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される「抗体重鎖」は、抗体立体構造中に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメインであるCH1、CH2及びCH3から構成される。VH領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に更に細分することができる。VHは、特に、3つのCDR及び4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される。抗体重鎖のCDRは、典型的には、「HCDR1」、「HCDR2」及び「HCDR3」と呼ばれる。抗体重鎖のフレームワーク領域は、典型的には、「HFR1」、「HFR2」、「HFR3」及び「HFR4」と呼ばれる。
本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、抗体立体構造に存在する2つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指し、κ及びλ軽鎖は、2つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)及び軽鎖定常領域(CL)から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLから構成される。VL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域に更に細分することができる。VLは、特に、3つのCDR及び4つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置される。抗体軽鎖のCDRは、典型的には、「LCDR1」、「LCDR2」及び「LCDR3」と呼ばれる。抗体軽鎖のフレームワーク領域は、典型的には、「LFR1」、「LFR2」、「LFR3」及び「LFR4」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」又は「抗原結合ドメイン」は、抗体の一部、すなわち、おそらくその天然形態で、特定の抗原に対する抗原結合能を示す本発明の抗体の構造の一部に対応する分子を意味し、そのような断片は、特に、対応する4本鎖抗体の抗原結合特異性と比較して、当該抗原に対して同じ又は実質的に同じ抗原結合特異性を示す。有利には、抗原結合断片は、対応する4鎖抗体と同様の結合親和性を有する。しかしながら、対応する4鎖抗体に関して低下した抗原結合親和性を有する抗原結合断片もまた、本発明の範囲内に包含される。抗原結合能は、抗体と標的断片との間の親和性を測定することによって決定することができる。これらの抗原結合断片は、抗体の「機能的断片」とも呼ばれ得る。抗体の抗原結合断片は、CDR(相補性決定領域)と呼ばれる超可変ドメイン又はその一部を含む断片である。そのような抗原結合ドメインは、例えば、Fab、scFv又はCrossMabであってもよい。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体(例えば、非ヒト抗体に由来する最小配列を含有するキメラ抗体)を指すことが意図される。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」はまた、ヒト化を受けた抗体も指す。ヒト化抗体は、一般に、元の抗体の所望の特異性、親和性、及び能力を維持しながら、1つ又は複数のCDR由来の残基が非ヒト抗体(ドナー抗体)の少なくとも1つのCDR由来の残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。更なるフレームワーク領域の修飾を、ヒトフレームワーク配列内で行うことができる。好ましくは、ヒト化抗体は、80%、85%又は90%を超えるT20ヒトスコアを有する。抗体の「ヒト性」は、例えば、Gao SH、Huang K、Tu H、Adler A S.、BMC Biotechnology. 2013:13:55に記載されているように、T20スコア分析器を使用して抗体の可変領域のヒト性を定量することによって、又はT20 Cutoff Human Databases:http://abAnalyzer.lakepharma.comを使用して抗体配列のT20スコアを計算するウェブベースのツールによって測定することができる。
「キメラ抗体」とは、好ましくはマウス等の非ヒト供給源由来の遺伝物質をヒト由来の遺伝物質と組み合わせることによって作製される抗体を意味する。そのような抗体は、キメラ領域によって連結されたヒト抗体及び非ヒト抗体の両方に由来する。キメラ抗体は、一般に、ヒト由来の定常ドメイン及び別の哺乳動物種由来の可変ドメインを含み、治療的処置において使用される場合、非ヒト動物由来の外来抗体に対する反応のリスクを低減する。
本明細書で使用される場合、「結晶化可能断片領域」、「Fc領域」又は「Fcドメイン」という用語は、互換的であり、Fc受容体と呼ばれる細胞表面受容体と相互作用する抗体の尾部領域を指す。Fc領域又はFcドメインは、典型的には、抗体の2つの重鎖の第2及び第3の定常ドメイン(すなわち、CH2及びCH3ドメイン)に由来する、任意に同一の2つのドメインから構成される。Fcドメインの一部は、CH2又はCH3ドメインを指す。任意に、Fc領域又はFcドメインは、CH1とCH2との間のヒンジ領域の全て又は一部を含んでもよい。したがって、Fcドメインは、ヒンジ、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含み得る。任意に、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4由来のものであり、任意に、IgG1ヒンジ-CH2-CH3及びIgG4ヒンジ-CH2-CH3を有する。
本明細書に記載される結合部分の「結合」能に関して、「結合する」又は「結合」という用語は、別のペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は分子を認識し、それと接触する抗体断片及び誘導体を含む抗体を指す。特定の標的に「特異的に結合」、「特異的に結合する」、「特異的な」、「選択的に結合する」及び「選択的な」という用語は、抗原結合ドメインが、特異的な標的を認識して結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識又は結合しないことを意味する。例えば、抗原に特異的に(又は優先的に)結合する抗体は、例えば、他の分子に結合するよりも高い親和性、結合活性で、より容易に、及び/又はより長い持続時間で抗原に結合する抗体である。好ましくは、「特異的結合」という用語は、10-7M以下の結合親和性での抗体(又は抗原結合ドメイン)と抗原との間の接触を意味する。特定の態様では、抗体は、10-8M、10-9M又は10-10M以下の親和性で結合する。
「アミノ酸変化」又は「アミノ酸修飾」とは、本明細書において、ポリペプチドのアミノ酸配列における変化を意味する。「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列における置換、挿入及び/又は欠失を含む。本明細書において「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを意味する。「アミノ酸挿入」又は「挿入」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。「アミノ酸欠失」又は「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。アミノ酸置換は保存的であってもよい。保存的置換は、類似の化学的特性(例えば、電荷、バルク及び/又は疎水性)を有する側鎖(「R基」)を有する別の残基による、所定のアミノ酸残基の置換である。本明細書で使用される場合、「アミノ酸位置」又は「アミノ酸位置番号」は、互換的に使用され、アミノ酸配列中の特定のアミノ酸の位置を指し、一般に、アミノ酸の1文字コードで特定される。アミノ酸配列中の最初の(すなわち、N末端から開始する)アミノ酸は、1位にあるとみなすべきである。
保存的置換は、類似の化学的特性(例えば、電荷、バルク及び/又は疎水性)を有する側鎖(「R基」)を有する別の残基による、所定のアミノ酸残基の置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。保存的置換及び対応する規則は、当技術分野の状態において十分に記載されている。例えば、保存的置換は、以下の表に反映されるアミノ酸の群内の置換によって定義され得る。
本明細書で使用される場合、2つの配列間の「配列同一性」は、パラメータ「配列同一性」、「配列類似性」又は「配列相同性」によって記載される。本発明の目的のために、2つの配列(A)と(B)との間の「同一性パーセンテージ」は、比較ウィンドウを介して、最適な様式でアラインメントされた2つの配列を比較することによって決定される。当該配列のアラインメントは、当技術分野で公知の方法によって、例えば、Needleman-Wunschのグローバルアラインメントのためのアルゴリズムを使用して実施することができる。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して、類似配列をマッチさせる。一旦、全アラインメントが得られると、同一性のパーセンテージは、アラインメントされた同一のアミノ酸残基の総数を、配列(A)と(B)との間の最も長い配列に含まれる残基の総数で割ることによって得ることができる。配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して決定される。2つのアミノ酸配列を比較するために、例えば、EMBL-EBIによって提供され、www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=proteinで入手可能な、タンパク質のペアワイズ配列アラインメントのためのツール「Emboss needle」を、例えば、デフォルト設定:(I)Matrix:BLOSUM62、(ii)Gap open:10、(iii)gap extend:0.5、(iv)output format:pair、(v)end gap penalty:false、(vi)end gap open:10、(vii)end gap extend:0.5を用いて使用することができる。
或いは、配列同一性はまた、典型的には、HHalignアルゴリズム及びそのコアアライメントエンジンとしてのそのデフォルト設定を使用する配列分析ソフトウェアClustal Omegaを使用して決定することができる。アルゴリズムは、デフォルト設定で、Soding, J. (2005)「Protein homology detection by HMM HMM comparison」Bioinformatics 21、951-960に記載されている。
「Euナンバリング」(Euインデックスとしても知られる)は、抗体ナンバリングシステム(Kabatら、1991、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、United States Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda)を指し、これは、配列決定された最初のヒトIgG1の連続ナンバリングに基づく(Eu抗体;Edelmanら、1969、Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85)。
本明細書で使用される「に由来する」及び「に由来した」という用語は、親化合物又はタンパク質の構造に由来する構造を有し、その構造が本明細書に開示されるものと十分に類似しており、その類似性に基づいて、特許請求される化合物と同じ又は類似の特性、活性及び有用性を示すことが当業者によって予想される化合物を指す。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、本発明による多機能性分子を、生理学的に適した担体及び賦形剤等の任意の他の化学成分と共に含むもの等の、1つ又は複数の活性剤の調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への活性剤の投与を容易にすることである。本発明の組成物は、任意の従来の投与経路又は使用に適した形態であってもよい。一態様では、「組成物」は、典型的には、活性剤、例えば、化合物又は組成物と、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバント等の、天然に存在する又は天然に存在しない担体、不活性物質(例えば、検出可能な薬剤又は標識)又は活性物質との組合せを意図し、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で言及される「許容されるビヒクル」又は「許容される担体」は、医薬組成物を製剤化するのに有用であることが当業者に公知である任意の公知の化合物又は化合物の組合せである。
本明細書で使用される「有効量」又は「治療有効量」は、単独で、又は1つ若しくは複数の他の活性剤と組み合わせて、対象に治療効果を与えるのに必要な活性剤の量、例えば、標的疾患若しくは障害を処置するのに、又は所望の効果をもたらすのに必要な活性剤の量を指す。「有効量」は、薬剤、疾患及びその重症度、年齢、健康状態、サイズ、性別及び体重を含む処置される対象の特徴、処置の期間、併用療法(もしあれば)の性質、特定の投与経路、並びに医療関係者の知識及び専門知識の範囲内の同様の要因に応じて変動する。これらの因子は当業者に公知であり、慣用的な実験を超えることなく対処することができる。一般に、個々の成分又はその組合せの最大用量、すなわち、健全な医学的判断に従った最も高い安全な用量を使用することが好ましい。
本明細書で使用される場合、「医薬」という用語は、障害又は疾患に対する治癒特性又は予防特性を有する任意の物質又は組成物を指す。
「処置」という用語は、疾患又は疾患の症状の治療、防止、予防及び遅延等の患者の健康状態を改善することを意図した任意の行為を指す。疾患の治癒的処置及び/又は予防的処置の両方を示す。治癒的処置は、治癒をもたらす処置、又は疾患若しくは疾患の症状若しくは疾患に直接若しくは間接的に起因する苦痛を緩和、改善及び/若しくは排除、低減及び/若しくは安定化させる処置として定義される。予防的処置は、疾患の予防をもたらす処置と、疾患の進行及び/若しくは発生又はその発生のリスクを低減及び/又は遅延させる処置の両方を含む。特定の態様では、そのような用語は、疾患、障害、感染性疾患、又はそれに関連する症状の改善又は根絶を指す。他の態様では、この用語は、癌の広がり又は悪化を最小限に抑えることを指す。本発明による処置は、必ずしも100%又は完全な処置を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の処置が存在する。好ましくは、「処置」という用語は、1つ又は複数の活性剤を含む組成物を、障害/疾患を有する対象に適用又は投与することを指す。
本明細書で使用される場合、「障害」又は「疾患」という用語は、遺伝的若しくは発生的エラー、感染、毒物、栄養欠乏若しくは栄養不均衡、毒性、又は好ましくない環境因子の影響から生じる、身体の不正確に機能する器官、部分、構造、又は系を指す。好ましくは、これらの用語は、健康障害又は疾患、例えば、正常な身体的又は精神的機能を破壊する病気を指す。より好ましくは、障害という用語は、動物及び/又はヒトに影響を及ぼす、癌等の免疫及び/又は炎症性疾患を指す。
本明細書で使用される「免疫細胞」は、例えば、骨髄で産生される造血幹細胞(HSC)に由来する白血球(white blood cell)(白血球(leukocyte))、リンパ球(T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞及びナチュラルキラーT細胞(NKT))、及び骨髄由来細胞(好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞)等の、自然免疫及び適応免疫に関与する細胞を指す。特に、免疫細胞は、B細胞、T細胞、特にCD4+ T細胞及びCD8+ T細胞、NK細胞、NKT細胞、APC細胞、樹状細胞及び単球を含む例示的なリストにおいて選択することができる。本明細書で使用される「T細胞」は、例えば、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、Tヘルパー1型T細胞、Tヘルパー2型T細胞、Tヘルパー17型T細胞、及び抑制性T細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「Tエフェクター細胞」、「T eff」又は「エフェクター細胞」という用語は、共刺激等の刺激に能動的に応答するいくつかのT細胞型を含む免疫細胞の群を表す。特に、(例えば、他の細胞の活性化を調節するサイトカインを産生することによって、又は細胞傷害活性によって)抗原を排除するように機能するT細胞を含む。特に、CD4+、CD8+、細胞傷害性T細胞及びヘルパーT細胞(Th1及びTh2)を含む。
本明細書で使用される場合、「調節性T細胞」、「Treg細胞」又は「Treg」という用語は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を予防するT細胞の亜集団を指す。Tregは免疫抑制性であり、一般に、エフェクターT細胞の誘導及び増殖を抑制又は下方制御する。Tregは、バイオマーカーCD4、FOXP3、及びCD25を発現し、ナイーブCD4細胞と同じ系統に由来すると考えられる。
「疲弊したT細胞」という用語は、機能不全(すなわち、「疲弊」)の状態にあるT細胞の集団を指す。T細胞疲弊は、機能の進行性喪失、転写プロファイルの変化、及び抑制性受容体の持続的発現を特徴とする。疲弊したT細胞は、サイトカイン産生能、高い増殖能及び細胞傷害能を失い、最終的にそれらの消滅をもたらす。疲弊したT細胞は、典型的には、CD62L及びCD127のより低い発現と組み合わされた、より高いレベルのCD43、CD69及び抑制性受容体を示す。
「幹細胞様エフェクターメモリーT細胞」という用語は、チェックポイントタンパク質PD-1及び転写因子Tcf1の発現を含む、疲弊した細胞及びセントラルメモリー細胞の特徴を有する腫瘍反応性腫瘍内T細胞のサブセットを指す。これらの細胞は、Tcf1+PD-1+CD8+ T細胞と呼ぶことができる。これらの細胞は、腫瘍微小環境に存在し、免疫療法によって促進される癌の免疫制御に重要である。これらは、慢性ウイルス感染及び癌の際にT細胞応答を維持するために重要であり、PD-1免疫療法後に見られる増殖バーストをもたらす。これらの細胞は、ゆっくりと自己再生し、また、より最終分化した疲弊したCD8 T細胞を生じる。これらの細胞及びそれらの特徴は、以下の文献:Siddiquiら、2019、Immunity、50、195-211及びJadhavら、2019、PNAS、116、14113-14118において更に定義され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び上記の細胞又は肝臓によって産生される可溶性高分子(抗体、サイトカイン、及び補体を含む)の作用を指し、これにより、侵入した病原体、病原体に感染した細胞若しくは組織、癌性細胞、又は自己免疫若しくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞若しくは組織が選択的に損傷されたり、破壊されたり、又は人体から排除されたりする。
本明細書で使用される「アンタゴニスト」という用語は、別の分子の生物学的活性又は機能性を遮断又は低減する分子を指す。特に、この用語は、細胞受容体(例えば、PD-1)に参照物質(例えば、PD-L1及び/又はPD-L2)として結合し、その通常の生物学的効果(例えば、免疫抑制性微小環境の形成)の形成の全て又は一部を妨げる抗体又はその断片を指す。本発明によるヒト化抗体のアンタゴニスト活性は、競合ELISAによって評価することができる。
本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、別の分子の生物学的活性、機能及び/又は発現を誘導及び/又は増大させる分子を指す。特定の実施形態によれば、アゴニストは、免疫細胞(例えば、T細胞)に対する共刺激効果を誘導及び/又は増大させる。特定の実施形態によれば、アゴニストは、免疫細胞(例えば、T細胞)へのシグナル伝達を誘導及び/又は増大させる。特に、この用語は、CD28に結合し、T細胞作用に必要な同時刺激シグナルを刺激/誘導する抗体又はその断片を指す。本発明によるヒト化抗体のアゴニスト活性は、T細胞バイオアッセイにおけるIL-2分泌の測定によって評価することができる。
本明細書で使用される場合、「薬物動態」及び「PK」という用語は、互換的に使用され、生体に投与される化合物、物質又は薬物の動態を指す。薬物動態は、特に、ADME又はLADMEスキームを含み、これは、遊離(すなわち、組成物からの物質の放出)、吸収(すなわち、血液循環への物質の進入)、分布(すなわち、身体を通した物質の分散又は伝播)、代謝(すなわち、物質の変換又は分解)及び排泄(すなわち、生物からの物質の除去又はクリアランス)を表す。代謝及び排泄の2つの相はまた、排出という表題の下で一緒にグループ化され得る。当業者は、とりわけ、排出半減期、消失速度定数、クリアランス(すなわち、単位時間当たりに薬物が排出される血漿の体積)、Cmax(最大血清濃度)、及び薬物曝露(曲線下面積によって決定され、Scheffら、Pharm Res. 2011年5月;28(5):1081-9を参照)等の異なる薬物動態パラメータをモニタリングすることができる。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、列挙された物質(例えば、抗体、ポリペプチド、核酸等)が、天然に共存する他の物質から実質的に分離されているか、又は相対的に濃縮されていることを示す。特に、「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離され、及び/又は回収されたものである。
本明細書で使用される「及び/又は」は、2つの指定された特徴又は構成要素の各々について、他方の特徴又は構成要素を有するか又は有さない具体的な開示とみなされる。例えば、「A及び/又はB」は、(i)A、(ii)B、並びに(iii)A及びBのそれぞれの具体的な開示とみなされ、あたかもそれぞれが個別に記載されているかのように解釈される。
「1つの(a)」又は「1つの(an)」という用語は、要素の1つ又は要素の2つ以上のいずれかが記載されていることが文脈上明らかでない限り、それが修飾する要素の1つ又は複数を指すことができる(例えば、「試薬(a reagent)」は、1つ又は複数の試薬を意味することができる)。
本明細書において任意の及び全ての値(数値範囲の下限及び上限を含む)に関連して使用される「約」という用語は、最大+/-10%(例えば、+/-0.5%、+/-1%、+/-1.5%、+/-2%、+/-2.5%、+/-3%、+/-3.5%、+/-4%、+/-4.5%、+/-5%、+/-5.5%、+/-6%、+/-6.5%、+/-7%、+/-7.5%、+/-8%、+/-8.5%、+/-9%、+/-9.5%)の許容可能な偏差の範囲を有する任意の値を意味する。一連の値の最初に「約」という用語を使用することは、値のそれぞれを修飾する(すなわち、「約1、2及び3」は、約1、約2及び約3を指す)。更に、値のリストが本明細書に記載される場合(例えば、約50%、60%、70%、80%、85%又は86%)、リストは、その全ての中間値及び小数値(例えば、54%、85.4%)を含む。
本明細書において任意の所定の生物学的配列に関連して使用される「本質的に」という用語は、当該生物学的配列が、配列表に含まれる参照配列から、生物学的配列の長さの10%まで変化することを意味する。特に、「から本質的になる」とは、生物学的配列がその配列からなるが、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の置換、付加、欠失又はそれらの混合物を含んでもよく、好ましくは1、2、3、4又は5個の置換、付加、欠失又はそれらの混合物を含んでもよく、但し、当該生物学的配列は、配列表に含まれる参照配列と比較して、生物学的配列の長さの最大10%異なることが意図される。
多機能性分子の構造
第1の態様では、本発明は、
(a)T細胞上に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分、及び
(b)アゴニスト抗CD28抗原結合ドメインである第2の結合部分を含み、
当該多機能性分子が、単一の抗CD28抗原結合ドメインを含む、多機能性分子に関する。
第1及び第2の結合部分は、2つの異なる標的に指向され、その結果、本発明による分子は、「多機能性」であり、すなわち、少なくとも2つの異なる標的(例えば、CD28と、PD-1等のT細胞表面に特異的に発現される標的)に結合することができる。第1及び第2の結合部分は、2つの異なる標的に指向され、その結果、本発明による分子は、特に「二機能性」であり、すなわち、2つの異なる標的(例えば、CD28と、PD-1等のT細胞表面に特異的に発現される標的)に結合することができる。
多機能性分子は、特に、2つ、3つ又は4つの結合部分を含み得るが、CD28に対する結合部分は1つだけである。例えば、多機能性分子は、
- T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する1つの結合部分及びCD28に結合する1つの結合部分、又は
- 同じ又は異なる標的に結合する、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する2つの結合部分、及びCD28に結合する1つの結合部分、又は
- 同じ又は異なる標的に結合する、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する3つの結合部分、及びCD28に結合する1つの結合部分を含み得る。
第1及び第2の結合部分は、好ましくは、特にFab、Fab'、F(ab')2、Fv、一本鎖(scFV)、CrossMAb又はナノボディ(VHH)、好ましくはF(ab')2、Fab、CrossMAb又はscFVに由来する抗原結合ドメインである。多機能性分子において、第1及び第2の結合部分は、同じ又は異なる形式を有してもよい。例えば、第1及び第2の結合部分は、いずれもFab又はscFVであってもよい。或いは、第1及び第2の結合部分は、いずれもscFvではない。好ましい態様では、抗CD28抗原結合部分はscFvであり、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する結合部分はscFvではない。例えば、第1の結合部分は、F(ab')2、CrossMAb又はFabであってもよく、第2の結合部分は、scFv、Fab又はCrossMAbであってもよい。
特に、第1の結合部分はF(ab')2、CrossMAb又はFabであり、第2の結合部分はscFvである。
多機能性分子は、好ましくは、i)第1及び第2の結合部分、i)任意でCH1、ii)任意でヒンジ、iii)任意でCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。
IgG抗体の文脈において、IgGアイソタイプはそれぞれ、3つの重鎖定常領域(CH)を有する。したがって、IgGの文脈における「CH」ドメインは、以下のとおりである。「CH1」は、重鎖の3つの定常ドメインのうちの第1の定常ドメイン(最もN末端側)を指す。CH1は、特に、KabatのEUインデックスに従って118～215位を指す。「ヒンジ」は、KabatのEUインデックスに従って216～230位を指す。「CH2」は、第2の定常ドメイン、特にKabatのEUインデックスに従って231～340位を指し、「CH3」は、第3の定常ドメイン(最もC末端側)、特にKabatのEUインデックスに従って341～447位を指す。CHドメインは、天然に存在するCHドメインであってもよく、又は1つ若しくは複数のアミノ酸が置換されている天然に存在するCHドメインであってよい。
「ヒンジ領域」という用語は、抗体のCH1ドメインとCH2ドメインとの間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを指す。ヒンジは、本発明の目的のために構造的に定義される。本明細書で使用されるIgG1「ヒンジ領域」は、KabatのEUインデックスに従って残基216～230を含む。
第1及び/又は第2の結合部分は、CLドメインを含み得る。
IgG抗体の文脈において、IgGアイソタイプはそれぞれ軽鎖定常ドメイン(CL)を有する。「CLドメイン」は、VLドメインのC末端に位置する軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを指す。CLドメインは、KabatのEUインデックスの位置107～216付近に及ぶ。CLドメインは、天然に存在するCLドメインであってもよく、又は1つ若しくは複数のアミノ酸が置換されている天然に存在するCLドメインであってよい。
そのような多機能性分子は、好ましくは、相補的であり一緒になってFcドメインを形成する第1のFc鎖及び第2のFc鎖を含む。第1及び第2の結合部分は、同じ又は異なるFc鎖上にあってもよく、それによって、それぞれ、ホモ二量体Fcドメイン又はヘテロ二量体Fcドメインを形成する。
したがって、多機能性分子は、2つの結合部分、好ましくは2つの抗原結合ドメイン及びFcドメインを含み得る。好ましくは、本発明の多機能性分子は、第1及び第2の抗原結合ドメイン並びにFcドメインを含む。更に、多機能性分子はまた、ヒンジドメインを含み得る。
更に、多機能性分子はまた、多機能性分子の異なる部分の間(例えば、Fc鎖と結合部分との間)の連結を可能にする1つ又はいくつかのペプチドリンカーを含み得る。
一実施形態では、第1及び第2の結合部分はFabであり、その結果、多機能性分子は、好ましくは、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第1の軽鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)を含む第1の重鎖
(当該第1の軽鎖及び重鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を形成する)、
(iii)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第2の軽鎖、
(iv)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)を含む第2の重鎖
(当該第2の軽鎖及び重鎖が、CD28に結合する第2の結合部分を形成する)
を含むか又はそれらからなる。
そのような分子は、Fcドメインを更に含んでもよく、その結果、多機能性分子は、好ましくは、2つの異なるFabドメイン及びFcドメインを含む。特に、多機能性分子は、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第1の軽鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)、第1の定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含み、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第1の重鎖
(当該第1の軽鎖及び重鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を形成する)、並びに
(iii)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第2の軽鎖、
(iv)可変ドメイン(VH)、第1の定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含み、当該CH2及びCH3ドメインが第2のFc鎖を形成する、第2の重鎖
(第2の軽鎖及び重鎖が、CD28に結合する第2の結合部分を形成する)
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、Fcドメインを形成する。
一実施形態では、第1の結合部分はFabであり、第2の結合部分はCrossMAbであり、その結果、多機能性分子は、好ましくは、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む軽鎖である第1の鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)を含む重鎖である第2の鎖
(当該軽鎖及び重鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を形成する)、
(iii)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CL)を含む第3の鎖、
(iv)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CH1)を含む第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
当該第1及び第2の鎖は、CD28に結合する第2の結合部分を形成する。
そのような分子は、Fcドメインを更に含んでもよく、その結果、多機能性分子は、好ましくは、2つの異なるFabドメイン及びFcドメインを含む。特に、多機能性分子は、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む軽鎖である第1の鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)、第1の定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含む重鎖であり、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第2の鎖
(当該第1及び第2の鎖が、免疫細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を形成する)、
(iii)可変ドメイン(VH)、第1の定常ドメイン(CL)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含む重鎖であり、当該CH2及びCH3ドメインが第2のFc鎖を形成する、第3の鎖、並びに
(iv)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CH1)を含む第4の鎖
(当該第3及び第4の鎖が、CD28に結合する第2の結合部分を形成する)
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、Fcドメインを形成する。
別の実施形態では、第1の結合部分はFabであり、第2の結合部分はscFvであり、その結果、多機能性分子は、好ましくは、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第1の軽鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)を含む第1の重鎖
(当該第1の軽鎖及び重鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を形成し、Fabを形成する)、
