JP2021078397A

JP2021078397A - 脂質減少促進剤

Info

Publication number: JP2021078397A
Application number: JP2019208089A
Authority: JP
Inventors: ヌルシャフィカモハマドイシャク; Syafiqah Mohamad Ishak Nur; 池本　一人; Kazuto Ikemoto; 一人池本
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2021-05-27

Abstract

【課題】ＰＱＱを用いて、新規な脂質減少促進剤及びその製造方法、並びに脂質の減少促進方法を提供することを目的とする。【解決手段】ピロロキノリンキノン及び／又はその塩を有効成分として含む、脂質減少促進剤。【選択図】なし

Description

本発明は、新規な脂質減少促進剤及びその製造方法、当該脂質減少促進剤を含む組成物、及び脂質の減少促進方法に関する。

肥満は現代社会における最も重大な疾患の一つであるが、その主たる要因は脂肪の過剰摂取である。脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、肥満に起因してメタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化などの生活習慣病を発症させることが知られている。

肥満に対する治療薬としては、食欲抑制剤であるマジンドールや、リパーゼ阻害剤であるオルリスタットなどが使用されている。しかしながら、これらの医薬では、口渇、便秘、吐き気、不眠、頭痛及び動悸など、並びにオイルスポット、鼓腸、急な便意、排便の増加、便失禁、直腸からの漏れ、上部呼吸器感染及び脂肪便などの副作用がそれぞれ報告されており、必ずしも安全性は十分であるとは言えない。

肥満を予防するためには、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効な手段である。しかしながら、そのためには十分な栄養指導を受けなければならず、実質的に日常生活での実施は困難である場合が多い。そのため、十分な安全性を有し、且つ効率的に肥満を解消することのできる物質が強く求められている。

ところで、ピロロキノリンキノン（以下、「ＰＱＱ」ともいう。）は、多くの食品に含まれるビタミン様の物質である。（非特許文献１）。乳酸脱水素酵素に結合してその機能を向上させることが報告されている（非特許文献２）。

ＰＱＱはこれまでに脳機能の改善（特許文献１，２，３）に注目され、その応用がなされてきた。また、血糖値の改善効果も報告されている。

特開２０１９−０８８２０６号公報特開２０１４−０３７３８４号公報特開２０１２−０１９７３９号公報

EFSA Journal, Volume15, Issue11, November 2017, e05058 Scientific Reports volume 6, Article number: 26723 (2016) Environ Health Perspect. 2015;123(8):813−819.

しかしながら、このようなＰＱＱを肥満の解消のために使用することは知られておらず、また脂質減少促進剤として利用することはこれまでに報告されていない。また、ＰＱＱを生殖機能の改善のために使用することも知られておらず、生殖機能改善剤として利用することはこれまでに報告されていない。

本発明の目的は、肥満の解消に有用な物質として上記ＰＱＱを用い、安全で、且つ効率的に脂質の減少を促進することのできる新規な脂質減少促進剤及びその製造方法、当該脂質減少促進剤を含む組成物、及び脂質の減少促進方法を提供することにある。

また、本発明の他の目的は、生殖機能の改善に有用な物質として上記ＰＱＱを用い、新規な生殖機能改善剤を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、驚くべきことにＰＱＱ及び／又はその塩に脂質の減少を促進する作用があることを見出した。かかる知見に基づき、本発明者らは、さらに研究を重ねることによって本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下に示すとおりである。
〔１〕
ピロロキノリンキノン及び／又はその塩を有効成分として含む、脂質減少促進剤。
〔２〕
前記ピロロキノリンキノンの塩が、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩である、〔１〕に記載の剤。
〔３〕
運動強度３メッツ以上の運動をしているとき、または、前記運動の開始前１時間以内もしくは終了後１時間以内に摂取する、〔１〕又は〔２〕に記載の剤。
〔４〕
前記脂質減少促進が、体脂肪代謝促進である、〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の剤。
〔５〕
〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の剤を含む、組成物。
〔６〕
〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の剤を使用する、脂質の減少促進方法。
〔７〕
ピロロキノリンキノン及び／又はその塩を有効成分として含む、生殖機能改善剤。

本発明によれば、安全で、かつ効率的に脂質の減少を促進することのできる新規な脂質減少促進剤及びその製造方法、当該脂質減少促進剤を含む組成物、並びに、脂質の減少促進方法を提供することができる。

また、本発明によれば、新規な生殖機能改善剤を提供することもできる。

さらに、本発明で用いられるＰＱＱ及び／又はその塩は、国内では食品に指定されており、飲食品としても使用可能であることから、本発明の剤及び組成物は、ヒト等の動物に対して十分な安全性を有しているといえる。

