JP2022149254A - 細胞培養容器および細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡易な作業工程で使用することができる細胞培養容器を提供すること。【解決手段】内筒一端部と、内筒一端部と対向する内筒他端部と、内筒一端部と内筒他端部とを繋ぐ筒状の内筒側壁と、内筒他端部に切り欠きとして形成された内筒凹部と、を有する内筒と、内筒凹部に着脱可能に装着され、内筒凹部を塞ぐ液止めピンと、内筒一端部に配置されて、内筒一端部に形成された内筒開口部を塞ぐ培養膜部と、内筒に内筒一端部側から内筒に着脱可能に装着される外筒であって、外筒一端部と、外筒一端部と対向する外筒他端部と、外筒一端部と外筒他端部とを繋ぐ筒状の外筒側壁とを有する外筒と、を備え、培養膜部は、外筒が内筒に装着された装着状態の場合に、外筒他端部の外筒開口部を塞ぐ、細胞培養容器。【選択図】図２

Description

本開示は、細胞培養容器および細胞培養方法に関する。

従来、培養膜の両面に細胞を培養するための細胞培養器具がある（例えば、特許文献１）。特許文献１の細胞培養器具は、第１の内筒と、外筒と、第１の内筒の端部を覆って配置される細胞培養用膜とを備える。そして、細胞が培養される際には、ウェルに細胞培養器具が入れられ、ウェル内が培養液で満たされることで、細胞培養膜は培養液に浸漬される。また、細胞培養膜の一方の面に細胞が培養された後、ウェルから細胞培養器具が取り出され、細胞培養器具が反転された後、ウェルに細胞培養器具が入れられ、細胞培養膜の他方の面に細胞が培養される。

特開２０１５－２０８２８３号公報

しかしながら、特許文献１に記載の細胞培養器具では、培養工程において、上記のように、ウェルに細胞培養用器具を入れる作業が必要であり、さらに、細胞培養器具を反転させるために、ウェルから細胞培養器具を取り出す作業が必要であり、作業が煩雑になるおそれがある。

本開示は、以下の形態として実現することが可能である。

（１）本開示の一形態によれば、細胞培養容器が提供される。この細胞培養容器は、内筒一端部と、前記内筒一端部と対向する内筒他端部と、前記内筒一端部と前記内筒他端部とを繋ぐ筒状の内筒側壁と、前記内筒他端部に切り欠きとして形成された内筒凹部と、を有する内筒と、前記内筒凹部に着脱可能に装着され、前記内筒凹部を塞ぐ液止めピンと、前記内筒一端部に配置されて、前記内筒一端部に形成された内筒開口部を塞ぐ培養膜部と、前記内筒に前記内筒一端部側から前記内筒に着脱可能に装着される外筒であって、外筒一端部と、前記外筒一端部と対向する外筒他端部と、前記外筒一端部と前記外筒他端部とを繋ぐ筒状の外筒側壁とを有する外筒と、を備え、前記培養膜部は、前記外筒が前記内筒に装着された装着状態の場合に、前記外筒他端部の外筒開口部を塞ぐ。この形態によれば、第１細胞を培養する第１培養工程においては、培養膜部を内筒の底面とする姿勢とすることによって、内筒を、第１細胞用液体培地を貯留するための容器として使用することができる。これにより、ウェルに細胞培養容器を入れる手間や、ウェルから細胞培養容器を取り出す手間がなく、作業性を向上させることができる。また、第２細胞を培養する第２培養工程においては、培養膜部を外筒の底面とする姿勢とすることによって、外筒を、第２細胞用液体培地を貯留するための容器として使用することができる。よって、細胞培養容器を用いて共培養を行うことができる。また、第２培養工程において、第１細胞用液体培地の残留空気を内筒凹部から排出することができる。
（２）上記形態の細胞培養容器において、前記外筒は、さらに、前記装着状態の場合に、前記内筒の径方向において、前記内筒凹部と重なる位置に、前記外筒側壁の一部が切り欠きとして形成された外筒凹部を有していてもよい。この形態によれば、第２培養工程において、内筒が液体に浸漬された場合、液体に残留する空気を、液止めピンが装着されていない内筒凹部と、外筒凹部とを介して排出することができる。よって、培養を良好に行うことができる。
（３）上記形態の細胞培養容器において、前記外筒は、さらに、前記外筒側壁の内周面から突出し、前記装着状態の場合に、前記培養膜部と前記内筒の中心軸に沿った方向に向かい合って当接する凸部を有していてもよい。この形態によれば、培養膜部が配置された内筒に外筒を固定し易くすることができる。
（４）上記形態の細胞培養容器において、前記凸部は、前記培養膜部と当接する平滑面を有していてもよい。この形態によれば、第２培養工程において、外筒に入れられた液体の、凸部と培養膜部との隙間からの漏れを抑制することができる。
（５）上記形態の細胞培養容器において、前記培養膜部は、さらに、前記内筒側壁の前記内筒一端部の端面を覆って配置される円環状の支持枠と、前記支持枠に接合される細胞培養膜とを有していてもよい。この形態によれば、端面に支持枠が配置されることにより、外力を支持枠で受けることができるため、内筒凹部にかかる応力を軽減し、細胞培養膜が受ける応力を軽減することができる。よって、細胞培養膜１２の破損や傷つきおよび第１細胞の損傷による品質低下を抑制することができる。
（６）本開示の一形態によれば、複数の細胞培養容器を用いた細胞培養方法が提供される。この細胞培養方法において、前記複数の細胞培養容器の各々は、内筒一端部と、前記内筒一端部と対向する内筒他端部と、前記内筒一端部と前記内筒他端部とを繋ぐ筒状の内筒側壁と、前記内筒他端部に切り欠きとして形成された内筒凹部と、を有する内筒と、前記内筒一端部に配置されて、前記内筒一端部に形成された内筒開口部を塞ぐ培養膜部と、前記内筒に前記内筒一端部側から前記内筒に着脱可能に装着される外筒であって、外筒一端部と、前記外筒一端部と対向する外筒他端部と、前記外筒一端部と前記外筒他端部とを繋ぐ筒状の外筒側壁とを有する外筒とを備え、前記培養膜部は、前記外筒が前記内筒に装着された装着状態の場合に、前記外筒他端部の外筒開口部を塞ぐ。前記細胞培養方法は、前記複数の細胞培養容器が有する複数の前記内筒を同時に固定可能な固定治具と、前記複数の内筒を把持し、前記複数の内筒を同時に反転可能な反転治具と、前記複数の細胞培養容器が有する複数の前記内筒凹部に着脱可能に装着され、前記複数の内筒凹部を塞ぐ液止め治具と、を用いて共培養する。この形態によれば、複数の細胞培養容器に対して同時に作業可能な固定治具、反転治具、および液止め治具を用いての作業であるため、個々の細胞培養容器について個別に作業を行うよりも、効率的に細胞培養を行うことができる。

