JP2020130167A - Protein expression method and protein expression vector - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
Description
本発明は、タンパク質の発現方法およびタンパク質発現用ベクターに関する。 The present invention relates to a protein expression method and a protein expression vector.
組換えタンパク質の発現において、発現した組換えタンパク質が不溶性画分に凝集してしまうことがある。例えば封入体などの不溶化状態では組換えタンパク質の本来の機能は得られないため、組換えタンパク質を可溶性タンパク質として回収するために、形質転換体の培養温度や培養時間などの検討が行われる。それでも可溶化しない組換えタンパク質については可溶性の高いタンパク質をタグとして融合させて発現することが知られている。このようなタグタンパク質としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が用いられており、このようなタンパク質を搭載したプラスミドベクターも市販されている。また、特定のベクターを用いて形質転換体を低温で培養するコールドショック発現系も知られている。しかし、このような方法を用いても可溶化しないタンパク質が依然として存在し、組換えタンパク質を所望の機能を示す可溶性タンパク質として得るための研究が続けられている（例えば、特許文献１）。 In the expression of the recombinant protein, the expressed recombinant protein may aggregate into an insoluble fraction. For example, since the original function of the recombinant protein cannot be obtained in an insolubilized state such as an inclusion body, the culture temperature and culture time of the transformant are examined in order to recover the recombinant protein as a soluble protein. It is known that recombinant proteins that are not solubilized even then are expressed by fusing highly soluble proteins as tags. Glutathione-S-transferase (GST) and maltose-binding protein (MBP) are used as such tag proteins, and plasmid vectors carrying such proteins are also commercially available. In addition, a cold shock expression system in which a transformant is cultured at a low temperature using a specific vector is also known. However, there are still proteins that are not solubilized even by using such a method, and research is being continued to obtain a recombinant protein as a soluble protein exhibiting a desired function (for example, Patent Document 1).
本発明の課題は、組換えタンパク質を可溶性タンパク質として発現する方法を提供することである。すなわち、本発明は可溶性組換えタンパク質の製造方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for expressing a recombinant protein as a soluble protein. That is, an object of the present invention is to provide a method for producing a soluble recombinant protein.
本発明者らは、上記課題の解決のための検討の過程で、ＧＳＴやＭＢＰとの融合タンパク質としても、またコールドショック発現系を用いても、可溶化しない不溶性の組換えタンパク質を可溶化できるタグタンパク質を見出し、得られた知見に基づいてさらに検討を重ね、本発明を完成させた。 In the process of studying to solve the above problems, the present inventors can solubilize an insoluble recombinant protein that is not solubilized by using a fusion protein with GST or MBP or using a cold shock expression system. The tag protein was found, and further studies were carried out based on the obtained findings to complete the present invention.
すなわち、本発明は下記の［１］〜［１４］を提供するものである。
［１］目的タンパク質をβ-グルクロニダーゼとの融合タンパク質として発現させることを含む、タンパク質の発現方法。
［２］上記融合タンパク質において、β-グルクロニダーゼが目的タンパク質のＮ末端側にある［１］に記載のタンパク質の発現方法。
［３］目的タンパク質をコードする塩基配列とβ-グルクロニダーゼをコードする塩基配列とを含む遺伝子を含む発現ベクターを導入した大腸菌を培養することを含む［１］または［２］に記載のタンパク質の発現方法。
［４］β-グルクロニダーゼが、配列表の配列番号１のアミノ酸配列、または配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質の発現方法。
［５］β-グルクロニダーゼをコードする塩基配列が配列表の配列番号２で表される塩基配列であるかまたは、配列表の配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってかつＧＵＳ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列である［４］に記載のタンパク質の発現方法。
That is, the present invention provides the following [1] to [14].
[1] A method for expressing a protein, which comprises expressing the target protein as a fusion protein with β-glucuronidase.
[2] The method for expressing a protein according to [1], wherein β-glucuronidase is on the N-terminal side of the target protein in the above fusion protein.
[3] Expression of the protein according to [1] or [2], which comprises culturing Escherichia coli into which an expression vector containing a gene containing a base sequence encoding a target protein and a base sequence encoding β-glucuronidase is introduced. Method.
[4] An amino acid sequence in which β-glucuronidase has a deletion, substitution or addition of one to several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The method for expressing a protein according to any one of [1] to [3].
[5] The nucleotide sequence encoding β-glucuronidase is the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or the polynucleotide and protein consisting of the complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. The method for expressing a protein according to [4], which is a nucleotide sequence of a polynucleotide that hybridizes under gentle conditions and encodes a protein having GUS activity.
［６］上記目的タンパク質が酵素またはレクチンである［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質の発現方法。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質の発現方法を用いたタンパク質の製造方法。
［８］β-グルクロニダーゼをコードする塩基配列、上記塩基配列の上流に機能的に連結されたプロモータ、および上記塩基配列の直下流のクローニングサイトを有する、タンパク質を可溶化発現するためのベクター。
［９］上記塩基配列の直上流にＨｉｓタグ対応塩基配列を有する［８］に記載のタンパク質を可溶化発現するためのベクター。
［１０］配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列または配列表の配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、β-グルクロニダーゼと硫酸基転移酵素との融合タンパク質。
［１１］［１０］に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
［１２］配列表の配列番号１１で表される塩基配列からなる［１１］に記載の遺伝子。
［１３］［１１］または［１２］に記載の遺伝子を含むベクター。
［１４］［１３］に記載のベクターを含む形質転換体。
［１５］配列表の配列番号２０で表されるアミノ酸配列または配列表の配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなる、β-グルクロニダーゼとレクチンとの融合タンパク質。
［１６］［１５］に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
［１７］配列表の配列番号１９で表される塩基配列からなる［１６］に記載の遺伝子。
［１８］［１６］または［１７］に記載の遺伝子を含むベクター。
［１９］［１８］に記載のベクターを含む形質転換体。
[6] The method for expressing a protein according to any one of [1] to [5], wherein the target protein is an enzyme or a lectin.
[7] A method for producing a protein using the method for expressing a protein according to any one of [1] to [6].
[8] A vector for solubilizing and expressing a protein, which has a base sequence encoding β-glucuronidase, a promoter functionally linked upstream of the base sequence, and a cloning site immediately downstream of the base sequence.
[9] A vector for solubilizing and expressing the protein according to [8], which has a His tag-compatible base sequence immediately upstream of the above base sequence.
[10] The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 in the sequence listing or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 in the sequence listing comprises an amino acid sequence having one to several amino acid deletions, substitutions or additions. A fusion protein of β-glucuronidase and sulfate transferase.
[11] A gene encoding the fusion protein according to [10].
[12] The gene according to [11], which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
[13] A vector containing the gene according to [11] or [12].
[14] A transformant containing the vector according to [13].