実施例１〜３と比較例１〜３における、染色された脂肪の蛍光強度を示すグラフである。実施例１〜３と比較例１〜３における、オオミジンコの蛍光顕微鏡写真（ａ）と実体顕微鏡写真（ｂ）である。実施例１〜３と比較例１〜３における、オオミジンコの体長測定結果を示すグラフである。実施例４と比較例４における、オオミジンコの生存率を示すグラフである。実施例４と比較例４における、オオミジンコの卵の量を示すグラフである。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。なお、脂質減少促進剤を第１実施形態とし、生殖機能改善剤を第２実施形態とする。また、第１実施形態と第２実施形態を区別する必要ない箇所については、本実施形態という。

〔第１実施形態：脂質減少促進剤〕
本発明者らは、ＰＱＱの生理機能を研究する過程において、ＰＱＱを添加した条件下で微小甲殻類を生育して、ＰＱＱが脂質の減少を促進する作用を有することを見出した。すなわち、第１実施形態の脂質減少促進剤（以下、「第１実施形態の剤」ともいう。）はこの知見に基づくものであり、ピロロキノリンキノン及び／又はその塩を有効成分として含むものである。

本実施形態において用いられるＰＱＱとは、化学式１に記載される化学構造を有している化合物である。また、ＰＱＱは水溶液中では化学式２に示される構造を有することもある。

また、ＰＱＱの塩は上記カルボキシル基がアルカリ金属イオン等と塩を形成したものである。ＰＱＱの塩としては、特に制限されないが、たとえば、ナトリウムやカリウムなどのアルカリ金属塩（具体的には、ＰＱＱナトリウム、ＰＱＱカリウムなど）、カルシウムやマグネシウムなどのアルカリ土類金属塩（具体的には、ＰＱＱカルシウム、ＰＱＱマグネシウムなど）、ＰＱＱアルミニウム、ＰＱＱ亜鉛、ＰＱＱマンガン及びＰＱＱ鉄などを挙げることができる。このなかでもＰＱＱの塩は、好ましくはＰＱＱナトリウム、ＰＱＱカルシウムである。特にナトリウム塩はモノナトリウム、ジナトリウム、トリナトリウムを使用でき、特にピロロキノリンキノン二ナトリウムが入手しやすく使用しやすい。尚、本実施形態においてＰＱＱの塩は水和物であってもよい。

ＰＱＱ及びその塩は、それらの入手方法については特に限定されず、動物や植物に由来する天然のもの、或いは化学合成法や発酵法などにより得られるもののいずれであってもよい。得られるＰＱＱ及びその塩の純度及び製造コスト等に基づき、好適なＰＱＱ及びその塩の製造方法を適宜選択することができる。また、ＰＱＱ及びその塩としては、市販されているＰＱＱ及びその塩を使用することができる。そのような市販品としては、例えば、三菱瓦斯化学株式会社で製造又は販売されている商品が挙げられる。また、本実施形態では、発酵法を利用して細菌（ＰＱＱ菌等）を培養しながら得られたＰＱＱ又はＰＱＱを含む組成物（飲食品等）をそのまま、或いは加工して使用することもできる。

本明細書において、「脂質減少促進剤」とは、生体内における脂質の減少を促進する作用を有する剤を意味する。

本明細書において「脂質」とは、生体内に存在する水不溶性の物質の総称である。また、代謝対象である脂質は、常温で固体であってもよく、或いは液体であってもよいが、固体であることが好ましい。尚、常温とは、第十六改正日本薬局方の通則に従い、通常１５〜２５℃であることを示す。脂質には、例えば、単純脂質（中性脂肪など）、複合脂質（リン脂質、糖脂質など）、誘導脂質（脂肪酸、コレステロールなど）などが含まれる。これらのうち第１実施形態で対象とされる脂質としては、単純脂質が好ましく、その中でも中性脂肪がより好ましく、最も好ましくはトリアシルグリセロール（トリグリセリド）である。

本明細書において脂質の「減少代謝」とは、主に脂質を分解することを示すが、脂質の量を減少することができる限り、特にこれに限定されるわけではない。
本発明において、「脂質代謝促進」には、生体内の脂質を減少する（「脂質代謝促進」又は「脂質の燃焼」と称する場合もある）概念と、体外より摂取される脂質を低減するなどして生体内への脂質の蓄積を抑制する概念と、が包含される。

第１実施形態における脂肪減少は、脂質を分解して生体内の脂質を減少する脂質代謝促進であることが好ましい。また、脂質は、生体内の場所に応じて、体脂肪（皮下脂肪、内臓脂肪など）及び血中脂質などが例示されるが、好ましくは体脂肪を分解して生体内の体脂肪を減少する体脂肪代謝促進であることが好ましい。さらに、脂質の化合物種の観点からは、第１実施形態における脂肪減少は、中性脂肪代謝促進であることが好ましい。

第１実施形態の剤は、脂質減少促進作用を通じて、肥満（「肥満症」とも称する）の予防及び治療、肝臓脂肪減少促進、体脂肪減少促進等のための食品又は医薬品として有用である。さらに、第１実施形態の剤は、肥満に起因して発症する疾患の予防及び治療のための食品又は医薬品としても有用である。そのような疾患としては、特に限定されないが、例えば、メタボリックシンドローム、脂肪肝、糖尿病（２型糖尿病を含む）、高脂血症、高血圧症、動脈硬化症などが挙げられる。

