JP2024502837A

JP2024502837A - 高病原性コロナウイルスに対する細胞傷害性ｔ細胞免疫療法

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Publication number: JP2024502837A
Application number: JP2023541012A
Authority: JP
Inventors: ラファエルポールヴィスシディ，; チャールズジェイ．パイヴェン，
Original assignee: Piven Charles J
Current assignee: Piven Charles J
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2024-01-23
Also published as: US20250276056A1; CN117157310A; KR20230131871A; EP4277657A2; AU2022208375A9; IL304175A; CA3204663A1; MX2023008242A; WO2022155417A2; EP4277657A4; WO2022155417A3; AU2022208375A1

Abstract

病原性コロナウイルスおよび感冒コロナウイルスに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）応答、すなわちＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞応答、を誘導する組成物および方法であって、パピローマウイルスＬ１タンパク質のＨＩループに挿入されたシステイン残基で挟まれた連続した負電荷アミノ酸を有するポリイオンパピローマウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる抗原の送達プラットフォームを含む。ＶＬＰと対になる抗原は、病原性コロナウイルス由来の融合ペプチド／タンパク質であって、ＭＨＣクラスＩエピトープの提示を増強するために、システイン残基およびＣ末端タンパク質プロセシング配列（ＡＡＹＹ）が前および／または後に続く連続する正電荷アミノ酸からなるＮ末端またはＣ末端のアミノ酸を有する、ヒト集団で一般的に循環している遺伝的に最も近縁のヒトコロナウイルス由来の融合ペプチド／タンパク質、を含む。

Description

本発明は、コロナウイルスに対する細胞性免疫応答を誘導するための組成物および方法に関する。

コロナウイルス（ＣｏＶ）は、サイズが約２６～３２キロベースの一本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、他の全てのコロナウイルスと同様にそのゲノムの構成と発現に共通の特徴を有しており、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａ／ｂによってコードされる非構造タンパク質の後に、主要な構造タンパク質スパイク（Ｓ）、エンベロープ（Ｅ）、膜（Ｍ）、およびヌクレオカプシド（Ｎ）が続く（Ｃｈｅｎら、２０２０年）。Ｓ糖タンパク質は、宿主受容体への結合を媒介する。Ｓ糖タンパク質は、宿主プロテアーゼによって、Ｓ１およびＳ２と称される２つの別々のポリペプチドに切断される。Ｓ１は、Ｓタンパク質の受容体結合ドメインを構成し、中和抗体の主要な標的であるが、Ｓ２は、スパイク分子のストーク（柄）を形成する。Ｍタンパク質は、最も豊富なウイルスタンパク質であり、コアウイルス粒子の形成に関与する。Ｎタンパク質は、唯一のヌクレオカプシドタンパク質であり、ウイルスゲノムと相互作用するコア粒子の部分を形成する。ＣｏＶは、系統発生に基づいて、α－ＣｏＶ、β－ＣｏＶ、γ－ＣｏＶ、およびδ－ＣｏＶの４つの属に分類される。β－ＣｏＶ属内では、４つの系統（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）が認識されている。

コロナウイルスは、動物に多種多様な疾患を引き起こす。ヒトの場合、ＣｏＶ感染は主に上気道および胃腸管に影響を及ぼし、主に、風邪などの軽度の自然治癒性の疾患を引き起こす。これらのヒトコロナウイルスのうち、２つはα－コロナウイルスであるＨＣｏＶ－２２９ＥおよびＨＣｏＶ－ＮＬ６３であり、他の２つはβ－コロナウイルスであるＨＣｏＶ－ＯＣ４３およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１である。ＨＣｏＶ－２２９ＥおよびＨＣｏＶ－ＯＣ４３は略５０年前に単離されたが、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３およびＨＣｏＶ－ＨＫＵ１は最近になって同定されたに過ぎない。これらのウイルスはヒト集団に常在しており、毎年呼吸器感染症の１５～３０％を引き起こしている。血清有病率調査から、これらのウイルスへの曝露はヒトにおいてほぼ普遍的であることが示唆されている（Severance et al、２００８）。さらなるヒトコロナウイルスの存在も考えられるが、不明である。最初の高病原性ヒトコロナウイルスは、β－コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶであった。中国の広東省で２００２～２００３年に発生した重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の原因物質として同定された。２０１２年に中東で、２番目の新規高病原性ヒトＣｏＶが出現した。中東呼吸器症候群－ＣｏＶ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と名付けられたこのウイルスもβ－コロナウイルスでもあり、サウジアラビアをはじめとする中東諸国における高病原性呼吸器感染症の原因物質であることが判明した。２０１９年後半に中国で初めて出現した、３番目で最新の高病原性ヒトコロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、同じくβ－コロナウイルスであり、現在進行中のパンデミックの原因となっている。高病原性コロナウイルスは、人獣共通の保有宿主、主にコウモリ種、において循環し、おそらく中間宿主種を介して、感受性の高いヒト集団に波及数すると考えられている。過去１７年間に３件の種を超えた感染事例が発生したことから、類似のウイルスが将来出現する可能性があると示唆される。高病原性コロナウイルスの決定的な特徴は、感染者に重篤な罹患率および死亡率を引き起こす能力であり、大雑把に推定すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、およびＭＥＲＳについて、それぞれ２．３％、９．５％、および３４％である（Petrosillo et al、２０２０年）。一般的に循環しているヒトコロナウイルスは、重篤な罹患率または死亡率を引き起こすことはほとんどない。

病原性コロナウイルスの治療は、主に支持療法である。継続的な努力にもかかわらず、高活性の抗ウイルス薬は存在しない。

本発明は、高病原性コロナウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ならびに他の関連する病原性コロナウイルスによって引き起こされる疾患の治療および予防に関する。

コロナウイルスの治療に対する本発明のアプローチは、身体の自然免疫防御を利用する免疫療法である。既存のウイルス感染を排除するための免疫防御のパラダイムは、ウイルス感染細胞を破壊し排除する能力を有する、ＭＨＣクラスＩ拘束性のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。しかしながら、感染性ウイルスに対するＴ細胞の誘導が、宿主が圧倒される前にその感染を除去できるかどうかは問題である。なぜなら、免疫に対する最大の応答を得るには、典型的には数週間、おそらく数ヶ月を要するからである。したがって、高病原性コロナウイルスの場合、急性感染を制御または排除するために、有効な抗ウイルス性細胞傷害性Ｔ細胞応答を迅速に動員するための戦略が必要である。提案されるアプローチは、交差反応性記憶Ｔ細胞を刺激することである。記憶Ｔ細胞は、ナイーブ細胞よりも刺激に対する応答性が高く、クローン的に非常に急速に増殖することができる。最近の研究では、２０１９年のウィルスの出現に先立って得られた血液サンプルにおいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２免疫を認識する交差反応性Ｔ細胞が同定されている（Grifoni et al、２０２０年; Weiskopf et al、２０２０年; Braun et al、２０２０年; Le et al、２０２０年）。感冒コロナウイルスであるＯＣ４３およびＨＫＵ１はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とアミノ酸に類似性があるため、これらの交差反応性Ｔ細胞は、感冒ヒトコロナウイルスによるそれ以前の感染によって誘導される可能性がある。実際、交差反応性Ｔ細胞によって認識されるエピトープをマッピングした最近の研究では、既存の記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および感冒コロナウイルスに対して交差反応性であることを実証している（Mateus et al、２０２０）。交差反応性Ｔ細胞の詳細な分子的および構造的基盤は十分には理解されていないが、免疫認識の現在のパラダイムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および感冒コロナウイルスによって共有されるＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープ（長さ８～１３アミノ酸の連続配列）内の高度に保存されたアミノ酸配列の必要性を予測している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の既知の一般的なヒトコロナウイルスの相同領域とのアラインメントでは、推定上のＴ細胞エピトープにおけるアミノ酸同一性の高い領域は、限られていることを示す。しかしながら、交差反応性が異種ウイルス由来のエピトープ間の実質的なアミノ酸同一性を必要とするという概念は、免疫認識のクローン選択理論に基づいており、この理論では、個々のリンパ球は単一の抗原に特異的、すなわち、１クローン－１特異性であり、交差反応性エピトープ間では密接なアミノ酸同一性が必要であると仮定している。何人かの科学者はこの理論を疑問視しており、Ｔ細胞が複数の特異性、１クローン－数百万の特異性を認識すると仮定するＴ細胞免疫認識の理論を提案している（Mason、１９９８；Wilson et al、２００４；Kersh and Allen、１９９６；Sewell、２０１２）。この理論は、ヒトにはわずか１０¹²個しかＴ細胞が存在せず、ヒトナイーブＴ細胞プールには＜１０⁸個の異なるＴ細胞受容体が存在するが、ＭＨＣ分子に結合できる２０個のアミノ酸のペプチドの理論上の限界は膨大（＞１０¹⁵）であり、翻訳後修飾を含むペプチドを考慮するとさらに大きくなる可能性が高い、という数学的考察に基づいている。Ｔ細胞交差反応性に関するこの理論は、高病原性コロナウイルスの治療および予防の両方のための新規なアプローチにつながる。高病原性コロナウイルスに対するＴ細胞応答と、大多数の個体が過去に曝され、したがって記憶Ｔ細胞を有する、１つ又は複数の遺伝的に関連する一般的なヒトコロナウイルスに対するＴ細胞応答と、を同時に誘導することで、治療と予防という２つのカテゴリーの細胞性免疫を作り出すことができる。この戦略は、交差反応性の部分的に保護的または完全に保護的な記憶Ｔ細胞を呼び戻し、高病原性コロナウイルスに特異的なナイーブＴ細胞を誘導する。これら２つのクラスのＴ細胞応答の二重作用は、宿主における急性高病原性コロナウイルス感染を迅速に制御および根絶し、重篤な症状および死亡を予防することで治療的であり、同時に、将来の高病原性コロナウイルス感染に対する長期的な防御を提供することで予防的である。