本開示は、細胞培養容器および細胞培養方法以外の種々の形態で実現することも可能である。例えば、細胞培養容器を用いた細胞培養方法や、固定治具、反転治具、液止め治具等の形態で実現することができる。

細胞培養容器の分解斜視図である。 細胞培養容器の斜視図である。 図２のＩＩＩ－ＩＩＩ断面図である。 細胞培養方法の工程を示すフローチャートである。 第１培養工程における内筒の模式図である。 第２培養工程における細胞培養容器の模式図である。 固定治具および液止め治具の斜視図である。 反転治具の斜視図である。 反転治具の平面図である。 図９のＸ－Ｘ断面図である。

Ａ．第１実施形態：
Ａ１．細胞培養容器の構成：
図１は、細胞培養容器１００の分解斜視図である。図２は、細胞培養容器１００の斜視図である。図３は、図２のＩＩＩ－ＩＩＩ断面図である。図１から図３では、互いに直交する、Ｘ軸と、Ｙ軸と、Ｚ軸とを示している。細胞培養容器１００は、典型的には、Ｚ方向が鉛直方向と沿うように配置されて使用される。以下では、＋Ｚ方向を上方向、－Ｚ方向を下方向として説明する場合がある。細胞培養容器１００は、培養膜部１０と、内筒２０と、外筒４０と、液止めピン６０とを備える。細胞培養容器１００は、培養膜部１０の両面に細胞を培養する共培養のために用いられる容器である。

図１に示すように、培養膜部１０は、中心軸ＣＸを有する円板形状を有する。培養膜部１０は、支持枠１１と、細胞培養膜１２とを有する。培養膜部１０は、内筒２０に接合される。支持枠１１は、円環状の枠である。そして、支持枠１１の端面を覆うように円形の細胞培養膜１２が接合されている。支持枠１１は、樹脂材料にて形成されている。樹脂材料としては、高密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ＡＢＳ（Acrylonitrile Butadiene Styrene）、アクリル、ポリエステル、ポリメチルペンテン等を挙げることができる。細胞培養膜１２は、細胞培養を行う際に、細胞培養の足場となる膜である。細胞培養膜１２として、膜の厚み方向に貫通する多数の細孔を有する、合成高分子製の多孔質膜や天然高分子製の多孔質膜を用いることができる。具体的には、多孔質膜として、トラックエッチング膜や、ナノファイバー膜や、コラーゲンビトリゲル膜や、多孔質ポリウレタン膜等が挙げられる。

内筒２０は、筒状である。具体的には、内筒２０は、中心軸ＣＸを有する円筒形状である。内筒２０の外径は、培養膜部１０の外径と、ほぼ同じである。内筒２０は、樹脂材料で形成されている。樹脂材料としては、ポリエチレンや、ポリプロピレンや、ポリスチレン、アクリル樹脂等が挙げられる。

内筒２０は、内筒一端部２１と、内筒他端部２２と、内筒側壁２３と、内筒凹部２４とを有する。内筒一端部２１は、内筒２０の中心軸ＣＸ方向における一端である。内筒他端部２２は、中心軸ＣＸ方向において内筒一端部２１と対向する。内筒側壁２３は、内筒一端部２１と内筒他端部２２とを繋ぐ。内筒凹部２４は、内筒一端部２１の端面から中心軸ＣＸ方向に沿って、内筒一端部２１に切り欠きとして形成されている。内筒２０を用いて細胞の培養を行う後述する第１培養工程Ｐ２０において、内筒凹部２４には、液止めピン６０が装着される。内筒凹部２４は、中心軸ＣＸ方向に沿った２つの第１凹部面２４ａと、内筒側壁２３の周方向に沿った第２凹部面２４ｂとにより形成されている。すなわち、内筒凹部２４は、端面２１ａから凹んだ形状であり、凹形状の底部となる第２凹部面２４ｂと、第２凹部面２４ｂから端面２１ａに向かって立ち上がる２つの第１凹部面２４ａとを備える。内筒凹部２４は、内筒２０の径方向内方から径方向外方に向かうに従い、開口面積が大きくなるテーパー形状を有する。本実施形態では、図３に示すように、第２凹部面２４ｂは、内筒２０の径方向において、内筒２０の内周面から外周面に向かって、内筒一端部２１から遠ざかるように傾斜することでテーパー形状を有する。これにより、液止めピン６０を装着し易くすることができる。