第１実施形態の剤は、運動と併用することが好ましい。より具体的には、運動強度３メッツ以上の運動をしているとき、または、その運動の開始前１時間以内もしくは終了後１時間以内に摂取することが好ましい。このようなタイミングで、第１実施形態の剤を投与又は摂取することにより、運動による脂質代謝をより効率的に促進することができる。

「メッツ」は運動強度を示す単位であり、ある身体活動時のエネルギー消費量が、安静時エネルギー消費量の何倍にあたるかを指数化したものである。メッツは、安静状態を維持するために必要な酸素量（酸素必要量）を性別や体重に関わらず３．５ｍｌ／ｋｇ／分を１単位とする。特に制限されないが、例えば、座って安静にしている状態が１メッツ、普通の歩行が３メッツに相当し、３メッツの強度が中強度とされる。なお、第１実施形態において、剤と併用される運動の種類は、運動強度３メッツ以上の身体活動であれば、特に制限されない。

〔第２実施形態：生殖機能改善剤〕
本発明者らは、ＰＱＱの生理機能を研究する過程において、ＰＱＱを添加した条件下で微小甲殻類を生育して、ＰＱＱが生殖機能を改善する作用を有することを見出した。すなわち、第２実施形態の生殖機能改善剤（以下、「第２実施形態の剤」ともいう。）はこの知見に基づくものであり、ピロロキノリンキノン及び／又はその塩を有効成分として含むものである。

なお、第２実施形態の剤で用いるピロロキノリンキノン及び／又はその塩は、第１実施形態で説明したものと同様とする。

本明細書において、「生殖機能改善剤」とは、生体の生殖機能を改善する作用を有する剤を意味する。

本明細書において、「生殖機能」とは、種を維持するために新しい個体をつくる機能であり、卵巣に関する機能など雌に備わる生殖機能と、精巣に関する機能など雄に備わる生殖機能とが含まれる。このなかで、第２実施形態の剤の対象となる生殖機能としては、雌に備わる生殖機能が好ましく、卵巣における卵子の生産や卵子の成熟に関する生殖機能が好ましい。

本明細書において生殖機能の「改善」とは、機能の向上に当たるものであれば特に制限されないが、例えば、卵巣において生産される卵子のうち、成熟卵子数の増加などが挙げられる。

〔使用態様〕
本実施形態の剤は、脂質の減少促進あるいは生殖機能の改善に用いる方法であれば特に制限されず、例えば、ヒト用又は動物用の、食品、機能性食品、医薬品又は医薬部外品として使用することができる。ここでいう機能性食品とは、健康食品、栄養補助食品、栄養機能食品、栄養保険食品等、健康の維持あるいは食事にかわり栄養補給の目的で摂取する食品を意味する。具体的な形態としてはカプセル剤、タブレット、チュアブル、錠剤、ドリンク剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

医薬品用途としては、本実施形態の剤は、経口投与、注射、点滴、皮膚吸収等の方法で使用することができる。経口投与の場合、本実施形態の剤はハードカプセル、ソフトカプセル、錠剤の形で他の物質と混合して用いることができる。また、本実施形態の剤は、飲料、点滴液、注射液として使用することもできる。

このなかで、本実施形態の剤は、飲料、ソフトカプセル、または錠剤として、経口で摂取する態様が好ましい。

本実施形態の剤は、医薬及び食品などとして有用であり、その適用対象は哺乳動物であり得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物又は家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられるが、本実施形態ではヒトが好ましい。尚、ヒト以外の哺乳動物に適用する場合、本実施形態の剤の投与量（摂取量）は、動物の体重又は大きさに応じて適宜加減すればよい。

〔組成物〕
本実施形態の剤は、製剤上の必要に応じて、薬学的に許容される担体を適宜用いて常法により製剤化し、組成物とすることができる（以下、「本実施形態の組成物」と称する）。これにより、本実施形態の組成物は、本実施形態の剤を含有しているということができる。本実施形態の組成物は、本実施形態の剤を含むことから、本実施形態の剤により発揮される効果をすべて有することができる。すなわち、本実施形態の組成物は、脂質減少促進作用や生殖機能改善作用を有する。ここで、「脂質減少促進」及び「生殖機能改善」とは、上記したとおりである。

上記担体は、製剤（組成物）の剤形により適宜選択することができ、特に限定されないが、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶剤、安定化剤、溶解補助剤、酸化防止剤、着色剤、着香剤、甘味剤等の添加剤が挙げられる。

賦形剤としては、特に制限されないが、例えば、糖類（白糖、乳糖、ブドウ糖、マンニトール等）、デンプン（コーンスターチ等）、結晶セルロース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。