[15] The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 in the sequence listing comprises an amino acid sequence having one to several amino acid deletions, substitutions or additions. A fusion protein of β-glucuronidase and lectin.
[16] A gene encoding the fusion protein according to [15].
[17] The gene according to [16], which comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 19 in the sequence listing.
[18] A vector containing the gene according to [16] or [17].
[19] A transformant containing the vector according to [18].
本発明により、組換えタンパク質を可溶性タンパク質として発現することのできる新規のタンパク質発現方法が提供される。本発明の発現方法により、組換えタンパク質を可溶性タンパク質として得ることができる。さらに本発明により、上記の方法に用いることができるタンパク質を可溶化発現するためのベクターが提供される。 The present invention provides a novel protein expression method capable of expressing a recombinant protein as a soluble protein. By the expression method of the present invention, a recombinant protein can be obtained as a soluble protein. Furthermore, the present invention provides a vector for solubilizing and expressing a protein that can be used in the above method.
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明者らは、実施例に示すように、ＧＳＴやＭＢＰとの融合タンパク質としても可溶化しない不溶性の組換えタンパク質が、β−グルクロニダーゼ（以下、「ＧＵＳ」ということがある。）との融合タンパク質として発現させることによって可溶性のタンパク質として得られることを見出した。そして、この融合タンパク質において目的のタンパク質の活性が維持されていることを見出した。
可溶性のタンパク質とは、例えば形質転換体の細胞を破砕し、10,000×g程度で遠心分離したときの上清（可溶性画分）の中に得られるタンパク質であり、その沈殿物として得られる不溶性のタンパク質と比較して、目的タンパク質の所望の活性や本来の立体構造を維持した状態で得られるタンパク質である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
As shown in Examples, the present inventors have fused an insoluble recombinant protein that is not solubilized as a fusion protein with GST or MBP with β-glucuronidase (hereinafter, may be referred to as “GUS”). It has been found that it can be obtained as a soluble protein by expressing it as a protein. Then, they found that the activity of the target protein was maintained in this fusion protein.
The soluble protein is a protein obtained in a supernatant (soluble fraction) when, for example, cells of a transformant are disrupted and centrifuged at about 10,000 × g, and is insoluble as a precipitate thereof. It is a protein obtained while maintaining the desired activity and original three-dimensional structure of the target protein as compared with the protein.
［ＧＵＳ］
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）は、β−グルクロニドを加水分解しＤ−グルクロン酸を生成する約６８ｋＤａの酵素であり、大腸菌の他、動物細胞で認められる。ＧＵＳは、ＧＵＳ活性が認められない植物において、プロモータ配列に繋いで遺伝子発現を調べるレポーター遺伝子等として広く使われており、X-Gluc(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)を基質としてインディゴ色素が生成することにより検出される。ＧＵＳは大腸菌において安定的に発現するため、組換えタンパク質発現系においてポシティブコントロールとして用いられることもある。
[GUS]
β-Glucuronide (GUS) is an enzyme of about 68 kDa that hydrolyzes β-glucuronide to produce D-glucuronic acid, and is found in animal cells as well as Escherichia coli. GUS is widely used as a reporter gene for investigating gene expression by linking to a promoter sequence in plants in which GUS activity is not observed, and X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D) -glucuronide) is used as a substrate to generate an indigo dye. Since GUS is stably expressed in Escherichia coli, it may be used as a positive control in a recombinant protein expression system.
本発明の方法においてタグタンパク質として用いるＧＵＳとしては、特に限定されないが、大腸菌のＧＵＳであることが好ましい。ＧＵＳとしては具体的には、配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加を有するアミノ酸配列からなり、かつ、β-グルクロニダーゼ活性を有するタンパク質を用いることができる。 The GUS used as the tag protein in the method of the present invention is not particularly limited, but is preferably Escherichia coli GUS. Specifically, GUS deletes, substitutes or adds one to several amino acids in the protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. A protein having an amino acid sequence and having β-glucuronidase activity can be used.
［目的タンパク質］
本発明の方法において可溶化される目的タンパク質は特に限定されず、酵素、抗体、サイトカイン、ホルモン、受容体、繊維状タンパク質などが挙げられる。酵素としては、硫酸基転移酵素などを挙げることができる。硫酸基転移酵素は古細菌以外のほとんどの生物が持っており、3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate（PAPS）のスルホニル基を基質（タンパク質、ペプチドや低分子化合物）の水酸基やアミノ基に転移させる反応を触媒する酵素である。また、目的タンパク質はレクチンであってもよい。レクチンは動物、植物、菌類が持っており、細胞膜上の糖鎖や糖タンパク質に結合活性を有するタンパク質である。目的タンパク質は、医薬や食品用途で製造されるものであってもよく、タンパク質の構造や機能解析などの研究目的で製造されるものであってもよい。
[Target protein]
The target protein to be solubilized in the method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include enzymes, antibodies, cytokines, hormones, receptors, and fibrous proteins. Examples of the enzyme include sulfate transferase and the like. Sulfate transferase is possessed by most organisms other than paleontology, and transfers the sulfonyl group of 3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS) to the hydroxyl group or amino group of a substrate (protein, peptide or low molecular weight compound). It is an enzyme that catalyzes the reaction that causes the reaction. Moreover, the target protein may be a lectin. Lectins are possessed by animals, plants, and fungi, and are proteins that have binding activity to sugar chains and glycoproteins on cell membranes. The target protein may be produced for pharmaceutical or food use, or may be produced for research purposes such as analysis of protein structure or function.
［ＧＵＳをコードする塩基配列および目的タンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子（融合タンパク質遺伝子）］
ＧＵＳをコードする塩基配列としては、いずれの種由来のＧＵＳをコードする塩基配列を用いてもよいが、大腸菌のＧＵＳをコードする塩基配列を用いることが好ましい。ＧＵＳをコードする塩基配列の例としては、配列表の配列番号２で表される塩基配列、配列表の配列番号２で表される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであってかつＧＵＳ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列、配列表の配列番号２で表される塩基配列とＢＬＡＳＴ解析で９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列であってＧＵＳ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列などが挙げられる。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
[Gene containing a base sequence encoding GUS and a base sequence encoding a target protein (fusion protein gene)]
As the base sequence encoding GUS, a base sequence encoding GUS derived from any species may be used, but it is preferable to use a base sequence encoding GUS of Escherichia coli. Examples of the nucleotide sequence encoding GUS include a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing and a complementary sequence of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing under stringent conditions. 90% or more, more preferably 95% or more in the nucleotide sequence of the polynucleotide that is a hybridizing polynucleotide and encodes a protein having GUS activity, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and BLAST analysis. Examples thereof include a base sequence having homology and encoding a protein having GUS activity. Hybridization under stringent conditions is carried out in a normal hybridization buffer at a temperature of 40 to 70 ° C., preferably 60 to 65 ° C., and a salt concentration of 15 mM to 300 mM, preferably 15 mM to 60 mM. It can be carried out according to the method of washing in a cleaning solution such as.