(iii)可変ドメイン(VL)を含む第2の軽鎖、
(iv)可変ドメイン(VH)を含む第2の重鎖
(当該第2の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、CD28に結合するscFvを形成する)
を含むか又はそれらからなる。
そのような分子は、多機能性分子がFab、scFv及びFcドメインを含むように、Fcドメインを更に含み得る。特に、多機能性分子は、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第1の軽鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)、第1の定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含み、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第1の重鎖
(当該第1の軽鎖及び重鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を形成し、Fabを形成する)、
(iii)可変ドメイン(VL)を含む第2の軽鎖、
(iv)可変ドメイン(VH)を含む第2の重鎖
(当該第2の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、CD28に結合するscFvを形成する)、
(v)第1のFc鎖に相補的であり、Fcドメインを形成する第2のFc鎖
を含むか又はそれらからなる。
特に、本発明の多機能性分子は、
(i)軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含むか又はそれらから本質的になる第1の鎖、
(ii)重鎖可変ドメイン(VH)、第1の重鎖定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の重鎖定常ドメイン(CH2)及び第3の重鎖定常ドメイン(CH3)を含むか又はそれらから本質的になり、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第2の鎖
(当該第1及び第2の鎖が、T細胞表面に特異的に発現されるPD-1等の標的に結合する第1の結合部分を形成し、Fabを形成する)、
(iii)a)好ましくはペプチドリンカーによって可変ドメイン(VH)に連結され、CD28に結合するscFVである第2の結合部分を形成する可変ドメイン(VL)、並びにb)任意でヒンジ、及び第1のFc鎖に相補的であり、Fcドメインを形成する第2のFc鎖を含むか又はそれらから本質的になる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第3の鎖は、CD28に結合する第2の結合部分を形成する。
一実施形態では、第1の結合部分はCrossMAbであり、第2の結合部分はScFVであり、その結果、多機能性分子は、好ましくは、
(i)軽鎖可変ドメイン(VL)及び重鎖定常ドメイン(CH1)を含む第1の鎖、
(ii)重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含む第2の鎖
(当該第1及び第2の鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的、好ましくはPD-1に結合するCrossMAbを形成する)、
(iii)好ましくはペプチドリンカーによって連結された、可変ドメイン(VH)及び可変ドメイン(VL)を含み、CD28に結合するscFvを形成する第3の鎖
を含むか又はそれらからなる。
そのような分子は、Fcドメインを更に含み得る。特に、多機能性分子は、
(ii)重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含む第1の鎖、
(ii)軽鎖可変ドメイン(VL)及び重鎖定常ドメイン(CH1)、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含み、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第2の鎖
(第1及び第2の鎖が、免疫細胞表面に特異的に発現される、PD-1等の標的に結合する第1の結合部分を形成する)、
(iii)a)好ましくはペプチドリンカーによって可変ドメイン(VH)に連結され、CD28に結合するscFVである第2の結合部分を形成する可変ドメイン(VL)、並びにb)第1のFc鎖に相補的であり、Fcドメインを形成する第2のFc鎖を含む第3の鎖
を含むか又はそれらからなる。
特に、scFvは、第2のFc鎖のN末端、第1若しくは第2のFc鎖のC末端、又は第1の結合部分のCLのC末端のいずれかに、好ましくは第2のFc鎖のN末端又は第1のFc鎖のC末端に、更により好ましくは第2のFc鎖のN末端に連結され得る。
特定の実施形態では、第2のFc鎖は、任意の結合部分、免疫療法剤又は他のタンパク質を欠いている。
或いは、第2のFc鎖は、そのC末端で、CD28に結合する部分ではない別の結合部分又は免疫療法剤若しくはタンパク質に連結することができる。
別の実施形態では、第1の結合部分はF(ab')2であり、第2の結合部分はscFvである。特に、多機能性分子は、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第1の軽鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)を含む第1の重鎖、
(iii)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第2の軽鎖、並びに
(iv)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)を含む第2の重鎖
(当該第1及び第2の軽鎖並びに当該第2の軽鎖及び重鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分F(ab')2を形成する)、
(v)可変ドメイン(VL)を含む第3の軽鎖、
(vi)可変ドメイン(VH)を含む第3の重鎖
(当該第3の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、CD28に結合する第2の結合部分(scFv)を形成する)
を含むか又はそれらからなる。
特定の実施形態では、F(ab')2は、Fab及びCrossMabを含み、その結果、多機能性分子は、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CH1)を含む第1の軽鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CL)を含む第1の重鎖、
(iii)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第2の軽鎖、
(iv)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)を含む第2の重鎖
(当該第1及び第2の軽鎖並びに当該第1及び第2の重鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を形成する)、
(v)可変ドメイン(VL)を含む第3の軽鎖、
(vi)可変ドメイン(VH)を含む第3の重鎖
(当該第3の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、CD28に結合する第2の結合部分(scFv)を形成する)
を含むか又はそれらからなる。
特に、多機能性分子は、
(i)軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含むか又はそれらから本質的になる第1の鎖、
(ii)重鎖可変ドメイン(VH)及び重鎖定常ドメイン(CH1)を含むか又はそれらから本質的になる第2の鎖、
(iii)軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含むか又はそれらから本質的になる第3の鎖、
(iv)重鎖可変ドメイン(VH)及び重鎖定常ドメイン(CH1)を含むか又はそれらから本質的になる第4の鎖
(当該第1、第2、第3及び第4の鎖が、T細胞表面に特異的に発現されるPD-1等の標的に結合する第1のF(ab')2結合部分を形成する)、
(v)好ましくはペプチドリンカーによって可変ドメイン(VH)に連結された可変ドメイン(VL)を含むか又はそれらから本質的になり、CD28に結合するscFVである第2の結合部分を形成する第5の鎖
を含むか又はそれらからなる。
そのような分子は、多機能性分子がF(ab')2、scFv及びFcドメインを含むように、Fcドメインを更に含み得る。特に、多機能性分子は、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第1の軽鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含み、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第1の重鎖、
(iii)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第2の軽鎖、
(iv)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含み、当該CH2及びCH3ドメインが第2のFc鎖を形成する、第2の重鎖
(第1及び第2のFc鎖が相補的であり、Fcドメインを形成し、当該第1及び第2の軽鎖並びに当該第1及び第2の重鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分(抗体)を形成する)、
(v)可変ドメイン(VL)を含む第3の軽鎖、
(vi)可変ドメイン(VH)を含む第3の重鎖
(当該第3の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、CD28に結合する第2の結合部分(scFv)を形成する)
を含むか又はそれらからなる。
特に、多機能性分子は、
(i)軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含むか又はそれらから本質的になる第1の鎖、
(ii)重鎖可変ドメイン(VH)及び重鎖定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の重鎖定常ドメイン(CH2)及び第3の重鎖定常ドメイン(CH3)を含むか又はそれらから本質的になり、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第2の鎖
(iii)軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含むか又はそれらから本質的になる第3の鎖、
(iv)重鎖可変ドメイン(VH)及び第1の重鎖定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の重鎖定常ドメイン(CH2)及び第3の重鎖定常ドメイン(CH3)を含むか又はそれらから本質的になり、当該CH2及びCH3ドメインが第2のFc鎖を形成する、第4の鎖
(第1及び第2のFc鎖が相補的であり、Fcドメインを形成し、当該第1、第2、第3、第4の鎖が、T細胞表面上に特異的に発現されるPD-1等の標的に結合する抗体である第1の結合部分を形成する)、並びに
(vi)好ましくはペプチドリンカーによって可変ドメイン(VH)に連結された可変ドメイン(VL)を含むか又はそれらから本質的になり、CD28に結合するscFVである第2の結合部分を形成する第5の鎖
を含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、分子は、Fab及びCrossMAbを含むF(ab')2、scFv及びFcドメインを含む。特に、多機能性分子は、
(i)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CH1)を含む第1の軽鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CL)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含み、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第1の重鎖、
(iii)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第2の軽鎖、
(iv)可変ドメイン(VH)及び定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含み、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第2の重鎖
(当該第1及び第2の軽鎖並びに当該第1及び第2の重鎖が、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分(抗体)を形成する)、
(v)可変ドメイン(VL)を含む第3の軽鎖、
(vi)可変ドメイン(VH)を含む第3の重鎖
(当該第3の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、CD28に結合する第2の結合部分(scFv)を形成する)
を含むか又はそれらからなる。
特に、scFvは、第1若しくは第2のFc鎖のC末端、第1の結合部分の第1若しくは第2の軽鎖のCLのC末端、又は第1の結合部分の第1若しくは第2の軽鎖のVH若しくはVLのN末端のいずれかに連結され得る。
一実施形態では、第1及び第2の結合部分は、いずれもscFvであり、その結果、多機能性分子は、好ましくは、
(i)可変ドメイン(VL)を含む第1の軽鎖、並びに
(ii)可変ドメイン(VH)を含む第1の重鎖
(当該第1の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を形成する)
(iii)可変ドメイン(VL)を含む第2の軽鎖、
(iv)可変ドメイン(VH)を含む第2の重鎖
(当該第2の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、CD28に結合する第2の結合部分を形成する)
を含むか又はそれらからなる。
そのような分子は、Fcドメインを更に含んでもよく、その結果、多機能性分子は、
(i)可変ドメイン(VL)を含む第1の軽鎖、
(ii)可変ドメイン(VH)、任意でヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含み、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第1の重鎖
(当該第1の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を形成する)、並びに
(iii)可変ドメイン(VL)及び定常ドメイン(CL)を含む第2の軽鎖、
(iv)可変ドメイン(VH)、第1の定常ドメイン(CH1)、任意でヒンジ、第2の定常ドメイン(CH2)及び第3の定常ドメイン(CH3)を含み、当該CH2及びCH3ドメインが第2のFc鎖を形成する、第2の重鎖
(当該第2の軽鎖及び重鎖が、ペプチドリンカーによって連結され、CD28に結合する第2の結合部分を形成する)
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、Fcドメインを形成する。
本発明の多機能性分子を構成する種々の要素を以下に更に詳細に記載する。
結合部分
本発明によれば、多機能性分子は、
(a)T細胞表面、特にT細胞に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分、及び
(a)CD28のアゴニストであり、抗CD28抗原結合ドメインである第2の結合部分を含み、
当該多機能性分子は、単一の抗CD28抗原結合ドメインを含む。
上述のように、多機能性分子は、特に、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する2つ、3つ又は4つの結合部分、CD28に結合する1つのみの結合部分を含み得る。例えば、多機能性分子は、T細胞表面上に特異的に発現される標的に結合する1つ、2つ、又は3つの結合部分及びCD28に結合する1つの結合部分を含み得る。
結合部分は、本明細書において以下により詳細に記載される。「第1の結合部分」の項は、本発明による多機能性分子に含まれ得る「T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する1、2又は3つの結合部分」として機能することができる結合部分の例である。この項において、「第2の結合部分」は、CD28に対する結合部分の例である。
第1及び第2の結合部分は、好ましくは、特にFab、Fab'、F(ab')2、Fv、一本鎖(scFV)、CrossMAb又はナノボディ(VHH)、好ましくはF(ab')2、Fab、CrossMAb又はscFVに由来する抗原結合ドメインである。多機能性分子において、第1及び第2の結合部分は、同じ又は異なる形式を有してもよい。特定の態様では、第1及び第2の結合部分は、いずれもscFvではない。好ましい態様では、抗CD28抗原結合部分はscFvであり、免疫細胞、特にT細胞表面に特異的に発現される標的に結合する結合部分はscFvではない。
一実施形態では、第1又は第2の結合部分は、CrossMabである。
好ましくは、抗CD28抗原結合部分はscFvであり、免疫細胞表面に特異的に発現される標的に結合する結合部分は、F(ab')2、Fab又はCrossMAbを含むか又はそれらからなる。
第1の結合部分
本発明による多機能性分子は、第1の結合部分を含み、当該第1の結合部分は、T細胞、特に腫瘍環境に存在する(例えば、腫瘍部位に動員される)T細胞、例えばPD-1陽性T細胞に特異的に発現される標的に結合する。
T細胞表面に特異的に発現される標的は、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、NKG2A、LAG3、2B4、DR3、CD101、CD44、CD38、CXCR3、CXCR5、CD4、CD8、CD25、CRTAM、CD96、CD226、CD112R、CD103、CEACAM及びCD122からなる群から選択される。好ましくは、T細胞表面に特異的に発現される標的は、PD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3からなる群から選択され、好ましくはPD-1である。これらのマーカーは、特に、TCR経路(抗原提示細胞とT細胞との間の相互作用)の抗原ではない。
好ましくは、T細胞表面に特異的に発現される標的は、T細胞と腫瘍細胞との間の相互作用を可能にする標的である(例えば、T細胞上のPD-1及び腫瘍細胞上のPD-L1)。特に、T細胞表面に特異的に発現される標的は、TCR経路を介してT細胞と抗原提示細胞(APC)との間の相互作用を可能にする標的ではない。
本明細書で使用される場合、結合部分の「標的」という用語は、本発明による第1の結合部分によって特異的に認識又は標的化され、T細胞の外表面に発現される炭水化物、脂質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原又はエピトープを指す。T細胞の表面での標的の発現に関して、「発現された」という用語は、細胞の外表面に存在するか又は提示される炭水化物、脂質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗原又はエピトープ等の標的を指す。
一態様では、標的は、健康な対象又は疾患、特に癌等に罹患している対象においてT細胞によって特異的に発現される。一態様では、標的は、癌等の疾患に罹患している対象においてT細胞によって特異的に発現される。好ましくは、標的は、健康な対象よりも、癌等の疾患に罹患している対象のT細胞において、より高い発現レベルを有する。これは、標的が、他の細胞よりもT細胞においてより高い発現レベルを有すること、又は全免疫細胞に対する標的を発現するT細胞の割合が、他の全細胞に対する標的を発現する他の細胞の割合よりも高いことを意味する。好ましくは、発現レベル又は割合は、2、5、10、20、50又は100倍高い。より具体的には、T細胞、より具体的にはCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、エフェクターT細胞若しくは疲弊したT細胞について、又は特定の状況において、例えば、癌若しくは感染性疾患等の疾患に罹患している対象について決定することができる。
本明細書で使用される「T細胞」又は「Tリンパ球」は、例えば、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、Tヘルパー1型T細胞、Tヘルパー2型T細胞、制御性T細胞、Tヘルパー17型T細胞、及び抑制性T細胞を含む。より特定の態様では、T細胞は、疲弊したT細胞又はエフェクターメモリー幹細胞様T細胞である。
標的は、T細胞の表面で発現される受容体であってもよい。受容体は、抑制性受容体であってもよい。或いは、受容体は活性化受容体であってもよい。
有利には、第1の結合部分は、CD28にも、又はその任意のバリアント若しくは変異体にも結合しない。或いは、又は更に、第1の結合部分は、CD28リガンド、すなわち、B7.1及びB7.2にも、又はその任意のバリアント若しくは変異体にも結合しない。
T細胞に発現されるこのような標的は、以下の表Dにより詳細に記載される。
特定の態様では、T細胞は疲弊したT細胞又はエフェクターメモリー幹細胞様T細胞であり、標的は疲弊したT細胞又はエフェクターメモリー幹細胞様T細胞の表面に発現される因子である。T細胞疲弊は、T細胞の機能、増殖能力及び細胞傷害能が徐々に失われ、最終的に消滅に至る状態である。T細胞疲弊は、持続的な抗原曝露又はPD-1、TIM3、CTLA-4、LAG-3、BTLA、TIGIT及びCD160を含む抑制性受容体等のいくつかの因子によって誘発することができる。好ましくは、そのような因子、特にそのような疲弊因子は、PD-1、TIM3、CTLA-4、LAG3、BTLA、TIGIT及びCD160からなる群から選択される。
好ましい態様では、第1の結合部分は、特に腫瘍細胞とT細胞(例えばPD-1)との間のチェックポイント阻害剤に対する、標的に対するアンタゴニスト活性を有する抗原結合ドメインである。
本明細書で使用される「アンタゴニスト」という用語は、別の物質の活性又は機能性を遮断又は低減する物質を指す。特に、この用語は、細胞受容体(例えば、PD-1)に参照物質(例えば、PD-L1及び/又はPD-L2)として結合し、その通常の生物学的効果(例えば、免疫抑制性微小環境の形成)の形成の全て又は一部を妨げる結合ドメインを指す。アンタゴニスト活性は、競合ELISAによって評価することができる。
一実施形態では、第1の結合部分は、特に抗体に由来する抗原結合ドメインである。これは、特に、F(ab')2、Fab、Fab'又はscFV等の抗体断片に関しては、そのような断片、特にVL及びVH鎖は、抗体、特に当技術分野において既に記載されている抗体に由来することを意味する。
好ましい態様では、多機能性分子の第1の結合部分は、免疫チェックポイント阻害剤に特異的な抗体、その断片又は誘導体である。
更により好ましくは、本発明の多機能性分子は、第1の結合部分を含み、当該第1の結合部分は、T細胞表面上に特異的に発現されるPD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3からなる群から選択される標的に結合する。
好ましい態様では、多機能性分子の第1の結合部分は、PD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3に特異的な、F(ab')2、Fab、Fab'又は一本鎖可変断片(scFV)等の抗体、その断片又は誘導体である。
好ましくは、多機能性分子の第1の結合部分は、PD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3に、好ましくはPD-1に特異的なF(ab')2、Fab、Fab'又はCrossMAbである。更により好ましくは、多機能性分子の第1の結合部分は、PD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3に、好ましくはPD-1に特異的なFab又はCrossMAbである。
好ましい態様では、多機能性分子の第1の結合部分は、PD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3に特異的な、F(ab')2、Fab、Fab'又は一本鎖可変断片(scFV)等の抗体、その断片又は誘導体からのものであるか又はそれらに由来する。これは、第1の結合部分が少なくとも抗原結合ドメイン(すなわち、当該抗体のCDR又はVH及びVLドメイン)を含むことを意味する。
PD-1、TIM3、VISTA、CTLA-4、LAG-3、BTLA、TIGIT及びCD160に対する多数の抗体が、当技術分野において既に記載されている。
本明細書で使用される場合、「プログラム死1」、「プログラム細胞死1」、「PD1」、「PD-1」、「PDCD1」、「PD-1抗原」、「ヒトPD-1」、「hPD-1」及び「hPD1」という用語は、互換的に使用され、CD279としても知られるプログラム死-1受容体を指し、ヒトPD-1のバリアント及びアイソフォーム、並びにPD-1と少なくとも1つの共通エピトープを有する類似体を含む。PD-1は、免疫応答及び末梢免疫寛容の閾値の重要な調節因子である。PD-1は、活性化T細胞、B細胞、単球、及び樹状細胞上に発現され、そのリガンドPD-L1及びPD-L2に結合する。ヒトPD-1は、PDCD1遺伝子によってコードされる。一例として、ヒトPD-1のアミノ酸配列は、GenBank受入番号NP_005009の下で開示されている。PD1は、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)上に発現される4つのスプライスバリアントを有する。したがって、PD-1タンパク質は、全長PD-1、並びにPD-1Aex2、PD-1Aex3、PD-1Aex2,3及びPD-1Aex2,3,4等のPD-1の選択的スプライシングバリアントを含む。他に特定されない限り、この用語は、PBMCによって天然に発現されるか、又はPD-1遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現される、ヒトPD-1の任意のバリアント及びアイソフォームを含む。
いくつかの抗PD-1は既に臨床的に承認されており、他のものはまだ臨床開発中である。例えば、抗PD1抗体は、ペンブロリズマブ(キイトルーダ、ラムブロリズマブ、MK-3475、SCH-900475としても知られる)、ニボルマブ(OPDIVO、MDX-1106、BMS-936558、ONO-4538)、ピディリズマブ(CT-011)、セミプリマブ(Libtayo)、カムレリズマブ、AUNP12、AMP-224、AGEN-2034(バルスチリマブ)、BGB-A317(チスレリズマブ)、PDR001(スパルタリズマブ)、MK-3477、PF-06801591(ササンリマブ)、JNJ-63723283(セトレリマブ)、ゲノリムズマブ(CBT-501)、LZM-009(Lipustobart)、BCD-100(プロゴリマブ)、SHR-1201、BAT-1306、AK-103(HX-008)、MEDI-0680(AMP-514としても知られる)、JS001(Si-Yang Liuら、J. Hematol. Oncol.10:136(2017)を参照)、BI-754091、CBT-501、INCSHR1210(SHR-1210としても知られる)、TSR-042(ANB011としても知られる)、GLS-010(WBP3055としても知られる)、AM-0001(Armo)、STI-1110(国際公開第2014/194302号を参照)、MGA012(国際公開第2017/19846号を参照)、又はIBI308(その開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2017/024465号、国際公開第2017/025016号、国際公開第2017/132825号及び国際公開第2017/133540号を参照し、)、その開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2006/121168号に記載されているモノクローナル抗体5C4、17D8、2D3、4H1、4A11、7D3及び5F4からなる群より選択することができる。RG7769(Roche社)、XmAb20717(Xencor社)、MEDI5752(AstraZeneca社)、FS118(F-star社)、SL-279252(Takeda社)及びXmAb23104(Xencor社)等のPD-1を標的とする多機能性分子も公知である。
いくつかの態様では、標的はPD-1であり、第1の結合部分はPD-1に特異的である。好ましくは、第1の結合部分は、PD-1のアンタゴニストである。更により好ましくは、抗PD-1抗体は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ又はOSE-279(例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2020/127366号に記載されている)である。
特定の態様では、抗PD1抗体は、ペンブロリズマブ(キイトルーダ、ランブロリズマブ、MK-3475としても知られる)又はニボルマブ(オプジーボ、MDX-1106、BMS-936558、ONO-4538)であってもよい。
TIM3に対する抗体及びTIM3を標的とする多機能性分子もまた、Sym023、TSR-022、MBG453、LY3321367、INCAGN02390、BGTB-A425、LY3321367、RG7769(Roche社)等として公知である。いくつかの態様では、TFM-3抗体は、国際公開第2013006490、国際公開第2016/161270号、国際公開第2018/085469号、又は国際公開第2018/129553号、国際公開第2011/155607号、米国特許第8,552,156号号、欧州特許出願公開第2581113号、及び米国特許出願公開第2014/044728号に開示されるとおりであり、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
CTLA-4に対する抗体及びCTLA-4を標的とする多機能性分子もまた、イピリムマブ、トレメリムマブ、MK-1308、AGEN-1884、XmAb20717(Xencor社)、MEDI5752(AstraZeneca社)等として公知である。抗CTLA-4抗体はまた、国際公開第18025178号、国際公開第19179388号、国際公開第19179391号、国際公開第19174603号、国際公開第19148444号、国際公開第19120232号、国際公開第19056281号、国際公開第19023482号、国際公開第18209701号、国際公開第18165895号、国際公開第18160536号、国際公開第18156250号、国際公開第18106862号、国際公開第18106864号、国際公開第18068182号、国際公開第18035710号、国際公開第18025178号、国際公開第17194265号、国際公開第17106372号、国際公開第17084078号、国際公開第17087588号、国際公開第16196237号、国際公開第16130898号、国際公開第16015675号、国際公開第12120125号、国際公開第09100140号及び国際公開第07008463号に開示されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
LAG3に対する抗体及びLAG-3を標的とする多機能性分子もまた、BMS-986016、IMP701、MGD012又はMGD013(二重特異性PD-1及びLAG-3抗体)等として公知である。抗LAG-3抗体はまた、国際公開第2008132601号、欧州特許出願公開第2320940号、国際公開第19152574号に開示されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
BTLAに対する抗体もまた、hu Mab8D5、hu Mab8A3、hu Mab21H6、hu Mab19A7、又はhu Mab4C7等として当技術分野で公知である。BTLAに対する抗体TAB004は、現在、進行した悪性腫瘍を有する対象において臨床試験中である。抗BTLA抗体はまた、国際公開第08076560号、国際公開第10106051号(例えば、BTLA8.2)、国際公開第11014438号(例えば、4C7)、国際公開第17096017号及び国際公開第17144668号(例えば、629.3)に開示されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
TIGITに対する抗体もまた、国際公開第19232484号に開示されるようなBMS-986207又はAB154、BMS-986207 CPA.9.086、CHA.9.547.18、CPA.9.018、CPA.9.027、CPA.9.049、CPA.9.057、CPA.9.059、CPA.9.083、CPA.9.089、CPA.9.093、CPA.9.101、CPA.9.103、CHA.9.536.1、CHA.9.536.3、CHA.9.536.4、CHA.9.536.5、CHA.9.536.6、CHA.9.536.7、CHA.9.536.8、CHA.9.560.1、CHA.9.560.3、CHA.9.560.4、CHA.9.560.5、CHA.9.560.6、CHA.9.560.7、CHA.9.560.8、CHA.9.546.1、CHA.9.547.1、CHA.9.547.2、CHA.9.547.3、CHA.9.547.4、CHA.9.547.6、CHA.9.547.7、CHA.9.547.8、CHA.9.547.9、CHA.9.547.13、CHA.9.541.1、CHA.9.541.3、CHA.9.541.4、CHA.9.541.5、CHA.9.541.6、CHA.9.541.7及びCHA.9.541.8等として、当技術分野で公知である。抗TIGIT抗体はまた、国際公開第16028656号、国際公開第16106302号、国際公開第16191643号、国際公開第17030823号、国際公開第17037707号、国際公開第17053748号、国際公開第17152088号、国際公開第18033798号、国際公開第18102536号、国際公開第18102746号、国際公開第18160704号、国際公開第18200430号、国際公開第18204363号、国際公開第19023504号、国際公開第19062832号、国際公開第19129221号、国際公開第19129261号、国際公開第19137548号、国際公開第19152574号、国際公開第19154415号、国際公開第19168382号及び国際公開第19215728号に開示されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