図２に示すように、内筒一端部２１に培養膜部１０が配置される。そして、培養膜部１０は、内筒一端部２１に形成された内筒開口部２５を塞ぐ。具体的には、図３に示すように、内筒一端部２１の端面２１ａを覆って、端面２１ａと支持枠１１とが接するように、培養膜部１０が配置される。そして、内筒一端部２１の端面２１ａと培養膜部１０とが接合される。端面２１ａに支持枠１１が配置されることにより、培養膜部１０が配置された内筒２０は、外力を支持枠１１で受けることができる。このため、内筒凹部２４にかかる応力を軽減し、細胞培養膜１２が受ける応力を軽減することができる。よって、細胞培養膜１２の破損や傷つきおよび第１細胞の損傷による品質低下を抑制することができる。

図１に示すように、液止めピン６０は、径方向に沿って、内筒凹部２４に着脱可能に装着され、内筒凹部２４を塞ぐ。これにより、第１培養工程Ｐ２０において、内筒２０を側面として、培養膜部１０を底面とする容器として、内筒２０を使用することができる。液止めピン６０は、弾性を有する材料で形成されている。弾性を有する材料としては、シリコンゴムや、フッ素ゴムや、ウレタンゴムや、スチレン系エラストマーや、オレフィン系エラストマーや、ウレタン系エラストマーや、エステル系エラストマーや、アミド系エラストマーを挙げることができる。液止めピン６０は、ピン本体６１と、ピン把持部６２とを有する。ピン本体６１の大きさは、内筒凹部２４の大きさよりも大きい。そして、ピン本体６１が弾性変形により縮小されて、内筒凹部２４に嵌められて装着される。これにより、内筒２０が容器として使用される場合、内筒凹部２４からの液漏れが抑制される。

図３に示すように、ピン把持部６２は、液止めピン６０が内筒２０に装着された場合、内筒側壁２３の外方に配置される。図１に示すように、内筒２０の径方向から視た場合、ピン把持部６２の外形は、ピン本体６１の外形よりも大きい。具体的には、内筒２０の径方向から視た場合、ピン把持部６２の幅方向両側の面（＋Ｙ方向側の面、－Ｙ方向側の面）、およびピン把持部６２の高さ方向下側の面（－Ｚ方向側の面）のそれぞれは、ピン本体６１の幅方向両側の面（＋Ｙ方向側の面、－Ｙ方向側の面）、およびピン本体６１の高さ方向下側の面（－Ｚ方向側の面）よりも外方に位置する。これにより、ピンセットなどの器具を内筒側壁２３の外周面と、ピン把持部６２との間に挿入することができるため、液止めピン６０を取り外し易くすることができる。なお、内筒２０の径方向から視た場合、ピン把持部６２の高さ方向上側の面（＋Ｚ方向側の面）は、ピン本体６１の高さ方向上側の面（＋Ｚ方向側の面）と面一である。これにより、液止めピン６０が装着された内筒２０に外筒４０が装着される場合、液止めピン６０と外筒４０との干渉を抑制することができる。さらに、図１および図３に示すように、ピン把持部６２の、内筒２０の中心軸ＣＸ方向に沿った端面には、周方向に凹んだピン凹部６２ａが形成されている。液止めピン６０を取り外す際には、ピンセットなどの器具の先端をピン凹部６２ａに配置することで、器具にて、液止めピン６０を把持し易くすることができる。よって、液止めピン６０を内筒２０から取り外し易くすることができる。

図１に示すように、外筒４０は、筒状である。具体的には、外筒４０は、中心軸ＣＸを有する円筒形状を有する。外筒４０は、内筒２０と同様の樹脂材料で形成されている。外筒４０の内径は、内筒２０の外径よりも大きい。外筒４０は、外筒一端部４１と、外筒他端部４２と、外筒側壁４３と、外筒凹部４４と、凸部４５とを有する。外筒一端部４１は、外筒４０の中心軸ＣＸ方向における一端である。外筒他端部４２は、中心軸ＣＸ方向において外筒一端部４１と対向する。外筒側壁４３は、外筒一端部４１と外筒他端部４２とを繋ぐ。外筒凹部４４は、外筒他端部４２の端面から中心軸ＣＸ方向に沿って、外筒他端部４２に切り欠きとして形成されている。後述する培養工程の工程Ｐ４０では、培養膜部１０が配置された内筒２０に対して、外筒他端部４２が内筒一端部２１を覆うように、内筒一端部２１側から外筒４０が装着される。

図２に示すように、外筒凹部４４は、径方向から視たときに、内筒凹部２４と重なる形状を有する。凸部４５は、外筒側壁４３の内周面４３ａから径方向に突出して形成されている。凸部４５は、培養膜部１０が配置された内筒２０に外筒４０が装着された装着状態の場合、内筒２０に配置された培養膜部１０と中心軸ＣＸ方向に向かい合って当接する。凸部４５の中心軸ＣＸ方向から視た形状は、円環状である。凸部４５は、中心軸ＣＸ方向において、外筒他端部４２の端面から離れた位置に形成されている。中心軸ＣＸ方向において、凸部４５と外筒他端部４２の端面との間に外筒凹部４４が形成されている。後述する第２培養工程Ｐ６０において、培養膜部１０が配置された内筒２０に外筒４０が装着された装着状態の場合、培養膜部１０は、外筒他端部４２の外筒開口部４６を塞ぐ。外筒４０は、外筒４０の外筒側壁４３を側面として、培養膜部１０を底面とする容器として機能する。図３に示すように、凸部４５は、内筒２０と当接する平滑面４５ａを有する。これにより、後に詳述するように、第２培養工程Ｐ６０において、外筒４０が容器として使用される場合、外筒４０に入れられた液体の漏れを抑制することができる。外筒他端部４２の内径は、平滑面４５ａとの境界部から内筒２０が位置する側（－Ｚ方向側）に向かうに従い、大きくなるように形成されている。これにより、培養膜部１０および内筒２０の外周面と、外筒他端部４２の内周面４３ａとの間に隙間が形成されるため、培養膜部１０が配置された内筒２０に外筒４０を装着し易くすることができる。