結合剤としては、特に制限されないが、例えば、α化デンプン、ゼラチン、トラガントガム、アラビアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。

滑沢剤としては、特に制限されないが、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。

崩壊剤としては、特に制限されないが、例えば、デンプン、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、寒天、クエン酸カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、デキストリンなどが挙げられる。

溶剤としては、特に制限されないが、例えば、水、エタノール、グリセロール、生理食塩水、大豆油などが挙げられる。

安定化剤としては、特に制限されないが、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エチル、プロピレングルコールなどが挙げられる。

溶解補助剤としては、特に制限されないが、例えば、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸などが挙げられる。

酸化防止剤としては、特に制限されないが、例えば、アスコルビン酸、トコフェロール、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸などが挙げられる。

着色剤、着香剤、及び甘味剤としては、医薬及び食品分野において通常添加することが許容されているものがそれぞれ挙げられる。

本実施形態の組成物におけるＰＱＱ及び／又はその塩の含有量は、本実施形態の組成物の全重量に対し、好ましくは０．１０〜９９．９９質量％であり、より好ましくは０．６０〜９９．９０質量％であり、さらに好ましくは１．００〜９９．９０質量％である。本実施形態の剤におけるＰＱＱ及び／又はその塩の含有量はその物質の重量として取り扱う。したがって、ＰＱＱの塩をＰＱＱの遊離体（フリー体）に換算する必要はなく、また、ＰＱＱの塩が水和物を形成している場合は、水分子を含んだ形で重量を算出するものとする。

本実施形態の組成物は、医薬（即ち、医薬組成物）として使用することができる。この場合、本実施形態の医薬組成物は、肥満症に関連する疾患の予防又は治療薬として取り扱うことが可能であり、かかる疾患は上述したとおりである。また、本実施形態の組成物は、生殖機能改善に関する治療薬として取り扱うことも可能である。

本実施形態の医薬組成物の投与方法としては、特に限定されるものではなく、一般に経口投与による投与方法が挙げられるが、対象患者の状態、重症度等に応じて、非経口投与（血管内（静脈内、動脈内）投与、皮下投与、経皮投与、直腸内投与等）を適宜選択してもよい。有効成分であるＰＱＱ及び／又はその塩はいずれも飲食可能であることから、本実施形態では経口投与を採用することが好ましい。

本実施形態の医薬組成物の剤形は、特に限定されず、投与方法に適した形態にすることができる。経口投与に適した形態としては、例えば、錠剤、ロゼンジ、硬質又は軟質カプセル、水性又は油性懸濁液、乳液、分散性粉末又は顆粒、シロップ又はエリキシルなどが挙げられる。非経口投与に適した形態としては、例えば、非経口注射に適した形態として、静脈内、皮下、筋肉内、血管内又は注入投与のための滅菌溶液、懸濁液、乳液などが、経皮投与に適した形態として、クリーム、軟膏、ゲル、水性又は油性の液剤（懸濁液を含む）などが挙げられる。

本実施形態の組成物はまた、飲食品（即ち、飲食品組成物）として使用することもできる。この場合、本実施形態の飲食品組成物は、上述した薬学的に許容される担体に加えて、飲食品の分野において通常使用される担体を用いて常法により製剤化することができる。

本実施形態における飲食品は、飲食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、消費者庁に規定されている特別用途食品（特定保健用食品、病者用食品、えん下困難者用食品など）や栄養機能食品をも含むものであり、さらにサプリメント、飼料等も本実施形態の飲食品に包含される。

本実施形態の飲食品組成物は、その剤形は特に限定されず、細粒剤、顆粒剤、丸剤、錠剤（コーティング錠、糖衣錠を含む）、カプセル剤（ハードカプセル、ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、飲料、ドリンク剤、液剤（シロップ剤、乳剤、懸濁剤を含む）、粉末食品、ゼリー、飴等の剤形とすることができる。

本実施形態の剤及び組成物の投与量（摂取量）は、特に限定されず、体内において脂質減少促進作用や生殖機能改善作用が発現することができる有効量の範囲内であればよく、対象の個人差、症状、投与方法等に応じて適宜設定することができる。また、１日あたりの投与量（摂取量）は、一度にもしくは数回（例えば、２、３回）に分けて投与（摂取）することができる。本実施形態の剤及び組成物の投与（摂取）は、食前、食後及び食間を問わず、またその期間は、本実施形態の効果が奏される限りにおいて特に限定されない。以下、本明細書において用語「投与」が使用される場合は、該用語は「摂取」の概念も包含することを意味する。

上述したとおり、ＰＱＱ及び／又はその塩は別個の製剤に製剤化することができ、その場合、本実施形態において両製剤は併用されることができる。ＰＱＱ及び／又はその塩及びカフェインは同時に投与されてもよく、或いはいずれかの順序で逐次的に投与されることもできる。