CD160に対する抗体もまた、国際公開第06015886号に開示されるようなCL1-R2 CNCM I-3204等として、又は国際公開第10006071号、国際公開第10084158号、国際公開第18077926号に開示されるような他の抗体として公知であり、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
別の特定の態様では、標的はPD-1であり、多機能性分子の第1の結合部分は、PD-1に特異的な抗原結合ドメイン、特にFab若しくはscFv又は抗体模倣物等の抗体、その断片若しくは誘導体である。次いで、特定の態様では、本発明による多機能性分子に含まれる抗原結合ドメインは、抗PD1抗体又はその抗原結合断片、好ましくはヒト、ヒト化若しくはキメラ抗PD1抗体又はその抗原結合断片である。
一実施形態では、標的はPD-1であり、第1の結合部分は、PD-1に特異的なF(ab')2、Fab又はscFv、好ましくはヒト、ヒト化又はキメラ抗PD1 Fab又はscFvである。
好ましくは、抗原結合ドメインは、PD-1のアンタゴニストである。
本開示のより特定の態様では、第1の結合部分は、PD-1を標的とし、その開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2020/127366号に開示されている抗体に由来する抗原結合ドメインである。
次いで、一実施形態では、第1の結合部分は、
(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、並びに
(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変ドメインを含む抗PD-1抗体結合ドメインを含み、
ここで、
- 重鎖CDR1(HCDR1)は、特に配列番号1の3位以外の任意の位置に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR2(HCDR2)は、特に配列番号2の13、14及び16位以外の任意の位置に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号2のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR3(HCDR3)は、特に配列番号3の2、3、7及び8位以外の任意の位置に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号3のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR1(LCDR1)は、特に配列番号4の5、6、10、11及び16位以外の任意の位置に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号4のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR2(LCDR2)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号5のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR3(LCDR3)は、配列番号6の1、4及び6位以外の任意の位置に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号6のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
別の態様では、抗PD-1抗原結合ドメインは、(i)配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含む重鎖可変領域(VH)並びに(ii)配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
好ましくは、そのような抗PD1結合ドメインのCDRは、Kabat法によって決定されている。
一態様では、抗PD-1抗原結合ドメインは、フレームワーク領域、特に重鎖可変領域フレームワーク領域(HFR)HFR1、HFR2、HFR3及びHFR4並びに軽鎖可変領域フレームワーク領域(LFR)LFR1、LFR2、LFR3及びLFR4、特にHFR1、HFR2、HFR3及びHFR4を含み、任意に、特にHFR3、すなわち配列番号9の27、29及び32位以外の任意の位置に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を有する。好ましくは、抗PD-1抗原結合ドメインは、配列番号7のHFR1、配列番号8のHFR2、配列番号9のHFR3及び配列番号10のHFR4を含む。更に、抗PD-1抗原結合ドメインは、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する軽鎖可変領域フレームワーク領域(LFR)LFR1、LFR2、LFR3及びLFR4を含み得る。好ましくは、抗PD-1抗原結合ドメインは、配列番号11のLFR1、配列番号12のLFR2、配列番号13のLFR3及び配列番号14のLFR4を含む。
一態様では、抗PD1抗原結合ドメインは、
(a)特に配列番号15の7、16、17、20、33、38、43、46、62、63、65、69、73、76、78、80、84、85、88、93、95、96、97、98、100、101、105、106及び112位以外の任意の位置に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号15のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域(VH)、
(b)特に配列番号16の3、4、7、14、17、18、28、29、33、34、39、42、44、50、81、88、94、97、99及び105位以外の任意の位置に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号16のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
好ましくは、1、2又は3つの修飾は、CDRの外側にある(すなわち、フレームワーク領域中にある)。
一態様では、抗PD1抗原結合ドメインは、
(a)配列番号15に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、97%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域(VH)、及び
(b)配列番号16に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ酸配列と80%、85%、90%、95%、97%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
別の態様では、抗PD1抗原結合ドメインは、
(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域(VH)、及び(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
別の実施形態では、第1の結合部分は、
(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、並びに
(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変ドメインを含む抗PD-1抗体結合ドメインを含み、
ここで、
- 重鎖CDR1(HCDR1)は、配列番号65のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR2(HCDR2)は、配列番号66のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR3(HCDR3)は、配列番号67のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR1(LCDR1)は、配列番号68のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR2(LCDR2)は、配列番号69のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR3(LCDR3)は、配列番号70のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
好ましくは、当該抗PD-1抗原結合ドメインは、i)配列番号71のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVH、及びii)配列番号72のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVLを含む。
別の実施形態では、第1の結合部分は、
(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、並びに
(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変ドメインを含む抗PD-1抗体結合ドメインを含み、
ここで、
- 重鎖CDR1(HCDR1)は、配列番号73のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR2(HCDR2)は、配列番号74のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR3(HCDR3)は、配列番号75のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR1(LCDR1)は、配列番号76のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR2(LCDR2)は、配列番号77のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR3(LCDR3)は、配列番号78のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
好ましくは、当該抗PD-1抗原結合ドメインは、i)配列番号79のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVH、及びii)配列番号80のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVLを含む。
一実施形態では、抗PD-1抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインがFabであるように、VH、VL、CH1及びCLドメインを含む。
そのような実施形態では、重鎖定常ドメイン(CH1)は、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する配列番号17を含むか又はそれから本質的になる。
好ましくは、軽鎖定常ドメイン(CL)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する配列番号18を含むか又はそれから本質的になる。
一実施形態では、抗PD-1抗原結合ドメインは、Fab又はFab'、Fab又はF(ab' )2であり、i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び16に記載のアミノ酸配列を有するVHドメイン及びCH1ドメイン、並びにii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18に記載のアミノ酸配列を有するVLドメイン及びCLドメインを含む。
好ましくは、第1の結合部分は、i)それぞれ配列番号15及び16に記載のアミノ酸配列を有するVHドメイン及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる鎖、並びにii)それぞれ配列番号16及び18に記載のアミノ酸配列を有するVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる鎖を含むか又はそれらからなる抗PD-1 Fab又はF(ab')2である。
一実施形態では、第1の結合部分は、i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号19に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる鎖、並びにii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる鎖を含むか又はそれらからなる抗PD-1 Fab又はF(ab')2である。
一実施形態では、第1の結合部分は、i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び18に記載のアミノ酸配列を有するVH及びCLドメインを含むか又はそれらからなる鎖、ii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び17に記載のアミノ酸配列を有するVL及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる鎖を含むか又はそれらからなる抗PD1 CrossMAbを含む。
好ましくは、第1の結合部分は、i)それぞれ配列番号15及び18に記載のアミノ酸配列を有するVHドメイン及びCLドメインを含むか又はそれらからなる鎖、並びにii)それぞれ配列番号16及び17に記載のアミノ酸配列を有するVL及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる鎖を含むか又はそれらからなる抗PD1 CrossMAbを含む。
一実施形態では、第1の結合部分は、i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号21に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる鎖、並びにii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号22に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる鎖を含むか又はそれらからなる抗PD1 CrossMAbである。
好ましくは、VH及び/若しくはVL又はCH及び/若しくはCLにおける1、2又は3つの修飾は、本明細書において上記したVH、VL、CH及び/又はCLのいずれか1つについてのCDRの外側にある(すなわち、フレームワーク領域中にある)。
第2の結合部分
本発明による多機能性分子は、第2の結合部分を含み、当該第2の結合部分は、CD28のアゴニストであり、抗CD28抗原結合ドメインである。多機能性分子は、分子がCD28に結合する抗原結合ドメインを1つのみ含むように、単一の第2の結合部分を含む。特に、多機能性分子は、CD28の標的化に関して一価である(CD28に対する原子価のみを有する)。
本明細書で使用される場合、「CD28」は、T細胞などのいくつかの免疫細胞の表面に発現される同時刺激分子に関する。特定の実施形態によれば、CD28タンパク質は、以下のGenBank番号NP_001230006、NP_001230007、NP_006130に提供されるようなヒトタンパク質を指す。ヒトCD28のcDNAは、配列を公開したDr.A.Aruffo及びDr.B.Seed、並びに文献Aruffo,A.及びSeed,B.、1987、「Molecular cloning of a CD28 cDNA by a high efficiency COS cell expression system」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:8573の以下の部分から自由に入手可能である。したがって、ヒトCD28のcDNAの産生は、この文献から詳細に理解することができる。CD28に対するいくつかのリガンドであるB7.1(CD80としても知られる)及びB7.2(CD86としても知られる)が同定されている。B7.1タンパク質は、特に、以下のGenBank番号NP_005182に提供されるようなヒトタンパク質を指す。特定の実施形態によれば、B7.2タンパク質は、以下のGenBank番号NP_001193853に提供されるようなヒトタンパク質を指す。
CD28とそのリガンドとの相互作用は、TCRシグナルと相乗作用してT細胞の活性化、増殖及び機能を促進する同時刺激シグナルを誘発する。CD28シグナル伝達は、T細胞活性化の閾値を調節し、T細胞活性化に必要なTCR関与の数を減少させることが示された。
本明細書で使用される場合、「CD28アゴニスト」という用語は、CD28の生物学的機能及び/又は発現を誘導及び/又は増加させるアゴニスト剤を指す。特定の実施形態によれば、CD28アゴニストは、CD28による免疫細胞(例えば、T細胞)へのシグナル伝達を誘導及び/又は増加させ、それによって、CD28免疫同時刺激活性を誘導及び/又は増加させる。特に、CD28アゴニストは、TCR活性化シグナル後のエフェクターT細胞の免疫応答を促進する。
特定の実施形態によれば、CD28アゴニストは、CD28に直接結合し、CD28受容体を活性化する。
特定の実施形態では、CD28アゴニストは、CD28への高親和性結合、例えば、107M、108M、109M、1010M以下のKDでのヒトCD28への結合、他の免疫チェックポイントタンパク質、例えば、CTLA-4及びICOSへの有意な交差反応性の欠如、T細胞増殖を刺激する能力、IFN-γ及び/又はIL-2分泌を増加させる能力、抗原特異的記憶応答を刺激する能力、抗体応答を刺激する能力及び/又は腫瘍細胞の増殖を阻害する能力等の1つ又は複数の望ましい機能特性を示す。
いくつかの実施形態では、CD28アゴニストは、Fab、Fab'、一本鎖可変断片(scFV)又は単一ドメイン抗体(sdAb)、好ましくは抗体、特にスーパーアゴニスト抗CD28抗体又は従来の抗CD28抗体に由来するFab又はscFVである。
いくつかの例では、抗CD28結合ドメインは、sdAb又はVHHではない。
本明細書で使用される場合、「従来の抗CD28抗体」という用語は、CD28に結合し(例えば、基底側部の外側のドメインにおいて)、TCR依存性機構においてT細胞を同時刺激する抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「スーパーアゴニスト抗CD28抗体」という用語は、TCR刺激が存在しない場合でさえもTリンパ球のポリクローナル活性化をもたらす基底側部を介してCD28に結合する抗体を指す。
本発明での使用に適した抗CD28抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。或いは、当技術分野で認識されている抗CD28抗体を使用することができる。抗CD28抗体の例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるPoirierら(2012)American Journal of Transplantation 12(7):1682-1690、Cell Immunol. 2005 Jul-Aug;236(1-2):154-60に開示される。
本発明のいくつかの実施形態に従って使用することができる特定の抗CD28抗体としては、TAB08(以前はTGN1412として知られ、TheraMAB社によって産生された)、ヒトCD28に対するヒト化モノクローナル抗体、Bioscienceカタログ番号100186によって提供される抗CD28アゴニスト抗体(ヒト化)、又はヒトCD28に対するマウスモノクロナール抗体(クローンCD28.2、例えばeBioscience番号16-0289-81によって提供される)が挙げられるが、これらに限定されない。
次いで、一実施形態では、第2の結合部分は、
(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、並びに
(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変ドメインを含む抗CD28抗体結合ドメインを含み、
ここで、
- 重鎖CDR1(HCDR1)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号30のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR2(HCDR2)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号31のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR3(HCDR3)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号32のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR1(LCDR1)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号33のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR2(LCDR2)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号34のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR3(LCDR3)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号35のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
別の態様では、第2の抗原結合ドメインは、(i)配列番号30のCDR1、配列番号31のCDR2及び配列番号32のCDR3を含む重鎖可変領域(VH)並びに(ii)配列番号33のCDR1、配列番号34のCDR2及び配列番号35のCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
好ましくは、そのような抗CD28結合ドメインのCDRは、Kabat法によって決定されている。
一態様では、このような抗CD28抗原結合ドメインは、フレームワーク領域、特に重鎖可変領域フレームワーク領域(HFR)HFR1、HFR2、HFR3及びHFR4並びに軽鎖可変領域フレームワーク領域(LFR)LFR1、LFR2、LFR3及びLFR4を含む。好ましくは、抗CD28抗原結合ドメインは、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号36のHFR1、配列番号37のHFR2、配列番号38のHFR3及び配列番号39のHFR4を含む。更に、抗CD28抗原結合ドメインは、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号40のLFR1、配列番号41のLFR2、配列番号42のLFR3及び配列番号43のLFR4を含み得る。
フレームワーク領域及び相補性決定領域は、好ましくは、以下の順序:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(アミノ末端からカルボキシ末端へ)で作動可能に連結される。別の実施形態では、第2の結合部分は、
(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、並びに
(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含む軽鎖可変ドメインを含む抗CD28抗体結合ドメインを含み、
ここで、
- 重鎖CDR1(HCDR1)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号91のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR2(HCDR2)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号92のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 重鎖CDR3(HCDR3)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号93のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR1(LCDR1)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号94のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR2(LCDR2)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号95のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
- 軽鎖CDR3(LCDR3)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号96のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
別の態様では、第2の抗原結合ドメインは、(i)配列番号91のCDR1、配列番号92のCDR2及び配列番号93のCDR3を含む重鎖可変領域(VH)並びに(ii)配列番号94のCDR1、配列番号96のCDR2及び配列番号97のCDR3を含む軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
好ましくは、そのような抗CD28結合ドメインのCDRは、IMGT法によって決定されている。
一態様では、抗CD28抗原結合ドメインは、フレームワーク領域、特に重鎖可変領域フレームワーク領域(HFR)HFR1、HFR2、HFR3及びHFR4並びに軽鎖可変領域フレームワーク領域(LFR)LFR1、LFR2、LFR3及びLFR4を含む。好ましくは、抗CD28抗原結合ドメインは、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号97のHFR1、配列番号98のHFR2、配列番号99のHFR3及び配列番号100のHFR4を含む。更に、抗CD28抗原結合ドメインは、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号101のLFR1、配列番号102のLFR2、配列番号103のLFR3及び配列番号104のLFR4を含み得る。
これらのフレームワーク領域及び相補性決定領域は、好ましくは、以下の順序:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(アミノ末端からカルボキシ末端へ)で作動可能に連結される。
一態様では、抗CD28抗原結合ドメインは、
(a)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号44のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域(VH)、
(b)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号45のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
別の態様では、抗CD28抗原結合ドメインは、
(a)配列番号44のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域(VH)、及び(b)配列番号45のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
好ましくは、抗CD28抗原結合ドメインは、任意にペプチドリンカーによって連結された、配列番号44の重鎖可変領域(VH)及び配列番号5の軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になるscFVである。
一実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインがFabであるように、VH、VL、CH1及びCLドメインを含む。
そのような実施形態では、重鎖定常ドメイン(CH1)は、好ましくは、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する配列番号46を含むか又はそれから本質的になる。
好ましくは、軽鎖定常ドメイン(CL)は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する配列番号47を含むか又はそれから本質的になる。
一実施形態では、抗CD28結合部分は、i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号44及び46に記載のアミノ酸配列を有するVHドメイン及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる鎖、ii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号45及び47に記載のアミノ酸配列を有するVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる軽鎖を含むか又はそれらからなるFabである。
一実施形態では、抗CD28結合部分は、i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号48に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる鎖、並びにii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号49に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる鎖を含むか又はそれらからなるFabである。
一実施形態では、抗CD28結合部分は、i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号44及び47に記載のアミノ酸配列を有するVHドメイン及びCLドメインを含むか又はそれらからなる鎖、ii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号45及び46に記載のアミノ酸配列を有するVL及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる軽鎖を含むか又はそれらからなるCrossMAbである。
好ましくは、抗CD28結合部分は、i)それぞれ配列番号44及び47に記載のアミノ酸配列を有するVHドメイン及びCLドメインを含むか又はそれらからなる鎖、並びにii)それぞれ配列番号45及び46に記載のアミノ酸配列を有するVL及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる軽鎖を含むか又はそれらからなるCrossMAbを含む。
一実施形態では、抗CD28結合部分は、i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号50に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる鎖、並びにii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号51に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる鎖を含むか又はそれらからなるFabである。
好ましくは、VH及び/若しくはVL又はCH及び/若しくはCLにおける1、2又は3つの修飾は、本明細書において上記したVH、VL、CH及び/又はCLのいずれか1つについてのCDRの外側にある(すなわち、フレームワーク領域中にある)。
いくつかの実施形態では、抗CD28結合ドメインは、参照配列と比較してCDR及び/又はフレームワーク領域に1つ又は複数の変異を含むバリアントである。特に、当該バリアントは、機能保存的バリアントである。本発明の文脈において、これは、当該バリアントが、i)CD28に結合し、ii)CD28に対してアゴニスト活性を有し、iii)本発明の多機能性分子に含まれる場合、多機能性分子にシス活性特性を付与することができることを意味する。そのようなバリアントを含む適切な多機能性分子を選択する方法は、例えば、以下に提供される「適切な多機能性分子を選択する方法」の項に開示される。
特に、抗CD28結合ドメインは、
(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個の修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号36のHFR1、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号30のHCDR1、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号37のHFR2、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号31のHCDR2、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6又は7つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号38のHFR3、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号32のHCDR3、並びに
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号39のHFR4を含む重鎖可変領域(VH)、
並びに(ii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6又は7つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号40のLFR1、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号33のLCDR1、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号41のLFR2、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号34のLCDR2、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6、7又は8個の修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号42のLFR3、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号35のLCDR3、並びに
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号43のLFR4を含む軽鎖可変領域(VL)
を含むか又はそれから本質的になる。
好ましくは、抗CD28結合ドメインは、
(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個のアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号36のHFR1、