ＧＵＳをコードする塩基配列を含む遺伝子の取得方法については特に制限はないが、例えば天然型の遺伝子を大腸菌由来のｃＤＮＡライブラリーなどから取得すればよい。適当なプライマーを設計し、それらを用いて取得した遺伝子を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、所望のＧＵＳをコードする遺伝子を得ることができる。または、ＧＵＳをコードする塩基配列を全合成したものを用いてもよい。 The method for obtaining a gene containing a base sequence encoding GUS is not particularly limited, but for example, a natural gene may be obtained from a cDNA library derived from Escherichia coli. A gene encoding a desired GUS can be obtained by designing appropriate primers and performing PCR using the gene obtained using them as a template. Alternatively, a total synthesis of the base sequence encoding GUS may be used.
ＧＵＳをコードする塩基配列からなる遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）は目的タンパク質をコードする塩基配列からなる遺伝子（目的タンパク質遺伝子）に連結して用いられる。融合タンパク質においてＧＵＳが目的タンパク質のＮ末側になるように連結してもＣ末側になるように連結してもよいが、ＧＵＳは目的タンパク質のＮ末側にあることが好ましい。 The gene consisting of the base sequence encoding GUS (GUS gene) is used by being linked to the gene consisting of the base sequence encoding the target protein (target protein gene). In the fusion protein, GUS may be linked so as to be on the N-terminal side of the target protein or C-terminal, but GUS is preferably located on the N-terminal side of the target protein.
ＧＵＳをコードする塩基配列と目的タンパク質をコードする塩基配列とは直接連結してもよく、他の配列を介して連結してもよいが、他の配列を介して連結することが好ましい。介在させる他の配列は、例えば６〜１２０塩基、好ましくは１５〜６０塩基ほどの特定の機能を有さない配列であればよい。一方、介在させる配列にプロテアーゼが認識し切断するアミノ酸配列をコードする塩基配列（プロテアーゼ認識配列）を含めてもよい。プロテアーゼ認識配列を含む場合、発現産物をプロテアーゼ処理することによって、目的タンパク質をＧＵＳから分離することができる。プロテアーゼ処理後の目的タンパク質の精製のために、プロテアーゼ認識配列と目的タンパク質をコードする塩基配列との間にＨｉｓタグ対応塩基配列を設けていてもよい。なお、後述するように、Ｈｉｓタグ対応塩基配列は融合タンパク質のＮ末またはＣ末側に対応する部位に設けることも好ましい。 The base sequence encoding GUS and the base sequence encoding the target protein may be directly linked or may be linked via another sequence, but it is preferable to link via another sequence. The other sequence to be intervened may be, for example, a sequence having no specific function of 6 to 120 bases, preferably 15 to 60 bases. On the other hand, the intervening sequence may include a base sequence (protease recognition sequence) encoding an amino acid sequence recognized and cleaved by the protease. If a protease recognition sequence is included, the protein of interest can be separated from GUS by treating the expression product with a protease. In order to purify the target protein after the protease treatment, a His tag-compatible base sequence may be provided between the protease recognition sequence and the base sequence encoding the target protein. As will be described later, it is also preferable to provide the His tag-corresponding base sequence at the site corresponding to the N-terminal or C-terminal side of the fusion protein.
遺伝子の連結は、公知の方法をいずれも用いることができるが、例えば、公知のベクターのマルチクローニングサイトなどのクローニングサイト（ＤＮＡの制限酵素部位）にＧＵＳ遺伝子および目的タンパク質遺伝子をそれぞれ所望の配置となるように挿入して、ベクターに連結する方法などをとることが好ましい。また、予めＧＵＳ遺伝子が挿入されたベクターを用意し、任意の目的タンパク質遺伝子と連結させることができる。 Any known method can be used for gene ligation. For example, the GUS gene and the target protein gene are arranged at a cloning site (DNA restriction enzyme site) such as a multicloning site of a known vector. It is preferable to take a method of inserting the gene so as to be such that the gene is linked to the vector. In addition, a vector into which the GUS gene has been inserted in advance can be prepared and linked to any target protein gene.
［ベクター］
ベクターの種類は特に限定されず、宿主中で複製可能なものが適宜選択される。ベクターとしては、プラスミドベクターを用いることが好ましい。
[vector]
The type of vector is not particularly limited, and one that can be replicated in the host is appropriately selected. As the vector, it is preferable to use a plasmid vector.
ベクターは、融合タンパク質遺伝子の挿入部位の上流にプロモータが機能的に連結された発現ベクターであることが好ましい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモータは宿主で作動可能なプロモータであれば特に限定されず、例えば大腸菌を宿主として用いる場合、Ｔ７プロモータ、ｃｓｐプロモータ、Ｔ３プロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、またはｔａｃプロモータ、などを用いることができる。プロモータおよび上記挿入部位の間にはリボソーム結合配列（シャイン・ダルガノ配列）が含まれていることが好ましい。 The vector is preferably an expression vector in which a promoter is functionally linked upstream of the insertion site of the fusion protein gene. The promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell and can be appropriately selected depending on the type of host. The promoter is not particularly limited as long as it can be operated by a host. For example, when Escherichia coli is used as a host, a T7 promoter, a csp promoter, a T3 promoter, a lac promoter, a trp promoter, a tac promoter, or the like can be used. It is preferable that a ribosome binding sequence (Shine-Dalgarno sequence) is contained between the promoter and the insertion site.
ベクターはターミネータを含むことが好ましい。ベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列などを有していてもよい。その他、スプライシングシグナルなどを含むように調製することもできる。ベクターは宿主内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよい。 The vector preferably contains a terminator. The vector may further carry a polyadenylation signal (eg, derived from the SV40 or adenovirus 5E1b region), a transcription enhancer sequence (eg, SV40 enhancer), a translation enhancer sequence, and the like. In addition, it can be prepared to include a splicing signal and the like. The vector may comprise a DNA sequence that allows it to replicate in the host.
ベクターはさらに選択マーカーを含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えば、カルベニシリン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン若しくはハイグロマイシンＢのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。 The vector may further contain a selectable marker. Selective markers include genes lacking its complement in host cells, such as, for example, dihydrofolate reductase (DHFR) or the sizosaccharomyces pombe TPI gene, or, for example, carbenicillin, ampicillin, canamycin, tetracycline, chloramphenicol. Drug resistance genes such as phenicol, spectinomycin, gentamicin, neomycin or hygromycin B can be mentioned.