本発明はさらに、病原性コロナウイルスおよび感冒コロナウイルスに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）応答、すなわちＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞応答を誘導するための、組成物および方法に関する。

本発明は、パピローマウイルスＬ１タンパク質のＨＩループに、システイン残基で挟まれた連続する負電荷アミノ酸が挿入されている、ポリイオンパピローマウイルスのウイルス様粒子（ＶＬＰ）からなる抗原のためのデリバリープラットフォームに関する。

本発明はさらに、上記ＶＬＰと対になる抗原であって、システイン残基の前および／または後に連続する正電荷アミノ酸からなるＮ末端またはＣ末端アミノ酸を有する融合ペプチド／タンパク質を含む抗原に関する。以下、この抗原をＴＡＧと称する。本発明はさらに、ＭＨＣクラスＩエピトープの提示を増強するための、Ｃ末端タンパク質プロセシング配列（ＡＡＹＹ）を有するＴＡＧに関する。

特定の実施形態において、本発明は、病原性コロナウイルスに由来する抗原、および、ヒト集団において一般的に循環する遺伝的に最も近縁のヒトコロナウイルスに由来する抗原に関する。本発明はさらに、ウイルス感染細胞におけるウイルスタンパク質の発現量、タンパク質中のＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープの予測される密度および位置、ならびに、特定のウイルスタンパク質を対象とする細胞傷害性Ｔ細胞を同定する経験的研究に基づいた、細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための抗原の選択に関する。本発明はさらに、ウイルス構造タンパク質およびウイルス非構造タンパク質にそれぞれ由来する、２つの別個の異なるクラスの標的を含む抗原の選択に関する。ウイルス感染細胞において最初に発現されるタンパク質は非構造ウイルスタンパク質であるため、これらのタンパク質を標的とすることにより、ウイルス感染の最も初期の段階で有効な細胞性免疫応答が得られる。本発明はさらに、上記基準、および、追加の基準であって、抗原が病原性コロナウイルスの対応するウイルスタンパク質と少なくとも４０％の同一性を共有するウイルスタンパク質の領域を含むという追加の基準に基づく、一般的な非病原性ヒトコロナウイルスの抗原の選択に関する。ＶＬＰ抗原組成物に関する特定の実施形態において、抗原は、長さ２５～３０アミノ酸の短いペプチド、長さ約４５～５５アミノ酸の伸長ペプチド、長さ約１１０～１４０アミノ酸の短いタンパク質、または標的抗原の全長アミノ酸配列のいずれかである。

特定の実施形態において、病原性コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であり、遺伝的に関連するヒトコロナウイルスはＯＣ４３およびＨＫＵ１である。特定の実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の抗原は、以下のウイルス構造タンパク質：膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、ＯＲＦ３ａ、ＯＲＦ７ａ、およびスパイク（Ｓ）エンベロープタンパク質のＳ２領域；に由来し、非構造タンパク質の抗原は、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７、およびｎｓｐ１２に由来する。特定の実施形態において、ＯＣ４３およびＨＫＵ１の構造タンパク質の抗原は、Ｍタンパク質およびＮタンパク質、ならびにＳタンパク質のＳ２領域に由来し、非構造タンパク質の抗原は、ＯＣ４３のｎｓｐ３、ｎｓｐ４、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７およびｎｓｐ１２タンパク質、ならびに同じウイルスタンパク質由来のＯＣ４３に関するＨＫＵ１の可変領域に由来する。

本発明はまた、コロナウイルス抗原と対になったポリイオン性パピローマウイルスＶＬＰを調製する方法に関する。本発明はさらに、静脈内、筋肉内、または皮内経路によるＶＬＰ抗原組成物の送達方法に関する。特定の実施形態において、ＶＬＰ抗原組成物は鼻腔内へまたは吸入によって送達され、肺および鼻咽頭組織常在記憶Ｔ細胞を刺激し、気道内の部位に優先的に移動する細胞傷害性Ｔリンパ球を生成する。

図１は、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）１型のＬ１タンパク質と、近縁のＢＰＶ分離株ＮＹ８３８５のＬ１タンパク質と、のアラインメントを示す：ＨＩループはａａ３４４－３５７である。図２は、ＯＣ４３およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭタンパク質のアラインメントを示す。図３は、ＯＣ４３およびＨＫＵ１のＭタンパク質のアラインメントを示す。図４Ａおよび４Ｂは、ＯＣ４３およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質の抗原領域のアラインメントを示す。図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ＯＣ４３およびＨＫＵ１のＮタンパク質の抗原領域のアラインメントを示す。図６Ａおよび６Ｂは、Ｓ２領域内のＯＣ４３およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の抗原領域のアラインメントを示す。図７は、可変抗原領域内のＨＫＵ１およびＯＣ４３のＳタンパク質のアラインメントを示す。図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃは、ＯＣ４３のＯＲＦ１ａｂの抗原領域と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ３タンパク質と、のアラインメントを示す。図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、ＯＣ４３のＯＲＦ１ａｂの抗原領域と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ４タンパク質と、のアラインメントを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＯＣ４３のＯＲＦ１ａｂの抗原領域と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ６タンパク質と、のアラインメントを示す。図１１は、ＯＣ４３のＯＲＦ１ａｂの抗原領域と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ７タンパク質と、のアラインメントを示す。図１２は、ウシパピローマウイルス１型カプシドタンパク質Ｌ１の配列を示す。図１３Ａは、ＯＣ４３のＯＲＦ１ａｂの抗原領域とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ１２タンパク質との第１組のアラインメントを示し、図１３Ｂは、ＯＣ４３のＯＲＦ１ａｂの抗原領域とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ１２タンパク質との第２組のアラインメントを示し、図１３Ｃは、ＯＣ４３のＯＲＦ１ａｂの抗原領域とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ１２タンパク質との第３組のアラインメントを示す。

本発明は、負に荷電したアミノ酸配列およびＬ１タンパク質のＨＩループ中のシステイン残基を含む遺伝子操作されたパピローマウイルスＬ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（以下、ポリイオン性ＶＬＰという。）に関する組成物および方法を提供する。本発明はさらに、ヒト、ウシ、ウマ、マウス、ヒツジ、ブタ、シカ、イヌ、ネコ、またはヤギを含む、任意のパピローマウイルス種由来のＬ１タンパク質に関する。一実施形態において、Ｌ１パピローマウイルスタンパク質は、ウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ１）に由来する（図１２）。