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号30のHCDR1、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1又は2つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号37のHFR2、
配列番号31のHCDR2、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6又は7つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号38のHFR3、
配列番号32のHCDR3、並びに
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号39のHFR4を含む重鎖可変領域(VH)、
並びに(ii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6又は7つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号40のLFR1、
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号33のLCDR1、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号41のLFR2、
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号34のLCDR2、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6、7又は8個の修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号42のLFR3、
配列番号35のLCDR3、並びに
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号43のLFR4を含む軽鎖可変領域(VL)
を含むか又はそれから本質的になる。
別の実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインは、
(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は11個のアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号36のHFR1、
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号30のHCDR1を含む重鎖可変領域(VH)、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1又は2つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号37のHFR2、
配列番号31のHCDR2、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6又は7つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号38のHFR3、
配列番号32のHCDR3、並びに
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号39のHFR4を含む重鎖可変領域(VH)、
並びに(ii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号45のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、当該修飾が好ましくはフレームワーク領域中にある軽鎖可変領域(VL)
を含むか又はそれから本質的になる。
別の実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインは、
(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号44のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、当該修飾が好ましくはフレームワーク領域中にある重鎖可変領域(VH)、並びに
(ii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6又は7つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号40のLFR1、
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号33のLCDR1、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号41のLFR2、
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号34のLCDR2、
置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2、3、4、5、6、7又は8個の修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号42のLFR3、
配列番号35のLCDR3、並びに
置換、付加、欠失から選択される1つのアミノ酸修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号43のLFR4を含む軽鎖可変領域(VL)
を含むか又はそれから本質的になる。
別の態様では、抗CD28抗原結合ドメインは、
(a)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せ、好ましくは置換から選択される1、2又は3つのアミノ酸修飾を任意に有する、配列番号44、83、84、85及び88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変領域(VH)、並びに(b)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せ、好ましくは置換から選択される1、2又は3つのアミノ酸修飾を任意に有する、配列番号45、86、87、89及び90からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
好ましくは、VH及び/又はVLにおける1、2又は3つの修飾は、CDRの外側にある(すなわち、フレームワーク領域中にある)。
別の態様では、抗CD28抗原結合ドメインは、
(a)配列番号44、83、84、85及び88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域(VH)、並びに(b)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せ、好ましくはアミノ酸置換から選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号45のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
別の態様では、抗CD28抗原結合ドメインは、
(a)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する配列番号44のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域(VH)、並びに(b)配列番号45、86、87、89及び90からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
別の態様では、抗CD28抗原結合ドメインは、
(a)配列番号44に記載のアミノ酸配列又はそれと80%、85%、90%、95%、97%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域(VH)、並びに(b)配列番号45に記載のアミノ酸配列又はそれと80%、85%、90%、95%、97%若しくは99%の配列同一性を有する配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含むか又はそれらから本質的になる。
Fcドメイン
多機能性分子のFcドメインは、抗原結合ドメインの一部と一緒になって、IgG免疫グロブリンの重鎖を形成することができる。実際、多機能性分子は、特に、可変重鎖(VH)、CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含む1つの重鎖を含み得る。しかしながら、多機能性分子はまた、Fcドメインに共有結合したscFv等の他の抗原結合ドメイン構造を含み得る。
Fcドメインは、ヒト免疫グロブリン重鎖、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、又は他のクラスの重鎖定常ドメインに由来し得る。好ましくは、多機能性分子は、IgG1又はIgG4重鎖定常ドメインを含む。
多機能性分子は、特に、CH1ドメイン、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含み得る。適切な重鎖定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)は、例えば、アミノ酸配列配列番号23及び24に提供されるとおりである。
多機能性分子は、好ましくはFcドメインを含む。そのようなFcドメインは、好ましくは、相補的であり二量体化することができる第1のFc鎖及び第2のFc鎖を含む。特定の実施形態では、第1のFc鎖は、1つ又は複数のアミノ酸付加、欠失又は置換において第2のFc鎖のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。そのようなFc第1及び第2のFc鎖は、「ヘテロ二量体Fc」を形成する。他の実施形態では、第1及び第2のFc鎖は、同じアミノ酸配列を含み、「ホモ二量体Fc」を形成する。
好ましくは、Fcドメインは、CH2及びCH3ドメインを含む。任意に、Fcドメインは、ヒンジ領域、CH2ドメイン及び/又はCH3ドメインの全て又は一部を含むことができる。いくつかの態様では、CH2及び/又はCH3ドメインは、ヒトIgG4又はIgG1重鎖に由来する。好ましくは、Fcドメインは、ヒンジ領域の全て又は一部を含む。ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、又は他のクラスに由来し得る。好ましくは、ヒンジ領域は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4に由来する。より好ましくは、ヒンジ領域は、ヒト又はヒト化IgG1又はIgG4重鎖に由来する。
IgG1ヒンジ領域は3つのシステインを有し、そのうち2つは免疫グロブリンの2つの重鎖間のジスルフィド結合に関与する。これらの同じシステインは、Fc部分間の効率的で一貫したジスルフィド結合形成を可能にする。したがって、本発明の好ましいヒンジ領域は、IgG1、より好ましくはヒトIgG1に由来する。いくつかの態様では、ヒトIgG1ヒンジ領域内の第1のシステインは、別のアミノ酸、好ましくはセリンに変異される。
IgG4のヒンジ領域では、鎖間ジスルフィド結合が不十分にしか形成されない可能性がある。本発明に適したヒンジ領域は、好ましくは重鎖由来部分間のジスルフィド結合の正しい形成を増強する変異を含むIgG4ヒンジ領域に由来し得る(例えば、Angal Sら(1993)Mol. Immunol.、30:105-8に記載される)。より好ましくは、ヒンジ領域はヒトIgG4重鎖に由来する。
一実施形態では、多機能性分子は、特に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号58に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるヒンジ領域を含む。
多機能性分子は、好ましくは二量体Fcドメインを含む。したがって、多機能性分子は、2つのFcドメインを含み、Fc鎖は、二量体Fcドメインを形成することができる。二量体Fcドメインは、ホモ二量体であってもよく、各Fc単量体(又は鎖)は、同一又は本質的に同一である。或いは、二量体Fcドメインは、ヘテロ二量体であってもよく、各Fc単量体(又は鎖)は、ヘテロ二量体Fcドメインの形成を促進するために異なり、かつ相補的である。
より具体的には、Fcドメインはヘテロ二量体Fcドメインである。ヘテロ二量体Fcドメインは、各単量体(すなわち、Fcドメインを形成するFc鎖の各々)のアミノ酸配列を変更することによって作製することができる。ヘテロ二量体Fcドメインは、ヘテロ二量体形成を促進するために、及び/又はホモ二量体よりもヘテロ二量体の精製を容易にするために、各鎖上で異なる定常領域中のアミノ酸バリアントに依存する。本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる多くの機構が存在する。更に、当業者には理解されるように、これらの機構を組み合わせて、高いヘテロ二量体化が得られるようになる。したがって、ヘテロ二量体の産生をもたらすアミノ酸バリアントは、「ヘテロ二量体化バリアント」と呼ばれる。ヘテロ二量体化バリアントは、立体バリアント(例えば、以下に記載される「ノブとホール(knobs and holes)」又は「ねじれ(skew)」バリアント、及び以下に記載される「電荷対」バリアント)、並びにヘテロ二量体からのホモ二量体の精製を可能にする「等電点バリアント」を含み得る。その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第2014/145806号は、ヘテロ二量体化の有用な機構を開示しており、「ノブとホール」、「静電的ステアリング」又は「電荷対」、等電点バリアント、及び一般的な更なるFcバリアントが含まれる。また、その全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるRidgwayら、Protein Engineering 9(7):617(1996);Atwellら、J. Mol. Biol. 1997 270:26;米国特許第8,216,805号、Merchantら、Nature Biotech. 16:677(1998)を参照されたい。「静電的ステアリング」については、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるGunasekaranら、J. Biol. Chem. 285(25):19637(2010)を参照されたい。等電点バリアントについては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2012/0149876号を参照されたい。
次いで、好ましい態様では、ヘテロ二量体Fcドメインは、「ノブとホール」技術に基づいて、第1のFc鎖及び相補的な第2のFc鎖を含む。例えば、第1のFc鎖は、「ノブ」又はK鎖であり、これは、ノブ鎖を特徴付ける置換を含むことを意味し、第2のFc鎖は、「ホール」又はH鎖であり、これは、ホール鎖を特徴付ける置換を含むことを意味する。逆もまた同様であり、第1のFc鎖は「ホール」又はH鎖であり、これは、ホール鎖を特徴付ける置換を含むことを意味し、第2のFc鎖は「ノブ」又はK鎖であり、これは、ノブ鎖を特徴付ける置換を含むことを意味する。
好ましい態様では、抗CD28結合ドメインに連結されるFc鎖(すなわち、第2のFc鎖)は、「ホール」又はH鎖である。或いは、抗CD28結合ドメインに連結されるFc鎖(すなわち、第2のFc鎖)は、「ノブ」又はK鎖である。
任意に、ヘテロ二量体Fcドメインは、以下の表Eに示される置換を含む一方のヘテロ二量体Fc鎖と、以下の表Eに示される置換を含む他方のヘテロ二量体Fc鎖とを含み得る。
好ましい態様では、第1のFc鎖は、「ホール」又はH鎖であり、置換T366S/L368A/Y407V/Y349Cを含み、第2のFc鎖は、「ノブ」又はK鎖であり、置換T366W/S354Cを含む。
任意に、Fc鎖は、追加の置換を更に含み得る。
特に、細胞表面分子、特に免疫細胞上の分子を標的とする多機能性分子については、エフェクター機能を無効にすることが必要とされ得る。Fc領域の操作はまた、多機能性分子のエフェクター機能を低下又は増大させるために所望され得る。
特定の態様では、アミノ酸修飾をFc領域に導入して、Fc領域バリアントを生成することができる。特定の態様では、Fc領域バリアントは、全てではないが、一部のエフェクター機能を有する。このような多機能性分子は、例えば、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能が不必要又は有害である適用において有用であってもよい。エフェクター機能が変化した多数の置換又は欠失が当技術分野で公知である。
一態様では、Fcドメインの定常領域は、Fc受容体に対する親和性を低下させるか、又はFcエフェクター機能を低下させる変異を含有する。例えば、定常領域は、IgG重鎖の定常領域内のグリコシル化部位を排除する変異を含有し得る。好ましくは、CH2ドメインは、CH2ドメイン内のグリコシル化部位を排除する変異を含む。
特定の態様では、Fcドメインは、FcRnへの結合を増加させ、それによって多機能性分子の半減期を増加させるように修飾される。別の態様又は追加の態様では、Fcドメインは、FcγRへの結合を減少させ、それによってADCC若しくはCDCを低減させるように、又はFcγRへの結合を増加させ、それによってADCC若しくはCDCを増加させるように修飾される。
Fc部分と非Fc部分との接合部付近のアミノ酸の変更は、国際公開第01/58957号に示されるように、Fc融合タンパク質の血清半減期を劇的に増加させることができる。したがって、本発明のタンパク質又はポリペプチドの接合領域は、免疫グロブリン重鎖及びエリスロポエチンの天然に存在する配列と比較して、好ましくは接合点の約10アミノ酸以内に存在する変更を含有し得る。これらのアミノ酸変化は、疎水性の増加を引き起こすことができる。一実施形態では、定常領域は、C末端リジン残基が置換されているIgG配列に由来する。好ましくは、IgG配列のC末端リジンは、血清半減期を更に増加させるために、アラニン又はロイシン等の非リジンアミノ酸で置換される。
一実施形態では、Fcドメインの定常領域は、以下の表Fに記載される変異の1つ、又はそれらの任意の組合せを有する。
特定の態様では、多機能性分子は、T250Q/M428L;M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F;E233P/L234V/L235A/G236A+A327G/A330S/P331S;E333A;S239D/A330L/I332E;P257I/Q311;K326W/E333S;S239D/I332E/G236A;N297A;L234A/L235A;P329G;N297A+M252Y/S254T/T256E;K322A、K444A、K444E、K444D、K444G、K444S、M428L、L309D、Q311H、N434S、M428L+N434S及びL309D+Q311H+N434Sからなる群から選択され、好ましくは、M252Y/S254T/T256Eと任意に組み合わされたN297A、及びP329Gと任意に組み合わされたL234A/L235Aからなる群から選択される置換又は置換の組合せを任意に有するヒトIgG1重鎖定常ドメイン又はIgG1 Fcドメインを含む。
別の態様では、多機能性分子は、S228P;L234A/L235A;L234A/L235A/P329G、P329G、S228P+M252Y/S254T/T256E、K444A K444E、K444D、K444G及びK444Sからなる群から選択される置換又は置換の組合せを任意に有するヒトIgG4重鎖定常ドメイン又はヒトIgG4 Fcドメインを含む。更により好ましくは、多機能性分子、好ましくは本発明による多機能性分子は、IgG4を安定化するS228Pを有するIgG4 Fc領域を含む。
本明細書で言及される場合、「/」及び「+」は、累積的な変異を指す。したがって、変異S228P+M252Y/S254T/T256Eとは、以下の変異:S228P、M252Y、S254T及びT256Eを意味する。
一般に、ヒトIgGの全てのサブクラスは、循環中に切断されやすい抗体重鎖のC末端リジン残基(K444)を有する。血液中でのこの切断は、連結された免疫刺激部分を多機能性分子に放出することによって、多機能性分子の生物活性を損なうか、又は減少させることができる。この問題を回避するために、IgGドメイン中のK444アミノ酸を別のアミノ酸で置換して、タンパク質分解切断を低減することができ、変異は、抗体に対して一般的に使用される。次いで、一態様では、多機能性分子は、K444A、K444E、K444D、K444G又はK444S、優先的にはK444Aからなる少なくとも1つの更なるアミノ酸置換を含む。特に、IgGドメイン中のK444アミノ酸は、アラニンで置換して、タンパク質分解切断を低減することができ、変異は、抗体に対して一般的に使用される。次いで、一態様では、多機能性分子は、K444Aからなる少なくとも1つの更なるアミノ酸置換を含む。
任意に、多機能性分子は、FcドメインのC末端ドメインに追加のシステイン残基を含み、追加のジスルフィド結合を生成し、多機能性分子の柔軟性を潜在的に制限する。
特定の一態様では、本発明による多機能性分子は、上記のような「ノブ・イントゥ・ホール(knob into holes)」修飾を含むFcドメインのヘテロ二量体を含む。好ましくは、そのようなFcドメインは、上記のようなIgG1又はIgG4 Fcドメインであり、更により好ましくは、上記に開示されるような変異N297Aを含むIgG1 Fcドメインである。
いくつかの実施形態では、第1の結合部分、特に抗PD1結合ドメイン鎖に連結されたFc鎖は、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25又は26に記載のアミノ酸配列を含み得るか又はそれからなり得る。
いくつかの実施形態では、抗CD28結合ドメインに連結されたFc鎖は、「ホール」又はH鎖であり、置換T366S/L368A/Y407V/Y349C及び任意にN297Aを含み、他のFc鎖は、「ノブ」又はK鎖であり、置換T366W/S354C及び任意にN297Aを含む。好ましくは、抗CD28結合ドメインに連結されたFc鎖は、「ホール」又はH鎖であり、配列番号54に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
より具体的には、多機能性分子は、
i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25に記載のアミノ酸配列(ノブ)を含むか又はそれからなる第1のFc鎖、
ii)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26又は54(ホール)に記載のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を含むか又はそれらからなるFcドメインを含み得る。
第1の実施形態では、多機能性分子は、FcドメインのC末端に連結された抗CD28結合ドメインを含み、当該Fcドメインはホール鎖である。
第2の実施形態では、多機能性分子は、FcドメインのN末端に連結された抗CD28結合ドメインを含み、当該Fcドメインはホール鎖である。
第3の実施形態では、多機能性分子は、FcドメインのC末端に連結された抗CD28結合ドメインを含み、当該Fcドメインはノブ鎖である。
第4の実施形態では、多機能性分子は、FcドメインのN末端に連結された抗CD28結合ドメインを含み、当該Fcドメインはノブ鎖である。
ペプチドリンカー
本発明は、1つ又は複数のペプチドリンカーを含み得る多機能性分子を含む。
ペプチドリンカーは、通常、リンカーを間に挟んで連結された2つのタンパク質エレメントが、それらの機能を発揮し、αヘリックス及びβフォールドの形成が組換え多機能性分子の安定性に及ぼす影響を回避するのに十分な空間的自由度を有することを保証するのに十分な長さ及び柔軟性を有する。
本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、多機能性分子の異なるドメイン又は鎖を連結する少なくとも1つのアミノ酸の配列を指す。このようなリンカーは、立体障害を防止するのに有用であってもよい。リンカーは、通常、3～44個のアミノ酸残基長である。好ましくは、リンカーは3～30個のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30個のアミノ酸残基を有する。
リンカー配列は、天然に存在する配列又は天然に存在しない配列であってもよい。治療目的で使用される場合、リンカーは、好ましくは、多機能性分子が投与される対象において非免疫原性である。リンカー配列の1つの有用な群は、国際公開第96/34103号及び国際公開第94/04678号に記載されるような重鎖抗体のヒンジ領域に由来するリンカーである。他の例は、ポリアラニンリンカー配列である。リンカー配列の更に好ましい例は、(Gly4Ser)4、(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)2、Gly4Ser、Gly3Ser、Gly3、Gly2ser及び(Gly3Ser2)3、特に(Gly4Ser)3を含む異なる長さのGly/Serリンカーである。
一実施形態では、多機能性分子に含まれる1つ又は複数のリンカーは、(Gly4Ser)4、(Gly4Ser)3、(Gly4Ser)2、Gly4Ser、Gly3Ser、Gly3、Gly2ser及び(Gly3Ser2)3からなる群から選択され、好ましくは(Gly4Ser)3である。
一実施形態では、多機能性分子に含まれる1つ又は複数のリンカーは、(GGGGS)4、(GGGGS)3、(GGGGS)2、GGGGS、(GGGS)3、(GGGS)2、GGGS、GGG、GGS及びGGからなる群から選択され、好ましくは(GGGGS)3である。
一実施形態では、抗CD28結合部分はscFvであり、上記のようなペプチドリンカー、特に(GGGGS)3リンカーによってFcドメインに、特に本明細書に記載されるようなFcドメインのN又はC末端に共有結合されている。
一実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインのVLドメインのC末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に(GGGGS)3リンカーによってFcドメインのN末端に連結され得る。
或いは、抗CD28抗原結合ドメインのVHドメインのC末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に(GGGGS)3リンカーによってFcドメインのN末端に連結される。
一実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインのVLドメインのN末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に(GGGGS)3リンカーによってFcドメインのC末端に連結され得る。
或いは、抗CD28抗原結合ドメインのVHドメインのN末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に(GGGGS)3リンカーによってFcドメインのC末端に連結される。
一実施形態では、抗CD28結合部分はscFvであり、上記のようなペプチドリンカー、特に(GGGGS)3リンカーによって第1の結合部分のCLドメインに共有結合されている。
一実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインのVLのC末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に配列番号57に記載されるような(GGGGS)3リンカーによって、第1の結合部分のCLドメインのN末端に連結され得る。
或いは、抗CD28抗原結合ドメインのVHのC末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に配列番号57に記載されるような(GGGGS)3リンカーによって、第1の結合部分のCLドメインのN末端に連結される。
一実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインのVLのN末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に配列番号57に記載されるような(GGGGS)3リンカーによって、第1の結合部分のCLドメインのC末端に連結され得る。
或いは、抗CD28抗原結合ドメインのVHのN末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に配列番号57に記載されるような(GGGGS)3リンカーによって、第1の結合部分のCLドメインのC末端に連結される。
一実施形態では、抗CD28抗原結合ドメインはscFvであり、当該scFvのVL及びVHドメインは、好ましくは、上記のようなペプチドリンカー、特に配列番号57に記載されるような(GGGGS)3リンカーによって、互いに共有結合されている。
特に、抗CD28抗原結合ドメインのVLのC末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に配列番号57に記載されるような(GGGGS)3リンカーによって、抗CD28抗原結合ドメインのVHのN末端に連結される。
或いは、抗CD28抗原結合ドメインのVHのC末端は、上記のようなペプチドリンカー、特に配列番号57に記載されるような(GGGGS)3リンカーによって、抗CD28抗原結合ドメインのVLのN末端に連結される。
したがって、いくつかの態様では、抗CD28結合ドメインは、N末端からC末端に向かって、配列番号44のVHドメイン、配列番号57のペプチドリンカー、及び配列番号45のVLドメインを含むscFVである。或いは、抗CD28結合ドメインは、N末端からC末端に向かって、配列番号45のVLドメイン、配列番号57のペプチドリンカー、及び配列番号44のVHドメインを含むscFVである。
結合接合部では、VL又はVHのC末端リジン残基をアラニンに変異させて、タンパク質分解切断を低減することができる。
したがって、多機能性分子は、C末端によって第1のFc鎖のN末端に連結された、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分と、任意にペプチドリンカーを介してC末端によって第2のFc鎖のN末端に共有結合されている抗CD28結合ドメインとを含み、第1及び第2のFc鎖は相補的である。好ましくは、抗CD28結合ドメインはscFvであり、その結果、分子はまた、当該scFvのVLドメインとVHドメインとの間にペプチドリンカーを含み得る。
別の実施形態では、多機能性分子は、C末端によって第1のFc鎖のN末端に連結された、T細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分と、任意にペプチドリンカーを介してN末端によって当該第1のFc鎖のC末端に共有結合されている抗CD28結合ドメインとを含み、相補的な第2のFc鎖は結合部分を欠いている。好ましくは、抗CD28結合ドメインはscFvであり、その結果、分子はまた、当該scFvのVLドメインとVHドメインとの間にペプチドリンカーを含み得る。
別の実施形態では、多機能性分子は、VH及びVLドメインを含むT細胞表面に特異的に発現される標的に結合する2つの第1の結合部分に連結されたFcドメインと、任意にペプチドリンカーを介して、C末端によって第1の結合部分の軽鎖のN末端に、又はN末端によってFcドメインのC末端若しくは第1の結合部分の軽鎖のC末端に共有結合された抗CD28結合ドメインとを含む。好ましくは、抗CD28結合ドメインはscFvであり、その結果、分子はまた、当該scFvのVLドメインとVHドメインとの間にペプチドリンカーを含む。
多機能性分子の例
本発明による多機能性分子の特定の例を以下に示し、多機能性分子は、
- 抗PD1結合部分、特に、Fab、Fab'、F(ab')2、CrossMAb、又は単鎖(scFv)からなる群から選択される抗PD1結合ドメインである第1の結合部分であって、好ましくは、「第1の結合部分」の項で上述したアミノ酸配列を有する、第1の結合部分、
- アゴニスト活性を有する抗CD28結合部分、特にFab、Fab'、CrossMAb又は単鎖(scFv)からなる群から選択される抗原結合ドメインである第2の結合部分であって、当該抗CD28結合部分が好ましくは「第2の結合部分」の項で上述したアミノ酸配列を有する、第2の結合部分、及び
- 第1及び第2のFc鎖であって、当該第1及び第2のFc鎖は相補的であり、一緒になってFcドメインを形成する、第1及び第2のFc鎖
を含むか又はそれらからなり、
当該多機能性分子は、単一の抗CD28結合を含む。
多機能性分子の特定の例は、図1、フォーマットA1、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4、C5及びC6に提供される。
好ましくは、二機能性分子は、特に図7Aに記載されるようなB1フォーマットを有する。特に、B1フォーマットは、i)第1のFc鎖に連結された抗PD-1 Fabと、ii)第2のFc鎖に連結された抗CD28 scFvとから本質的になり、第1及び第2のFc鎖は、Fcドメインを形成するように相補的である。
換言すれば、多機能性分子は、CD28に一価で結合し、CD28と架橋することができない。
この項に開示され、第1の結合部分として抗PD1結合部分を含む多機能性分子の全ての及び任意の具体例では、抗PD1結合部分は、T細胞表面に特異的に発現される別の標的、特に、CTLA-4、BTLA、VISTA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3等に結合する別の結合部分によって置換することができる。
第1の態様では、多機能性分子は、
- 第1のFc鎖に連結された抗PD1 Fabである第1の結合部分、
- 第2のFc鎖に連結された抗CD28アゴニストFab又はCrossMAbである第2の結合部分
を含むか又はそれらからなり、
- 当該第1及び第2のFc鎖は相補的であり、一緒になってFcドメインを形成し、
当該多機能性分子は、単一の抗CD28結合部分を含む。
より具体的には、当該多機能性分子は、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1結合部分のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1結合部分のVH及びCH1ドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)抗CD28結合部分の(Fab)VH及びCH1ドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、一緒になって第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなるか、或いは(ii)抗CD 28結合部分の(CrossMAb)VH及びCLドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、一緒になって第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる、第3の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)抗CD28結合部分の(Fab)VL及びCLドメイン、又は(ii)抗CD 28結合部分の(CrossMAb)VL及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、多機能性分子は、