Ａ２．細胞培養容器を用いた細胞培養方法：
細胞培養容器１００を用いた細胞培養方法について説明する。図４は、細胞培養容器１００を用いた細胞の細胞培養方法の工程を示すフローチャートである。図５は、第１培養工程Ｐ２０における内筒２０の模式図である。図６は、第２培養工程Ｐ６０における細胞培養容器１００の模式図である。図５および図６には、細胞培養容器１００の使用態様における、Ｘ軸と、Ｙ軸と、Ｚ軸とが示されている。Ｚ方向は、鉛直方向を示し、ＸＹ平面は、水平面を示す。＋Ｚ方向を上、－Ｚ方向を下とも呼ぶ。

まず図４の工程Ｐ１０にて、培養膜部１０が接合され、液止めピン６０が装着された内筒２０が用意される。以下の説明では、特記しない限り、内筒２０とは、培養膜部１０が接合された内筒２０を指す。図４の第１培養工程Ｐ２０にて、図５に示ように、内筒一端部２１が内筒他端部２２の下方となるようにプレート５００上に配置された内筒２０に第１細胞懸濁液４０１が注入され、第１細胞４０２が培養される。第１細胞懸濁液４０１には、第１細胞４０２と、第１細胞４０２用の液体である第１培地４０３とが含まれている。第１細胞懸濁液４０１が注入されることにより、細胞培養膜１２に第１細胞４０２が播種される。プレート５００の内筒２０と対向する表面は、平滑である。これにより、培養膜部１０とプレート５００との間に隙間が生じにくくなり、内筒２０からの第１細胞懸濁液４０１の漏れを抑制することができる。さらに、プレート５００は、細胞接着性が低い材料で形成されている。これにより、第１細胞懸濁液４０１が内筒２０から漏れたとしても、細胞培養膜１２のプレート５００と対向する面での、第１細胞４０２の定着を抑制することができる。

図４の工程Ｐ３０にて、例えばピペットを用いて、内筒２０から第１細胞懸濁液４０１が吸い出され、内筒一端部２１が内筒他端部２２の上方となるように、内筒２０が反転される。工程Ｐ４０にて、内筒２０に外筒４０が装着され、内筒２０から液止めピン６０が取り外される。具体的には、液止めピン６０が装着された内筒２０の内筒一端部２１側から、外筒４０の凸部４５が培養膜部１０に当接するまで、外筒４０が内筒２０に嵌め込まれる。また、中心軸ＣＸ方向から視た場合、外筒凹部４４の位置が液止めピン６０の位置と重なるように、外筒４０が内筒２０に嵌め込まれる。この際、液止めピン６０のピン把持部６２は、内筒側壁２３の外方に位置するため、突出するピン把持部６２に外筒凹部４４が嵌るように、外筒４０は内筒２０に装着される。これにより、内筒２０の径方向から視て、内筒凹部２４と外筒凹部４４とが重なるように、外筒４０を内筒２０に装着することができる。内筒２０から液止めピン６０が取り外されることにより、内筒２０の内部と、外部とが、内筒凹部２４を介して連通する。

工程Ｐ５０にて、第１細胞４０２用の第１培地４０３が入れられたウェル５０１に、外筒４０が装着された内筒２０が入れられる。これにより、細胞培養膜１２の第１細胞４０２が定着している内筒２０側の面は、第１培地４０３に浸漬される。第２培養工程Ｐ６０にて、図６に示すように、外筒４０に第２細胞懸濁液４０４が入れられ、第２細胞４０５が培養される。具体的には、第２細胞懸濁液４０４が入れられることにより、第２細胞４０５が播種され、その後、時間の経過に伴い、細胞培養膜１２に第２細胞４０５が培養される。第２細胞懸濁液４０４には、第２細胞４０５と、第２細胞４０５用の液体である第２培地とが含まれている。第２細胞懸濁液４０４が注入されることにより、細胞培養膜１２に第２細胞４０５が播種される。内筒２０の内部と外部とは、内筒凹部２４および外筒凹部４４を介して連通しているため、内筒凹部２４および外筒凹部４４を介して第１培地４０３の残留空気を内筒２０の外部に排出することができる。これにより、第１細胞４０２の培養を良好に行うことができる。凸部４５は、平滑面４５ａを有するため、凸部４５と培養膜部１０における隙間の形成は低減され、外筒４０に入れられた第２細胞懸濁液４０４の漏れを抑制することができる。よって、第１培地４０３への第２細胞４０５の混入を抑制することができる。なお、第２細胞４０５の培養中、第２培地の交換が適宜行われてもよい。第２培地の交換の際には、ピペットなどの器具を用いて、外筒４０から第２細胞懸濁液４０４が吸い出される。この際、器具の先端を凸部４５上に位置させることにより、器具の先端が細胞培養膜１２に当たることによる細胞培養膜１２の損傷を抑制することができる。第２細胞４０５の培養が終了すると、本工程は終了する。

以上、説明した第１実施形態によれば、細胞培養容器１００は、内筒２０と、内筒凹部２４を塞ぐ液止めピン６０と、内筒側壁２３の内筒一端部２１に配置される培養膜部１０と、内筒２０に内筒一端部２１側から着脱可能に装着される外筒４０とを備える。よって、第１培養工程Ｐ２０においては、内筒２０を、第１細胞用の第１培地４０３を貯留するための容器として使用することができるため、ウェルに細胞培養容器１００を入れる手間や、ウェルから細胞培養容器１００を取り出す手間がなく、作業性を向上させることができる。また、第２培養工程Ｐ６０においては、外筒４０を、第２細胞用の第２培地を貯留するための容器として使用することができる。よって、細胞培養容器１００を用いて共培養を行うことができる。また、内筒２０は内筒凹部２４を備えるため、第２培養工程Ｐ６０において、第１培地４０３の残留空気を内筒凹部２４から排出することができる。