特定の実施形態において、遺伝子操作されたＢＰＶ１Ｌ１タンパク質のＨＩループは、Ｎ末端もしくはＣ末端または両方の末端にシステイン残基が隣接する、４～１０個の連続した負に荷電したアミノ酸を含む。ＢＰＶ１Ｌ１のＨＩループは、ここではアミノ酸３４４～３５７位として定義され、その範囲は１４アミノ酸であり、先端は３４９位のプロリン（Ｐ）残基として定義される（図１）。本発明のＶＬＰの負電荷アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはその両方であり得る。様々な実施形態において、５～１２個のアミノ酸長さのアミノ酸配列（４～１０個の連続した負電荷アミノ酸および１つまたは２つの隣接するシステイン残基）をＨＩループに挿入することができ、天然アミノ酸を置換しないか、天然アミノ酸のうちの１または複数を置換してもよい。特定の例示的な実施形態において、ＨＩループに挿入されるアミノ酸配列は、８つの負電荷アミノ酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸または交互のアスパラギン酸およびグルタミン酸、および、Ｃ末端またはＮ末端システイン残基を含む９残基長であり、ウシパピローマウイルスＬ１タンパク質のＨＩループの３４７～３５５位にある９つの天然アミノ酸を置換する（表１、挿入物１～４）。他の特定の例示的な実施形態において、ＨＩループに挿入されるアミノ酸配列は、５、６、７、８、１０、または１１アミノ酸長であり、それぞれ、４、５、６、７、９、または１０個のグルタミン酸とＣ末端システイン残基とを含む。それぞれの挿入物は、ウシパピローマウイルスＬ１タンパク質のＨＩループの位置、３４７～３５１、３４７～３５２、３４７～３５３、３４７～３５４、３４６～３５５、または３４５～３５５において、それぞれ、等価な数の天然アミノ酸を置換する（表１挿入物５～１０）。特定の例示的な実施形態において、ＨＩループに挿入されるアミノ酸配列は、９残基長であり、８個の負電荷グルタミン酸とＣ末端およびＮ末端システイン残基とを含み、ウシパピローマウイルスＬ１タンパク質のＨＩループの３４６～３５５位の１０の天然アミノ酸を置換する（表１、挿入物１１）。他の様々な実施形態において、負電荷アミノ酸およびシステインは、ＨＩループに挿入することができ、挿入物を構成する数よりも少ない数の天然アミノ酸を置換することができる。特定の例示的な実施形態において、８個のグルタミン酸およびＣ末端システイン残基を含む９アミノ酸配列は、ウシパピローマウイルスＬ１タンパク質のＨＩループのそれぞれ３４８～３５４位、または３４８～３５２位、または３４８～３５０位においてそれぞれ、７個、または５個、または３個の天然アミノ酸を置換する（表１、挿入物１２～１４）。他の様々な実施形態において、負電荷アミノ酸およびシステインは、ＨＩループに挿入され、挿入物を含む数よりも最大２つ多い天然アミノ酸を置換することができる。特定の例示的な実施形態において、８つのグルタミン酸およびＣ末端システイン残基を含む９アミノ酸配列は、ウシパピローマウイルスＬ１タンパク質のＨＩループの３４６～３５６位の１１の天然アミノ酸を置換する（表１、挿入物１５）。様々な実施形態において、ＨＩループに挿入されたグルタミン酸－システインアミノ酸配列は、ループの先端と推定される位置においてプロリンを置換してもよく、または、プロリン残基と直後のＣ末端ロイシン残基との間において天然アミノ酸を何ら除去することなく挿入されてもよい。いくつかの実施形態において、プロリンを置換するかまたはプロリン残基とロイシン残基との間に位置する挿入アミノ酸は、グリシン－セリン－セリン－グリシン（ＧＳＳＧ）リンカーアミノ酸配列によって隣接してもよい。特定の例示的な実施形態において、ＨＩループに挿入されるアミノ酸配列は、ＧＳＳＧアミノ酸が隣接しているか隣接していない、８つのグルタミン酸およびＣ末端システイン残基を含み、３４９位のプロリンを置換するか、またはウシパピローマウイルスＬ１タンパク質のＨＩループのアミノ酸３４９位と３５０位との間に位置する（表１、挿入物１６～１９）。

本発明はさらに、ＶＬＰに連結させる抗原に関し、この抗原は、システイン残基が先行するおよび／または後続する４～１０の連続した正電荷アミノ酸からなるＮ末端またはＣ末端アミノ酸を有する融合ペプチド／タンパク質を含む。この抗原を以後、ＴＡＧと称する。ＴＡＧは、静電相互作用と、ＶＬＰ上のシステイン残基とＴＡＧ中のシステイン残基との間の酸化還元反応と、の複合作用によって、抗原をポリイオン性パピローマウイルスＶＬＰに結合させることができる。本発明はさらに、ＭＨＣクラスＩエピトープの提示を増強するためのＣ末端タンパク質プロセシング（分解処理）配列（ＡＡＹＹ）を有するＴＡＧに関する。ＴＡＧが抗原のＣ末端に付加される場合、タンパク質プロセシング配列（ＡＡＹＹ）は、ペプチド／タンパク質抗原のＮ末端に配置される。

特定の例示的な実施形態において、ＴＡＧは、正電荷を有する、アミノ酸、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）の群を含み、配列は８アミノ酸長である（表２、Ｔａｇ－１、－２、－３）。他の特定の例示的な実施形態において、ＴＡＧは、８アミノ酸長のＲＫＨＲＫＨＲＫの反復モチーフを含む（表２、ＴＡＧ－４）。他の特定の例示的な実施形態において、ＴＡＧは、４、５、６、または７つの連続したアルギニンにシステイン残基が続くアミノ酸配列（表２、ＴＡＧ－５、－６、－７、および－８）、または、９または１０個のアルギニンにシステイン残基が続くアミノ酸配列（表２、ＴＡＧ－９および－１０）を含む。他の特定の例示的な実施形態において、ＴＡＧは、システイン残基が先行するか、またはシステイン残基によってＮ末端およびＣ末端に隣接する、８個の正アルギニンからなる（表２、ＴＡＧ－１１および－１２）。

本発明はさらに、細胞傷害性（ＭＨＣクラスＩ拘束性）Ｔ細胞応答を誘導する目的のための、ポリイオン性パピローマウイルスＶＬＰおよびＴＡＧ配列を有する標的抗原の組成物に関する。特定の実施形態において、本発明は、感冒コロナウイルスおよび病原性コロナウイルスに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する目的で、ポリイオン性ＶＬＰに連結されたコロナウイルス抗原に関する。

ウイルスのプロテオーム全体がＴ細胞応答の標的となり得る。しかしながら、構造タンパク質は、感染細胞において最も豊富に発現するウイルスタンパク質であり、したがってＭＨＣ分子への効率的な提示を可能にするため、抗原特異的Ｔ細胞応答のための特に有効なターゲットである。コロナウイルスに対する細胞性免疫応答の経験的研究も、細胞性免疫応答の主要な標的としての構造タンパク質の重要性を支持している（Liu et al、２０１７の概説）。細胞傷害性Ｔ細胞応答は、ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープに向けられる。これらのエピトープは、最も一般的には９アミノ酸長であり、８～１３アミノ酸長の範囲であり得る。ヒトおよび他の哺乳動物におけるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の遺伝的不均一性により、ウイルスタンパク質の中に多数のエピトープが存在する可能性がある。可能性のある非常に多くのエピトープを網羅するために、抗原は、標的タンパク質の全アミノ酸配列であるか、または全アミノ酸配列を一緒に含む抗原の短い断片の集合である必要がある。ポリイオン性ＶＬＰＳに連結された抗原断片の好ましい長さは、代替形態抗原提示経路を介したＴ細胞応答の誘導のためのエピトープ提示効率の経験的関数である。加えて、製造上の考慮が、抗原の好ましい長さの選択に影響を及ぼし得る。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するためのポリイオン性パピローマウイルスＶＬＰ組成物に関する好ましい実施形態は、膜（Ｍ）、ヌクレオカプシド（Ｎ）、スパイク（Ｓ）のＳ２領域、ＯＲＦ３ａ、およびＯＲＦ７ａ構造タンパク質、ならびにｎｓｐ６、ｎｓｐ７、およびｎｓｐ１２非構造タンパク質に由来の抗原を含む。