本実施形態の剤及び組成物を使用する場合はまた、脂質減少促進作用や生殖機能改善作用を有する既存の成分と併用することも可能である。そのような場合、本実施形態の剤及び組成物と上記既存の成分とを投与する順序は、同時又は別々であってもよい。別々の場合、本実施形態の剤及び組成物の投与は、上記既存の成分の前又は後のいずれでもよい。

脂質減少促進作用に関する既存の成分としては、特に制限されないが、例えば、茶抽出物、カカオ抽出物、コーヒー豆マンノオリゴ糖、りんご由来プロシアニジン、糖転移ヘスペリジン、レスベラトロール、グリーンシトラスエキス、シトラスナリジニン、グルコサミン、キノコキトサン、キトサン、ジアシルグリセロール、中鎖脂肪酸、ＥＰＡ、ＤＨＡ、大豆蛋白、植物ステロール（β−シトステロール等）、サイリウム種皮由来食物繊維、低分子化アルギン酸ナトリウム、ガラナ、ショウキョウ、ガルシニア、グロビン蛋白分解物、カルニチン、α−リポ酸、植物スタノールエステル、リン脂質結合大豆ペプチド又はこれらの組み合わせ等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。

本実施例で用いるピロロキノリンキノン二ナトリウム塩は、三菱瓦斯化学製ＢｉｏＰＱＱ（以下、「ＰＱＱ」ともいう。）を使用した。また、その他の化合物については、特に断りのない限り和光純薬工業株式会社製の試薬を使用した。

本実施例では、脂質減少促進試験にオオミジンコ（学名：Daphnia magna）を使用した。オオミジンコの餌となるクロレラ(学名：Chlorella vulgaris)は有限会社日海センターの製品を使用した。具体的には、親のオオミジンコを、ライト条件８時間、暗条件１６時間を一日のサイクルとして、水温２２度の水槽中で育成した。餌となるクロレラは、月、水、金曜日に８×１０⁷個を与えた。水槽の飼育水は一週間に一回の頻度で交換した。そして、このような飼育条件下において、親のオオミジンコから生まれた子のオオミジンコを以下の実施例において用いた。

〔実施例１〕高い餌濃度−ＰＱＱ存在下での飼育
子のオオミジンコ２０匹を、ライト条件８時間、暗条件１６時間を一日のサイクルとして、５００ｍＬのミネラル水（水温２２度）で飼育した。餌となるクロレラは、オオミジンコ一匹当たり、８×１０⁵〜９×１０⁵個／日となるように、毎日与えた。飼育開始から４８時間後（２日後）に、濃度１５ｍｇ／Ｌとなるように、飼育水にピロロキノリンキノン二ナトリウムを添加し、引き続き餌となるクロレラもオオミジンコ一匹当たり８×１０⁵〜９×１０⁵個／日与え続けた。飼育水にピロロキノリンキノン二ナトリウムを添加し始めてから４日後、ナイルレッドを使用してオオミジンコの脂肪を染色した。

〔比較例１〕高い餌濃度−ＰＱＱなし条件下での飼育
子のオオミジンコ２０匹を、ライト条件８時間、暗条件１６時間を一日のサイクルとして、５００ｍＬのミネラル水（水温２２度）で飼育した。餌となるクロレラは、オオミジンコ一匹当たり、８×１０⁵〜９×１０⁵個／日となるように、毎日与えた。飼育開始から６日後、ナイルレッドを使用して脂肪を染色した。

〔実施例２〕
餌となるクロレラを、オオミジンコ一匹当たり、２×１０⁵個／日となるように、毎日与えたこと以外は、実施例１と同様にしてオオミジンコを飼育し、ナイルレッドを使用してオオミジンコの脂肪を染色した。

〔比較例２〕
餌となるクロレラを、オオミジンコ一匹当たり、２×１０⁵個／日となるように、毎日与えたこと以外は、比較例１と同様にしてオオミジンコを飼育し、ナイルレッドを使用してオオミジンコの脂肪を染色した。

〔実施例３〕
餌となるクロレラを、オオミジンコ一匹当たり、４×１０⁴個／日となるように、毎日与えたこと以外は、実施例１と同様にしてオオミジンコを飼育し、ナイルレッドを使用してオオミジンコの脂肪を染色した。

〔比較例３〕
餌となるクロレラを、オオミジンコ一匹当たり、４×１０⁴個／日となるように、毎日与えたこと以外は、比較例１と同様にしてオオミジンコを飼育し、ナイルレッドを使用してオオミジンコの脂肪を染色した。

〔脂肪量の測定〕
非特許文献３に準じて脂肪量の測定をした。実施例１〜３及び比較例１〜３で飼育したオオミジンコを、ナイルレッド０．５ｍｇ／Ｌを含む水溶液２ｍＬに加え、２時間処理した。その後、水洗いをして各オオミジンコを取り出した。そして、オオミジンコ一匹当たり３００μＬの水を加え、１５分超音波を当てることにより粉砕した。粉砕液を遠心分離して上澄みを取り出した。これをプレートリーダーにより４８５ｎｍ励起／５３５ｎｍ検出により蛍光強度を測定した。この測定作業をオオミジンコ２０匹に対して行った。その結果を図１に示す。