また、外筒４０は、内筒２０の径方向において、内筒凹部２４と重なる位置に、外筒凹部４４を有している。これにより、第２培養工程Ｐ６０において、内筒２０が第１培地４０３に浸漬された場合、第１培地４０３に残留する空気を、排出し易くすることができる。よって、培養を良好に行うことができる。また、凸部４５は、培養膜部１０と当接する平滑面４５ａを有している。これにより、第２培養工程Ｐ６０において、外筒４０に入れられた第２細胞懸濁液４０４の、凸部４５と培養膜部１０との隙間からの漏れを抑制することができる。また、培養膜部１０は、内筒一端部２１の端面２１ａを覆って配置される円環状の支持枠１１と、細胞培養膜１２とを有している。これにより、外力を支持枠１１で受けることができるため、内筒凹部２４にかかる応力を軽減し、細胞培養膜１２が受ける応力を軽減することができる。よって、細胞培養膜１２の破損や傷つきおよび第１細胞の損傷による品質低下を抑制することができる。

Ｂ．第２実施形態：
Ｂ１．治具の構成：
第２実施形態では、複数の細胞培養容器１００を用いて、細胞培養が行われる。図７は、内筒２０と共に示す液止め治具５１０および固定治具５２０の斜視図である。図８は、内筒２０と共に示す反転治具５３０の斜視図である。図９は、内筒２０と共に示す反転治具５３０の平面図である。図１０は、図９のＸ－Ｘ断面図である。第２実施形態に係る細胞培養容器１００では、第１実施形態に係る液止めピン６０に代えて、液止め治具５１０が用いられる。図７から図１０では、互いに直交する、Ｘ軸と、Ｙ軸と、Ｚ軸とを示している。Ｘ方向およびＹ方向は、固定治具５２０における内筒２０の配列方向である。Ｚ方向は、内筒２０の中心軸ＣＸ方向である。細胞培養容器１００は、典型的には、Ｚ方向が鉛直方向と沿うように配置されて使用される。以下では、＋Ｚ方向を上方向、－Ｚ方向を下方向として説明する場合がある。培養膜部１０、内筒２０、および外筒４０の構成は、第１実施形態と同様であるため、同じ符号を付し、詳細な説明は省略する。

本実施形態では、合計２４個の細胞培養容器１００が、図７に示すような４行、６列のマトリクス状に配列されて細胞培養が行われる場合を例示して説明する。なお、同時に細胞培養される細胞培養容器１００の数は、２４に限られない。

固定治具５２０は、載置された複数の内筒２０を固定し、第１細胞４０２を培養するための治具である。固定治具５２０は、複数の細胞培養容器１００が有する複数の内筒２０を同時に固定可能である。固定治具５２０は、樹脂材料または金属材料で形成されている。樹脂材料としては、ポリプロピレンや、ポリスチレンや、アクリル樹脂、等があげられる。金属材料としては、ステンレスや、チタンを挙げることができる。さらに、固定治具５２０は、医療機材に使用される金属であることが好ましい。医療機材に使用される金属として、チタンや、Ｔｉ－６Ａｌ－４Ｖ合金や、ステンレス鋼や、Ｃｏ－Ｃｒ合金などを挙げることができる。固定治具５２０は、底面部５２１と、２４つの固定凸部５２２とを有する。本実施形態では、底面部５２１は、矩形のプレートと、矩形のプレートの４つの辺から上方向に立設された４つの側面とを有する箱形状を有している。後述するように、第１細胞４０２の培養の際には、固定治具５２０の上方に図示しない蓋が被せられることにより、培養中のコンタミネーションを抑制することができる。底面部５２１のプレートは、第１実施形態に係るプレート５００と同様に、表面は平滑であり、表面の細胞接着性は低い。細胞接着性を低くする方法としては、例えば、ポリスチレンのような細胞接着性の低い材料を用いてプレートを形成する方法や、プレートを形成する樹脂の表面にポリエチレングリコールや、アガロースゲル、等の細胞接着性の低い材料をコーティングする方法などが挙げられる。固定凸部５２２は、円環の周方向の一部を欠くＣ字状の形状を有する。固定凸部５２２は、Ｙ方向に沿って、等間隔で配置されている。同様に、固定凸部５２２は、Ｘ方向に沿って、等間隔で配置されている。固定凸部５２２の内径は、内筒２０の外径よりも大きい。また、固定凸部５２２の開口部分は、液止め治具５１０の後述するピン本体５１１よりも大きい。これにより、固定凸部５２２の開口部分にピン本体５１１を配置して、液止め治具５１０が装着された複数の内筒２０を固定治具５２０に載置することができる。または、固定凸部５２２の開口部分に内筒凹部２４を配置して載置された内筒２０に、液止め治具５１０装着することができる。

液止め治具５１０は、複数の細胞培養容器１００が有する複数の内筒凹部２４に着脱可能に装着され、複数の内筒凹部２４を塞ぐ。液止め治具５１０は、６つのピン本体５１１と、連結板部５１２とを有する。ピン本体５１１は、第１実施形態に係るピン本体６１と同様の形状を有する。すなわち、ピン本体５１１の大きさは、内筒凹部２４の大きさよりも大きく、ピン本体５１１が弾性変形にて縮小されて内筒凹部２４に嵌められて装着される。６つのピン本体５１１は、装着される６つの内筒２０の内筒凹部２４の各々に対応して設けられている。具体的には、６つのピン本体５１１の間隔は、固定凸部５２２の配置される間隔と同じである。連結板部５１２は、内筒２０の配列方向であるＹ方向に長い平板形状を有し、内筒２０と対向する＋Ｘ方向側の面にて、６つのピン本体５１１を連結する。