Ｍタンパク質は２２２アミノ酸長であり、抗原領域はａａ６～２２１に及ぶ。Ｎタンパク質は、４１９アミノ酸長である。ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞エピトープに関する経験的研究と予測アルゴリズムに基づくと、抗原領域はａａ５１～３６９である。スパイク（Ｓ）タンパク質は１２７０アミノ酸長であり、受容体結合ドメイン（ａａ３３０－５８３）を含むＳ１（ａａ１－６６１）とＳ２（ａａ６６２－１２７０）との２つの領域を含む。Ｔ細胞エピトープは、Ｓタンパク質にわたって広く分布している。Ｓ１領域は、ビリオン表面に露出したアミノ酸の大部分を含み、中和抗体を含む体液性免疫応答の主要な標的である。この領域は、抗体依存性増強（ＡＤＥ）を媒介する抗体の誘導のような、有害な作用を起こし得る抗体応答の意図しない誘導を回避するために、細胞性免疫の誘導を意図したワクチンから除外することが好ましい。ＯＲＦ３ａは２７５アミノ酸長である。経験的研究によると、Ｔ細胞応答のための標的抗原としてＯＲＦ３ａを選択することが支持される。予測アルゴリズム（ＭＨＣ－ＮＰ：Sebastien Giguere, Alexandre Drouin, Alexandre Lacoste, Mario Marchand, Jacques Corbeil，およびFrancois Lavioletteによって開発されたＭＨＣによる、自然にプロセシングされたペプチドの予測；http://tools.iedb.org/mhcnp/）によると、５つの代表的な対立遺伝子について、Ｃ末端はＮ末端と比較して、推定ＭＨＣクラスＩ制限エピトープの密度が高いことが示される（Ｎ末端１０４アミノ酸にわたる２０個に対して、Ｃ末端１７１アミノ酸にわたる６７個）。経験的研究は、細胞傷害性Ｔ細胞応答の標的として、１２１アミノ酸のタンパク質であるＯＲＦ７ａを選択することを支持している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ１ａｂは、７０９６アミノ酸のポリタンパク質である。このポリタンパク質は、ウイルス感染細胞内でタンパク質分解的に処理（プロセシング）されて、ウイルスのライフサイクルにおいて多様な機能を果たす複数の非構造タンパク質を生成する。タンパク質はウイルス感染細胞中に低存在量で存在し、このため、細胞性免疫応答の主要なターゲットではないが、最近の研究で、いくつかのｎｓｐタンパク質に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者の血液中で、また、ＣＯＶＩＤ１９前に何人かの健康な血液ドナーから得られた血液中で、検出され得ることが示された（Grifoni et al、２０２０; Le et al、２０２０）。これらのタンパク質は、感染細胞において最初に発現するため、細胞傷害性Ｔ細胞にとって魅力的な標的である。これらのウイルス感染細胞を迅速に死滅させることにより、細胞が感染性ウイルスを産生するのを防ぐことができる。抗原特異的Ｔ細胞の頻度および応答する対象の割合からみると、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の主要な標的は、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７、およびｎｓｐ１２タンパク質である。

ポリイオン性ＶＬＰに連結された抗原のアミノ酸長は、８～１４アミノ酸の定義されたエピトープまたはそれより長いアミノ酸配列から、ウイルスタンパク質またはいくつかのウイルスタンパク質の融合体の抗原領域の全長アミノ酸配列まで、の範囲とすることができる。例示的な実施形態において、抗原は、長さが約２５～３０アミノ酸の短いペプチド、長さが約４５～５５アミノ酸の伸長ペプチド、長さが約１１０～１４０アミノ酸の短いタンパク質、または標的とするウイルスタンパク質の抗原領域の全長アミノ酸配列である。抗原領域の全長アミノ酸配列よりも短い抗原断片の場合、特定の実施形態は、標的ウイルスタンパク質の抗原領域の全アミノ酸を含む抗原のセット（集合）を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭタンパク質に対する抗原を、抗原領域の、短いペプチド、伸長ペプチド、短いタンパク質、または全アミノ酸配列として具体化し、表３に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質に対して同等の抗原を表４に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２、ＯＲＦ３ａ、およびＯＲＦ７ａ構造タンパク質について、同等に設計された抗原を表５～７に示す。非構造タンパク質ｎｓｐ６およびｎｓｐ７の抗原を表８に示し、ｎｓｐ１２タンパク質に対する抗原を表９および表１０に示す。短いペプチドと伸長ペプチドは１０アミノ酸が重なり、短いタンパク質抗原は１１アミノ酸が重なっている。最終製剤において、ペプチド、タンパク質、または全長抗原は、上記のようにＴＡＧを有する。

感冒コロナウイルスへの事前の曝露によって誘導される記憶Ｔ細胞を刺激するためのポリイオン性パピローマウイルスＶＬＰ組成物に関する好ましい実施形態は、構造タンパク質と非構造タンパク質の両方に由来する抗原を含む。Ｔ細胞認識の複数の特異性理論は、Ｔ細胞の交差反応性の構造的基礎を分子レベルで定義していない。本発明者らは、本明細書において、交差反応性Ｔ細胞エピトープを含有するウイルスタンパク質またはウイルスタンパク質のサブ領域を、一般的な感冒コロナウイルスと特定の病原性コロナウイルスの相同アミノ酸配列にわたって４０％を超える（＞４０％）平均アミノ酸同一性を有するものと定義する。

特定の実施形態において、共通のコロナウイルスはＯＣ４３およびＨＫＵ１であり、交差反応性Ｔ細胞応答を誘導するための抗原は、Ｍ、Ｎ、およびＳ２構造タンパク質、ならびにｎｓｐ３、ｎｓｐ４、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７およびｎｓｐ１２非構造タンパク質、に由来する。ＯＣ４３およびＨＫＵ１のアミノ酸配列が、標的抗原の相同アミノ酸間で平均して４０～８０％超で（＞４０－８０％）共有する場合、ＯＣ４３のアミノ酸配列のみが標的抗原として使用される。他の特定の実施形態において、ＨＫＵ１のアミノ酸配列は、抗原である。

ＯＣ４３のＭタンパク質は長さが２３０ａａであり、ａａ１４－２２６の領域内でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭタンパク質と４０．８％の同一性を共有する（図２）。ＯＣ４３のＭタンパク質とＨＫＵ１のＭタンパク質とのアラインメントは、有意な変動性の領域（アミノ酸同一性＜８０％）を示さない（図３）。ＯＣ４３のＮタンパク質は長さが４４８ａａであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質と平均で３６％のアミノ酸同一性を有する。非整列領域ａａ２６６～２６９、ａａ３４１～３４９、およびａａ３８２～３８７を除く、ａａ９９～４００由来のＯＣ４３の抗原領域は、ＯＣ４３のＮタンパク質のアミノ酸配列と整列しないａａ２２１～２２４を除いた後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮタンパク質の相同領域と４３．５％の同一性を有する（図４Ａ）。ａａ６４～８８位のＯＣ４３のＮタンパク質のＮ末端アミノ酸は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＮの対応する領域と５２％の同一性を有する（図４Ｂ）。ＯＣ４３のＮタンパク質とＨＫＵ１のＮタンパク質とのアラインメントは、２つのウイルスアミノ酸配列間のアミノ酸同一性が３３％～５０％の範囲と低いレベルの３つの抗原領域を示す。（図５Ａ、５Ｂ、および５Ｃ）。ＯＣ４３のＳタンパク質は１３５３アミノ酸であり、Ｓ１とＳ２の２つのサブ領域から構成される。Ｓ１はａａ１－７８９まで伸びており、ａａ７０－５５２間の整列領域においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１領域と低いアミノ酸同一性（２４％）を示す。対照的に、ウイルスのＳ２領域は、ａａ８９８－１１５３およびａａ１２２８－１３０２の２つの抗原領域を含み、これらは、それぞれ平均で５２．７２％および５１．３％のアミノ酸同一性を有する（図６）。ＨＫＵ１の相同領域とＯＣ４３のａａ８９８－１１５３とのアラインメントは、変動性の高い領域を含むことなく８３．５％という全体的な同一性を示し、ａａ１２２８－１３０３間のＯＣ４３の抗原領域は、ＨＫＵ１の相同Ｓ２領域と７０．７％の同一性を有する（図７）。

例示的な実施形態において、抗原は、長さが約２５～３０アミノ酸の短いペプチド、長さが約４５～５５アミノ酸の伸長ペプチド、長さが約１１０～１４０アミノ酸の短いタンパク質、または標的ウイルスタンパク質の抗原領域の全長アミノ酸配列である。抗原領域の全長アミノ酸配列よりも短い抗原断片に関し、特定の実施形態は、標的ウイルスタンパク質の抗原領域の全アミノ酸を含む抗原のセットを含む。ＯＣ４３のＮタンパク質およびＨＫＵ１の可変領域についての同等の抗原を、抗原領域の、短いペプチド、伸長ペプチド、短いタンパク質、または全アミノ酸配列として具体化して、表１１に示す。ＯＣ４３のＳ２タンパク質およびＨＫＵ１の可変領域について同等の抗原を表１２に示し、ＯＣ４３のＳ２タンパク質およびＨＫＵ１の可変領域に対する抗原を表１３に示す。短いペプチドと伸長ペプチドは１０アミノ酸が重なり、短いタンパク質抗原は１１アミノ酸が重複する。最終製剤において、ペプチド、タンパク質または全長アミノ酸配列には、上記のようにＴＡＧが含まれる。