図１に示すように、餌の量にかかわらず、飼育途中からＰＱＱを添加した飼育水を用いて飼育したオオミジンコの脂肪量は低い値であることが分かった。特に、高程度の餌の量（実施例１、比較例１）と中程度の餌の量（実施例２、比較例２）では、ＰＱＱの添加により脂肪量が優位に減少していた。

また、ＰＱＱの添加が脂肪減少に関与していることを確かめるために、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｔ検定を行った。具体的には、ＰＱＱを添加して育てたオオミジンコの脂肪量と、同量の餌量でＰＱＱを添加せずに育てたオオミジンコの脂肪量とに差がないという帰無仮説を設定し、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｔ検定を行った。その結果、実施例１と比較例１、実施例２と比較例２、実施例３と比較例３のいずれの場合においても、ｐ＜０．０５となり、ＰＱＱを添加せずに育てたオオミジンコに対して、ＰＱＱを添加して育てたオオミジンコの脂肪量減少には、統計的に有意な差がみられることが確認された。なお、図１中の「Ｎ．Ｓ．」は、ｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔの略であり、「＊」は０．０１≦ｐ＜０．０５であることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１であることを示す。以上の結果より、ＰＱＱは体内の脂肪を分解する、即ち、体脂肪の減少作用を有することが示唆された。

なお、上記試験においてオオミジンコは常に運動をしている状態であり、ヒトの運動強度に例えると３メッツ以上の運動をしている状態と考えられる。

〔蛍光顕微鏡写真〕
実施例１〜３と比較例１〜３で飼育したオオミジンコの蛍光顕微鏡写真を図２に示す。なお、図２（ａ）と（ｂ）は同じ視野の顕微鏡写真であって、図２（ａ）は、ナイルレッドによる蛍光を撮影した蛍光顕微鏡写真であり、図２（ｂ）は、通常の顕微鏡写真である。図２に示されるように、餌の量が多くなるにつれ、オオミジンコの個体の大きさが大きく、蓄えられる脂肪量も多くなることが分かる。また、図２（ａ）と（ｂ）の対比から、餌の量が同一である場合には、ＰＱＱを添加して育てたオオミジンコの方が染色される脂肪量は少なくなることが分かる。この顕微鏡写真から得られた結果は、上記プレートリーダーの結果と同様であった。

〔体長測定〕
実施例１〜３比較例１〜３で飼育したオオミジンコの体長測定を行った。その結果を図３に示す。また、オオミジンコの体長においてもＰＱＱの添加が関与しているか否かを確かめるために、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｔ検定を行った。その結果、体長に関してはＰＱＱ添加の有無にかかわらず、有意差は存在しないことが分かった（ｐ＞０．０５）。図３中の「Ｎ．Ｓ．」は、ｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔの略である。また、ＰＱＱによってオオミジンコの体長に有害な影響は確認されなかった。

〔ＰＱＱ添加有無による生存率と卵の量〕
オオミジンコの産卵する卵の量は個体の健康状態と比例する。そこで、オオミジンコの生存率と卵の量を測定した。

〔実施例４〕
子のオオミジンコを一匹ずつ、ライト条件８時間、暗条件１６時間を一日のサイクルとして、５０ｍＬのミネラル水（水温２２度）で飼育した。飼育開始から７日間は、餌となるクロレラを、オオミジンコ一匹当たり、１×１０⁵個／日となるように、毎日与えた。そして、飼育開始から８〜１４日間は、クロレラの量を、オオミジンコ一匹当たり、５×１０⁵個／日に増やして、毎日与えた。また、飼育開始から８〜１４日間は、濃度１．５ｍｇ／Ｌとなるように、飼育水にピロロキノリンキノン二ナトリウムも添加した。なお、飼育水の交換は、週３回行った。

〔比較例４〕
飼育開始から８〜１４日間において、飼育水にピロロキノリンキノン二ナトリウムを添加しなかったこと以外は、実施例４と同様の条件でオオミジンコを育てた。

実施例４及び比較例４の条件でオオミジンコを１４日間飼育し、オオミジンコの生存と卵の数を確認した。オオミジンコの生存を図４に示し、卵の数を図５に示す。図４に示すように、ＰＱＱ添加の有無にかかわらずオオミジンコの生存率は１００％であった。また、図５に示すように、ＰＱＱを添加した飼育水で飼育されたオオミジンコの方が、卵の数が多くなることが分かった。このことから、ＰＱＱを添加した飼育水で飼育されたオオミジンコの固体はより健康な状態であることが分かる。また、オオミジンコの健康状態においてもＰＱＱの添加が関与しているか否かを確かめるために、Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｔ検定を行った。その結果、ＰＱＱを添加せずに育てたオオミジンコに対して、ＰＱＱを添加して育てたオオミジンコの健康状態の向上には、統計的に有意な差がみられることが確認された。図５中の「＊＊」はｐ＜０．０１であることを示す。また、図５中の1st brood 及び2nd broodは、それぞれ一回目と二回目の産卵を意味する。