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- 抗CD28抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号44及び46を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号54を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖、
- 抗CD28抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号45及び47を含むか又はそれらからなる抗CD28抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
或いは、多機能性分子は、
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- 抗CD28抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号44及び47を含むか又はそれらからなるVH及びCLドメイン、ii)任意に、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号54を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖、
- 抗CD28抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号45及び46を含むか又はそれらからなる抗CD28抗体のVL及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号27に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号53に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖、並びに
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号51に記載の配列を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなる。
第2の態様では、多機能性分子は、
- 抗PD1 Fab、Fab'又はCrossMAbである第1の結合部分、
- アゴニスト抗CD28 scFVである第2の結合部分、及び
- 第1のFc鎖及び第2のFc鎖であって、当該第1及び第2のFc鎖は相補的であり、一緒になってFcドメインを形成する、第1及び第2のFc鎖
を含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、当該多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗体のVHドメイン及びCH1ドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含むか又はこれらからなる第2の鎖であって、当該CH2ドメイン及びCH3ドメインが一緒になって第1のFc鎖を形成する、第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、ペプチドリンカーによって連結された抗CD28抗体のVLドメイン及びVHドメイン、任意でペプチドリンカー、任意でヒンジ、抗体のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含むか又はこれらからなる第3の鎖であって、当該CH2ドメイン及びCH3ドメインが一緒になって第2のFc鎖を形成する、第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、一緒になってFcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、多機能性分子は、
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)CH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- (i)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号45及び44を含むか又はそれらからなる抗CD28抗体のVL及びVHドメインを含む抗CD28 scFv、(ii)任意でペプチドリンカー、(iii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、iv)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26又は54、好ましくは配列番号54を含むか又はそれらからなる第2のFc鎖を形成する抗体のCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、当該多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号27に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、及び
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号56に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなる。
好ましい実施形態では、本発明の多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなり、当該修飾が好ましくはフレームワーク領域にある第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号27に記載の配列を含むか又はそれからなり、当該修飾が好ましくはフレームワーク領域にある、第2の鎖、並びに
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号56に記載の配列を含むか又はそれからなり、当該修飾が好ましくはフレームワーク領域にある、第3の鎖
を含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、並びに
- N末端からC末端に向かって、好ましくはペプチドリンカーによって連結された抗CD28抗体のVHドメイン及びVLドメイン、任意でペプチドリンカー、任意でヒンジ、抗体のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含むか又はこれらからなる第3の鎖であって、当該CH2ドメイン及びCH3ドメインが第2のFc鎖を形成する、第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、一緒になってFcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、多機能性分子は、
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号44及び45を含むか又はそれらからなる抗CD28抗体のVH及びVLドメインを含む抗CD 28 scFv、(ii)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、(iii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、iv)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26又は54、好ましくは配列番号54を含むか又はそれらからなる第2のFc鎖を形成する抗体のCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号27に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、及び
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号55に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなる。
好ましくは、1、2又は3つの修飾は、好ましくはCDRの外側にある(すなわち、フレームワーク領域中にある)。
一実施形態では、多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、i)任意でヒンジ、ii)抗体のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなり、当該CH2ドメイン及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメイン、(ii)任意でペプチドリンカー、並びに(iii)好ましくはペプチドリンカーによって連結された、抗CD28抗体のVL及びVHドメインを含む抗CD 28 scFVを含むか又はそれらからなる第2の鎖、並びに
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、当該多機能性分子は、
- 抗体のFc鎖であり、N末端からC末端に向かって、i)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、ii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、a)(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)CH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む抗PD1抗体の重鎖、(b)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、(c)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号45及び44を含むか又はそれらからなる抗CD28抗体のVL及びVHドメインを含む抗CD28 scFvを含むか又はそれらからなる第2の鎖、並びに
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、当該多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号62に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、及び
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなる。
そのような態様では、第1のFc鎖、特にノブ鎖は、好ましくは、任意の他の結合部分又は免疫療法剤を欠いている。
一実施形態では、多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、i)任意でヒンジ、ii)抗体のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなり、当該CH2ドメイン及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、ヒンジ、抗PD1抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメイン、任意でペプチドリンカー、並びに(ii)好ましくはペプチドリンカーによって連結された、抗CD28抗体のVH及びVLドメインを含む抗CD28 scFVを含むか又はそれらからなる第2の鎖、並びに
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
そのような態様では、第1のFc鎖、特にノブ鎖は、好ましくは、任意の他の結合部分又は免疫療法剤を欠いている。
好ましくは、多機能性分子は、
- 抗体の第1のFc鎖であり、i)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、ii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなり、当該第1のFc鎖が他の結合部分又は免疫療法剤を欠いている、第1の鎖、
- a)(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む抗PD1抗体の重鎖、(b)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、並びに(c)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号44及び45を含むか又はそれらからなる抗CD28抗体のVH及びVLドメインを含む抗CD28 scFvを含むか又はそれらからなる第2の鎖、並びに
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、当該多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号61に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、及び
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなる。
第3の態様では、多機能性分子は、
- 抗PD1 F(ab')2である第1の結合部分、
- アゴニスト抗CD28 scFVである第2の結合部分、
- 第1及び第2のFc鎖であって、当該第1及び第2のFc鎖は相補的であり、Fcドメインを形成する、第1及び第2のFc鎖
を含むか又はそれらからなり、
抗PD1 F(ab')2は、Fcドメインに連結される。
好ましくは、F(ab')2は、1つのFab及び1つのCrossMAbを含み、それぞれの1つの鎖はFc鎖に連結される。
換言すれば、多機能性分子は、
- 抗PD1抗体である第1の結合部分、及び
- 任意でペプチドリンカーによって、抗PD1抗体に連結された抗CD28 scFVである第2の結合部分
を含み得るか又はそれらからなり得る。
好ましくは、抗PD1抗体は、CrossMAb、好ましくは1つのCrossMAbを含む。
任意に、抗CD28 scFVは、
a)軽鎖、好ましくは1つの軽鎖のC末端、
b)軽鎖、好ましくは1つの軽鎖のN末端、又は
c)重鎖、好ましくは1つの重鎖のC末端に連結される。
一実施形態では、当該多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVL及びCH1ドメイン、(ii) 任意でペプチドリンカー、並びに(iii)好ましくはペプチドリンカーによって連結された、抗CD28抗体のVH及びVLドメインを含む抗CD28 scFvを含むか又はこれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCLドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖、並びに
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、当該多機能性分子は、
- (i)N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCH1ドメインを含む鎖、(ii)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、(iii)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号44及び45を含むか又はそれらからなる抗CD28抗体のVH及びVLドメインを含む抗CD28 scFvを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCLドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む鎖を含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖を含むか又はそれらからなり、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む第3の鎖、
- (i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含む抗PD1抗体の軽鎖を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、当該多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号60に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号28に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号29に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖、並びに
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、当該多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、(i)好ましくはペプチドリンカーによって連結された、抗CD28抗体のVHドメイン及びVLドメインを含む抗CD28 scFv、(ii)任意でペプチドリンカー、並びに(iii)抗PD1抗体のVLドメイン及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCLドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖であって、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖であって、当該CH2及びCH3ドメインが第2のFc鎖を形成する、第3の鎖、並びに
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、当該多機能性分子は、
- (i)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号44及び45を含むか又はそれらからなるVH及びVLドメインを含む抗CD28 scFV、(ii)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、(iii)N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCH1ドメインを含む鎖を含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCLドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む鎖を含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む抗PD1抗体の重鎖を含むか又はそれからなる第3の鎖、並びに
- (i)N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含む抗PD1抗体の軽鎖を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、当該多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号59に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号28に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号29に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖、並びに
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVL及びCH1ドメイン、(ii)任意でペプチドリンカー、並びに(iii)好ましくはペプチドリンカーによって連結された、抗CD28抗体のVL及びVHドメインを含む抗CD28 scFvを含むか又はこれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCLドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖であって、当該CH2及びCH3ドメインが第1のFc鎖を形成する、第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖、並びに
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、多機能性分子は、
- (i)N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCH1ドメインを含む鎖、(ii)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、並びに(iii)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号45及び44を含むか又はそれらからなるVL及びVHドメインを含む抗CD28 scFvを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCLドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む鎖を含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- 重鎖を含むか又はそれからなり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、並びに(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む第3の鎖、並びに
- (i)N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含む抗PD1抗体の軽鎖を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、当該多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号64に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号28に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号29に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖、並びに
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、当該多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、(i)好ましくはペプチドリンカーによって連結された、抗CD28抗体のVLドメイン及びVHドメインを含む抗CD28 scFv、(ii)任意でペプチドリンカー、(iii)抗PD1抗体のVLドメイン及びCH1ドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCL、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCH1、任意でヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第3の鎖、並びに
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、当該多機能性分子は、
- (i)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号45及び44を含むか又はそれらからなるVL及びVHドメインを含む抗CD28 scFV、(ii)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、並びに(iii)N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCH1ドメインを含む鎖を含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCLドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、並びに(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む鎖を含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖を含むか又はそれからなり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、並びに(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む第3の鎖、
- (i)N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含む抗PD1抗体の軽鎖を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、当該多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号63に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号28に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号29に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖、並びに
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなる。
別の実施形態では、当該多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、ヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、ヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメイン、(ii)任意でペプチドリンカー、並びに(iii)好ましくはペプチドリンカーによって連結された、抗CD28抗体のVL及びVHドメインを含む抗CD 28 scFVを含むか又はそれらからなる第3の鎖、並びに
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、当該多機能性分子は、
- N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる軽鎖である第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる重鎖である第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、a)(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、並びに(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む重鎖、(b)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、並びに(c)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号45及び44を含むか又はそれらからなる抗CD28抗体のVL及びVHドメインを含む抗CD28 scFvを含むか又はそれらからなる第3の鎖、並びに
- N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる抗PD1抗体の軽鎖である第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、当該多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号27に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号62に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖、並びに
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなる。
別の実施形態では、当該多機能性分子は、特に、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、ヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、(i)抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、ヒンジ、抗体のCH2及びCH3ドメインであって、第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメイン、(ii)任意でペプチドリンカー、並びに(iii)好ましくはペプチドリンカーによって連結された、抗CD28抗体のVH及びVLドメインを含む抗CD 28 scFVを含むか又はそれらからなる第3の鎖、
- N末端からC末端に向かって、抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
特に、第1のFc鎖は「ノブ」であり、第2のFc鎖は「ホール」である。或いは、第1のFc鎖は「ホール」であり、第2のFc鎖は「ノブ」である。
好ましくは、当該多機能性分子は、
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、並びに(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- a)N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26を含むか又はそれからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含む重鎖、(b)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、並びに(c)好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結された、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号44及び45を含むか又はそれらからなる抗CD28抗体のVH及びVLドメインを含む抗CD28 scFvを含むか又はそれらからなる第3の鎖、
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなる抗PD1抗体のVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
非常に特定の実施形態では、当該多機能性分子は、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第1の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号27に記載の配列を含むか又はそれからなる第2の鎖、
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号61に記載の配列を含むか又はそれからなる第3の鎖、並びに
- 置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号20に記載の配列を含むか又はそれからなる第4の鎖
を含むか又はそれらからなる。
上記の分子の各々は、単一(1つ)の抗CD28結合部分を含む。
好ましくは、変異がVL又はVHにある場合、1、2又は3つの修飾は、好ましくはCDRの外側にある(すなわち、フレームワーク領域中にある)。
いくつかの実施形態では、抗CD28結合ドメインは、CDR及び/又はフレームワーク領域に1つ又は複数の変異を含むバリアントである。当該抗CD28バリアントは、特に、「第2の結合部分」の項で上述されている。当該バリアントのいずれか1つを、上記に例示した多機能性分子に組み込むことができる。
いくつかの態様では、多機能性分子は、
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、
(i)(a)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号44、83、84、85及び88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変領域(VH)、並びに
(b)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号45、86、87、89及び90からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる軽鎖可変領域(VL)であって、好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結されたVH及びVL
を含む抗CD28 scFv、
(ii)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、(iii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、iv)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26又は54、好ましくは配列番号54を含むか又はそれらからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメイン
を含むか又はそれらからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
いくつかの態様では、多機能性分子は、
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、
(i)(a)配列番号44、83、84、85及び88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変領域(VH)、並びに
(b)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号45のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)であって、好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結されたVH及びVL