ＯＣ４３コロナウイルスのＯＲＦ１ａｂは、７０９５アミノ酸からなるポリタンパク質をコードしている。このポリタンパク質は、ウイルス感染細胞内でタンパク質分解的に処理されて、ウイルスのライフサイクルにおいて多様な機能を果たす複数の非構造タンパク質を生成する。抗原特異的Ｔ細胞の出現頻度および応答する対象の割合から、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の主要な標的は、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７、およびｎｓｐ１２タンパク質である。これらの非構造タンパク質からの抗原の選択はまた、感冒ウイルスとＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との間のアミノ酸配列が平均して＞４０％の同一性であるという、追加的な考慮に基づく。

ｎｓｐ３タンパク質は、１，９４５アミノ酸長である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＯＣ４３のｎｓｐ３アミノ酸配列との間の全体的な同一性は２６％である。しかし、３８４アミノ酸のＣ末端領域は３９％の同一性を有し、その中に、ＯＣ４３のアミノ酸配列とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の相同アミノ酸配列との間で５２．８％、４１％、および４３．６％という同一性を有する連続したアミノ酸からなる３つの領域を含む（図８Ａ～Ｃ）。ｎｓｐ４タンパク質は長さが５００個のアミノ酸であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ‐２とＯＣ４３のｎｓｐ４タンパク質は、４２％のアミノ酸同一性を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＯＣ４３の相同アミノ酸配列間では、ｎｓｐ４タンパク質の中央部分またはＣ末端における３つのサブ領域は、それぞれ４５、１３３および５０アミノ酸長であり、それぞれ５３．３％、４７．４％および７２％のアミノ酸同一性を有する（図９Ａ～Ｃ）。ｎｓｐ６タンパク質は２９０アミノ酸長であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＯＣ４３の相同アミノ酸配列は３０．５％の同一性を有する。Ｃ末端の８４アミノ酸は５４．８％の同一性を有し、Ｎ末端の３１アミノ酸領域は４１．９％の同一性を有する（図１０Ａ～Ｂ）。ｎｓｐ７タンパク質は８３アミノ酸長であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＯＣ４３のｎｓｐ７のアミノ酸配列は４６％の同一性を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＣ末端１３アミノ酸を除くと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＯＣ４３のｎｓｐ７タンパク質のアミノ酸同一性は、５５．２％である（図１１）。ｎｓｐ１２タンパク質は、９３２アミノ酸長である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染患者における抗原特異的細胞性免疫応答の経験的研究では、Ｔ細胞エピトープの大部分が、タンパク質のａａ１２５～３７５およびａａ５２０～９２０に包含される領域に位置づけられた（Grifoni et al、２０２１）。ＯＣ４３のＯＲＦ１ａｂ内の２つのアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ１２タンパク質のａａ１２５～２７５断片内の対応するアミノ酸と、６１．５％および６７％の同一性を有し（図１３Ａ～Ｂ）、ＯＣ４３のＯＲＦ１ａｂの３４１ａａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ１２タンパク質のａａ５２０～９２０断片内の対応するアミノ酸と、７６．８％の同一性を有する（図１３Ｃ）。ＯＣ４３とＨＫＵ１の非構造タンパク質は、～９０％の同一性を有し、アミノ酸可変性の拡張領域は有さない（同一性＜８０％）。

例示的な実施形態において、抗原は、長さが約２５～３０アミノ酸の短いペプチド、長さが約４５～５５アミノ酸の伸長ペプチド、長さが約１１０～１４０アミノ酸の短いタンパク質、または標的ウイルスタンパク質の抗原領域の全長アミノ酸配列である。抗原領域の全長アミノ酸配列よりも短い抗原断片について、特定の実施形態は、標的ウイルスタンパク質の抗原領域の全アミノ酸を含む抗原のセットを含む。
ｎｓｐ３およびｎｓｐ４タンパク質に対する抗原を、抗原領域の、短いペプチド、伸長ペプチド、短いタンパク質、または全アミノ酸配列として具体化して、表１４に示す。ＯＣ４３のｎｓｐ６タンパク質およびｎｓｐ７タンパク質について同等に設計された抗原を表１５に示し、ｎｓｐ１２については表１６および１７に示す。短いペプチドと伸長ペプチドは１０アミノ酸が重なり、短いタンパク質抗原は１１アミノ酸が重複する。最終製剤において、ペプチド、タンパク質または全長アミノ酸配列には、上記のＴＡＧが含まれる。

実施例１：遺伝子操作されたＢＰＶのＬ１遺伝子を有する組換えバキュロウイルスの生成

Ｋｏｚａｋコンセンサスを有し、各末端に特有の制限部位（ＥｃｏＲ１／Ｎｏｔ１）を持つＢＰＶのＬ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体を、ＰＣＲベースの遺伝子合成によって人工的に操作し、ｐＵＣ１８ベクターにクローニングした。昆虫細胞で効率的に発現させるために、ＯＲＦ全体を、キイロショウジョウバエの好ましいコドンを用いてコドン修飾した。ＯＲＦは、アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基と、システイン残基と、を有するペプチドの挿入物を含み、表１に記載されるように、ＨＩループに挿入され、挿入物－１～挿入物－１９と命名する。

修飾ＢＰＶＬ１遺伝子は、ｐＯＲＢバキュロウイルス転移ベクターのＥｃｏＲ１／Ｎｏｔ１部位間にサブクローニングされる。この転移ベクターを、製造業者によって提案されている好ましい市販のトランスフェクション試薬を用い、線状バキュロウイルスＤＮＡとともに、ヨトウガのｓｆ９細胞中にコトランスフェクションした。トランスフェクションから５日後、回収した組換えバキュロウイルスを、ｓｆ９細胞の大量感染させてさらに増幅させた。６ウェルプレート中で増殖しているイラクサキンウワバの２×１０^６のHigh Five細胞を用い、バキュロウイルスストックの連続希釈物で感染させることで、修飾Ｌ１タンパク質の発現を確認するための小規模感染を行った。感染の７２時間後、細胞を５００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中で溶解し、清澄化した溶解液をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供して、予測される分子量５５ｋＤａのタンパク質の過剰発現を検出した。

実施例２：組換えバキュロウイルスからのポリイオン性ＶＬＰの産生

ＶＬＰの産生のために、スピナーフラスコ中で増殖している約２×１０⁹のイラクサキンウワバのHigh Five細胞を、５００ｍｌのＴＮＭ－ＦＨ／１０％ＦＢＳ中で、所定量の高力価組換えバキュロウイルスストックに感染させた。２７℃で９６時間培養した後、細胞を回収し、２，０００ｒｐｍ（Ｓｏｒｖａｌｌ，ＦＨ１８／２５０遠心機）で５分間の遠心分離した。細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤（Roche Complete ULTRA、１０ｍｌあたり１錠）を含む抽出緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５、１ＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＣａＣｌ_２、５０μｍＦｅＣｌ_２）中に再懸濁し、３７℃での融解と－８０℃エタノールバスでの凍結とを５サイクル実施した。溶解液を８０００ｒｐｍで１時間回転させ、バキュロウイルス粒子を除去した。清澄化された溶解液を、等容量のバートレルＤＦ（Vertrel DF、Fisher Scientific製）で１０分間抽出した。水層を、４０％ショ糖クッション上に重層し、ＳＷ３２Ｔｉローターで、３２，０００ｒｐｍ、１．５時間で遠心分離した。ショ糖ペレットを２０ｍＭリン酸塩ｐＨ８．０、０．５ＭＮａＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ_２に再懸濁し、２５０Ｕ／ｍｌ塩活性ヌクレアーゼ（Ａｒｃｔｉｃｚｙｍｅｓ製）と共に３７℃で３０分間培養した。２０ｍＭリン酸塩ｐＨ６．５、０．５ＭＮａＣｌで透析した後、ＶＬＰ液を、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、０．０５％カルボキシメチルセルロース、５０μＭＦｅＣｌ₂に調整し、４℃で保存した。純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析によって評価し、タンパク質濃度をブラッドフォード色素法およびＵＶ分光法によって測定した。ＶＬＰの直接可視化を容易にするために、希釈粒子のアリコートを、３００メッシュのｆｏｒｍｖａｒ／炭素被覆銅グリッド上に置き、２％リンタングステン酸（ｐＨ＝７．０）でネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。表１から挿入物を有するキメラＶＬＰは、より小さなカプソメア様構造からの形成と一致し、天然のＨＰＶ１型ＶＬＰに類似する多彩な外観を備えた、直径～５０ｎｍのカプシド様構造を生成することが示された。