ベクターが、融合タンパク質遺伝子挿入部位の直上流または直下流部位にＨｉｓタグなどの精製用タグ対応塩基配列を有していてもよい。このようなベクターを用いることにより発現した融合タンパク質については、精製用タグを利用した発現タンパク質のアフィニティー精製を行うことができる。 The vector may have a base sequence corresponding to a purification tag such as a His tag at the site immediately upstream or immediately downstream of the fusion protein gene insertion site. For the fusion protein expressed by using such a vector, affinity purification of the expressed protein can be performed using a purification tag.
プラスミドとしては、市販のプラスミドを用いてもよく、全合成してもよい。市販のプラスミドの例としては、pET21a、pET300、pDEST、pET39b、pCOLADuet-1、pACYCDuet-1、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）, pUC118、pUC119, pColdI（いずれもタカラバイオ社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）などが挙げられる。 As the plasmid, a commercially available plasmid may be used, or total synthesis may be used. Examples of commercially available plasmids are pET21a, pET300, pDEST, pET39b, pCOLADuet-1, pACYCDuet-1, pCDF-1b, pRSF-1b (all manufactured by Qiagen), pUC118, pUC119, pColdI (all manufactured by Takara Bio Inc.). , PGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-30 (manufactured by Qiagen), etc.
実施例で示すように、まず市販のエントリーベクターを用いて、ＧＵＳ遺伝子および目的タンパク質遺伝子を連結させたエントリークローンを作製し、次いでデスティネーションベクターと組換え反応を行って発現ベクターを作製してもよい。 As shown in Examples, an entry clone in which the GUS gene and the target protein gene are ligated is first prepared using a commercially available entry vector, and then an expression vector is prepared by performing a recombination reaction with the destination vector. Good.
［可溶化発現用ベクター］
上述のように、予めＧＵＳ遺伝子が挿入されたベクターは、任意の目的タンパク質を可溶化発現するためのベクターとして用いることができる。本明細書において、「可溶化発現」とは、タンパク質を可溶性タンパク質として発現させることを意味する。具体的には、可溶化発現用ベクターは、ＧＵＳ遺伝子、該ＧＵＳ遺伝子の上流に機能的に連結されたプロモータ、および上記ＧＵＳ遺伝子の直下流もしくは直上流のマルチクローニングサイトなどのクローニングサイトを有するベクターであり、これを用いて、任意の目的タンパク質が導入された発現ベクターを作製することができる。可溶化発現用ベクターはさらに上述のように、リボソーム結合配列、精製用タグ対応塩基配列やプロテアーゼ認識配列を有していることが好ましい。例えば、可溶化発現用ベクターは、ＧＵＳ遺伝子の直上流であって、プロモータの下流にＨｉｓタグ対応配列を有するものであってもよい。可溶化発現用ベクターは上記のベクターの項目で説明した追加の要素を含んでいてもよい、
[Vector for solubilization expression]
As described above, the vector into which the GUS gene has been inserted in advance can be used as a vector for solubilizing and expressing any target protein. As used herein, "solubilized expression" means expressing a protein as a soluble protein. Specifically, the solubilization expression vector is a vector having a GUS gene, a promoter functionally linked upstream of the GUS gene, and a cloning site such as a multi-cloning site immediately downstream or immediately upstream of the GUS gene. This can be used to prepare an expression vector into which an arbitrary target protein has been introduced. As described above, the solubilization expression vector preferably has a ribosome binding sequence, a purification tag-compatible base sequence, and a protease recognition sequence. For example, the solubilization expression vector may be directly upstream of the GUS gene and have a His tag-compatible sequence downstream of the promoter. The solubilization expression vector may contain the additional elements described in the Vector section above.
［形質転換体］
発現ベクターを宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。宿主としては、大腸菌などの細菌、酵母、真菌細胞、および昆虫、植物、または動物の細胞などの真核細胞等が挙げられ、大腸菌が好ましい。
[Transformant]
A transformant can be prepared by introducing an expression vector into a host. Examples of the host include bacteria such as Escherichia coli, yeast, fungal cells, and eukaryotic cells such as insect, plant, or animal cells, and Escherichia coli is preferable.
得られた形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、タンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。 The resulting transformant is cultured in a suitable nutrient medium under conditions that allow expression of the introduced gene. In order to isolate and purify a protein from a culture of a transformant, a usual protein isolation and purification method may be used.
本発明の方法により、目的タンパク質は、ＧＵＳと結合した融合タンパク質として発現し、その少なくとも一部が、細胞内に溶解状態で得られる。溶解状態のタンパク質は、例えば、以下の手順で回収、精製することができる。培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、可溶性である目的の融合タンパク質を得ることができる。この上清について通常のタンパク質の単離精製法を行えばよい。単離精製法としては、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法が挙げられる。これらは、単独で行っても組み合わせて行ってもよい。 According to the method of the present invention, the target protein is expressed as a fusion protein bound to GUS, and at least a part thereof is obtained in a lysed state in the cell. The dissolved protein can be recovered and purified by the following procedure, for example. After completion of the culture, the cells are collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, and then crushed with an ultrasonic crusher or the like to obtain a cell-free extract. From the supernatant obtained by centrifuging this cell-free extract, a soluble fusion protein of interest can be obtained. The usual protein isolation and purification method may be performed on this supernatant. Examples of the isolation and purification method include a solvent extraction method, a salt analysis method using sulfuric acid, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, an anion exchange chromatography method using a resin such as diethylaminoethyl (DEAE) sepharose, and S-Sepharose. Cation exchange chromatography method using a resin such as FF (manufactured by Pharmacia), hydrophobic chromatography method using a resin such as butyl Sepharose and phenyl Sepharose, gel filtration method using a molecular sieve, affinity chromatography method, chromatography Methods such as focusing method and electrophoresis method such as isoelectric point electrophoresis can be mentioned. These may be performed alone or in combination.
アフィニティークロマトグラフィー法はタグタンパク質であるＧＵＳに特異的に結合する抗体などを用いて行ってもよい。また、Ｈｉｓタグなどの精製用タグを有するように発現したタンパク質はこれを利用して精製を行うことができる。 The affinity chromatography method may be carried out using an antibody or the like that specifically binds to GUS, which is a tag protein. In addition, a protein expressed to have a purification tag such as a His tag can be used for purification.
また、実施例で示すように、本発明者らは、ＧＵＳと結合した融合タンパク質においても、X-Glucの存在下での呈色があることを見出した。すなわち、融合タンパク質も、β−グルクロニドを加水分解しＤ−グルクロン酸を生成するβ-グルクロニダーゼ活性を示すことを見いだした。したがって、本発明の方法は、上記の呈色を利用して目的タンパク質の発現クローンの選抜を行うことができるという利点がある。 In addition, as shown in Examples, the present inventors have found that the fusion protein bound to GUS also has coloration in the presence of X-Gluc. That is, it was found that the fusion protein also exhibits β-glucuronidase activity that hydrolyzes β-glucuronide to produce D-glucuronic acid. Therefore, the method of the present invention has an advantage that an expression clone of a target protein can be selected by utilizing the above coloration.