を含む抗CD28 scFv、
(ii)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、(iii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、iv)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26又は54、好ましくは配列番号54を含むか又はそれらからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメイン
を含むか又はそれらからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
いくつかの態様では、多機能性分子は、
- 抗PD1抗体の軽鎖であり、N末端からC末端に向かって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号16及び18を含むか又はそれらからなるVL及びCLドメインを含むか又はそれらからなる第1の鎖、
- 抗PD1抗体の重鎖であり、N末端からC末端に向かって、(i)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号15及び17を含むか又はそれらからなるVH及びCH1ドメイン、(ii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、(iii)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号25を含むか又はそれからなる第1のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメインを含むか又はそれらからなる第2の鎖、
- N末端からC末端に向かって、
(a)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾、好ましくはアミノ酸置換を任意に有する、配列番号44のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域(VH)、並びに
(b)配列番号45、86、87、89及び90からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる軽鎖可変領域(VL)であって、好ましくは配列番号57の、好ましくはペプチドリンカーによって連結されたVH及びVL
を含む抗CD28 scFv、
(ii)任意で、好ましくは配列番号57のペプチドリンカー、(iii)任意で、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、好ましくは配列番号58のヒンジ、iv)抗体のCH2及びCH3ドメインであって、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号26又は54、好ましくは配列番号54を含むか又はそれらからなる第2のFc鎖を形成するCH2及びCH3ドメイン
を含むか又はそれらからなる第3の鎖
を含むか又はそれらからなり、
第1及び第2のFc鎖は相補的であり、それにより、Fcドメインを形成する。
多機能性分子の調製-本発明の多機能性分子をコードする核酸分子、そのような核酸分子を含む組換え発現ベクター及び宿主細胞
特に哺乳動物細胞によって、本発明による多機能性分子を産生するために、多機能性分子をコードする核酸配列又は核酸配列の群を、1つ又は複数の発現ベクターにサブクローニングする。このようなベクターは、一般に、哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用される。抗体配列を含む分子を産生するための一般的な技術は、その内容が参照により本明細書に組み込まれるColiganら(編)、Current protocols in immunology、10.19.1～10.19.11頁(Wiley Interscience 1992)、及び分子の産生に関する解説が各文書に分散されているW. H. Freeman and Company社(1992)の「Antibody engineering:a practical guide」に見出すことができる。
一般に、このような方法は、以下の工程:
(1)本発明の組換え多機能性分子をコードするポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含有するベクターで適切な宿主細胞をトランスフェクト又は形質転換する工程と、
(2)宿主細胞を適切な培地で培養する工程と、
(3)任意で、培地又は宿主細胞から多機能性分子を単離及び/又は精製する工程と
を含む。
本発明は更に、上記に開示されるような多機能性分子をコードする核酸、本発明の核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクター、本発明のベクターで形質転換されたか、又は組換え多機能性分子をコードする配列で直接形質転換された遺伝子操作された宿主細胞、及び組換え技術によって本発明の多機能性分子を産生するための方法に関する。
核酸、ベクター及び宿主細胞を以下により詳細に記載する。
核酸配列
本発明はまた、上記で定義された多機能性分子をコードする核酸分子、又は上記で定義された多機能性分子をコードする核酸分子の群に関する。本明細書に開示される多機能性分子をコードする核酸は、PCR等の当技術分野で公知の任意の技術によって増幅することができる。このような核酸は、当業者に公知の従来の手順を使用して、容易に単離及び配列決定され得る。
好ましくは、本発明は、上記で定義された多機能性分子をコードする単離された核酸分子、又は上記で定義された多機能性分子をコードする単離された核酸分子の群に関する。
特定の態様では、本明細書で定義される多機能性分子をコードする核酸分子は、本明細書に、特に「多機能性分子の例」の項で記載される多機能性分子の異なる鎖をコードする核酸分子又は核酸分子の群を含むか又はそれらからなる。
一実施形態では、核酸分子は、単離された、特に非天然の核酸分子である。
ベクター
別の態様では、本発明は、上記で定義された核酸分子又は核酸分子の群を含むベクターに関する。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、遺伝物質を細胞に移入するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体を包含する。一般に、操作されたベクターは、複製起点、マルチクローニング部位及び選択マーカーを含む。ベクター自体は、一般に、インサート(導入遺伝子)及びベクターの「骨格」として働くより大きな配列を含むヌクレオチド配列、一般にはDNA配列である。現代のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格に加えて、更なる特徴であるプロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、標的化配列、タンパク質精製タグを包含し得る。発現ベクター(発現構築物)と呼ばれるベクターは、具体的には、標的細胞における導入遺伝子の発現のためのものであり、一般に、制御配列を有する。
多機能性分子をコードする核酸分子又は核酸分子の群は、当業者によってベクターにクローニングされ、次いで宿主細胞に形質転換され得る。これらの方法には、インビトロ組換えDNA技術、DNA合成技術、インビボ組換え技術等が含まれる。当業者に公知の方法を使用して、本明細書に記載の多機能性分子、バリアントの核酸配列、及び転写/翻訳のための適切な調節成分を含有する発現ベクターを構築することができる。
したがって、本発明はまた、本発明による多機能性分子をコードする核酸分子又は核酸分子の群を含む組換えベクターを提供する。好ましい一態様では、発現ベクターは、プロモーター、及び分泌シグナルペプチドをコードする核酸配列、並びに任意でスクリーニングのための少なくとも1つの薬剤耐性遺伝子を更に含む。発現ベクターは、翻訳を開始するためのリボソーム結合部位、転写ターミネーター等を更に含んでもよい。
発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション等を含む様々な技術を使用して宿主細胞に導入することができる。好ましくは、トランスフェクトされた細胞が選択及び増殖され、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれて、安定な形質転換体を産生する。
宿主細胞
別の態様では、本発明は、例えば多機能性分子を産生する目的のための、上記で定義されたベクター又は核酸分子若しくは核酸分子の群を含む宿主細胞に関する。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明による多機能性分子をコードするベクター、外因性核酸分子、及びポリヌクレオチドのレシピエントであってもよいか又はレシピエントであった任意の個々の細胞又は細胞培養物を含むことが意図される。「宿主細胞」という用語はまた、単一細胞の子孫又は潜在的子孫を含むことが意図される。適切な宿主細胞には、原核細胞又は真核細胞が含まれ、また、細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、並びに昆虫細胞及び哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、ウサギ、マカク又はヒト等の動物細胞も含まれるが、これらに限定されない。
適切な宿主細胞は、特に、グリコシル化等の適切な翻訳後修飾を提供する真核生物宿主細胞である。好ましくは、そのような適切な真核生物宿主細胞は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の真菌、アワヨトウ(Mythimna separate)等の昆虫細胞、タバコ等の植物細胞、並びにBHK細胞、293細胞、CHO細胞、NSO細胞及びCOS細胞等の哺乳動物細胞であってもよい。
好ましくは、本発明の宿主細胞は、CHO細胞、COS細胞、NSO細胞、及びHEK細胞からなる群から選択される。
次いで、宿主細胞は、本発明による多機能性分子を安定に又は一過性に発現する。そのような発現方法は、当業者に公知である。
多機能性分子の生成方法もまた、本明細書に開示される。本方法は、上記の多機能性分子をコードする核酸又は核酸の群を含む宿主細胞を、その発現に適した条件下で培養すること、及び任意で、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から多機能性分子を回収することを含む。特に、多機能性分子の組換え産生のために、例えば、上記のような多機能性分子をコードする核酸又は核酸の群を単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び/又は発現のために1つ又は複数のベクターに挿入する。次いで、当技術分野で公知の任意の方法によって、多機能性分子を単離及び/又は精製する。これらの方法は、従来の再生処理、タンパク質沈殿薬(塩析等)による処理、遠心分離、浸透による細胞溶解、音波処理、超遠心分離、分子ふるいクロマトグラフィ又はゲルクロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ、イオンクロマトグラフィ、HPLC、任意の他の液体クロマトグラフィ、及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。多機能性分子の単離技術は、特に、プロテインAセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィを含み得る。プロテインAは、好ましくは、本発明の多機能性分子を単離するために使用される。
適切な多機能性分子を選択する方法
一態様では、本発明は、本発明の多機能性分子を選択する方法であって、以下の工程:
a.免疫細胞表面に特異的に発現される標的に結合する第1の結合部分を選択する工程であって、免疫細胞表面に特異的に発現される標的が、好ましくは、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、NKG2A、LAG3、2B4、DR3、CD101、CD44、CD38、CXCR3、CXCR5、CD4、CD8、CD25、CRTAM、CD96、CD226、CD112R、CD103、CEACAM及びCD122からなる群から、好ましくは、PD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3からなる群から選択され、好ましくは、PD-1である、工程と、
b.多機能性分子の構造を選択する工程と、
c.抗CD28結合ドメイン及び第1の結合部分を含む多機能性分子を構築/クローニングする工程と、
d.PD-1、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、NKG2A、LAG3、2B4、DR3、CD101、CD44、CD38、CXCR3、CXCR5、CD4、CD8、CD25、CRTAM、CD96、CD226、CD112R、CD103、CEACAM及びCD122、好ましくはPD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3からなる群からのもの、より好ましくはPD-1に結合する多機能性分子の能力、並びに任意で、ヒトPD-1へのヒトPD-L1及び/又はPD-L2の結合を阻害する多機能性分子の能力を試験する工程と、
e.CD28に結合する多機能性分子の能力及びCD28に対してアゴニスト活性を有する多機能性分子の能力を試験する工程と、
f.ii)免疫細胞、特にT細胞にシス結合する多機能性分子の能力、及び/又は
iii)トランス活性を示さない、すなわち、腫瘍細胞及びT細胞を同時標的化する、多機能性分子の能力
を試験する工程と、
任意で、以下の工程:
g.免疫細胞表面に特異的に発現される標的、好ましくは、PD-1、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、CD40L、ICOS、CD27、OX40、4-1BB、GITR、HVEM、Tim-1、LFA-1、TIM3、CD39、CD30、NKG2D、NKG2A、LAG3、2B4、DR3、CD101、CD44、CD38、CXCR3、CXCR5、CD4、CD8、CD25、CRTAM、CD96、CD226、CD112R、CD103、CEACAM及びCD122からなる群から、好ましくはPD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3からなる群から選択され、より好ましくはPD1である標的に特異的に結合し、CD28に結合し、免疫細胞、特にT細胞にシス結合することができ、及び/又はトランス活性を示さない多機能性分子を選択する工程
の少なくとも1つを含むか又はそれらからなる。
本発明の多機能性分子を選択する方法は、有利には、上記の本発明による多機能性分子を生成する方法に加えて実施することができる。
医薬組成物及びその投与方法
本発明はまた、本明細書に記載される多機能性分子、上記の核酸分子、核酸分子の群、ベクター及び/又は宿主細胞を、好ましくは有効成分又は化合物として含む医薬組成物に関する。製剤は滅菌することができ、所望であれば、本発明の多機能性分子、本発明の核酸、ベクター及び/又は宿主細胞と有害に相互作用せず、望ましくない毒性効果を与えない、薬学的に許容される担体、賦形剤、塩、抗酸化剤及び/又は安定剤等の補助剤と混合することができる。任意に、医薬組成物は、追加の治療剤を更に含んでもよい。
特に、本発明による医薬組成物は、局所、経腸、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下又は眼内投与等を含む任意の従来の投与経路用に製剤化することができる。投与を容易にするために、本明細書に記載される多機能性分子は、インビボ投与のための医薬組成物に作り変えることができる。そのような組成物を作製する手段は、当技術分野において記載されている(例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy、Lippincott Williams&Wilkins、第21版(2005)を参照)。
医薬組成物は、所望の純度を有する多機能性分子を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、抗酸化剤、及び/又は安定剤と混合することによって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製することができる。そのような適切な担体、賦形剤、抗酸化剤、及び/又は安定剤は、当技術分野において公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A編(1980)に記載されている。
送達を容易にするために、任意の多機能性分子又はそのコード核酸をシャペロン剤とコンジュゲートさせることができる。シャペロン剤は、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポタンパク質、又はグロブリン)、炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、又はヒアルロン酸)、又は脂質等の天然に存在する物質であってもよい。また、合成ポリマー、例えば合成ポリペプチド等の組換え分子又は合成分子であってもよい。
本発明による医薬組成物は、投与の実質的に直後に、又は投与後の任意の所定の時間若しくは期間に、有効成分(例えば、本発明の多機能性分子)を放出するように製剤化することができる。いくつかの態様における医薬組成物は、組成物の送達が、処置される部位の感作が起こる前、及び感作を引き起こすのに十分な時間内に起こるように、時間放出、遅延放出、及び持続放出送達系を用いることができる。当技術分野で公知の手段を使用して、標的組織又は器官に到達するまで組成物の放出及び吸収を防止又は最小化するか、又は組成物の持続放出を確実に行うことができる。
本発明の製剤はヒト血液と等張であってもよい、すなわち、本発明の製剤はヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有することが当業者に理解される。このような等張性製剤の浸透圧は、一般に、約250mOSm～約350mOSmである。等張性は、例えば、蒸気圧又は製氷型浸透圧計によって測定することができる。
医薬組成物は、典型的には、製造及び保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。微生物の存在を防止するには、滅菌処理(例えば、精密濾過による)、並びに/又は様々な抗菌剤及び抗真菌剤の添加によって確実に行うことができる。
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、処置される対象、及び特定の投与様式に応じて変動する。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。好ましくは、本明細書に記載される医薬組成物は、一般に、免疫応答を誘導するのに必要又は十分な量及び時間で投与される。
疾患の処置における使用
本発明の多機能性分子、核酸、ベクター、宿主細胞、組成物及び方法には、インビトロ及びインビボでの多数の有用性及び適用性がある。特に、本明細書で提供される多機能性分子、核酸分子、核酸分子の群、ベクター、宿主細胞又は医薬組成物のいずれかは、治療方法において及び/又は治療目的のために使用することができる。
本発明はまた、対象における障害及び/若しくは疾患の処置における使用のための、並びに/又は医薬若しくはワクチンとしての使用のための、多機能性分子、それをコードする核酸若しくはベクター、又はそれを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、対象における疾患及び/又は障害を処置するための、本明細書に記載の多機能性分子、それをコードする核酸若しくはベクター、又はそれを含む医薬組成物の使用に関する。本発明はまた、対象における疾患及び/又は障害を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載される多機能性分子、それをコードする核酸若しくはベクター、又はそれを含む医薬組成物の使用に関する。最後に、本発明は、対象における疾患又は障害を処置する方法であって、治療有効量の医薬組成物若しくは多機能性分子、又はそれをコードする核酸若しくはベクターを対象に投与することを含む方法に関する。
本発明による多機能性分子、核酸、核酸の群、それらをコードするベクター、又はそれらを含む医薬組成物の使用には、全てのTリンパ球依存性病態における用途がある。
そのような病態は、例えば、癌又は感染性疾患であってもよい。
一態様では、本発明は、癌及び感染性疾患からなる群から選択される疾患及び/又は障害の処置を必要とする対象における、疾患及び/又は障害を処置する方法であって、有効量の上記で定義された多機能性分子又は医薬組成物を当該対象に投与することを含む方法に関する。このような疾患の例は、以下により詳細に記載される。
一態様では、処置方法は、(a)処置を必要とする患者を同定すること、及び(b)本明細書に記載される多機能性分子、核酸、核酸の群、ベクター又は医薬組成物の治療有効量を患者に投与することを含む。
処置を必要とする対象は、疾患を有するか、そのリスクがあるか、又は有する疑いがあるヒトであってもよい。このような患者は、日常的な医学的検査によって同定することができる。
別の態様では、本明細書に開示される多機能性分子は、免疫を増強するために、好ましくは障害及び/又は疾患を処置するために、例えばインビボで対象に投与することができる。したがって、一態様では、本発明は、対象における免疫応答を改変する方法であって、対象における免疫応答が改変されるように、本発明の多機能性分子、核酸、ベクター又は医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、免疫応答は、増強、増加、刺激又はアップレギュレートされる。
癌
別の態様では、本発明は、癌を処置するための、例えば、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための医薬の製造における、本明細書に開示される多機能性分子又は医薬組成物の使用を提供する。
本発明はまた、癌を有する対象の処置に使用するための多機能性分子、組合せ、又は医薬組成物を提供する。
本発明はまた、対象における癌を処置する方法であって、治療有効量の本明細書に開示されるような医薬組成物、組合せ、又は多機能性分子を投与することを含む方法を提供する。
本明細書で使用される「癌」という用語は、異常細胞の急速かつ制御されない増殖を特徴とする疾患として定義される。癌細胞は、局所的に、及び血流及びリンパ系を介して身体の他の部分に拡散し得る。
したがって、一態様では、本発明は、例えば、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するために、癌を処置する方法であって、治療有効量の本発明による多機能性分子又は医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。特に、本発明は、癌細胞の増殖が阻害されるような、多機能性分子を使用する対象の処置に関する。
本明細書で提供されるもので処置することができる任意の適切な癌は、造血癌又は固形癌であってもよい。このような癌としては、癌腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、消化器癌、頭部及び頚部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、リンパ種、神経膠腫、中皮種、黒色腫、胃癌(stomach cancer)、尿道癌、環境的に誘発された癌及び当該癌の任意の組合せが挙げられる。更に、本発明は、難治性又は再発性の悪性腫瘍を含む。好ましくは、処置又は予防される癌は、転移性又は非転移性の、黒色腫、悪性中皮腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、尿路上皮癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、小細胞肺癌、転移性メルケル細胞癌、胃癌又は胃食道癌及び子宮頸癌からなる群から選択される。
特定の態様では、癌は、血液系腫瘍又は充実性腫瘍である。そのような癌は、血液リンパ系新生物、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病からなる群から選択することができる。
特定の態様では、癌は、ウイルスによって誘発されるか、又は免疫不全に関連する癌である。このような癌は、カポジ肉腫(例えば、カポジ肉腫ヘルペスウイルスに関連する);子宮頸部、肛門、陰茎及び外陰部の扁平上皮癌及び中咽頭癌(例えば、ヒトパピローマウイルスに関連する);びまん性大細胞型B細胞リンパ腫を含むB細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)、バーキットリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、HHV-8原発性滲出性リンパ腫、古典的ホジキンリンパ腫、及びリンパ球増殖性障害(例えば、エプスタインバーウイルス(EBV)及び/又はカポジ肉腫ヘルペスウイルスに関連する);肝細胞癌(例えば、B型肝炎ウイルス及び/又はC型肝炎ウイルスに関連する);メルケル細胞癌(例えば、メルケル細胞ポリオーマウイルス(MPV)に関連する);並びにヒト免疫不全ウイルス感染(HIV)に関連する癌からなる群から選択することができる。
処置に好ましい癌としては、典型的には免疫療法に反応する癌が挙げられる。或いは、処置に好ましい癌は、免疫療法に非応答性の癌である。
感染性疾患
本発明の多機能性分子、核酸、核酸の群、ベクター、宿主細胞又は医薬組成物は、特定の毒素又は病原体に曝露された患者を処置するために使用することができる。したがって、本発明の一態様は、対象における感染性疾患を処置する方法であって、好ましくは対象の感染性疾患が処置されるように、本発明による多機能性分子又はそれを含む医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
任意の適切な感染は、本明細書において提供される多機能性分子、核酸、核酸の群、ベクター、宿主細胞又医薬組成物で処置することができる。
本発明の方法によって処置可能な感染性疾患を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、肝炎ウイルス(A、B、又はC)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II、及びCMV、エプスタインバーウイルス)、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス及びアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
本発明の方法によって治療可能な感染性疾患を引き起こす病原性細菌のいくつかの例としては、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌及び淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ、並びにライム病細菌が挙げられる。
本発明の方法によって治療可能な感染性疾患を引き起こす病原性真菌のいくつかの例としては、カンジダ(アルビカンス、クルーセイ、グラブラータ、トロピカリス等)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス(フミガーツス、ニガー等)、ケカビ目中の属(ムコール属、ユミケカビ属、クモノスカビ属)、スポロトリクス・シェンキィ(Sporothrix schenkii)、ブラストミセス・デルマティティジス(Blastomyces dermatitidis)、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)及びヒストプラズマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)が挙げられる。
本発明の方法によって処置可能な感染性疾患を引き起こす病原性寄生虫のいくつかの例としては、赤痢アメーバ(Entamoeba histolytica)、大腸バランチジウム(Balantidium coli)、フォーラーネグレリア(Naegleriafowleri)、アカントアメーバ種(Acanthamoeba sp.)、ジアルジア(Giardia lambia)、クリプトスポリジウム種(Cryptosporidium sp.)、ニューモシスチス・カリニ(Pneumocystis carinii)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、ネズミバベシア(Babesia microti)、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma brucei)、トリパノソーマ・クルージ(Trypanosoma cruzi)、ドノバンリーシュマニア(Leishmania donovani)、トキソプラスマ原虫(Toxoplasma gondi)、及びブラジル鉤虫(Nippostrongylus brasiliensis)が挙げられる。
併用又は併用療法
一態様では、本発明は、a)本発明の多機能性分子と、b)別個の治療剤、好ましくは抗癌剤又は抗感染剤との組合せを指す。そのような組合せは、特に、本明細書に記載されるような医薬組成物に含まれ得る。
本発明による多機能性分子は、臨床開発中の、又は既に市販されている薬剤を用いて免疫回避機構を克服するためのいくつかの他の潜在的戦略と組み合わせることができる(例えば、Antoniaら、Immuno-oncology combinations:a review of clinical experiences and future prospects. Clin. Cancer Res. Off. J. Am. Assoc. Cancer Res. 20、6258-6268、2014の表1を参照)。本発明による多機能性分子とのそのような組合せは、特に以下:
1-適応免疫の阻害を逆転させる(T細胞チェックポイント経路を遮断する)こと、
2-適応免疫のスイッチを入れる(アゴニスト分子、特に抗体を使用してT細胞共刺激受容体シグナル伝達を促進する)こと、
3-自然免疫細胞の機能を改善すること、
4-例えばワクチンに基づく戦略を通じて免疫系を活性化する(免疫細胞エフェクター機能を増強する)ことのために有用であり得る。
したがって、本明細書に記載される多機能性分子又はそれを含む医薬組成物のいずれかと、疾患又は障害を処置するための好適な第2の薬剤との併用療法も本明細書に提供される。一態様では、多機能性分子及び第2の薬剤は、上記のような固有の(又は単一の)医薬組成物中に存在し得る。或いは、本明細書で使用される「併用療法(combination therapy)」又は「併用療法(combined therapy)」という用語は、これらの2つの薬剤(例えば、本明細書に記載される多機能性分子及び追加の又は第2の好適な治療剤)が逐次的に投与されること、すなわち、各治療剤が異なる時間に投与されること、並びにこれらの治療剤の投与又は薬剤のうちの少なくとも2つの投与が実質的に同時に行われることを包含する。各薬剤の逐次的又は実質的に同時の投与は、任意の適切な経路によって行うことができる。薬剤は、同じ経路又は異なる経路によって投与することができる。例えば、第1の薬剤(例えば、多機能性分子)は、経口投与することができ、追加の治療剤(例えば、抗癌剤、抗感染剤、又は免疫モジュレーター)は、静脈内投与することができる。或いは、選択された組合せの薬剤は、静脈内注射によって投与することができるが、この組合せの他の薬剤は、経口投与することができる。
一態様では、追加の治療剤は、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗体、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、抗増殖剤、抗ウイルス剤、オーロラキナーゼ阻害剤、アポトーシス促進剤(例えば、Bcl-2ファミリー阻害剤)、デスレセプター経路の活性化剤、Bcr-Ablキナーゼ阻害剤、BiTE(二重特異性T細胞エンゲージャー)抗体、抗体薬物コンジュゲート、生物応答調整物質、ブルートンチロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ-2阻害剤、leukemia viral oncogene homolog(ErbB2)受容体阻害剤、増殖因子阻害剤、熱ショックタンパク質(HSP)-90阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤、ホルモン療法、アポトーシスタンパク質阻害剤(IAP)阻害剤、挿入抗生物質、キナーゼ阻害剤、キネシン阻害剤、Jak2阻害剤、ラパマイシン阻害剤の哺乳動物標的、マイクロRNA、マイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤、多価結合タンパク質、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、ポリADP(アデノシン二リン酸)-リボースポリメラーゼ(PARP)阻害剤、プラチナベースの化学療法剤、ポロ様キナーゼ(Plk)阻害剤、ホスホイノシチド-3キナーゼ(PI3K)阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド、植物アルカロイド、低分子阻害性リボ核酸(siRNA)、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤、メチル化阻害剤、チェックポイント阻害剤、ペプチドワクチン等、腫瘍抗原由来のエピトープ又はネオエピトープ、並びにこれらの薬剤の1つ又は複数の組合せを含む非網羅的なリストにおいて選択することができる。
例えば、追加の治療剤は、化学療法、放射線療法、標的療法、抗血管新生剤、メチル化阻害剤、癌ワクチン、腫瘍抗原由来のエピトープ又はネオエピトープ、骨髄チェックポイント阻害剤、他の免疫療法、及びHDAC阻害剤からなる群において選択することができる。
一態様では、本発明は、第2の治療剤が、特に、治療ワクチン、免疫チェックポイント遮断薬又は活性化剤、特に適応免疫細胞(T及びBリンパ球)並びに抗体薬物複合体からなる群から選択される、上記で定義された併用療法に関する。好ましくは、本発明による多機能性分子のいずれか又は医薬組成物との併用に適した薬剤としては、共刺激受容体(例えば、OX40、CD40、ICOS、CD27、HVEM又はGITR)に結合する抗体、免疫原性細胞死を誘導する薬剤(例えば、化学療法剤、放射線治療剤、抗血管新生剤又は標的療法のための薬剤)、チェックポイント分子(例えば、CTLA4、LAG3、TIM3、BTLA又はTIGIT)を阻害する薬剤、癌ワクチン、免疫抑制酵素(例えば、IDO1又はiNOS)を修飾する薬剤、Treg細胞を標的とする薬剤、養子細胞療法のための薬剤又は骨髄細胞を調節する薬剤が挙げられる。