図８に示す反転治具５３０は、弾性のある樹脂材料または金属材料で形成されている。樹脂材料としては、ポリエーテルケトンや、ポリプロピレンや、ポリスチレンや、アクリル樹脂、等が挙げられる。金属材料としては、ステンレスや、チタンなどを挙げることができる。金属材料は、医療機材に使用される金属であることが好ましい。医療機材に使用される金属として、チタンや、Ｔｉ－６Ａｌ－４Ｖ合金や、ステンレス鋼や、Ｃｏ－Ｃｒ合金などを挙げることができる。複数の細胞培養容器１００が有する複数の内筒２０を把持し、複数の内筒２０を同時に反転することができる治具である。反転治具５３０は、第１平板５３１と、第２平板５３２と、複数の第１半円部５３３と、複数の第２半円部５３４と、第１底面部５３５と、第２底面部５３６と、係止部５３７とを有する。第１平板５３１は、内筒２０の配列方向であるＹ方向に長い平板である。第１平板５３１は、幅方向が内筒２０の中心軸ＣＸ方向に沿うように、厚さ方向が内筒２０の径方向に沿うように配置されている。第１平板５３１の＋Ｙ方向における端部に第１平板凹部５３１ａが形成されている。第１平板凹部５３１ａは、第１平板５３１の＋Ｚ方向側の端面にＺ方向に沿って凹んで形成されている。第２平板５３２は、第１平板５３１と同様のＹ方向に長い平板である。第２平板５３２は、幅方向が内筒２０の中心軸ＣＸ方向に沿うように、厚さ方向が内筒２０の径方向に沿うように配置されている。第２平板５３２は、第１半円部５３３および第２半円部５３４を挟んで、内筒２０の径方向であるＸ方向において、第１平板５３１と対向する。図９に示すように、第１半円部５３３および第２半円部５３４は、内筒２０の外周を囲む円筒形状を、内筒２０の直径方向に沿って切断して形成される半円環形状を有する。複数の第１半円部５３３の第１平板５３１と接する－Ｘ方向側の端部は、第１平板５３１に接合されている。複数の第２半円部５３４の第２平板５３２と接する＋Ｘ方向側の端部は、第２平板５３２に接合されている。

第１底面部５３５および第２底面部５３６は、平板形状を有し、第１平板５３１と第２平板５３２とを連結する。第１底面部５３５は、第１平板５３１および第２平板５３２の－Ｙ方向端部に配置されている。第２底面部５３６は、第１平板５３１および第２平板５３２の＋Ｙ方向端部に配置されている。第１平板５３１は、第１底面部５３５および第２底面部５３６と固定されている。対して第２平板５３２は、第１底面部５３５および第２底面部５３６に対して、Ｙ方向に移動可能に取り付けられている。具体的には、図１０に示すように、第１底面部５３５の第２平板５３２が配置される面には、第２平板５３２の幅方向に沿って凹んだ第１底面溝５３５ａが形成されている。そして、第２平板５３２の幅方向である－Ｚ方向における端部は、第１底面溝５３５ａと嵌る凸形状に形成されている。図９に示すように、第１底面溝５３５ａは、第２平板５３２の長辺方向であるＹ方向に沿って形成されている。第２底面部５３６の第２平板５３２が配置される面にも、第１底面溝５３５ａと同様の第２底面溝５３６ａが形成されている。これにより、第２平板５３２は、第１底面溝５３５ａおよび第２底面溝５３６ａに案内されて、第１底面部５３５および第２底面部５３６に対して、Ｙ方向に移動することができる。ここで、図９に示すように、第１半円部５３３および第２半円部５３４の各々が、内筒２０と接するように配置された状態における、第１平板５３１に対する第２平板５３２の位置を固定位置と称する。対して、図８の実線にて示すように、第２半円部５３４が、内筒２０と離隔するように配置された状態における、第１平板５３１に対する第２平板５３２の位置を離隔位置と称する。

図９に示すように、係止部５３７は、第２平板５３２の＋Ｙ方向における端部に取り付けられている。係止部５３７は、移動可能な第２平板５３２を、第１平板５３１に対して固定するために用いられる。係止部５３７は、係止平板５３７ａと、係止凸部５３７ｂとを有する。係止平板５３７ａは、Ｘ方向に長い矩形平板である。係止平板５３７ａの＋Ｘ方向側の端部は、第２平板５３２の＋Ｚ方向における端部に軸支されている。これにより、係止部５３７は、係止平板５３７ａの＋Ｘ方向における端部を軸に回動可能である。係止凸部５３７ｂは、係止平板５３７ａの第１平板５３１に近い側の端部に、長辺方向に沿って突設されている。係止凸部５３７ｂは、第１平板凹部５３１ａと嵌る形状を有している。

複数の内筒２０を反転する場合、まず、図８の実線にて示すように、配置した場合、第２半円部５３４が内筒２０と離隔するように第２平板５３２が離隔位置に調整される。次に、第１半円部５３３と第２半円部５３４とが内筒２０を挟んで対向するように、反転治具５３０が複数の内筒２０に対して配置される。この際、Ｚ方向において、液止め治具５１０と内筒２０の内筒他端部２２との間の部分に第１半円部５３３および第２半円部５３４が位置するように反転治具５３０は配置される。次に、図８の破線にて示すように、第１半円部５３３および第２半円部５３４が、内筒２０と接する固定位置となるように、第２平板５３２は第１平板５３１に対して移動される。これにより、図９に示すように、内筒２０は、第１半円部５３３と第２半円部５３４とに挟まれて、把持される。次に、係止部５３７の係止凸部５３７ｂが第１平板５３１の第１平板凹部５３１ａに嵌められる。これにより、第２平板５３２の第１平板５３１に対する移動が制限される。次に、複数の内筒２０を把持している反転治具５３０の＋Ｚ方向端部が－Ｚ方向端部となるように、反転治具５３０が上下に反転される。これにより、複数の内筒２０は、同時に、上下に反転される。