得られたＧＵＳが融合している目的タンパク質は、ＧＵＳが目的タンパク質の用途や機能に影響しないものである場合は、そのまま融合タンパク質として使用することができる。例えば、後述の実施例で示すように、目的タンパク質が硫酸基転移酵素である例では、ＧＵＳ融合タンパク質においても目的タンパク質の酵素活性を有しており、このまま酵素として用いることも可能である。
ＧＵＳと目的タンパク質との間にプロテアーゼ認識配列を含む融合タンパク質については、その配列を認識するプロテアーゼを作用させて目的タンパク質とＧＵＳを分離してもよい。
The obtained target protein to which GUS is fused can be used as it is as a fusion protein if GUS does not affect the use or function of the target protein. For example, as shown in Examples described later, in the example where the target protein is a sulfate transferase, the GUS fusion protein also has the enzymatic activity of the target protein, and can be used as it is as an enzyme.
For a fusion protein containing a protease recognition sequence between GUS and the target protein, the target protein and GUS may be separated by allowing a protease that recognizes the sequence to act.
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、試薬、物質量とその割合、操作等は本発明の趣旨から逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The materials, reagents, amounts of substances and their ratios, operations, etc. shown in the following examples can be appropriately changed as long as they do not deviate from the gist of the present invention. Therefore, the scope of the present invention is not limited to the following examples.
＜＜ＧＵＳと硫酸基転移酵素との融合タンパク質＞＞
＜発現ベクターの構築＞
配列表の配列番号２のＧＵＳの塩基配列からストップコドンのみを除いたＯＲＦ配列を以下のプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅した。
ＧＵＳのＰＣＲプライマー
GUS-pENTR-InF: GCAGGCTCCGCGGCCATGGTCCGTCCTGTAGAAAC（配列表の配列番号３）
GUS-pENTR-InR: GTGAAGGGGGCGGCCGCTTGTTTGCCTCCCTGCTG（配列表の配列番号４）
（下線はインフュージョン反応のためのベクター配列）
<< Fusion protein of GUS and sulfate transferase >>
<Construction of expression vector>
The ORF sequence obtained by removing only the stop codon from the nucleotide sequence of GUS of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing was amplified by PCR using the following primers.
GUS PCR primers
GUS-pENTR-InF: GCAGGCTCCGCGGCC ATGGTCCGTCCTGTAGAAAC (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing)
GUS-pENTR-InR: GTGAAGGGGGCGGCCGC TTGTTTGCCTCCCTGCTG (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing)
(Underlined vector sequence for infusion reaction)
イネ科植物ソルガム（Sorghum bicolor）の硫酸基転移酵素（配列表の配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質）は細胞質局在の可溶性タンパク質であるが、本発明者らの検討において、ＧＳＴやＭＢＰとの融合タンパク質としても、また、コールドショック発現系を用いても、可溶化しなかったタンパク質である。このタンパク質の遺伝子のSbLGS1のＯＲＦ配列（配列表の配列番号６）を以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
SbLGS1のＰＣＲプライマー
SbLGS1-F4: CACCATGAACGTACAGGAGAGGAG（配列表の配列番号７）
SbLGS1-R2: TTACACGGATATGGAGTCGGCAAAG（配列表の配列番号８）
Sorghum bicolor grass transferase (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing) is a soluble protein localized in the cytoplasm, but in our study, it was referred to as GST and MBP. It is a protein that has not been solubilized either as a fusion protein of sorghum or by using a cold shock expression system. The ORF sequence of SbLGS1 (SEQ ID NO: 6 in the sequence listing) of the gene for this protein was amplified by PCR using the following primers.
SbLGS1 PCR primer
SbLGS1-F4: CACCATGAACGTACAGGAGAGGAG (SEQ ID NO: 7 in the sequence listing)
SbLGS1-R2: TTACACGGATATGGAGTCGGCAAAG (SEQ ID NO: 8 in the sequence listing)
上記ＰＣＲ増幅産物をインビトロジェン社のエントリーベクターpENTR/D-TOPO（登録商標）（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K240020）のクローニングサイトに、メーカーのプロトコルにしたがって挿入し、プラスミド１（pENTR-SbLGS1）を得た。 Insert the above PCR amplification product into the cloning site of Invitrogen's entry vector pENTR / D-TOPO® (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K240020) according to the manufacturer's protocol. , Plasmid 1 (pENTR-SbLGS1) was obtained.
プラスミド１（pENTR-SbLGS1）をクローニングサイト上流の制限酵素部位NotIで切断した。上記のＧＵＳのＰＣＲ増幅産物をプラスミド１のNotI切断部位にインフュージョン反応により挿入し、プラスミド２（pENTR-GUS-SbLGS1）を得た。 Plasmid 1 (pENTR-SbLGS1) was cleaved at the restriction enzyme site NotI upstream of the cloning site. The above PCR amplification product of GUS was inserted into the NotI cleavage site of plasmid 1 by an infusion reaction to obtain plasmid 2 (pENTR-GUS-SbLGS1).
インビトロジェン社のGateway（登録商標）LR Clonase（登録商標）Enzyme Mix（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11791019）を用い、メーカーのプロトコルにしたがって、プラスミド１（pENTR-SbLGS1）およびプラスミド２（pENTR-GUS-SbLGS1）それぞれのattL領域をデスティネーションベクターpET300/NT-DEST（インビトロジェン社：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K630001）のattB領域（上流にＨｉｓタグ配列を含む）に組み換えるＬＲ組換え反応を行い、プラスミド４（pET300-SbLGS1）およびプラスミド５（pET300-GUS-SbLGS1）を得た。Gateway（登録商標）LR Clonase（登録商標）Enzyme Mixに付属しているポシティブコントロールであるpENTR-GUS（プラスミド３）についても同様にＬＲ組換え反応を行い、プラスミド６（pET300-GUS）を得た。なお、プラスミド４〜６の塩基配列を確認したところ、発現遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号９、１１、１３であった。また、形質転換大腸菌で発現するタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号１０、１２、１４のアミノ酸配列となる。 Using Invitrogen's Gateway® LR Clonase® Enzyme Mix (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11791019) and according to the manufacturer's protocol, plasmid 1 (pENTR-SbLGS1) ) And plasmid 2 (pENTR-GUS-SbLGS1) attL regions of the destination vector pET300 / NT-DEST (Invitrogen: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K630001) attB region ( An LR recombination reaction was carried out to recombinate into (containing a His tag sequence upstream) to obtain plasmid 4 (pET300-SbLGS1) and plasmid 5 (pET300-GUS-SbLGS1). The positive control pENTR-GUS (plasmid 3) attached to Gateway (registered trademark) LR Clonase (registered trademark) Enzyme Mix was also subjected to LR recombination reaction in the same manner to obtain plasmid 6 (pET300-GUS). .. When the nucleotide sequences of plasmids 4 to 6 were confirmed, the nucleotide sequences of the expressed genes were SEQ ID NOs: 9, 11 and 13 in the sequence listing. The amino acid sequences of the proteins expressed in transformed Escherichia coli are the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 12 and 14 in the sequence listing, respectively.