実施例３：抗原のポリイオン性ＶＬＰへのコンジュゲーション

ＶＬＰへのコンジュゲーションのために、ペプチドを５ｍｇ／ｍｌで蒸留水に溶解させた（水に溶けない場合、ＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍｌで溶解）。好ましい濃度２．５ｍｇ／ｍｌであるが、緩衝液中の溶解性が低い場合にはより低い濃度のペプチドを、１０ｍＭのＢｏｎｄ－ｂｒｅａｋｅｒＴＣＥＰ溶液（Thermo Fisher Scientific製）を用いて５０℃で２０分間還元した。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５、０．１５ＭＮａＣｌ）中で透析した後、ＶＬＰタンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）とペプチドを、溶解特性に基づきペプチド：Ｌ１タンパク質のモル比を４：１～１６：１として、４ｍＭグルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）および０．８ｍＭ還元グルタチオン（ＧＳＨ）の存在下で混合し、３７℃で一晩培養した。未反応のペプチドを除去するために、１００万ｋＤａのカットオフの透析チューブを使用して、反応物を２０ｍＭリン酸、ｐＨ６．５、０．５ＭＮａＣｌに対して透析した。ＶＬＰ－ペプチド溶液は、０．０１%Ｔｗｅｅｎ８０、０．０５％カルボキシメチルセルロース、０．５ｍＭＧＳＳＧ、および０．０５ｍＭＧＳＨに調整し、アリコートした後、－２０℃で保存した。ＶＬＰに結合したペプチドの量を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析と、既知量のペプチド標準曲線からのサンプル－ペプチドバンド密度の内挿によって決定した。ゲルを、ＢｉｏＲａｄ製のＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲ撮影装置でスキャンし、画像をＮＩＨのＩｍａｇｅＪソフトウェアで解析した。

実施例４：細胞溶解ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するための、ＨＩループに様々な挿入物を有するＶＬＰの例示的な実施形態の能力

Ｌ１タンパク質（表１）中の種々例示的な挿入物を用いて生成されたＶＬＰは、ＴＡＧを介して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的バックグラウンドにおいて認識されるＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープをコードする代表的なペプチドに連結した。マウスは、以下に記載されるように、皮内経路によって免疫した。免疫応答は、以下に記載するように測定した。代表的な抗原に連結された複数の挿入物を用いて製剤化したＶＬＰは、抗原特異的インターフェロン－γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞（ｔ検定比較による平均応答に有意差なし）の細胞傷害性Ｔ細胞応答を、同程度の頻度で誘導することが示された。

実施例５：例示的実施形態のＴＡＧによって抗原に連結されたＶＬＰの細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する能力

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの遺伝的バックグラウンドにおいて認識されるＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープをコードする代表的なペプチドを、表２に列挙されるＴＡＧを用いて、＞９０％の純度で化学的に合成する。ＴＡＧ－１～－４、－１１および－１２を有するペプチドが、挿入物－１を有するポリイオン性ＶＬＰに連結される。ＴＡＧ５～１０を有するペプチドは、それぞれ挿入物５～１０を有するＶＬＰに連結される。マウスは以下に記載されるように、皮内経路によって免疫される。免疫応答は、以下に記載するように測定される。複数のＴＡＧを用いて製剤化された代表的な抗原に連結されたＶＬＰは、抗原特異的なインターフェロン－γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞を同程度の頻度で誘導することが示された（ｔ検定比較による平均応答に有意差なし）。

実施例６：ポリイオン性ＶＬＰによる免疫化と、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の検出

６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１週間隔で３回、それぞれ５～５０ｕｇのＶＬＰ－ペプチドを皮内注射することによって免疫した。コントロールとして、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、非標識（ペプチドなし）ＶＬＰタンパク質で免疫する。ＶＬＰ－ペプチド免疫原は、表３～１２に記載されている、異なるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原およびＯＣ４３抗原のための伸長ペプチドのセットを使用して製剤化された。皮内免疫化の場合、ＶＬＰ／抗原ワクチンを、剃毛したマウスの背中の皮膚に、単回または分割用量で注射した。

免疫学的アッセイ用の試料を提供するために、ワクチンの最終投与から１０～１４日後にマウスを屠殺し、脾臓を解剖した。脾細胞（または肺組織由来のＣＤ３＋細胞の懸濁液）を、ブレフェルジンＡ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下、標的抗原の全長アミノ酸配列にわたる長さ１１アミノ酸（８アミノ酸が重複）の重複ペプチドのプール１ｕｇ／ｍｌを用い、５％ＣＯ₂中３７℃で一晩刺激した。細胞を、Ｚｏｍｂｉｅｇｒｅｅｎ（商標）固定可能な生存率解析用色素で染色し、固定緩衝液で処理し、Ｃｙｔｏｌａｓｔ中で保存した。細胞は、透過処理緩衝液で透過処理し、ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔＢＶ（商標）５１０標識抗マウスＣＤ３、クローン１７Ａ２、ＰｅｒＣＰＣｙ５．５標識抗マウスＣＤ８α、クローン５３－６．７、およびＰＥ標識抗マウスＩＦＮγ、クローンＸＭＧ１．２で、染色した。試薬は、市販のものを使用した。ＬＳＲ－ＩＩまたは同等のフローサイトメーターでフローサイトメトリーを行い、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアまたはＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてデータを解析した。前方散乱と側方散乱のパラメータでゲーティングを行い、リンパ球と単一細胞を選択した。死細胞の除去後、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、ゲーティングされたリンパ球のＣＤ３／ＣＤ８ドットプロット上で同定し、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）分泌細胞を、ゲーティングされたＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ８／ＩＦＮγドットプロット上で同定した。最低３０，０００個のＣＤ８＋Ｔ細胞を分析する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭ、Ｎ、Ｓ２、ＯＲＦ３ａ、ＯＲＦ７ａ、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７、およびｎｓｐ１２抗原のＶＬＰペプチド免疫原、ならびにＯＣ４３のＭ、Ｎ、Ｓ２、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７、およびｎｓｐ１２抗原の免疫原は、検出可能な抗原特異的なインターフェロン－γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することが示された。

実施例７：チャレンジモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２疾患からマウスを保護するポリイオン性ＶＬＰＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの能力

マウス株：Ｃ５７ＢＬ／６系マウスにおいて、内因性マウスＡＣＥ２（ｍＡＣＥ２）をヒトＡＣＥ２に置換するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックイン技術を用いて作製した安定ヒト化アンギオテンシン変換酵素ＩＩ（ＡＣＥ２）マウスを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに使用した（Sun et al.、２０２０年）。

マウス免疫化：ＨＩループ中に例示的な挿入物を有するＶＬＰを、特定の挿入物に対して例示的かつ適切なＴＡＧを有する例示的な伸長ペプチドのセットと共に製剤化した。ポリイオン性ＶＬＰワクチンを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原のＭ、Ｎ、Ｓ２、ＯＲＦ３ａ、ＯＲＦ７ａ、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７および／またはｎｓｐ１２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原と共に製剤化した。ペプチドは、シーケンスＩＤが伸長を表す－Ｅ１、－Ｅ２、－Ｅ３などで終わる表３～１０のリストから選択される。ペプチドの正確な数は、表に記載されるように抗原によって異なる。好ましい挿入物は、天然アミノ酸の置換を伴う、ウシパピローマウイルス１型Ｌ１タンパク質のＨＩループにおけるアミノ酸位置３４７～３５５のＥ８Ｃアミノ酸配列であり（挿入物－１、表１）、好ましいＴＡＧは、ＣＲＲＲＲＲＲＲＲＣＡＡＹＹである（ＴＡＧ－１、表２）。１または複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対するペプチドのセットを有する、挿入物およびＴＡＧの追加の組合せも、他の可能な実験から情報を得て試験される。ＶＬＰ／抗原構築物は、上記のように作製される。マウスは、皮内経路、鼻腔内／肺経路、または両方の経路で、同時に免疫される。皮内免疫の場合、ＶＬＰ／抗原ワクチンを、剃毛したマウスの背中の皮膚に、単回または分割用量で注射する。鼻腔／肺免疫の場合、ＶＬＰ／抗原構築物を、軽く麻酔したマウスの鼻に滴下投与（１０μｌ）する。麻酔をかけたマウスでは、鼻腔内に投与されたワクチンもマウスに吸入されるため、肺組織と鼻咽頭組織の両方に送達される。