Ｂ２．複数の細胞培養容器を用いた細胞培養方法：
第２実施形態では、第１実施形態と同様の工程により、細胞培養が行われる。よって、図４を用いて、本実施形態に係る複数の細胞培養容器１００を用いた細胞培養方法について説明し、各工程の詳細な説明は適宜省略する。

図４の工程Ｐ１０にて、液止めピン６０に代えて、液止め治具５１０が装着された複数の内筒２０が用意される。複数の内筒２０は、図７に示す固定治具５２０の固定凸部５２２に配置され、固定される。複数の内筒２０が固定治具５２０に配置されることで、複数の内筒２０を予め定められた間隔で固定することができる。これにより、予め定められた間隔でピン本体５１１が配置された液止め治具５１０を用いて、複数の内筒２０の内筒凹部２４を同時に塞ぐことができる。

図４の第１培養工程Ｐ２０にて、第１実施形態と同様に、内筒２０に第１細胞懸濁液４０１が注入され、第１細胞４０２が培養される。第１細胞懸濁液４０１が注入された後、固定治具５２０の上方は、図示しない蓋で覆われる。これにより、培養中のコンタミネーションが抑制される。

図４の工程Ｐ３０にて、内筒２０から第１細胞懸濁液４０１が吸い出され、内筒２０が反転される。反転の際には、図８に示す反転治具５３０が用いられる。反転治具５３０を用いることにより、個々の内筒２０を個別に反転するよりも効率的に、反転作業を行うことができる。

図４の工程Ｐ４０にて、内筒２０に外筒４０が装着され、内筒２０から液止め治具５１０が取り外される。工程Ｐ３０にて、内筒２０が反転された後、複数の内筒２０に、対応する複数の外筒４０が装着される。これにより、内筒２０と外筒４０とは一体化される。具体的には、複数の内筒２０は、反転治具５３０に把持された状態で、図示しない治具により把持された複数の外筒４０が装着される。外筒４０が装着された後、反転治具５３０の第２平板５３２が離隔位置に移動されて、内筒２０から反転治具５３０が取り外される。内筒２０から反転治具５３０が取り外された後、複数の内筒２０から液止め治具５１０が取り外される。

図４の工程Ｐ５０にて、第１細胞４０２用の第１培地４０３が入れられたウェル５０１（図６）に、外筒４０が装着された内筒２０が入れられる。工程Ｐ４０にて一体化された外筒４０と内筒２０とは、外筒４０が治具に把持されることにより、治具に把持されている状態で、ウェル５０１に入れられる。第２実施形態では、固定治具５２０における固定凸部５２２の配置態様と同様の配置態様で、複数のウェル５０１がプレートに配置された図示しないウェルプレートが用いられる。つまり、ウェルプレートには、固定治具５２０における固定凸部５２２の間隔と同じ間隔でウェル５０１が配置されている。このため、複数の一体化された外筒４０と内筒２０とを治具を用いて把持した状態で、同時にウェル５０１に入れることができる。これにより、一体化された外筒４０と内筒２０とをウェル５０１に入れる作業を個別に行うよりも効率的に、ウェル５０１に入れることができる。複数の外筒４０を把持する治具は、外筒４０の外筒一端部４１を把持することにより、複数の外筒４０を把持可能な治具である。なお、複数の外筒４０を把持する治具として、反転治具５３０と同様の治具が用いられてもよい。

図４の第２培養工程Ｐ６０にて、外筒４０に第２細胞懸濁液４０４が入れられ、第２細胞４０５が培養される。第２細胞４０５の培養が終了すると、本工程は終了する。

以上、説明した第２実施形態によれば、複数の内筒２０を同時に固定可能な固定治具５２０と、複数の内筒２０を同時に反転可能な反転治具５３０と、複数の前記内筒凹部２４に着脱可能に装着される液止め治具５１０とを用いて、共培養が行われる。よって、個々の細胞培養容器１００について、個別に作業を行うよりも、効率的に細胞培養を行うことができる。また、作業プロセスの簡略化と作業時間を短縮することにより、培養工程におけるコンタミネーションを抑制することができる。

Ｃ．他の実施形態：
（Ｃ１）上記第１実施形態では、第１培養工程Ｐ２０にて、内筒２０は、プレート５００に配置され、第２培養工程Ｐ６０では、細胞培養容器１００はウェル５０１に入れられる。これに対して、第１培養工程Ｐ２０にて、内筒２０をウェル５０１に入れてもよい。外筒４０は、第２細胞懸濁液４０４を入れる容器として機能し、ウェル５０１に第２細胞懸濁液４０４が入れられることはないため、ウェル５０１に入れられる液体は、第１細胞懸濁液４０１と第１培地４０３とのいずれかである。よって、同じウェル５０１を用いて、第１培養工程Ｐ２０および第２培養工程Ｐ６０を行うことも可能である。

（Ｃ２）上記実施形態では、内筒凹部２４は、内筒一端部２１の端面２１ａから中心軸ＣＸ方向に沿って、内筒一端部２１に切り欠きとして形成されている。これに対して、内筒凹部２４は、内筒一端部２１の端面２１ａから内筒他端部２２の端面まで中心軸ＣＸ方向において貫通するスリットとして形成されてもよい。