また、上記試験において、ＰＱＱを添加した飼育水で飼育されたオオミジンコの卵の数が有意に増えていることから、ＰＱＱには生殖機能の改善効果があることも分かった。

（実施例５）肥満関連遺伝子解析
脂質減少促進の予想されているメカニズムとしてはミトコンドリアを豊富に新生し、ミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）の高発現により熱産生を行い、脂肪を分解するというものである。ＵＣＰ１は主に褐色脂肪細胞に存在し、ミトコンドリア内での脂肪燃焼（熱産生）に必要なタンパク質である。本検討では、オオミジンコを用いてＰＱＱの影響によるＵｃｐ１の発現変化を調べた。

遺伝子発現を測定するリアルタイムＰＣＲ実験のため、ターゲット遺伝子（Ｕｃｐ１）のプライマー配列を設計した。ホモサピエンスのＵＣＰ１タンパク配列はNational Center for Biotechnology Information (NCBI)のウェブサイトから収得した。その配列を利用してオオミジンコのゲノムデータベース（wFleaBase: Daphnia Water Flea Genome Database）でミジンコにあるＵｃｐ１遺伝子を検索した。表１に記載した配列はPCR primer design tool （https://www.eurofinsgenomics.eu/en/ecom/tools/pcr-primer-design/）を使ってオオミジンコのＵｃｐ１遺伝子に対応したプライマーの配列である。Ｂ−ａｃｔｉｎ遺伝子はリアルタイムＰＣＲ分析の内部参照遺伝子として利用した。

ＲＮＡ抽出サンプル：
ＰＱＱ存在下での飼育とＰＱＱなし条件下での飼育（コントロール）を行った。ＰＱＱ存在下での飼育では子のオオミジンコ１０匹を、ライト条件８時間、暗条件１６時間を一日のサイクルとして、３００ｍＬのミネラル水（水温２２度）で飼育した。餌となるクロレラは、オオミジンコ一匹当たり、１×１０⁶個／日となるように、毎日与えた。７日後に、濃度２０ｍｇ／Ｌとなるように、飼育水にＰＱＱを添加し、引き続き餌となるクロレラもオオミジンコ一匹当たり１×１０⁶個／日与え続けた。飼育水にＰＱＱを添加し始めてから３日後、１匹ずつ２ｍＬチューブ移し、水を抜いた。ＴｏｔａｌＲＮＡ抽出実験まで−８０℃に保存した。

ＰＱＱなし条件下では子のオオミジンコ１０匹を、ライト条件８時間、暗条件１６時間を一日のサイクルとして３００ｍＬのミネラル水（水温２２度）で飼育した。餌となるクロレラは、オオミジンコ一匹当たり、１×１０⁶個／日となるように、毎日与えた。飼育開始から１０日後、ナイルレッドを使用して脂肪を染色した。１匹ずつ２ｍＬチューブ移し、水を抜いた。ＴｏｔａｌＲＮＡ抽出実験まで−８０℃に保存した。

ＰＱＱなし条件下で飼育したオオミジンコ（コントロール）とＰＱＱ存在下で飼育したオオミジンコの３つのサンプルからＲＮＡをそれぞれ抽出した。サンプルを入れた２ｍＬチューブに１ｍＬ Sepasol-RNA I Super G（ナカライ）を加え、プラスチックのホモジナイザーペッスルでオオミジンコをつぶした。室温で５分間を放置した後、２００ｕＬフェノールクロロホルムイソアミルアルコール（ナカライ）を加え、３０秒間激しく振盪して混和した。室温で３分間放置した後、遠心（12,000×g，15分間，4°C）して上清を新しいチューブに移した。上清に対して、上清と同じ容量のイソプロパノールを加えてゆっくりで混和した。室温で１０分間放置した後、さらに遠心（12,000×g，5分間，4°C）して上清を除去し、沈殿したＲＮＡを得た。ＲＮＡの沈殿物は７０％エタノール１ｍＬで洗い、もう一度遠心（12,000×g，5分間，4°C）して上清を除去した。数分ＲＮＡを風乾して２５μＬ純水（RNAse-free water）で懸濁した。各サンプルにはオオミジンコ１匹から得られたＴｏｔａｌＲＮＡ２〜６ｕｇが含まれていた。各サンプルよりＲＮＡ１０〜５０ｎｇを用い、１ステップリアルタイムＰＣＲを行った。