＜タンパク質発現＞
プラスミド４，５，６をそれぞれ大腸菌Rosetta2(DE3)pLysS（Novagen社）（http://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Rosetta-2DE3pLysS-Competent-Cells-Novagen,EMD_BIO-71403）に導入した。形質転換した大腸菌をＬＢ培地１５０ｍＬ（抗生物質カルベニシリン１００μｇ／ｍＬを含む）に入れ、３７℃、１８０ｒｐｍでＯＤ600が０．６〜０．８になるまで培養した。２５℃で３０分間培養したのち、IPTG（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）を０．１ｍＭになるように加えてタンパク質の発現を誘導した。２５℃、１８０ｒｐｍでＯＤ600が２．５〜３．０になるまで培養した。８，０００×ｇ、５分間の遠心により大腸菌を回収して、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１５ｍＬで懸濁した。超音波で大腸菌を破砕した後、懸濁液を４℃、２０，４００×ｇ、５分間の遠心にかけ、上清（可溶性画分）とペレット（不溶性画分）に分けた。不溶性画分は８Ｍ尿素１．５ｍＬで溶解した。
<Protein expression>
Escherichia coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen) (http://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Rosetta-2DE3pLysS-Competent-Cells-Novagen, EMD_BIO-71403) Introduced. The transformed Escherichia coli was placed in 150 mL of LB medium (containing 100 μg / mL of the antibiotic carbenicillin) and cultured at 37 ° C. and 180 rpm until the OD 600 reached 0.6 to 0.8. After culturing at 25 ° C. for 30 minutes, IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) was added to 0.1 mM to induce protein expression. The cells were cultured at 25 ° C. and 180 rpm until the OD 600 became 2.5 to 3.0. E. coli was recovered by centrifugation at 8,000 × g for 5 minutes and suspended in 15 mL of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5). After crushing Escherichia coli with ultrasonic waves, the suspension was centrifuged at 4 ° C., 20,400 × g for 5 minutes, and separated into a supernatant (soluble fraction) and pellets (insoluble fraction). The insoluble fraction was dissolved in 1.5 mL of 8M urea.
プラスミド４，５それぞれを用いて得られた上清６μＬおよび溶解した不溶性画分３μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。結果を図１に示す。
図１に示す結果から、ＧＵＳをタグにすることによりSbLGS1の可溶化発現が促進されていることがわかる。
SDS-PAGE electrophoresis of 6 μL of the supernatant obtained using each of the plasmids 4 and 5 and 3 μL of the dissolved insoluble fraction was performed. The results are shown in FIG.
From the results shown in FIG. 1, it can be seen that the solubilization expression of SbLGS1 is promoted by using GUS as a tag.
プラスミド５，６それぞれを用いて得られた上清（可溶性画分）につき、アフィニティーカラムHis GraviTrap（GEヘルスケア社）（https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/1129.html）を用いてＨｉｓタグ精製を行い、３ｍＬで溶出した。得られた溶出物それぞれの６μＬおよび１２μＬと未精製の上清６μＬおよび溶解した不溶性画分３μＬについて同時にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。結果を図２に示す。図２に示す結果から、融合蛋白質（GUS-SbLGS1）の回収率はＧＵＳのみを発現させたものに比べて低いが、Ｎ末に付加したＨｉｓタグによりアフィニティーカラム精製も可能であることがわかる。 Affinity column His GraviTrap (GE Healthcare) (https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/1129.html) was added to the supernatant (soluble fraction) obtained using each of plasmids 5 and 6. His tag was purified using the product and eluted with 3 mL. SDS-PAGE electrophoresis was performed simultaneously on 6 μL and 12 μL of each of the obtained eluates, 6 μL of the unpurified supernatant and 3 μL of the dissolved insoluble fraction. The results are shown in FIG. From the results shown in FIG. 2, it can be seen that the recovery rate of the fusion protein (GUS-SbLGS1) is lower than that in which only GUS is expressed, but the affinity column purification is also possible by the His tag added to the N-terminal.
＜酵素活性実験＞
pET300-GUS-SbLGS1（プラスミド５）を用いて得られた組換えタンパク質（GUS-SbLGS1タンパク質）について、SbLGS1の酵素活性の有無を調べた。Ｈｉｓタグ精製して得られた上記溶出物２００μＬに以下の溶液を加え、２８℃で１時間放置した。
・５００μＭ 硫酸供与体3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate（ＰＡＰＳ）６μＬ
・１００ｎｇ／μＬ 基質rac-18-hydroxycarlactonoic acid（１８−ＨＯ−ＣＬＡ）１μＬ
<Enzyme activity experiment>
The presence or absence of the enzymatic activity of SbLGS1 was examined in the recombinant protein (GUS-SbLGS1 protein) obtained using pET300-GUS-SbLGS1 (plasmid 5). The following solution was added to 200 μL of the above eluate obtained by purifying His tag, and the mixture was left at 28 ° C. for 1 hour.
-500 μM sulfate donor 3'-Phosphoadenosine-5'-phosphosulfate (PAPS) 6 μL
100 ng / μL Substrate rac-18-hydroxycarlactonoic acid (18-HO-CLA) 1 μL
放置後の溶液を酢酸エチル２００μＬで３回抽出した。抽出液に硫酸ナトリウムを加えて脱水後、ろ過して硫酸ナトリウムを除いた。ろ過液に、窒素を吹きつけて濃縮した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（QTRAP5500、AB Sciex社）を用いて分析した。結果を図３に示す。比較として、pET300-GUS（プラスミド６）を用いて得られた組換えタンパク質を用いて同様の反応および分析を行った結果を図４、GUS-SbLGS1タンパク質を用い、基質のみを加え硫酸供与体を加えずに、同様の反応および分析を行った結果を図５に示す。 The solution after standing was extracted 3 times with 200 μL of ethyl acetate. Sodium sulfate was added to the extract, dehydrated, and then filtered to remove sodium sulfate. Nitrogen was sprayed onto the filtrate to concentrate it, and then analysis was performed using LC-MS / MS (QTRAP5500, AB Sciex). The results are shown in FIG. For comparison, the results of the same reaction and analysis using the recombinant protein obtained using pET300-GUS (plasmid 6) are shown in Fig. 4, using the GUS-SbLGS1 protein, adding only the substrate, and adding the sulfuric acid donor. The results of the same reaction and analysis without addition are shown in FIG.