一態様では、本発明は、第2の治療剤が、抗CTLA4、抗CD2、抗CD40、抗HVEM、抗BTLA、抗CD160、抗TIGIT、抗TIM-1/3、抗LAG-3、抗2B4、及び抗OX40、抗CD40アゴニスト、CD40-L、TLRアゴニスト、抗ICOS、ICOS-L及びB細胞受容体アゴニストからなる群から選択される適応免疫細胞(T及びBリンパ球)の免疫チェックポイント遮断薬又は活性化剤である、上記で定義された併用療法に関する。
本発明はまた、対象における疾患を処置する方法であって、治療有効量の本明細書に記載される多機能性分子又は医薬組成物及び治療有効量の追加の又は第2の治療剤を当該対象に投与することを含む方法に関する。
追加の又は第2の治療剤の具体例は、国際公開第2018/053106号の36～43頁に記載されている。
好ましい態様では、第2の治療剤は、化学療法剤、放射線療法剤、免疫療法剤、細胞療法剤(CAR-T細胞等)、抗生物質及びプロバイオティクスからなる群から選択される。
併用療法はまた、本発明による多機能性分子又はそれを含む医薬組成物の投与と手術との組合せによるものであってもよい。
特に、本発明による多機能性分子は、第1の多機能性分子及び/又は少なくとも1つの免疫刺激サイトカインを含む多機能性分子とは異なる、免疫細胞表面上に特異的に発現される標的に結合する少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む第2の多機能性分子と組み合わせて使用するためのものである。
本発明の多機能性分子及び第2の多機能性分子は、同時に又は連続して投与される。逐次投与の例において、本発明の多機能性分子は、第2の多機能性分子の投与前に投与される。別の例では、本発明の多機能性分子は、第2の多機能性分子の投与後に投与される。
対象、レジメン及び投与
本発明は、医薬として使用するための、又は疾患の処置において使用するための、又は対象に投与するための、本明細書に開示される多機能性分子、核酸、核酸の群若しくはそれをコードするベクター、宿主細胞又は医薬組成物に関する。本発明はまた、対象における疾患又は障害を処置する方法であって、治療有効量の医薬組成物又は多機能性分子を対象に投与することを含む方法に関する。
処置する対象は、ヒト、特に出生前段階のヒト、新生児、小児、乳児、青年又は成人、特に少なくとも20歳、30歳、40歳の成人、好ましくは少なくとも50歳の成人、更により好ましくは少なくとも60歳の成人であってもよい。
特定の態様では、対象は、免疫抑制されているか、又は免疫無防備状態であってもよい。免疫無防備状態の対象は、通常、疾患、栄養不良、又は免疫抑制療法の結果として、強い免疫応答を発生させることができないか、又は発生させる可能性が低い対象である。免疫抑制又は免疫無防備状態であると考えられ得る対象としては、免疫抑制剤で処置されたか又は免疫抑制剤での処置の候補である対象、AIDS(又はHIV陽性)に罹患した対象、重症複合免疫不全症の対象、糖尿病患者、移植を受けた対象及び免疫抑制剤を服用している対象、並びに癌の化学療法を受けている対象が挙げられるが、これらに限定されない。免疫無防備状態の個体には、ほとんどの形態の癌(皮膚癌以外)、鎌状赤血球貧血、嚢胞性線維症を有する対象、脾臓を有さない対象、末期腎疾患(透析)の対象、及び過去1年以内に頻繁にコルチコステロイド又は他の免疫抑制療法を受けている対象も含まれる。
いくつかの特定の実施形態では、対象は、PD-1/PDL-1経路に関与する疾患に罹患しており、特に、PD-1のリガンド(例えば、PDL-1及び/又はPDL-2)又はPD-1のうちの少なくとも1つが発現しており、特に過剰発現している。好ましくは、対象は、癌、更により好ましくはPD1、PD-L1及び/若しくはPD-L2陽性癌又はPD-1陽性癌に罹患している。
特定の実施形態では、対象は、本発明による多機能性分子又は本発明による医薬組成物の投与前に、少なくとも1つの処置ライン、好ましくはいくつかの処置ラインを既に受けている。
いくつかの実施形態では、患者は、処置、特に抗癌処置に対する耐性を有し、当該処置は、特に、抗PD-1免疫療法などの免疫チェックポイント阻害剤である。
処置される疾患の種類又は疾患の部位に応じて、本明細書に開示される多機能性分子又は医薬組成物を対象に投与するために、医学の当業者に公知の従来の方法を使用することができ、例えば、経口、非経口、経腸、吸入スプレーによって、局所、直腸、経鼻、頬側、経膣、又は移植されたリザーバーを介して投与することができる。好ましくは、多機能性分子又は医薬組成物は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、腫瘍内、胸骨内、包膜内、病変内、及び頭蓋内注射又は注入技術によって投与される。
本発明による医薬組成物又は多機能性分子の医薬組成物の形態、投与経路及び投与用量は、感染性疾患の種類及び重症度、並びに患者、特にその年齢、体重、サイズ、性別及び/又は一般的な健康状態に応じて当業者によって調整され得る。本発明の組成物は、局所又は全身処置が所望されるかどうかに依存して、多くの方法で投与され得る。
キット
本明細書に記載される多機能性分子又は組成物のいずれかが、本発明によって提供されるキットに含まれ得る。本開示は、特に、疾患又は障害(例えば、癌及び/又は感染性疾患)の処置に使用するためのキットを提供する。
本発明の文脈において、「キット」という用語は、容器、受容器又はその他のもので包装された2つ以上の構成要素(そのうちの1つは、本発明の多機能性分子、核酸分子、ベクター又は細胞に対応する)を意味する。したがって、キットは、特定の目標を達成するのに十分な製品及び/又は用具のセットとして記載することができ、単一のユニットとして販売することができる。本発明のキットは、適切な包装中にある。
特に、本発明によるキットは、
- 上記で定義された多機能性分子、
- 当該多機能性分子を含む医薬組成物、
- 当該多機能性分子をコードする核酸分子若しくは核酸分子の群、
- 当該核酸分子若しくは核酸分子の群を含むベクター、及び/又は
- 当該ベクター若しくは核酸分子若しくは核酸分子の群を含む細胞
を含み得る。
キットは、適切な容器中に、本発明の医薬組成物若しくは多機能性分子、及び/又は宿主細胞、及び/又は本発明の核酸をコードするベクターを含み得る。
本発明によるキットに含まれる成分、特に医薬組成物は、特に、シリンジ適合性組成物に製剤化することができる。
いくつかの実施形態では、キットは、癌又は感染性疾患を処置するための追加の薬剤を更に含み、追加の薬剤は、本発明の医薬組成物、融合タンパク質若しくは多機能性分子、及び/又は宿主細胞、及び/又は本発明の核酸分子をコードするベクター、及び/又は核酸分子、又は本発明のキットの他の成分と組み合わせることができ、或いはキット中に別々に提供することができる。特に、本明細書に記載されるキットは、上記の「併用療法」に記載されるものなどの1つ又は複数の追加の治療剤を含み得る。キットは、個体の特定の癌に合わせて調整することができ、本明細書の上記に記載されるように、個体のためのそれぞれの第2の癌療法を含み得る。
本明細書に記載される多機能性分子又は医薬組成物の使用に関する説明書は、一般に、投薬量、投薬スケジュール、意図される処置のための投与経路、多機能性分子を再構成するための手段及び/又は本発明の多機能性分子を希釈するための手段に関する情報を含む。
本発明のキットに同梱される説明書は、通常、ラベル又はパッケージの添付文書(例えば、リーフレット又は取扱説明書の形態でキットに含まれる紙シート)に書かれた説明書である。
最適なシス有効性のために設計された抗PD-1/抗CD28多機能性分子フォーマットの例。 抗PD-1*1/抗CD28*1フォーマットB1は、ヒトPD-1への効率的な結合、及びPD-L1/PD-1相互作用を遮断することによるアンタゴニスト活性を示す。(A)PD-1結合ELISAアッセイ。ヒト組換えPD-1(rPD1)タンパク質を固定化し、抗PD-1*1/抗CD28*1フォーマットB1を異なる濃度で添加した。ペルオキシダーゼに結合した抗ヒトFc抗体を用いて、顕色を行った。比色分析は、TMB基質を使用して450nmで測定した。(B)PD-1結合サイトメトリーアッセイ。抗PD-1*1/抗CD28*1フォーマットB1を、100nMのヒトPD-1を形質導入したCHOと共にインキュベートした。PE標識抗ヒトFc抗体を用いて顕色を行った。結合は、PEシグナルのMFI(平均蛍光強度)の測定によるサイトメトリーによって測定した。(C)アンタゴニストPD-1/PD-L1 ELISAアッセイ。ヒト組換えPD-L1(rPDL1)タンパク質を固定化し、抗PD-1*1/抗CD28*1フォーマットB1を、固定濃度のビオチン化ヒトPD-1と異なる濃度で混合し、固定化PD-L1に添加した。ペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを用いて顕色を行った。比色分析は、TMB基質を使用して450nmで測定した。 抗PD-1*1/抗CD28*1フォーマットB1は、ヒトCD-28に効率的に結合する。CD28結合MSDアッセイ。ビオチン化ヒト組換えCD28タンパク質をMSD用のストレプトアビジンプレート上に固定化し、抗PD-1*1/抗CD28*1 scFvフォーマットB1を異なる濃度で添加した。SulfoTagに結合した抗ヒトFc抗体を用いて顕色を行った。電気信号は、MSDシステムを使用して決定した。 抗PD-1*1/抗CD28フォーマットB1のシス活性は、PD-1+CD28+T細胞を特異的に再活性化し、PD-1 negT細胞を温存する。(A)抗PD-1/CD28二重特異性抗体のシス活性化の概略図。(B)抗PD-1/抗CD28多機能性分子での処理後のPD-1+CD28+又はPD-1-CD28+ジャーカット細胞のIL-2分泌バイオアッセイ。簡潔には、PD-1+CD28+ジャーカット細胞株を、PD-1*1/抗CD28*1 scFvフォーマットB1(100nM)、抗PD-1*1、アイソタイプ対照又は抗CD28(非特異的PD-1非依存性活性化の二価抗CD28陽性対照)の存在下で、CD3コーティングされたプレート(2.5ug/mL)上でインキュベートした。刺激の48時間後に、培養上清中のIL-2分泌を定量した。N=5の独立した実験。IL-2分泌は、抗体なしの対照条件に対して正規化した。(C)抗PD-1*1 CD28*1フォーマットB1(●)又は陰性対照:アイソタイプ対照(□)若しくは抗PD-1*1(○)で処置したPD-1+CD28+ジャーカットT細胞のIL-2用量反応シス活性化。5回の独立した実験のうちの1回の代表的な実験。 PD-1陰性CD28+T細胞に対する抗PD-1*1/抗CD28フォーマットB1のトランス活性の欠如。(A)実験設定の概略図であり、PD-1組換えタンパク質をコーティングし、PD-1-CD28+ジャーカットT細胞を、100nMのPD-1*1/抗CD28*1 scFvフォーマットB1(100nM)、抗PD-1*1、アイソタイプ対照又は抗CD28(非特異的PD-1非依存性活性化の二価抗CD28陽性対照)と共にインキュベートした。(B)に示すように、ELISAアッセイを用いて、培養48時間後の上清におけるIL-2分泌を定量した。 抗PD-1/抗CD28の複数のフォーマットは、PD1+CD28+を特異的に活性化する。(A)PD-1結合ELISAアッセイ。ヒト組換えPD-1タンパク質を固定化し、抗PD-1/抗CD28多機能性分子フォーマットA1、B1、B2、C1又はC2を異なる濃度で添加した。ペルオキシダーゼに結合した抗ヒトFc抗体を使用して顕色を行った。比色分析は、TMB基質を使用して450nmで測定した。データは、20nMの抗PD-1*2又は抗PD-1*1の条件によって正規化し、それぞれ、二価及び一価の数字について結合の100%とみなした。条件あたりN=2の独立した実験。(B)アンタゴニストPD-1/PDL1 ELISAアッセイ。ヒト組換えPD-L1タンパク質を固定化し、抗PD-1/抗CD28多機能性分子フォーマットA1、B1、B3、C1、C2、C5を、固定濃度のビオチン化ヒトPD-1と異なる濃度で混合し、ELISAプレート上に固定化したPD-L1に添加した。ペルオキシダーゼに結合したストレプトアビジンを用いて顕色を行った。比色分析は、TMB基質を使用して450nmで測定した。アンタゴニスト活性のパーセンテージを、式100-((DO450nM*100)/抗体なしDO450nM)によって決定した。N=2の独立した実験。(C)CD28結合MSDアッセイ。ビオチン化ヒト組換えCD28タンパク質をストレプトアビジンコーティングされたプレート上に固定化し、抗PD-1*1/抗CD28*1多機能性分子フォーマットA1、B1又はB2を異なる濃度で添加した。二価抗CD28結合ドメイン及び一価抗PD-1結合ドメインを、それぞれ陽性対照及び陰性対照としてロードした。SulfoTagに結合した抗ヒトFc抗体を用いて顕色を行った。電気信号は、MSDシステムを使用して決定した。(D)シス活性ジャーカットT細胞ベースのバイオアッセイ。抗PD-1/抗CD28多機能性分子での処理後のPD-1+CD28+又はPD-1-CD28+ジャーカット細胞のIL-2分泌バイオアッセイ。簡潔には、PD-1/抗CD28多機能性分子フォーマットA1、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C5及びC6(100nM)、抗PD-1又は抗CD28抗体(非特異的PD-1非依存性活性化の二価抗CD28陽性対照)の存在下で、PD-1+CD28+ジャーカット細胞株をCD3コーティングされたプレート(2.5～3μg/mL)上でインキュベートした。刺激の48時間後に培養上清中のIL-2分泌を定量し、抗体を含まない条件によってデータを正規化した。N=2～7の独立した実験。IL-2分泌は、抗体なしの対照条件に対して正規化した。統計分析は、マン・ホイットニー検定を使用して行った。**はp値≦0.001を示し、nsは有意でないことを示す。(E)抗CD28プレブロッキングを用いたジャーカットT細胞ベースのバイオアッセイのシス活性。抗CD28アンタゴニスト及び抗PD1/抗CD28多機能性分子での処理後のPD-1+CD28+ジャーカット細胞のIL-2分泌バイオアッセイ。簡潔には、PD-1+CD28+ジャーカット細胞株を、1μg/mLの抗CD28アンタゴニストで20分間処理し、次いで、フォーマットB1 PD-1*1/抗CD28*1 scFvクローン1(100nM)の存在下で、CD3コーティングされたプレート(3μg/mL)上でインキュベートした。刺激の48時間後に培養上清中のIL-2分泌を定量し、抗体を含まない条件によってデータを正規化した。N=3の独立した実験及び抗CD28アンタゴニストを用いない条件についての2つの更なる実験。統計分析は、マン・ホイットニー検定を使用して行った。*はp値≦0.05を示す。(F)トランス活性ジャーカットT細胞ベースのアッセイ。PD-1組換えタンパク質をコーティングし、PD-1-CD28+ジャーカットT細胞を、100nMのPD-1/抗CD28多機能性分子フォーマットA1、B1、B2、B4、C1、C2及びC6(100nM)、抗PD-1又は抗CD28抗体(非特異的PD-1非依存性活性化の二価抗CD28陽性対照)と共にインキュベートした。ELISAアッセイを使用して、48時間の培養後の上清中のIL-2分泌を定量し、抗体を含まない条件によってデータを正規化した。N=1～2の独立した実験。 先行技術からの他の抗CD28クローンは、PD-1+CD28+T細胞のシス活性化を誘導しないが、CD28+PD1陰性T細胞をトランス様式で活性化する。(A)フォーマットB1抗PD-1*1/抗CD28*1 scFv抗体の概略図。(B)シス活性ジャーカットT細胞ベースのバイオアッセイ。抗PD-1/抗CD28多機能性分子での処理後のPD-1+CD28+又はPD-1-CD28+ジャーカット細胞のIL-2分泌バイオアッセイ。簡潔には、PD-1+CD28+ジャーカット細胞株を、フォーマットB1抗PD-1*1/抗CD28*1 scFvクローン1、クローン2又はクローン3(100nM)の存在下で、CD3コーティングされたプレート(2.5～3μg/mL)上でインキュベートした。刺激の48時間後に培養上清中のIL-2分泌を定量し、抗体を含まない条件によってデータを正規化した。N=2～6の独立した実験。(C)トランス活性ジャーカットT細胞ベースのアッセイ。抗CD3及びPD-1組換えタンパク質をコーティングし、PD-1-CD28+ジャーカットT細胞を、100nMのフォーマットB1抗PD-1*1/抗CD28*1 scFvクローン1、クローン2又はクローン3(100nM)と共にインキュベートした。ELISAアッセイを使用して、48時間の培養後の上清中のIL-2分泌を定量し、抗体を含まない条件によってデータを正規化した。N=1～2の独立した実験。(D)シス活性ジャーカットT細胞ベースのバイオアッセイ。抗PD1/抗CD28未変異又は変異クローン1で処理した後のPD-1+CD28+又はPD-1-CD28+ジャーカット細胞のIL-2分泌バイオアッセイ。簡潔には、PD-1+CD28+ジャーカット細胞株を、フォーマットB1抗PD-1*1/抗CD28*1 scFvクローン1又は変異配列mutVH_FR1、mutVH_FR2、mutVH_FR3、mutVL_FR1、mutVL_F2、mutVH_CDR1、mutVL_CDR1、mutVL_CDR2(300nM)の存在中で、CD3コーティングされたプレート(2.5～3μg/mL)上でインキュベートした。刺激の48時間後に培養上清中のIL-2分泌を定量し、抗体を含まない条件によってデータを正規化し、PD1+及びPD-1-細胞の倍率変化によってIL-2分泌を正規化した。N=2の独立した実験。 他の抗PD-1クローン及び抗CD28クローン1で構築された抗CD28/抗PD-1は、PD-1+CD28+T細胞のシス活性化を可能にする。シス活性ジャーカットT細胞ベースのバイオアッセイ。抗PD-1/抗CD28多機能性分子での処理後のPD-1+CD28+又はPD-1-CD28+ジャーカット細胞のIL-2分泌バイオアッセイ。簡潔には、PD-1+CD28+ジャーカット細胞株を、一価抗PD-1クローン1配列又は一価ペンブロリズマブ配列(100nM)、一価抗PD-1(クローン1配列)又は抗CD28抗体(非特異的PD-1非依存性活性化の二価抗CD28陽性対照)を有する抗PD-1*1/抗CD28*1 scFv多機能性分子フォーマットB1の存在下で、CD3コーティングされたプレート(3μg/mL)上でインキュベートした。刺激の48時間後に培養上清中のIL-2分泌を定量し、抗体を含まない条件によってデータを正規化した。N=4の独立した実験。 フォーマットB1抗PD-1*1/抗CD28*1 scFvは、ヒト腫瘍浸潤リンパ球を再活性化する。TILSによるIFNγ分泌。新たに単離した肺腫瘍(n=2)及び卵巣腹水(n=1)を処理して、腫瘍オルガノイドを単離し、培養した。腫瘍オルガノイドを、70nMのアイソタイプ対照、抗PD-1*2又は抗PD-1*1/抗CD28*1 scFv(多機能性分子フォーマットB1クローン1)の存在下、37℃、5%CO2で48時間、3連で培養した。インキュベーション後、上清を回収し、TILSによって分泌されたIFNγをMSD又はELISAによって定量した。ウィルコクソン検定を使用して統計分析を行った。*はp値≦0.05を示す。 抗PD-1/抗CD28多機能性分子の複数のフォーマットは、マウスにおいて良好な薬物動態を示す。C57BL/6Jrjマウスに、それぞれ4mg/kg又は5mg/kgの抗PD-1/抗CD28クローン1多機能性分子(フォーマットA1、B1、B3、C2及びC6)又は二価抗PD-1を静脈内単回投与した。血液を0.5、1、4、24、48、100及び144時間でサンプリングした。抗体濃度は、マウス抗ヒトκIgG抗体を使用して血清中のELISAによって測定し、ロバ抗ヒトIgG-ペルオキシダーゼ及びTMB基質を用いて検出を行った。
本発明の更なる態様及び利点は、以下の実施例に記載され、これらは例示的であり、限定するものではないとみなされるべきである。
材料及び方法
多機能性分子
本発明による多機能性分子の構造の例を、図1及び図7Aに示す。
抗PD-1クローン1は、国際公開第2020/127366号に開示されているOSE-279抗体に由来する。そのような抗PD-1結合ドメインは、配列番号15に記載される可変重鎖及び配列番号16に記載される可変軽鎖を含む。
ペンブロリズマブは、国際公開第2008156712号に開示されている。ペンブロリズマブに由来する抗PD-1結合ドメインは、配列番号79に記載される可変重鎖及び配列番号80に記載される可変軽鎖を含む。
抗CD28クローン1は、配列番号44に記載される可変重鎖及び配列番号45に記載される可変軽鎖を含む。
抗CD28クローン2は、国際公開第2006050949号に由来する。抗CD28クローン2を含む多機能性分子は、特に、i)配列番号81(抗CD 28アーム)並びにii)配列番号25及び配列番号16(抗PD-1アーム)に記載されている。このような多機能性分子はB1フォーマットである。
抗CD28クローン3は、国際公開第2021260064号に由来する。抗CD28クローン3を含む多機能性分子は、特に、i)配列番号82(抗CD 28アーム)並びにii)配列番号25及び配列番号16(抗PD-1アーム)に記載されている。このような多機能性分子はB1フォーマットである。
抗CD28クローン1の変異体
抗CD28クローン1の変異体が作製されている。変異アミノ酸は、未変異配列と比較して、以下の表2に提供される変異体の配列において太字で下線が引かれている。各変異体について、VH配列が変異を含む場合(例えば、配列番号83、84、85又は88に記載されるもの等)、VL配列は変異していない(すなわち、配列番号45に記載されるもの等)。逆に、VL配列が変異を含む場合(例えば、配列番号86、87、89又は90に記載されるもの等)、VH配列は変異していない(すなわち、配列番号44に記載されるもの等)。
特に、変異が抗-CDR28結合ドメインのフレームワーク領域にある場合、抗-CDR28クローン1の元の配列と比較して、mutVH_FRs1は重鎖フレームワーク領域HFR1、HFR2及びHFR3にアミノ酸置換を含み、mutVH_FRs2はHFR1、HFR2、HFR3及びHFR4にアミノ酸置換を含み、mutVH_FRs3はHFR1、HFR3及びHFR4にアミノ酸置換を含み、mutVL_FRs1は軽鎖フレームワーク領域LFR1、LFR2、LFR3及びLFR4にアミノ酸置換を含み、mutVL_FRs2はLFR1、LFR3及びLFR4にアミノ酸置換を含む。
変異が抗-Cd28結合ドメインのCDRにある場合、抗-Cd28クローン1の元の配列と比較して、mutVH_CDRs1は重鎖CDR1にアミノ酸の置換を含み(HCDR1の配列はIGMT法に従って決定される)、mutVL_CDRs1は軽鎖CDR1にアミノ酸の置換を含み(LCDR1の配列はIGMT又はKabat法に従って決定される)、mutVL_CDRs2は軽鎖CDR2にアミノ酸の置換を含む(LCDR1の配列はIGMT又はKabat法に従って決定される)。
PD-1 ELISA結合
組換えhPD1(Sino Biologicals社、Beijing、China、参照番号10377-H08H)を96ウェルに固定化した。炭酸緩衝液(pH9.2)中0.5μg/mlでプレーティングし、精製抗体を添加して結合を測定した。インキュベーション及び洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch社、USA、参照番号709-035-149)を添加し、従来の方法によって明らかにした。
PD1+発現CHO細胞への結合分析
CHOにヒトPD1遺伝子を形質導入し、PD1受容体を発現するように選択した。精製抗体をCHO PD1+に100nMで添加した。インキュベーション及び洗浄後、フィコエリトリン標識抗ヒトIgG(Biolegend社、参照番号409303)を添加し、サイトメトリーで従来の方法によって明らかにした。
PD-1/PD-L1アンタゴニストELISAアッセイ
競合ELISAアッセイを、PD-1:PD-L1阻害剤スクリーニングELISAアッセイペア(AcroBiosystems社、USA、参照EP-101)によって実施した。このアッセイでは、組換えヒトPDL1を、pH7.4のPBS緩衝液中2μg/mlでプラスチック上に固定化した。精製抗体(異なる濃度)を、ビオチン化ヒトPD1(AcroBiosystems社、USA、参照番号EP-101)の最終濃度0.66μg/ml(固定濃度)と混合して、37℃で2時間競合結合を測定した。インキュベーション及び洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Vector laboratoring社、USA、参照番号SA-5004)を添加して、ビオチン-PD-1 Fc結合を検出し、従来の方法によって明らかにした。
MSD技術を使用したCD28結合測定
活性ELISAアッセイのために、組換えヒトCD28(bio-techne社、参照番号342-CD-200)を1×PBS(pH7.4)中5μg/mlでプラスチック上に固定化し、精製抗体及び多機能性分子を添加して結合を測定した。インキュベーション及び洗浄後、sulfoTag標識モノクローナルマウス抗ヒトκ抗体(クローンNaM76-5F3、MSD GOLD SULFO-TAG NHS-Ester試薬(MSD社、参照番号R91AO-1)で標識)を添加し、MSDシステムによって明らかにした。
ジャーカットの表現型決定
ジャーカットT細胞リンパ腫は、フローサイトメトリーを使用して表現型を決定した。ジャーカットを、1×黄色live/dead試薬(#L34968、Thermofisher社)と共に氷上で20分間インキュベートした。細胞を1×PBS、2mM EDTA、2%FBSで3回洗浄した。ジャーカットを、抗CD28-FITC(1/20、#555728、BD)と共に、氷上で30分間インキュベートした。細胞を1×PBS、2mM EDTA、2%FBSで3回洗浄した。ジャーカットを、従来のフローサイトメーターCytoflex(Beckman社)で分析した。CD28発現を、非染色及び/又はFMO(蛍光マイナス1)対照を使用して、生存(LIVE/DEAD陰性)単一事象において試験した。
シス活性のバイオアッセイ
CD28を発現するジャーカットT細胞リンパ腫にヒトPD-1を形質導入し、細胞表面上でのヒトPD-1の安定な発現を可能にした。バイオアッセイのために、ジャーカットCD28+PD-1-又はジャーカットCD28+PD-1+を、抗PD-1/抗CD28多機能性分子の存在下で、CD3コーティングされたプレート(2.5～3μg/mLのOKT3)上で培養した。48時間のインキュベーション後、ジャーカット細胞によって分泌されたIL-2を、ELISA(Duoset R&Dキット、#DY202-05又はOptEIA(商標)BDキット、#555190)を使用して上清において定量した。
トランス活性バイオアッセイ
ジャーカットCD28+PD-1-細胞を、抗PD-1/抗CD28多機能性分子の存在下で、CD3(2.5～3μg/mLのOKT3)+ヒトPD-1コーティングされたプレート上で培養した。48時間のインキュベーション後、ジャーカット細胞によって分泌されたIL-2を、ELISA(Duoset R&Dキット、#DY202-05又はOptEIA(商標)BDキット、#555190)を使用して上清において定量した。
Biacore
hCD28組換えタンパク質(bio-techne社、参照番号342-CD-200)を、Biacore T200において酢酸ナトリウム(pH5)中20ug/mLでCM5センサーシップに固定化した。結合は、HBS EP緩衝液(CYTIVA社によって提供される)中の抗CD28二価抗体又は抗CD28/抗PD-1(フォーマットB1)抗体を、漸増用量(0、187、375、750、1500及び3000nM)で、40μL/分の流速で流すことによって測定した。抗原-抗体会合動態を2分間追跡し、解離動態を10分間追跡した。会合及び解離曲線を二価モデルに適合させた。
マウスにおける薬物動態
抗PD-1/抗CD28(4mg/kg)又は抗PD-1*2(5mg/kg)の単回用量を、雌の9週齢のC57BL6RJ野生型マウスに静脈内注射した。投与後、複数の時点(0.5、1、4、24、48、72、100及び144時間)で血液を採取し、PBSで50倍に希釈し、遠心分離し、抗体を含有する上清(血清)を定量分析まで-20℃(短期)又は-80℃(長期)で保存した。
血清中の薬物濃度を、1×ホウ酸緩衝液中に1μg/mlで希釈した固定化マウス抗ヒトκIgG(クローンNaM76-5F3)を使用してELISAによって決定した。検出は、ペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch社、USA、参照番号709-035-149)を用いて実施し、従来の方法によって明らかにした。
腫瘍オルガノイドにおけるTILS-IFNγ分泌定量
切除手術後に腫瘍を新たに採取し、処理まで(手術後最大24時間)MACS組織保存(Miltenyi社)中で2～8℃で保存した。この実験のために、肺癌の2つの試料を採取した。穿刺後に、卵巣腹水を新たに収集し、この実験のために1つの卵巣腹水を採取した。化学療法又は放射線療法処置を受けた患者から試料を採取し、それらはいずれも免疫チェックポイント遮断療法で処置しなかった。
5%FBS、100U/mLペニシリン及び0.1mg/mLストレプトマイシン/プリモシンを添加した50%RPMI1640(Gibco社)、50%TexMacs(Miltenyi社)中で、腫瘍を2～3mm3の断片に細分した。断片をUltra Low Attachmentプレートに均一にプレーティングした。70nMの抗体(アイソタイプ対照、抗PD-1*2及び抗PD-1*1/抗CD28*1 scFvフォーマットB1クローン1)を腫瘍オルガノイドに添加し(3連)、プレートを37℃、5%CO2でインキュベートした。48時間のインキュベーション後、培養上清を回収し、MSD IFNγ定量まで-80℃で保存した。
腹水を遠心分離し、5mM EDTAを添加したPBSでペレットを洗浄した。2回目の遠心分離後、赤血球をRBC溶解緩衝液で除去した。5%FBS、100U/mLペニシリン及び0.1mg/mLストレプトマイシン/プリモシンを添加した50%RPMI1640(Gibco社)、50%TexMacs(Miltenyi社)に残りの細胞を再懸濁し、Ultra Low Attachmentプレートにプレーティングした。70nMの抗体(アイソタイプ対照、抗PD-1*2及び抗PD-1*1/抗CD28*1 scFvフォーマットB1クローン1)を細胞に添加し(3連)、プレートを37℃、5%CO2でインキュベートした。48時間後、培養上清を回収し、MSD定量まで-80℃で保存した。腫瘍オルガノイドにおいてTILSによって分泌されたIFNγを、S-plex Human IFN-yキット(#K151X9S-2、MSD社)によって定量した。
結果
(実施例1)
一価抗PD-1を用いて効率的に構築された抗PD-1/抗CD 28多機能性分子は、ヒトPD-1阻害シグナル伝達に効率的に結合し、アンタゴナイズする。
ヒトPD-1受容体への抗PD-1/抗CD28(フォーマットB1)の結合をELISAによって評価した。簡潔には、組換えヒトPD-1受容体をプレート上にコーティングし、多機能性分子を段階希釈で添加し、次いで、ペルオキシダーゼ+TMBに結合した二次抗ヒトIgG抗体で明らかにした。PD-1発現細胞への結合もまた、ヒトPD-1形質導入CHO細胞を抗PD-1/抗CD28+抗ヒトIgG-PE抗体と共にインキュベートした後に評価した。PD-1に対する多機能性分子のアンタゴニスト活性を、競合ELISAアッセイ(Acrobiosystem社)によって評価した。
図2に示すように、一価抗PD-1で構築されたフォーマットB1は、ヒトPD-1受容体に結合し、PD-L1相互作用を効率的にアンタゴナイズし、一価フォーマットであっても、多機能性分子の抗PD-1ドメインがPD-1+疲弊したT細胞を標的とし、PD-L1/PD-1会合を遮断し、その結果、PD-1媒介性阻害シグナル伝達をアンタゴナイズし、PD-1+疲弊したT細胞の再活性化を促進する(エフェクター機能を増強する)ことができることを実証している。
(実施例2)
一価抗CD28抗体を用いて効率的に構築された抗PD-1/抗CD28多機能性分子は、ヒトCD28に結合することができる。
図3は、MSD技術を使用したELISAによって評価されるように、抗PD-1/抗CD28(フォーマットB1)がヒトCD28に結合することを示す。簡潔には、ビオチン化ヒト組換えCD28タンパク質をMSD用のストレプトアビジンプレート上に固定化し、抗PD-1*1/抗CD28*1 scFvフォーマットB1を異なる濃度で添加した。SulfoTagに結合した抗ヒトFc抗体を用いて顕色を行った。電気信号は、MSDシステムを使用して定量した。
(実施例3)
抗PD-1/抗CD28 scFv多機能性分子(フォーマットB1)シスは、PD-1陰性CD28+T細胞を温存しながら、PD-1+CD28+T細胞を標的化し、特異的に活性化する
抗PD-1/抗CD28多機能性分子のシス有効性を、CD28受容体のみを発現するか、又はCD28及びPD-1受容体を同時発現するジャーカットT細胞を使用して、細胞ベースのバイオアッセイにおいて評価した。抗CD3コーティングされたプレート(2.5μg/mL)上で抗PD-1/抗CD28(フォーマットB1)で処理した後、ELISAアッセイを使用して、インキュベーションの48時間後に上清中のIL-2分泌を定量した。
図4A、B及びCは、抗PD-1/抗CD28(フォーマットB1)を示す。多機能性分子は、PD-1+CD28+T細胞においてT細胞活性化(IL-2分泌)を促進することができるが、薬物は、PD-1陰性T細胞に対して効果がなく、PD-1+T細胞のみへのCD28シグナル伝達を誘発する分子のシス特異的活性(すなわち、同じ細胞に対する)を実証する。この効果は、図Cに示すように、用量依存的である。並行して、本発明者らはまた、抗PD-1二価抗体はT細胞の活性化を誘導しないが、二価抗CD28は、PD-1発現に関係なく、全てのT細胞集団において活性化を促進することを示している。CD28は全てのT細胞上で発現されるので、二価抗CD28抗体は、以前の臨床試験(Suntharalingamら、NEJM、2016)に記載されるように、高い免疫毒性及びサイトカインストームを誘導する全てのT細胞の活性化を誘発する。対照的に、本発明者らによって記載される抗PD-1/抗CD28多機能性分子は、PD-1+T細胞(腫瘍特異的な疲弊したT細胞)の選択的活性化を示す一方で、二価抗CD28抗体によって誘導される非特異的毒性を防止するPD-1陰性T細胞(ナイーブCD28+非特異的T細胞)の活性化を温存する。
抗PD1/抗CD28多機能性分子によって誘導される効果がシス様式でのみ媒介されること、及び薬物がトランス活性を有さないことを確認するために、本発明者らは、図5Aに示すように、二重特異性の抗PD-1ドメインの結合を強制するためのPD-1コーティングされたプレートに対する薬物の効果を試験した。次いで、CD28受容体のみを発現するジャーカットT細胞をプレートに添加し、共インキュベーションの48時間後に、上清中のIL-2分泌をELISAによって測定した。図5Bは、PD-1がプレートにコーティングされた場合、抗PD-1/抗CD28(フォーマットB1)多機能性分子がIL-2の分泌を誘導しないことを示し、多機能性分子がPD-1陰性CD28+T細胞に対してトランス活性効果を有さないことを示唆している。これらのデータは、本発明者らによって記載された抗PD-1/抗CD28が、PD-1陰性細胞(ナイーブT細胞)を活性化せず、PD-1受容体を発現する同じ細胞へのCD28シグナルを誘発することによってシス依存性特性のみを有することを確認する。