遺伝子発現を測定するため、One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit II (タカラバイオ（株）)のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ専用キットを利用した。プライマーセットを使ってＵｃｐ１の発現量を測定した。ＰＣＲ反応（ｎ＝２）はキットマニュアル通りに実施し、反応チューブを軽く遠心後、Thermal Cycler Dice Real Time System (タカラバイオ（株）)にセットし、下記の反応条件を行った。
・Pattern 1：逆転写反応（Ｈｏｌｄ；４２℃ ５分→９５℃ １０秒）
・Pattern 2：ＰＣＲ反応（４０Ｃｙｃｌｅｓ；９５℃ ５秒→６０℃ ３０秒）
・Pattern 3：Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ

遺伝子発現解析においてＣｔ値はＲＴ−ＰＣＲから求めて２^-ΔΔ^CT法により遺伝子発現相対比を計算した。結果、Ｂ−ａｃｔｉｎを参照遺伝子として設定すると、ＰＱＱを与えたサンプルにはコントロールと比較して目的遺伝子Ｕｃｐ１の発現量が１．２５倍増加した（ｐ−ｖａｌｕｅ＝０．３）。ＰＱＱがオオミジンコのＵｃｐ１発現増加を行うことと考えられる。

〔実施例６〕脂質取り込みへの影響評価
体脂肪の蓄積は脂肪の取り込みを阻害することによっても防ぐことができる。脂質は体に取り込まれるとき、体内の酵素（リパーゼ）によって分解される。そのため、ＰＱＱがリパーゼの阻害作用を有しているのであれば、ＰＱＱは体内への脂肪の取り込みを抑制していると推察される。そこでＰＱＱを使用してリパーゼ阻害試験を行った。

試験には、リパーゼ（豚膵臓由来：東京化成ＲＮ＝９００２−６２−１）を使用した。ＳＢバイオサイエンス製のリパーゼキットＳを使用して実験した。以下、溶液名、プロトコールはキットのスケール１／２でリパーゼと試験サンプルの混合を評価する方法にモディファイした。

リン酸バッファー（ＰＢＳ：ＧＩＢＣＯ製ｐＨ７．２）を使用し、ＰＱＱを所定量溶かし、試験液を調製した。リパーゼ１０ｍｇ／Ｌ水溶液４０μＬと試験液２５μＬを混合し、さらに、発色液５００μＬエラスターゼ阻害剤１０μＬを混合した。３０℃５分処理したのち、基質液５０μＬ加えた。これを３０分間インキュベートした。阻害液１ｍＬをさらに加え、吸光度４１２ｎｍで測定した。盲検としてリパーゼと試験液を阻害液投入後に加えるものを準備した。試験液をＰＱＱなし（ＰＢＳ）のみの吸光度を１００％として酵素活性を評価した。

以上の結果から、ＰＱＱにより酵素反応の阻害は見られなかった。また、高濃度のＰＱＱを使用した場合においても盲検では３%の影響で測定への影響はほとんどないことが分かった。この試験により、ＰＱＱのリパーゼ阻害活性は確認されず、ＰＱＱが直接的に脂肪吸収を阻害しているとは考えられないことが分かった。

（実施例７）運動能力評価
実施例５で記載したＰＱＱなし条件下で飼育したオオミジンコ（コントロール）とＰＱＱ存在下で飼育したオオミジンコを利用した。二つの１００ｍｍプラスチックシャーレに１５ｍＬのミネラルウォーターをそれぞれを入れ、そこにそれぞれのＰＱＱなし条件下で飼育したオオミジンコ（コントロール）とＰＱＱ存在下で飼育したオオミジンコを１匹ずつ移した。シャーレは隣同士に置き、１分間のミジンコの動きを録画した。これを違う個体を用いて３回繰り返した。そしてＫｉｎｏｖｅａ動画分析ソフトを用いてミジンコの３０秒間移動距離を分析した。

上記のとおり、ＰＱＱ摂取によりオオミジンコの運動量の減少は見られず、寧ろＰＱＱ摂取により約１．２倍の運動量の向上が認められた。これによれば、ＰＱＱ摂取によってオオミジンコの運動機能が向上した可能性がある。また、脂肪減少は運動量が増えた影響と代謝活性の複合的な効果とも考えられる。なお、オオミジンコの動き自体は通常の運動であり、ヒトでいうところの通常の歩行と見做せるものと考えられる。

本発明の剤は、脂質の減少促進剤あるいは生殖機能の改善剤として、産業上の利用可能性を有する。

Claims

ピロロキノリンキノン及び／又はその塩を有効成分として含む、脂質減少促進剤。
前記ピロロキノリンキノンの塩が、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩である、請求項１に記載の剤。
運動強度３メッツ以上の運動をしているとき、または、前記運動の開始前１時間以内もしくは終了後１時間以内に摂取する、請求項１又は２に記載の剤。
前記脂質減少促進が、体脂肪代謝促進である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の剤。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の剤を含む、組成物。
請求項１〜４のいずれか一項に記載の剤を使用する、脂質の減少促進方法。
ピロロキノリンキノン及び／又はその塩を有効成分として含む、生殖機能改善剤。