図３〜５において、ＴＩＣは選択した総イオン、１８−ＨＯ−ＣＬＡは基質、１８−ＨＯ−ＣＬＡ＋８０は推定代謝物である１８−ＨＯ−ＣＬＡの硫酸エステル、４ＤＯ／５ＤＳ: 推定代謝物である4-deoxyorobanchol/5-deoxystrigolを示す。矢印は基質１８−ＨＯ−ＣＬＡのピークを示し、４ＤＯ／５ＤＳにおいてアステリスクは代謝物のピークではない。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析はＭＲＭ法（多重反応検出法）で行い、検出イオン（プリカーサー；プロダクト）は、１８−ＨＯ−ＣＬＡ（３４７；１１３，６９）、１８−ＨＯ−ＣＬＡ＋８０（４２７；１１３，６９）、４ＤＯ／５ＤＳ（３３１；２３４，２１６，９７）である。 In FIGS. 3-5, TIC is the selected total ion, 18-HO-CLA is the substrate, 18-HO-CLA + 80 is the putative metabolite 18-HO-CLA sulfate, 4DO / 5DS: putative metabolite. It shows 4-deoxyorobanchol / 5-deoxystrigol. Arrows indicate the peak of substrate 18-HO-CLA and at 4DO / 5DS the asterisk is not the peak of metabolites. LC-MS / MS analysis is performed by the MRM method (multiple reaction detection method), and the detected ions (precursor; product) are 18-HO-CLA (347; 113,69) and 18-HO-CLA + 80 (427; 113,). 69), 4DO / 5DS (331; 234,216, 97).
図４、５において顕著な１８−ＨＯ−ＣＬＡのピークは図３においては確認できず、GUS-SbLGS1タンパク質、基質および硫酸供与体を混合して反応させた例のみにおいて、酵素によるrac-18-hydroxycarlactonoic acid（１８−ＨＯ−ＣＬＡ）からの産物として4-deoxyorobanchol（４ＤＯ）および5-deoxystrigol（５ＤＳ）のピークが現れている。なお、以下に示すように１８−ＨＯ−ＣＬＡに硫酸基が付加した18-HO-CLA sulfate(１８−ＨＯ−ＣＬＡ＋８０）は不安定なため速やかに４ＤＯおよび５ＤＳに変換する。
得られた結果から、GUS-SbLGS1タンパク質は酵素機能を有しており、硫酸供与体ＰＡＰＳ依存的に１８−ＨＯ−ＣＬＡから４ＤＯと５ＤＳを生成していることがわかる。
The remarkable peak of 18-HO-CLA in FIGS. 4 and 5 was not confirmed in FIG. 3, and only in the case where the GUS-SbLGS1 protein, the substrate and the sulfuric acid donor were mixed and reacted, the enzyme rac-18- Peaks of 4-deoxyorobanchol (4DO) and 5-deoxystrigol (5DS) appear as products from hydroxycarlactonoic acid (18-HO-CLA). As shown below, 18-HO-CLA sulfate (18-HO-CLA + 80) in which a sulfate group is added to 18-HO-CLA is unstable and is rapidly converted to 4DO and 5DS.
From the obtained results, it can be seen that the GUS-SbLGS1 protein has an enzymatic function and produces 4DO and 5DS from 18-HO-CLA in a sulfuric acid donor PAPS-dependent manner.
＜ＧＵＳ融合タンパク質発現クローンの検出＞
プラスミド４，５をそれぞれ大腸菌Rosetta2(DE3)pLysS（Novagen社）に導入した。ＬＢプレート（１．５％寒天）にアンピシリンを１００μｇ／ｍＬ、IPTGを０．１ｍＭ、X-Glucを１００μｇ／ｍＬになるように加えた。そのＬＢプレートに形質転換した大腸菌を広げ、３７℃で１６時間培養した。結果を図６に示す。図６において、５はpET300-GUS-SbLGS1（プラスミド５）を用いて培養したものであり、４はpET300-SbLGS1（プラスミド４）を用いて培養したものである。５においてコロニーに青色の呈色が観測された。
<Detection of GUS fusion protein expression clone>
Plasmids 4 and 5 were introduced into Escherichia coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen), respectively. Ampicillin was added to an LB plate (1.5% agar) at 100 μg / mL, IPTG at 0.1 mM, and X-Gluc at 100 μg / mL. The transformed Escherichia coli was spread on the LB plate and cultured at 37 ° C. for 16 hours. The results are shown in FIG. In FIG. 6, 5 is a culture using pET300-GUS-SbLGS1 (plasmid 5), and 4 is a culture using pET300-SbLGS1 (plasmid 4). Blue coloration was observed in the colony at 5.
上記のように、融合タンパク質を発現したコロニーにおいて呈色があり、融合タンパク質がＧＵＳ酵素活性を有していることが確認された。本発明の方法においてタグタンパク質として用いるＧＵＳはストップコドンを除いただけであるためと考えられる。このように、ＧＵＳ融合タンパク質を発現するプラスミドを形質転換した大腸菌はX-Gluc存在下で青色に呈色したことから、発現クローンの選抜を行うことが可能であった。 As described above, the colonies expressing the fusion protein had coloration, and it was confirmed that the fusion protein had GUS enzyme activity. It is considered that GUS used as a tag protein in the method of the present invention only excludes stop codons. As described above, the Escherichia coli transformed with the plasmid expressing the GUS fusion protein turned blue in the presence of X-Gluc, so that the expression clone could be selected.
＜＜ＧＵＳとレクチンとの融合タンパク質＞＞
＜発現ベクターの構築＞
配列表の配列番号２のＧＵＳの塩基配列からストップコドンのみを除いたＯＲＦ配列を以下のプライマーを用いて、ＰＣＲで増幅した。
ＧＵＳのＰＣＲプライマー
GUS-pENTR-InF: GCAGGCTCCGCGGCCATGGTCCGTCCTGTAGAAAC（配列表の配列番号３）
GUS-pENTR-InR: GTGAAGGGGGCGGCCGCTTGTTTGCCTCCCTGCTG（配列表の配列番号４）
（下線はインフュージョン反応のためのベクター配列）
<< Fusion protein of GUS and lectin >>
<Construction of expression vector>
The ORF sequence obtained by removing only the stop codon from the nucleotide sequence of GUS of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing was amplified by PCR using the following primers.