マウスチャレンジ：鼻腔内感染のために、高齢（３０週齢）ｈＡＣＥ２マウスを、精密気化器を用いて送達されるイソフルランで麻酔し、次いで、４×１０⁵ｐｆｕのＳＡＲＳＣｏＶ－２で鼻腔内感染させる。その後、マウスの体重を測定して毎日モニターし、感染後６日目に、血清採取と組織処理のために屠殺する。脾臓と肺組織を、ウイルスＲＮＡ量の分析、組織病理学、および細胞性免疫応答の測定のために採取する。

ウイルスＲＮＡ量の測定：肺組織中のウイルスＲＮＡを、プロトコールに従ってＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出する。ウイルスＲＮＡの定量化は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子を標的とするＲＴ－ｑＰＣＲによって行う。ＲＴ－ｑＰＣＲは、以下のプライマーおよびプローブ：ＣｏＶ－Ｆ３、ＣｏＶ－Ｒ３およびＣｏＶ－Ｐ３（Sun et al、２０２０）で、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ステップＲＴ－ＰＣＲ用キット（タカラ）を用いてを行う。

抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答：脾臓細胞と、肺ホモジネートから回収したＣＤ３＋Ｔ細胞と、についてのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、上記のように測定する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリイオン性ＶＬＰワクチンは、標的抗原（Ｍ、Ｎ、Ｓ２、ＯＲＦ３ａおよびＯＲＦ７ａ）のそれぞれに対して、脾細胞および肺組織由来のＣＤ３＋Ｔ細胞において検出可能な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することが示された。さらにワクチン接種されたマウスは、模擬ワクチンを接種されたマウスと比較して、ウイルスＲＮＡ量が優位に低減され、肺病理学的所見が少ないことが示された。ワクチンはまた、肺におけるウイルスＲＮＡの発現を減少させることも示された。なお、ワクチンが滅菌免疫提示することは期待されない。

実施例８：チャレンジモデルにおいてシリアンハムスターをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染から保護するポリイオン性ＶＬＰのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンの能力

動物種：シリアンハムスターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対して非常に感受性が高く、ワクチンの防御効果を評価するのに最適な小動物モデルである（Rosenke et al、２０２０；Chan et al.、２０２０）。６～８週齢のシリアンハムスター（Mesocricetus auratus）を、Jackson Laboratoriesから購入した。

ハムスター免疫化：ＨＩループ中に例示的な挿入物を有するＶＬＰを、特定の挿入物に対して例示的かつ適切なＴＡＧを有する例示的な伸長ペプチドのセットと共に製剤化した。ポリイオン性ＶＬＰワクチンは、Ｍ、Ｎ、Ｓ２、ＯＲＦ３ａ、ＯＲＦ７ａ、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７および／またはｎｓｐ１２のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原と共に製剤化される。ペプチドは、シーケンスＩＤが伸長を表す－Ｅ１、－Ｅ２、－Ｅ３などで終わる、表３～１０のリストから選択される。ペプチドの正確な数は、表に記載されるように抗原によって異なり、－Ｅ伸長指定を有する全ての抗原またはより少ない抗原を含み得る。好ましい挿入物は、天然アミノ酸の置換を伴う、ウシパピローマウイルス１型Ｌ１タンパク質のＨＩループのアミノ酸位置３４７～３５５におけるＥ８Ｃアミノ酸配列であり（挿入物－１、表１）、好ましいＴＡＧは、ＣＲＲＲＲＲＲＲＲＣＡＡＹＹ（ＴＡＧ－１、表２）である。１または複数のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原に対するペプチドのセットを有する、追加の挿入物およびＴＡＧの組合せも、他の可能な実験から情報を得て試験することができる。ＶＬＰ／抗原構築物を上記のように作製する。ハムスターは、皮内経路、鼻腔内経路、または両方の経路を、単独で、または組み合わせて、免疫される。皮内免疫は、上記のように行う。鼻腔内免疫の場合、ＶＬＰ／抗原構築物を、軽く麻酔したマウスの鼻に滴下（１０μｌ）して投与する。

ハムスターチャレンジ：自然の感染経路を模擬するために、ワクチン接種された動物と対象動物（接触動物）を同じケージに共同収容することによって、以前に感染した動物（指標動物）に曝露する。指標動物に対する鼻腔内感染のために、ハムスターを、精密気化器を用いて送達されるイソフルランで麻酔し、次いで、１００組織培養容量５０（ＴＣＩＤ５０）のＳＡＲＳＣｏＶ－２ウイルスで鼻腔内感染させる。ＣＤＣからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離株ｎＣｏＶ－ＷＡ１－２０２０（ＭＮ９８５３２５．１）、または適切な代替単離株を入手し、ＶｅｒｏＥ６細胞中で増殖させる。ＴＣＩＤ５０用量は、ＶｅｒｏＥ６細胞中のウイルスストックの滴定によって決定される。感染したハムスター、および同時収容されたワクチン接種ハムスターおよび対照のナイーブハムスターの体重を測定し、疾患の臨床徴候がないか毎日モニターした。ＲＴ－ｑＰＣＲによる感染をモニターするために、軽く麻酔したナイーブ接触動物（ワクチン接種および対照）および指標動物（以前に感染させた）に、１５０ｕｌのＰＢＳ／０．３％ＢＳＡを両鼻孔に滴下して回収することで、鼻洗浄液を１０日間毎日回収した。

ウイルスＲＮＡ量の測定：肺組織中のウイルスＲＮＡを、プロトコールに従ってＲＮｅａｓｙＭｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ製）で抽出した。ウイルスＲＮＡの定量は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ遺伝子を標的とするＲＴ－ｑＰＣＲによって行った。ＲＴ－ｑＰＣＲは、以下のプライマーとプローブ：ＣｏＶ－Ｆ３、ＣｏＶ－Ｒ３およびＣｏＶ－Ｐ３（Sun et al.、２０２０）で、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）１ステップＲＴ－ＰＣＲ用キット（タカラ）を用いてを行った。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリイオン性ＶＬＰワクチン接種ハムスターは、感染した指標ハムスターに曝露した後、偽ワクチン接種マウスよりも、鼻洗浄液中のウイルスＲＮＡ量が有意に減少することが示された。

［表］

Braun,J., Loyal,L., Frentsch,M., Wendisch,D., Georg,P., Kurth,F., Hippenstiel,S., Dingeldey,M., Kruse,B., Fauchere,F., Baysal,E., Mangold,M., Henze,L., Lauster,R., Mall,M.A., Beyer,K., Rohmel,J., Voigt,S., Schmitz,J., Miltenyi,S., Demuth,I., Muller,M.A., Hocke,A., Witzenrath,M., Suttorp,N., Kern,F., Reimer,U., Wenschuh,H., Drosten,C., Corman,V.M., Giesecke-Thiel,C., Sander,L.E., and Thiel,A. (2020). SARS-CoV-2-reactive T cells in healthy donors and patients with COVID-19（健常ドナーおよびＣＯＶＩＤ－１９罹患者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２反応性Ｔ細胞）. Nature.