（Ｃ３）上記第２実施形態に係る反転治具５３０の第１半円部５３３および第２半円部５３４は、半円環形状を有する。第１半円部５３３および第２半円部５３４の形状は、半円環形状に限られず、例えば、半円環形状の一部分のみの形状としてもよい。第１半円部５３３と、第２半円部５３４とが、内筒２０を挟むことが可能な形状であれば、内筒２０を把持することができる。

本開示は、上述の実施形態に限られるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲において種々の構成で実現することができる。例えば、発明の概要の欄に記載した各形態中の技術的特徴に対応する実施形態の技術的特徴は、上述の課題の一部又は全部を解決するために、あるいは、上述の効果の一部又は全部を達成するために、適宜、差し替えや、組み合わせを行うことが可能である。また、その技術的特徴が本明細書中に必須なものとして説明されていなければ、適宜、削除することが可能である。

１０…培養膜部、１１…支持枠、１２…細胞培養膜、２０…内筒、２１…内筒一端部、２１ａ…端面、２２…内筒他端部、２３…内筒側壁、２４…内筒凹部、２４ａ…第１凹部面、２４ｂ…第２凹部面、２５…内筒開口部、４０…外筒、４１…外筒一端部、４２…外筒他端部、４３…外筒側壁、４４…外筒凹部、４５…凸部、４５ａ…平滑面、４６…外筒開口部、６０…液止めピン、６１，５１１…ピン本体、６２…ピン把持部、６２ａ…ピン凹部、１００…細胞培養容器、４０１…第１細胞懸濁液、４０２…第１細胞、４０３…第１培地、４０４…第２細胞懸濁液、４０５…第２細胞、５００…プレート、５０１…ウェル、５１０…液止め治具、５１２…連結板部、５２０…固定治具、５２１…底面部、５２２…固定凸部、５３０…反転治具、５３１…第１平板、５３１ａ…第１平板凹部、５３２…第２平板、５３３…第１半円部、５３４…第２半円部、５３５…第１底面部、５３５ａ…第１底面溝、５３６…第２底面部、５３６ａ…第２底面溝、５３７ｂ…係止凸部、５３７ａ…係止平板、５３７…係止部、ＣＸ…中心軸、Ｐ１０，Ｐ３０，Ｐ４０，Ｐ５０…工程、Ｐ２０…第１培養工程、Ｐ６０…第２培養工程

Claims (6)

1. 細胞培養容器であって、
   内筒一端部と、前記内筒一端部と対向する内筒他端部と、前記内筒一端部と前記内筒他端部とを繋ぐ筒状の内筒側壁と、前記内筒他端部に切り欠きとして形成された内筒凹部と、を有する内筒と、
   前記内筒凹部に着脱可能に装着され、前記内筒凹部を塞ぐ液止めピンと、
   前記内筒一端部に配置されて、前記内筒一端部に形成された内筒開口部を塞ぐ培養膜部と、
   前記内筒に前記内筒一端部側から前記内筒に着脱可能に装着される外筒であって、外筒一端部と、前記外筒一端部と対向する外筒他端部と、前記外筒一端部と前記外筒他端部とを繋ぐ筒状の外筒側壁とを有する外筒と、を備え、
   前記培養膜部は、前記外筒が前記内筒に装着された装着状態の場合に、前記外筒他端部の外筒開口部を塞ぐ、細胞培養容器。
2. 請求項１に記載の細胞培養容器であって、
   前記外筒は、さらに、
   前記装着状態の場合に、前記内筒の径方向において、前記内筒凹部と重なる位置に、前記外筒側壁の一部が切り欠きとして形成された外筒凹部を有する、細胞培養容器。
3. 請求項１または２に記載の細胞培養容器であって、
   前記外筒は、さらに、
   前記外筒側壁の内周面から突出し、前記装着状態の場合に、前記培養膜部と前記内筒の中心軸に沿った方向に向かい合って当接する凸部を有する、細胞培養容器。
4. 請求項３に記載の細胞培養容器であって、
   前記凸部は、前記培養膜部と当接する平滑面を有する、細胞培養容器。
5. 請求項１から４の何れか一項に記載の細胞培養容器であって、
   前記培養膜部は、さらに、
   前記内筒側壁の前記内筒一端部の端面を覆って配置される円環状の支持枠と、前記支持枠に接合される細胞培養膜とを有する、細胞培養容器。
6. 複数の細胞培養容器を用いた細胞培養方法であって、
   前記複数の細胞培養容器の各々は、
   内筒一端部と、前記内筒一端部と対向する内筒他端部と、前記内筒一端部と前記内筒他端部とを繋ぐ筒状の内筒側壁と、前記内筒他端部に切り欠きとして形成された内筒凹部と、を有する内筒と、
   前記内筒一端部に配置されて、前記内筒一端部に形成された内筒開口部を塞ぐ培養膜部と、
   前記内筒に前記内筒一端部側から前記内筒に着脱可能に装着される外筒であって、外筒一端部と、前記外筒一端部と対向する外筒他端部と、前記外筒一端部と前記外筒他端部とを繋ぐ筒状の外筒側壁とを有する外筒と、を備え、
   前記培養膜部は、前記外筒が前記内筒に装着された装着状態の場合に、前記外筒他端部の外筒開口部を塞ぎ、
   前記細胞培養方法は、
   前記複数の細胞培養容器が有する複数の前記内筒を同時に固定可能な固定治具と、
   前記複数の内筒を把持し、前記複数の内筒を同時に反転可能な反転治具と、
   前記複数の細胞培養容器が有する複数の前記内筒凹部に着脱可能に装着され、前記複数の内筒凹部を塞ぐ液止め治具と、を用いて共培養する細胞培養方法。

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