GUS PCR primers
GUS-pENTR-InF: GCAGGCTCCGCGGCC ATGGTCCGTCCTGTAGAAAC (SEQ ID NO: 3 in the sequence listing)
GUS-pENTR-InR: GTGAAGGGGGCGGCCGC TTGTTTGCCTCCCTGCTG (SEQ ID NO: 4 in the sequence listing)
(Underlined vector sequence for infusion reaction)
菌類のサナギタケ（Cordyceps militaris）のレクチン（配列表の配列番号１５のアミノ酸配列からなるタンパク質）は、本発明者らの検討において、コールドショック発現系や可溶化が期待される大腸菌を用いても、可溶化しなかったタンパク質である。このタンパク質の遺伝子のCmRLecのＯＲＦ配列（配列表の配列番号１６）を以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
CmRLecのＰＣＲプライマー
pENTR_RLec_fw: CACCATGGCCGGCACGCACTTTCTCAACCACAC（配列表の配列番号１７）
CM41A.3544_RLec_rv: TCAACTATAGCACCCCTCAATCGCAG（配列表の配列番号１８）
The fungal cordyceps militaris lectin (protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 in the sequence listing) can be used in our studies even when using a cold shock expression system or Escherichia coli, which is expected to be solubilized. It is a protein that has not been solubilized. The ORF sequence of CmRLec (SEQ ID NO: 16 in the sequence listing) of the gene for this protein was amplified by PCR using the following primers.
CmRLec PCR Primer
pENTR_RLec_fw: CACCATGGCCGGCACGCACTTTCTCAACCACAC (SEQ ID NO: 17 in the sequence listing)
CM41A.3544_RLec_rv: TCAACTATAGCACCCCTCAATCGCAG (SEQ ID NO: 18 in the sequence listing)
上記ＰＣＲ増幅産物をインビトロジェン社のエントリーベクターpENTR/D-TOPO（登録商標）（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K240020）のクローニングサイトに、メーカーのプロトコルにしたがって挿入し、プラスミド７（pENTR-CmRLec）を得た。 Insert the above PCR amplification product into the cloning site of Invitrogen's entry vector pENTR / D-TOPO® (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K240020) according to the manufacturer's protocol. , Plasmid 7 (pENTR-CmRLec) was obtained.
プラスミド７（pENTR-CmRLec）をクローニングサイト上流の制限酵素部位NotIで切断した。上記のＧＵＳのＰＣＲ増幅産物をプラスミド７のNotI切断部位にインフュージョン反応により挿入し、プラスミド８（pENTR-GUS-CmRLec）を得た。 Plasmid 7 (pENTR-CmRLec) was cleaved at the restriction enzyme site NotI upstream of the cloning site. The above PCR amplification product of GUS was inserted into the NotI cleavage site of plasmid 7 by an infusion reaction to obtain plasmid 8 (pENTR-GUS-CmRLec).
インビトロジェン社のGateway（登録商標） LR Clonase（登録商標） Enzyme Mix（https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11791019）を用い、メーカーのプロトコルにしたがって、プラスミド８（pENTR-GUS-CmRLec）のattL領域をデスティネーションベクターpET300/NT-DEST（インビトロジェン社：https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K630001）のattB領域（上流にＨｉｓタグ配列を含む）に組み換えるＬＲ組換え反応を行い、プラスミド９（pET300-GUS-CmRLec）を得た。Gateway（登録商標）LR Clonase（登録商標）Enzyme Mixに付属しているポシティブコントロールであるpENTR-GUS（プラスミド３）についても同様にＬＲ組換え反応を行い、プラスミド６（pET300-GUS）を得た。なお、プラスミド６、９の塩基配列を確認したところ、発現遺伝子の塩基配列は配列表の配列番号１３、１９であった。また、形質転換大腸菌で発現するタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号１４、２０のアミノ酸配列となる。 Invitrogen's Gateway® LR Clonase® Enzyme Mix (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11791019) was used and plasmid 8 (pENTR-GUS) was used according to the manufacturer's protocol. -CmRLec) attL region to destination vector pET300 / NT-DEST (Invitrogen: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K630001) attB region (including His tag sequence upstream) The recombinant LR recombination reaction was carried out to obtain plasmid 9 (pET300-GUS-CmRLec). The positive control pENTR-GUS (plasmid 3) attached to Gateway (registered trademark) LR Clonase (registered trademark) Enzyme Mix was also subjected to LR recombination reaction in the same manner to obtain plasmid 6 (pET300-GUS). .. When the nucleotide sequences of plasmids 6 and 9 were confirmed, the nucleotide sequences of the expressed genes were SEQ ID NOs: 13 and 19 in the sequence listing. The amino acid sequences of the proteins expressed in transformed Escherichia coli are the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 14 and 20 in the sequence listing, respectively.
＜タンパク質発現＞
プラスミド６、９をそれぞれ大腸菌Rosetta2(DE3)pLysS（Novagen社）（http://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Rosetta-2DE3pLysS-Competent-Cells-Novagen,EMD_BIO-71403）に導入した。形質転換した大腸菌をＬＢ培地１５０ｍＬ（抗生物質カルベニシリン１００μｇ／ｍＬを含む）に入れ、３７℃、１８０ｒｐｍでＯＤ600が０．６〜０．８になるまで培養した。２５℃で３０分間培養したのち、IPTGを０．１ｍＭになるように加えてタンパク質の発現を誘導した。２５℃、１８０ｒｐｍでＯＤ600が２．５〜３．０になるまで培養した。８，０００×ｇ、５分間の遠心により大腸菌を回収して、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１５ｍＬで懸濁した。超音波で大腸菌を破砕した後、懸濁液を４℃、２０，４００×ｇ、５分間の遠心にかけ、上清（可溶性画分）とペレット（不溶性画分）に分けた。不溶性画分は８Ｍ尿素１．５ｍＬで溶解した。
<Protein expression>
Plasmids 6 and 9 were introduced into Escherichia coli Rosetta2 (DE3) pLysS (Novagen) (http://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Rosetta-2DE3pLysS-Competent-Cells-Novagen, EMD_BIO-71403), respectively. .. The transformed Escherichia coli was placed in 150 mL of LB medium (containing 100 μg / mL of the antibiotic carbenicillin) and cultured at 37 ° C. and 180 rpm until the OD 600 reached 0.6 to 0.8. After culturing at 25 ° C. for 30 minutes, IPTG was added to 0.1 mM to induce protein expression. The cells were cultured at 25 ° C. and 180 rpm until the OD 600 became 2.5 to 3.0. E. coli was recovered by centrifugation at 8,000 xg for 5 minutes and suspended in 15 mL of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5). After crushing Escherichia coli with ultrasonic waves, the suspension was centrifuged at 4 ° C., 20,400 × g for 5 minutes, and separated into a supernatant (soluble fraction) and pellets (insoluble fraction). The insoluble fraction was dissolved in 1.5 mL of 8M urea.
プラスミド６，９それぞれを用いて得られた上清６μＬおよび溶解した不溶性画分３μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。結果を図７に示す。
図７に示す結果から、ＧＵＳをタグにすることによりCmRLecが可溶性画分に発現していることがわかる。
SDS-PAGE electrophoresis of 6 μL of the supernatant obtained using each of the plasmids 6 and 9 and 3 μL of the dissolved insoluble fraction was performed. The results are shown in FIG.
From the results shown in FIG. 7, it can be seen that CmRLec is expressed in the soluble fraction by using GUS as a tag.
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