まとめると、本発明者らによって記載された抗PD-1/抗CD28多機能性分子は、CD28同時刺激シグナルを誘発することによって、また、PD-1阻害性シグナル伝達を遮断することによって、シス依存性様式で作用して、非特異的T細胞を活性化することなく、PD-1+CD28+疲弊T細胞エフェクター機能を再活性化する。反対に、一価CD28及び一価抗TAAドメインを有する、他の研究者らによって記載された二価抗CD28抗体又は他の抗CD28二重特異性抗体は、全てのT細胞、PD-1腫瘍特異的T細胞、及びPD-1陰性非特異的T細胞をトランスで活性化する。
(実施例4)
抗PD-1/抗CD28多機能性分子の複数のフォーマットは、PD1-CD28+細胞を温存しながら、PD1+CD28+細胞をシス様式で効率的かつ特異的に活性化する。
実施例2に記載される以外の抗PD-1/抗CD28多機能性の他のフォーマットを、図1に記載するように、抗CD28 scFvに融合された二価抗PD-1抗体(フォーマットC1及びC2)、抗CD28 scFvに融合された一価抗PD-1抗体(フォーマットB1及びB2)、又は一価抗CD28 Fab CrossMAbに融合された一価抗PD-1 Fab(フォーマットA1)を使用して構築した。これらの異なる構築物を、抗CD28クローン1を用いて作製した。PD-1+CD28+T細胞をシス活性化する抗体の能力を、PD1+CD28+ジャーカットT細胞バイオアッセイを使用して評価した。ヒトCD28(MSD技術)又はヒトPD-1(ELISAアッセイ)に結合する抗体の能力を、実施例2及び3に詳述されるように試験した。ヒトPD-1への抗PD-1/抗CD28多機能性分子の結合を、ELISAプレート上にヒトPD-1組換えタンパク質をコーティングした後にELISAによって評価した。
図6Aは、二価(フォーマットC1及びC2)又は一価(フォーマットB1及びB2)抗PD-1ドメインを有する二重特異性抗体の異なるフォーマットが、ヒトPD1受容体に効率的に結合することを実証している。抗CD28ドメインに対してCrossMAb技術を使用する抗体(フォーマットA1)は、PD-1に結合するが、効力がより低い。scFv抗CD28ドメインを抗PD-1結合ドメインのC末端又はN末端ドメインに融合させると、フォーマットC1とC2との間で類似の結合活性が観察されるので、PD-1受容体に結合する能力を改変しない。PD-L1/PD-1系に対する抗PD-1/抗CD28多機能性分子のアンタゴニスト活性を、競合ELISAアッセイ(Accrobiosystems社)を使用して、二価抗PD 1(フォーマットC5)又は一価抗PD 1(フォーマットB3)のC末端に融合した2つの他のフォーマットscFv抗PD28と比較して試験した。
図6Bは、全てのフォーマットが有効なアンタゴニスト抗PD-1活性を有することを示している。フォーマットC5は高いアンタゴニスト活性を示し、抗PD-1一価フォーマット(B1及びB3)は二価抗PD-1構築物(C1及びC2)と同様のアンタゴニスト活性を示した。
次に、本発明者らは、ヒトCD28に結合する異なる構築物の特性を評価した。抗PD-1*1構築物を、このアッセイの陰性対照試料として使用した。
図6Cは、抗CD28 scFvフォーマット(フォーマットB1及びB2)を含むか、又は抗CD28 Fabフォーマット(フォーマットA1)を有する二重特異性分子の全ての異なるフォーマットがヒトCD28に結合することを検証する。B1及びB2構築物は同等の結合能力を有するので、VH及びVLドメインの配向はヒトCD28への結合に影響を及ぼさない。一価抗CD28標的化ドメインを含む全ての抗PD-1/抗CD28構築物は、ヒトCD28に対して、抗PD-1結合価を有さない抗CD28二価クローン1抗体(実験の陽性対照)よりも結合能力が低い(図6C及び以下の表1)。75.4nMに等しい親和性が二価抗CD28抗体について観察され、最大5000nMのKDが抗PD-1/抗CD28抗体(フォーマットB1)について推定された。二価抗CD28抗体は、ヒト患者において非特異的T細胞活性化(TCR誘発とは無関係に)及び高い毒性効果を誘導し、ナイーブT細胞の非特異的活性化及び高いサイトカイン放出をもたらすことができる。PD-1+T細胞を特異的に活性化し、PD-1とは独立してナイーブT細胞上のCD28受容体の誘発/クラスター形成を回避するために、本発明者は、PD-1受容体への多機能性分子の標的化を支持し、PD-1+腫瘍特異的T細胞へのCD28シグナル伝達を厳密に再活性化するために、CD28結合特性が低い抗CD28一価フォーマットを有する抗PD-1/抗CD28多機能性分子を設計した。
実施例3に記載される細胞ベースのバイオアッセイを使用して、異なる構築物のシス活性を、PD-1+CD28+細胞又はPD-1陰性CD28+ジャーカット細胞によるIL-2の分泌を定量することによって評価した。図6Dは、試験した抗PD-1/抗CD28多機能性分子の全てがPD-1陰性CD28+T細胞を活性化せず(灰色のバー)、PD1+CD28+T細胞を活性化する(抗体を含まない条件に対して2～7倍のIL-2分泌の増加が観察された(黒色のバー))ことを実証している。二価抗CD28(陽性対照)は、PD1+及びPD1-CD28+T細胞集団の両方を同様の有効性で活性化し、バイオアッセイにおけるPD-1+及びPD1-細胞の両方が抗CD28抗体で活性化され得ることが確認されている。予想外に、二価抗CD28(対照+)と比較して、シングルアームフォーマットにおける抗CD28結合ドメインの低い親和性/結合活性にもかかわらず、PD-1+CD28+T細胞の同等の活性化がいくつかの構築物について観察され、同じT細胞上のPD-1及びCD28を同時標的化する多機能性分子の高い効力が確認されている。
抗CD28アームを有さない二価又は一価抗PD-1構築物(陰性対照)は、IL-2分泌を誘導せず、CD28シグナル伝達の関与が、多機能性分子を有するPD-1+細胞を活性化するために必要とされることを実証している。驚くべきことに、異なる抗PD-1/抗CD28多機能性分子のPD-1受容体への結合が、2アーム抗PD-1抗体を有する他の構築物と比較して、シングルアーム抗PD-1抗体(一価抗PD-1)で低減される場合でさえ(図6Aで証明されるように)、全ての一価構築物は、PD-1+CD28+T細胞をシス活性化するために、二価抗PD-1アームを有する構築物と同様の有効性を有する。まとめると、これらのデータは、CD28クローン1を含む抗PD-1/抗CD28多機能性分子の全てのフォーマットが、PD-1陰性CD28+T細胞を温存しながら、PD-1+CD28+への厳密なシス活性化シグナル伝達を促進することができることを強調している。
バイオアッセイにおいて観察されるT細胞の活性化がCD28シグナル伝達の関与によって誘導されることを確認するために、本発明者らは、抗PD-1*1/抗CD28*1 scFv多機能性分子(フォーマットB1)のインキュベーション前にPD-1+CD28+細胞に対してプレインキュベートした抗CD28遮断抗体を用いて同じバイオアッセイを行った。図6Eは、IL-2分泌が、プレブロッキングなしの条件と比較して、抗CD28アンタゴニスト処置の存在下でPD1+細胞において有意に抑止されることを示している。このデータは、抗PD-1/抗CD28多機能性分子によって誘導されるIL-2分泌が抗CD28アゴニスト活性に依存することを示唆している。他方で、抗PD-1ドメインは、特異的PD-1標的化及びCD28分子の架橋を可能にし、その結果、PD-1+T細胞へのCD28共刺激カスケードシグナル伝達経路を誘発する。
最後に、本発明者らは、図5Aに例示され、実施例3に記載されるように、抗PD-1ドメインの結合及び抗CD28ドメインのトランス提示を強制するために、PD-1コーティングされたELISAプレート上で異なる抗PD 1/抗CD28多機能性分子フォーマットのトランス活性を試験した。このアッセイは、抗CD28ドメインのPD-1+細胞によるトランス提示を模倣し、PD-1陰性T細胞へのCD28シグナル伝達を誘発する分子の潜在的な非特異的効果を評価することを可能にする。図6Fは、ヒトPD-1でコーティングされた条件下でも、PD-1/抗CD28多機能性分子フォーマットがPD-1-CD28+細胞によるIL-2の分泌を誘導しないことを示し、CD28クローン1で構築された抗PD-1/抗CD28多機能性分子が、多機能性分子の設計(すなわち、フォーマット)にかかわらず、PD-1-CD28+T細胞に対してトランス活性効果を有さないことが確認された。
まとめると、これらのデータは、抗CD28クローン1を含む抗PD-1/抗CD28多機能性分子の複数のフォーマットがPD-1陰性細胞(例えば、ナイーブT細胞)を活性化しないが、(1)PD-1/PD-L1阻害性シグナル伝達を特異的に遮断し、(2)PD-1+細胞へのCD28活性化シグナル伝達を誘導して、疲弊したPD1+T細胞の再活性化及び抗腫瘍有効性を促進することができることが確認された。
(実施例5)
抗PD-1/抗CD28多機能性分子のシス活性は、抗CD28クローン1エピトープ結合ドメインに特異的である。
抗CD28エピトープ結合ドメインが多機能性分子のシス活性特性に重要であるかどうかを評価するために、本発明者らは次に、トランス様式で腫瘍細胞抗原を標的化した後にCD28シグナル伝達を誘発するためのスーパーアゴニストTGN1412(クローン2)を含む他の抗CD28配列(クローン2及び3)を用いて、フォーマットB1(図7A)の更なる多機能性分子を構築した。異なる抗CD28クローンのアゴニスト特性を、抗CD3+抗PD-1/抗CD3構築物でコーティングしたプレート上でインキュベートしたヒトPBMCを使用して最初に確認して、コーティングしたELISAプレートとのCD28の架橋を誘導した(データは示さず)。次いで、異なる抗PD-1/抗CD28分子(可溶性形態)のシス活性特性を、実施例3に記載されるPD-1+対PD-1-T細胞ベースのアッセイを使用して評価した。図7Bは、クローン2がPD-1陰性T細胞の高い活性化(4倍)を誘導することを実証した。抗PD-1/抗CD28クローン3はまた、PD-1陰性細胞の非特異的活性化を誘導する(2倍)。興味深いことに、抗PD-1/抗CD28クローン2及びクローン3は、PD-1組換えタンパク質がELISAプレート上にコーティングされた場合に高いIL-2分泌を誘導し、これらの分子が、クローン1とは異なり、トランス様式で非PD-1 T細胞を活性化することができることを示唆している(図7C)。最後に、データは、抗CD28クローン1配列を含む構築物が、T細胞のシス活性化を可能にする特定の特性を有するが、他のクローンは、このようなシス標的化効果を提供しなかったことを実証している。
抗CD28クローン1のフレームワーク領域(FR)又は相補性決定領域(CDR)における異なる変異を作製した(材料及び方法並びに表2を参照)。異なる抗CD28変異体は、一価抗PD-1結合ドメイン(Fab)を有するB1フォーマットの多機能性分子にscFvとして含まれている。そのような多機能性分子のシス活性特性をPD1+及びPD1-ジャーカットT細胞で試験し、図7Dは、PD1+とPD1との間のIL2分泌の比を表す。図7Dは、全ての異なる構築物(すなわち、異なる抗CD28バリアントを含む)が、PD-1+CD28+細胞の活性化を維持し、PD1-CD28+細胞上では維持しないことを示す。同様に、異なるフレームワーク又はCDR変異を含む抗CD28クローン1の変異体とのシス活性が、シス活性の陽性対照としてこのアッセイで使用される抗PD 1/抗CD28未変異クローン1(先の実施例で使用された)と比較して観察された。まとめると、これらのデータは、クローン1のシス活性が、抗CD28 scFvドメインにおける変異を有する多機能性分子事象について維持されることを示している。
(実施例6)
抗PD-1/抗CD28多機能性分子は、異なる抗PD-1抗体で構築され、シス活性特性を維持することができる。
次に、本発明者らは、抗PD-1結合ドメインが多機能性分子のシス活性能力に影響を及ぼすかどうかを評価する。2つの抗PD-1クローンである抗PD-1クローン1(実施例1～5に記載される)及びペンブロリズマブ(FDAにより承認された抗PD-1抗体)のシス活性を評価した。実施例3に詳述されるT細胞ベースのアッセイにおいて、抗CD28クローン1に融合されたペンブロリズマブ及び抗PD-1クローン1を含むフォーマットB1の多機能性分子のシス活性を比較した。図8は、両方の二重特異性抗体が、PD-1+細胞の特異的標的化及びPD-1+細胞とPD-1陰性細胞との類似した標的化比率を有するシス活性特性を有することを実証している。これにより、多機能性分子のシス活性化能力が、任意の抗PD-1結合ドメインで維持され得ることが確認される。
(実施例7)
抗PD-1/抗CD 28多機能性分子は、ヒト腫瘍浸潤リンパ球を再活性化することができる。
次に、抗PD-1/抗CD28多機能性分子の生物学的活性を、新鮮なヒト腫瘍及び腹水から単離されたTILに対してエクスビボで評価した。TIL(腫瘍浸潤リンパ球)は、腫瘍微小環境中に生じる慢性腫瘍抗原刺激のためにPD-1を高度に発現する。阻害性受容体の高発現は、エフェクター機能及び腫瘍細胞を排除する能力を制限するT細胞の枯渇を誘導する。抗PD-1治療用抗体はT細胞を再活性化することができるが、その効果は一般に永続的ではない。共刺激の欠如は、TILの完全な再活性化の1つの制限因子である。抗PD-1/抗CD28多機能性分子が、疲弊したT細胞を再活性化することができるかどうかを評価するために、抗PD-1/抗CD28多機能性分子の存在下での新鮮な腫瘍/腹水のエクスビボ培養を実施した。細胞をオルガノイド系で培養して、腫瘍の構造アーキテクチャ及び微小環境を維持し、培養上清中のIFNg分泌を、処置の48時間後にMSDによって定量した。図9に示すように、抗PD-1/抗CD28多機能性分子(フォーマットB1)は、TILによるIFNgの分泌を増強し、疲弊したTILを再活性化する多機能性分子の生物活性が確認される。
(実施例8)
抗PD-1/抗CD28多機能性分子の複数のフォーマットは、マウスにおいて良好な薬物動態を示す。
二重特異性薬物の臨床開発は、分子量、物理化学的特性、Fc受容体との相互作用によって支配され得る高いクリアランスに関連するそれらの悪い薬物動態プロファイルによって制限されることが多い(Datta-Mannanら、2022、Chenら、2017)。マウスにおける本発明の抗PD-1/抗CD28抗体の薬物動態を、ヒトPD-1もヒトCD28受容体も発現しないC57BL/6JrJ野生型マウスにおいて調査した。抗PD-1/抗CD28(4mg/kg;23～30nM/kg)又は抗PD-1*2(5mg/kg;35nM/kg)をマウスに静脈内単回投与した。異なるタイミングで血液を採取し、抗ヒトκ及び抗ヒトFc抗体を顕色のために使用して、血清中の抗体濃度をELISAによって定量した。
図10は、抗PD-1/抗CD28抗体の全てのフォーマットが、従来の抗PD-1 IgG4抗体と同様の薬物動態を示すことを示している。

Claims (29)

  1. (a)第1の結合部分であって、PD-1、VISTA、CTLA-4、BTLA、TIGIT、CD160、LAG3及びTIM3からなる群から選択される、T細胞表面上に特異的に発現される標的に結合する、第1の結合部分と、
    (b)第2の結合部分であって、CD28に対してアゴニスト効果を有し、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)並びに任意に重鎖定常ドメイン(CH1)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含む抗CD28抗原結合ドメインである、第2の結合部分と
    を含み、
    (i)前記重鎖可変ドメイン(VH)が、相補性決定領域(CDR)である、HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含み、
    (ii)前記軽鎖可変ドメイン(VL)が、相補性決定領域(CDR)である、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、
    ここで、
    - 前記重鎖CDR1(HCDR1)が、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号30のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記重鎖CDR2(HCDR2)が、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号31のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記重鎖CDR3(HCDR3)が、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号32のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記軽鎖CDR1(LCDR1)が、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号33のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記軽鎖CDR2(LCDR2)が、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号34のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記軽鎖CDR3(LCDR3)が、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号35のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    前記多機能性分子が、単一の抗CD28抗原結合ドメインを含む、多機能性分子。
  2. T細胞表面に特異的に発現される前記標的がPD-1である、請求項1に記載の多機能性分子。
  3. 前記第1の結合部分が、重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)並びに任意に軽鎖定常ドメイン(CL)及び第1の重鎖定常ドメイン(CH1)を含む第1の抗原結合ドメインであり、前記第1の抗原結合ドメインが第1のFc鎖のN末端に連結され、前記分子が、前記第1のFc鎖とFcドメインを形成する第2のFc鎖を更に含む、請求項1又は2に記載の多機能性分子。
  4. 前記抗CD28抗原結合ドメインが、Fab、CrossMAb又はscFv、好ましくはscFvである、請求項1から3のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  5. 前記抗CD28抗原結合ドメインが、scFvであり、
    - N末端からC末端に向かって、好ましくはペプチドリンカーにより、VLに連結されたVH、又は
    - N末端からC末端に向かって、好ましくはペプチドリンカーにより、VHに連結されたVLを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  6. (i)前記重鎖可変ドメイン(VH)が、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号36、37、38及び39のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる重鎖可変領域フレームワーク領域(HFR)である、HFR1、HFR2、HFR3及びHFR4を更に含み、
    (ii)前記軽鎖可変ドメイン(VL)が、置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、それぞれ配列番号40、41、42及び43のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域フレームワーク領域(LFR)である、LFR1、LFR2、LFR3及びLFR4を更に含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  7. 前記抗CD28抗原結合ドメインが、(a)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せ、好ましくは置換から選択される1、2又は3つのアミノ酸修飾を任意に有する、配列番号44、83、84、85及び88からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変領域(VH)、並びに(b)置換、付加、欠失及びそれらの任意の組合せ、好ましくは置換から選択される1、2又は3つのアミノ酸修飾を任意に有する、配列番号45、86、87、89及び90からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる軽鎖可変領域(VL)を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  8. 前記抗CD28抗原結合ドメインが、(a)好ましくはフレームワーク領域に、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号44のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVH、並びに(b)好ましくはフレームワーク領域に、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号45のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVLを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  9. 前記抗CD28抗原結合ドメインが、(i)第1の結合部分のCLのC末端、(ii)第1の結合部分のCH1のC末端、(iii)第1の結合部分のVHのN末端、又は(iii)第1の結合部分のVLのN末端に、任意にペプチドリンカーを介して、共有結合されている、請求項1から8のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  10. 前記分子が、Fcドメインを一緒に形成する第1のFc鎖及び第2のFc鎖を含み、任意にペプチドリンカーを介して、前記抗CD28抗原結合ドメインが、前記Fc鎖の一方のC末端に、好ましくは、前記第1の抗原結合ドメインにN末端で共有結合された前記第1のFc鎖のC末端に共有結合されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  11. 前記分子が、Fcドメインを一緒に形成する第1のFc鎖及び第2のFc鎖を含み、任意にペプチドリンカーを介して、前記抗CD28抗原結合ドメインが、そのC末端で前記第2のFc鎖のN末端に共有結合され、前記第1の抗原結合ドメインが、そのC末端で前記第1のFc鎖のN末端に共有結合されている、請求項1から9のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  12. 前記第1の結合部分が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、セミプリマブ、カムレリズマブ、AUNP12、AMP-224、AGEN-2034、チスレリズマブ、PDR001、MK-3477、PF-06801591、JNJ-63723283、ゲノリムズマブ、LZM-009、BCD-100、SHR-1201、BAT-1306、AK-103、MEDI-0680、JS001、BI-754091、CBT-501、INCSHR1210、TSR-042、GLS-010、AM-0001、STI-1110、MGA012、又はIBI308、好ましくはペンブロリズマブ又はニボルマブからなる群から選択される抗PD-1抗体であるか又はそれに由来する、請求項1から11のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  13. 前記第1の結合部分が、抗PD-1抗原結合ドメイン、好ましくは、
    (i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH、並びに(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVLを含む抗PD-1抗原結合ドメインであり、
    ここで、
    - 前記重鎖CDR1(HCDR1)が、配列番号1のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記重鎖CDR2(HCDR2)が、配列番号2のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記重鎖CDR3(HCDR3)が、配列番号3のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記軽鎖CDR1(LCDR1)が、配列番号4のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記軽鎖CDR2(LCDR2)が、配列番号5のアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、
    - 前記軽鎖CDR3(LCDR3)が、配列番号6のアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、
    請求項1から11のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  14. 前記第1の結合部分が、抗PD-1抗原結合ドメイン、好ましくは、(a)好ましくはフレームワーク領域に、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号15のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVH、並びに(b)好ましくはフレームワーク領域に、置換、付加、欠失、及びそれらの任意の組合せから選択される1、2又は3つの修飾を任意に有する、配列番号16のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるVLを含むPD-1抗原結合ドメインである、請求項1から11のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  15. 前記第1の結合部分が、
    a)(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH、並びに(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVLであって、ここで、前記重鎖CDR1(HCDR1)が、配列番号65のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記重鎖CDR2(HCDR2)が、配列番号66のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記重鎖CDR3(HCDR3)が、配列番号67のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記軽鎖CDR1(LCDR1)が、配列番号68のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記軽鎖CDR2(LCDR2)が、配列番号69のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記軽鎖CDR3(LCDR3)が、配列番号70のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる、VH及びVL、又は
    b)i)配列番号71のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるVH、及びii)配列番号72のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるVL、又は
    c)(i)HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含むVH、並びに(ii)LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含むVLであって、ここで、前記重鎖CDR1(HCDR1)が、配列番号73のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記重鎖CDR2(HCDR2)が、配列番号74のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記重鎖CDR3(HCDR3)が、配列番号75のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記軽鎖CDR1(LCDR1)が、配列番号76のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記軽鎖CDR2(LCDR2)が、配列番号77のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなり、前記軽鎖CDR3(LCDR3)が、配列番号78のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなる、VH及びVL、又は
    d)i)配列番号79のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるVH、及びii)配列番号80のアミノ酸配列を含むか若しくはそれからなるVL
    を含む抗PD-1抗原結合ドメインである、請求項1から11のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  16. 前記抗PD-1抗原結合ドメインが、F(ab')2、Fab又はCrossMAbである、請求項1から15のいずれか一項に記載の多機能性分子。
  17. 請求項1から16のいずれか一項に記載の多機能性分子をコードする、単離された核酸配列又は単離された核酸配列の群。
  18. 請求項17に記載の単離された核酸配列又は単離された核酸配列の群を含むベクター。
  19. 請求項18に記載のベクター又は請求項17に記載の単離された核酸若しくは核酸分子の群を含む宿主細胞。
  20. 請求項1から16のいずれか一項に記載の多機能性分子を作製する方法であって、請求項19に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記多機能性分子を単離する工程を含む方法。
  21. 請求項1から16のいずれか一項に記載の多機能性分子、請求項17に記載の核酸若しくは核酸分子の群、請求項18に記載のベクター、又は請求項19に記載の宿主細胞、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  22. 医薬として使用するための、請求項21に記載の医薬組成物、請求項1から16のいずれか一項に記載の多機能性分子、請求項17に記載の単離された核酸若しくは核酸分子の群、請求項18に記載のベクター、又は請求項19に記載の宿主細胞。
  23. 癌の処置又は感染性疾患の処置に使用するための、請求項22に記載の使用のための医薬組成物、多機能性分子、単離された核酸若しくは核酸分子の群、ベクター、又は宿主細胞。
  24. 前記疾患が、脳腫瘍、癌腫、子宮頸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌(gastric cancer)、消化器癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、リンパ種、神経膠腫、中皮種、黒色腫、胃癌(stomach cancer)、尿道癌、環境的に誘発された癌及び前記癌の任意の組合せからなる群から選択される癌である、請求項23に記載の使用のための医薬組成物、多機能性分子、核酸若しくは核酸分子の群、ベクター、又は宿主細胞。
  25. 前記疾患が、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、リノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、おたふくかぜウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ヒトTリンパ球向性ウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、JCウイルス及びアルボウイルス脳炎ウイルスから成る群から選択されるウイルスにより引き起こされる感染性疾患である、請求項23記載の使用のための医薬組成物、多機能性分子、核酸若しくは核酸分子の群、ベクター、又は宿主細胞。
  26. 放射線療法と、又は追加の治療剤、特に化学療法剤若しくは抗感染剤と併用して使用するための、請求項22から25のいずれか一項に記載の使用のための医薬組成物、多機能性分子、核酸若しくは核酸分子の群、ベクター、又は宿主細胞。
  27. 前記追加の治療剤が、化学療法剤、抗感染剤、アルキル化剤、血管形成抑制薬、抗体、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害薬、抗増殖剤、抗ウイルス剤、オーロラキナーゼ阻害剤、アポトーシス促進剤、デスレセプター経路活性化剤、Bcr-Ablキナーゼ阻害剤、二重特異性T細胞エンゲージャー抗体薬物コンジュゲート、ブルートンチロシンキナーゼ(BTK)阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ-2阻害剤、白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ受容体阻害剤、増殖因子阻害剤、熱ショックタンパク質-90阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ホルモン療法、アポトーシスタンパク質阻害剤、抗生物質、キナーゼ阻害剤、キネシン阻害剤、Jak2阻害剤、ラパマイシン阻害剤の哺乳動物標的、マイクロRNA、マイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害剤、多価結合タンパク質、非ステロイド性抗炎症薬、ポリADP-リボースポリメラーゼ阻害剤、プラチナ製剤化学療法、ポロ様キナーゼ阻害剤、ホスホイノシチド-3キナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド、低分子干渉リボ核酸(siRNA)、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤、低メチル化剤、チェックポイント阻害剤、ペプチドワクチン、癌ワクチン、腫瘍抗原由来のエピトープ又はネオエピトープ、並びにこれらの薬剤の1つ又は複数の組合せからなる群から選択される、請求項26に記載の使用のための医薬組成物、多機能性分子、核酸若しくは核酸分子の群、ベクター、又は宿主細胞。
  28. 必要とする対象において癌又は感染性疾患を処置する方法であって、請求項1から16のいずれか一項に記載の多機能性分子又は請求項21に記載の医薬組成物を、好ましくは有効量で投与することを含む方法。
  29. 癌又は感染性疾患の処置のための医薬の製造における、請求項1から16のいずれか一項に記載の多機能性分子又は請求項21に記載の医薬組成物の使用。
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