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電子ファイルを添付した。

Claims

（ａ）キメラパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、Ｌ１タンパク質と、前記Ｌ１タンパク質のＨＩループに挿入されたアミノ酸挿入物と、を含むＶＬＰと、
（ｂ）コロナウイルス抗原と、
を含む組成物。
前記アミノ酸挿入物は、負電荷アミノ酸の連続配列と末端システイン残基とを含む、
請求項１に記載の組成物。
前記負電荷アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、
請求項２に記載の組成物。
前記アミノ酸挿入物は、４～１０の前記負電荷アミノ酸と、Ｃ末端、Ｎ末端、または両方における前記末端システイン残基と、を含む、
請求項２に記載の組成物。
前記アミノ酸挿入物は、表１に示される挿入物から選択される、
請求項２に記載の組成物。
前記アミノ酸挿入物は、３４４位と３５７位との間の位置で前記Ｌ１タンパク質の前記ＨＩループに挿入されている、
請求項１に記載の組成物。
前記アミノ酸挿入物は、３４４位と３５７位との間の１以上の天然残基を置換する、
請求項６に記載の組成物。
前記アミノ酸挿入物は、表１に示される天然アミノ酸配列を置換する、
請求項６に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＯＣ４３抗原、ＨＫＵ１抗原、２２９Ｅ抗原、ＮＬ６３抗原、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１抗原、ＭＥＲＳ抗原、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、およびこれらの融合体からなる群から選択される、
請求項１に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルスに由来する１または複数のタンパク質を含む、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルスに由来する、膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、ならびにスパイク（Ｓ）エンベロープタンパク質のＳ２領域からなる群から選択される、ウイルス構造タンパク質を含む、請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のコロナウイルスの、ＯＲＦ３ａタンパク質およびＯＲＦ７ａタンパク質からなる群から選択されるウイルス構造タンパク質を含む、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに由来する、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７、およびｎｓｐ１２タンパク質からなる群から選択されるウイルス非構造タンパク質を含む、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、スパイク（Ｓ）エンベロープタンパク質のＳ２領域、ＯＲＦ３ａ、およびＯＲＦ７ａからなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス構造タンパク質を含む、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス構造タンパク質抗原は、表３～７のアミノ酸配列の１以上から選択される、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｎｓｐ６、ｎｓｐ７および／またはｎｓｐ１２タンパク質に由来するウイルス非構造タンパク質を含む、請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス非構造タンパク質抗原は、表８～１０のアミノ酸配列の１以上から選択される、請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、膜タンパク質（Ｍ）、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、およびスパイク（Ｓ）エンベロープタンパク質のＳ２領域からなる群から選択される、ＯＣ４３コロナウイルスおよび／またはＨＫＵ１コロナウイルスの１または複数のウイルス構造タンパク質を含む、請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４、ｎｓｐ６、ｎｓｐ７および／またはｎｓｐ１２タンパク質からなる群から選択される、ＯＣ４３コロナウイルスの１以上のウイルス非構造タンパク質を含む、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＯＣ４３コロナウイルスおよび／またはＨＫＵ１コロナウイルスの１以上のウイルスタンパク質を含み、
前記１以上のウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１コロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有する、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＯＣ４３コロナウイルスおよび／またはＨＫＵ１コロナウイルスの１以上のウイルスタンパク質を含み、
前記１以上のウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１コロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有する、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＯＣ４３コロナウイルスおよび／またはＨＫＵ１コロナウイルスの１以上のウイルスタンパク質を含み、
前記１以上のウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１コロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有する、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＯＣ４３コロナウイルスおよび／またはＨＫＵ１コロナウイルスの１以上のウイルスタンパク質を含み、
前記１以上のウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１コロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有する、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ＯＣ４３コロナウイルスおよび／またはＨＫＵ１コロナウイルスの１以上のウイルスタンパク質を含み、
前記１以上のウイルスタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１コロナウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスのアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する、
請求項９に記載の組成物。
前記ＯＣ４３および／またはＨＫＵ１コロナウイルス構造タンパク質抗原は、表１１～１３のアミノ酸配列の１または複数から選択される、
請求項９に記載の組成物。
前記ＯＣ４３コロナウイルス非構造抗原は、表１４～１７のアミノ酸配列の１以上から選択される、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、ウイルスタンパク質の抗原領域の全アミノ酸配列を含むポリペプチドのセットを含む、
請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、
ＯＣ４３および／またはＨＫＵ１コロナウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質およびペプチドから選択される第１の抗原と、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの構造タンパク質および非構造タンパク質およびペプチドから選択される第２の抗原と、
を含む、請求項９に記載の組成物。
前記コロナウイルス抗原は、
ＯＣ４３および／またはＨＫＵ１コロナウイルスの構造タンパク質および構造ペプチドから選択される第１の抗原と、
ＯＣ４３の非構造タンパク質および非構造ペプチドから選択される第２の抗原と、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスの構造タンパク質および構造ペプチドから選択される第３の抗原と、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非構造タンパク質および非構造ペプチドから選択される第４の抗原と、
を含む、請求項９に記載の組成物。
第１の末端で前記アミノ酸挿入物に連結され、第２の末端で前記コロナウイルス抗原に連結されるＴＡＧ配列をさらに含む、
請求項１に記載の組成物。
前記ＴＡＧ配列は、ジスルフィド結合によってキメラパピローマウイルスに連結され、ペプチド結合によって前記コロナウイルス抗原に連結される、
請求項３０に記載の組成物。
前記ＴＡＧ配列は、Ｃ末端タンパク質プロセシング配列ＡＡＹＹを含む、
請求項３０に記載の組成物。
前記ＴＡＧ配列は、４～１０の正電荷アミノ酸および末端システイン残基の配列を含む、請求項３０に記載の組成物。
前記ＴＡＧ配列は、表２に示されるアミノ酸配列を含む、
請求項３０に記載の組成物。
哺乳動物における細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するのに有効である、
請求項１に記載の組成物。
哺乳動物におけるコロナウイルスに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するための方法であって、
請求項１～３５のいずれか１項に記載の組成物を前記哺乳動物に投与すること、
を含む、方法。
前記組成物は、ＯＣ４３抗原、ＨＫＵ１抗原、２２９Ｅ抗原、ＮＬ６３抗原、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、コロナウイルス抗原を含む、
請求項３６に記載の方法。
前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちの１以上である、
請求項３６に記載の方法。
哺乳動物における２以上のコロナウイルスに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するための方法であって、
請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物を前記哺乳動物に投与すること、
を含み、
前記コロナウイルス抗原は、前記２以上のコロナウイルスのそれぞれに由来する少なくとも１つの抗原を含む、
方法。
前記組成物は、
ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９ＥおよびＮＬ６３の構造タンパク質および構造ペプチドからなる群から選択される第１のコロナウイルス抗原と、
ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９ＥおよびＮＬ６３の非構造タンパク質および非構造ペプチドからなる群から選択される第２のコロナウイルス抗原と、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質および構造ペプチドからなる群から選択される第３のコロナウイルス抗原と、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非構造タンパク質および非構造ペプチドからなる群から選択される第４のコロナウイルス抗原と、
を含む、請求項３９に記載の方法。
前記細胞傷害性Ｔ細胞応答は、交差反応性記憶Ｔ細胞の刺激を含み、
前記交差反応性記憶Ｔ細胞は、前記第１のコロナウイルス抗原および前記第２のコロナウイルス抗原の投与によって刺激され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちの１つに感染した細胞に対して細胞傷害性を示す、
請求項４０に記載の方法。
コロナウイルスに対する治療免疫および保護免疫の両方を刺激するための方法であって、
請求項１～３５のいずれか１項に記載の組成物を対象に投与すること、
を含む、方法。
前記組成物は、
ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ、および／またはＮＬ６３の構造タンパク質または構造ペプチドからなる群から選択される第１のコロナウイルス抗原と、
ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ、およびＮＬ６３の非構造タンパク質または非構造ペプチドからなる群から選択される第２のコロナウイルス抗原と、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の構造タンパク質および構造ペプチドからなる群から選択される第３のコロナウイルス抗原と、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非構造タンパク質および非構造ペプチドからなる群から選択される第４のコロナウイルス抗原と、
を含む、請求項４２に記載の方法。
前記細胞傷害性Ｔ細胞応答は、交差反応性記憶Ｔ細胞の刺激を含み、
前記交差反応性記憶Ｔ細胞は、前記第１のコロナウイルス抗原および第２のコロナウイルス抗原の投与によって刺激され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちの１つに感染した細胞に対して細胞傷害性を示す、
請求項４３に記載の方法。
哺乳動物において事前に存在する交差反応性記憶Ｔ細胞を刺激するための方法であって、
請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、
事前に存在する前記交差反応性記憶Ｔ細胞は、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ、およびＮＬ６３のうちの１つに対する感染に応答して誘導されたものであり、
前記交差反応性記憶Ｔ細胞は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ、およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちの１つに感染した細胞に対して細胞傷害性を示す、
方法。