JP2013158247A

JP2013158247A - 細胞回収方法

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Publication number: JP2013158247A
Application number: JP2012019951A
Authority: JP
Inventors: Goshi Tanaka; 郷史田中; Akira Suenaga; 亮末永; Masahiro Kuninori; 正弘國則; Kyohei Ota; 恭平太田
Original assignee: Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Current assignee: Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2012-02-01
Publication date: 2013-08-19
Anticipated expiration: 2032-02-01
Also published as: JP5924004B2

Abstract

【課題】新たな洗浄用の培養液や洗浄液を用いることなく、細胞の回収効率を向上させることを可能とする。
【解決手段】少なくとも、細胞を培養するための培養容器と、培養後の細胞を回収する細胞回収容器と、培養後の培地を回収する廃液容器とが、導管によって連結されてなる細胞培養用キットを用いて培養された細胞の回収方法であって、培養済みの培養上清を培養容器から廃液容器へ移送する上清排出工程、濃縮された細胞懸濁液を培養容器から細胞回収容器へ移送する細胞回収工程、廃液容器に排出された培養上清の一部を培養容器に戻し、培養容器に残存する細胞を細胞懸濁液に分散させる上清戻し工程、及び残存細胞が分散された細胞懸濁液を培養容器から細胞回収容器に再度移送する再回収工程を含む細胞回収方法とする。
【選択図】図２

Description

本発明は、培養容器を用いて培養した細胞の回収方法に関し、特に細胞の回収効率を向上させるための細胞回収方法に関する。

近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物などを人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。
このような細胞の大量培養では、一般に培養容器を用いて細胞を培養することが行われている。この培養容器を用いた細胞培養においては、培養後に培養容器から細胞を回収する必要がある。
培養細胞（特に浮遊系細胞）を回収する場合、従来は培養容器から細胞懸濁液を全量回収し、遠心分離により細胞を分離する方法が行われていた。しかし、この方法では、細胞を大量に培養して細胞懸濁液が多量にある場合、何回かに分けて遠心分離する必要があり、時間と手間がかかるという問題点があった。

一方、細胞回収方法に関連する技術として、例えば特許文献１に記載の細胞培養方法において用いられている回収方法を挙げることができる。この回収方法では、まず使用済みの培地上清を培養容器から排出した後に、培養細胞を含む細胞懸濁液を回収しており、これによって濃縮された細胞懸濁液を得ることが可能となっている。

国際公開２００７／０５２７１６号パンフレット

しかしながら、この方法では、培養容器内に残留して回収できない細胞が比較的多く生じ、回収効率が十分とは言えないという問題があった。
すなわち、この回収方法によれば、濃縮された細胞懸濁液を回収することができるが、細胞懸濁液を回収しても、培養容器内の壁面などに付着した状態で残ってしまう細胞が存在する。また、培養容器が可撓性材料からなる場合には、細胞懸濁液が少量になると培養容器内が閉塞し易く、比較的多量の細胞懸濁液が培養容器に残る結果、細胞が培養容器内に残存してしまうという問題もあった。

このような問題を解決するため、細胞懸濁液を回収した後に、培養容器に新たな洗浄液（生理食塩水やリン酸緩衝液）を入れて攪拌し、培養容器内に残存する細胞を洗浄液に懸濁させて、再度回収を行うという方法も考えられる。しかし、このように洗浄液を用いて培養容器内に残存する細胞を回収する方法では、新たな洗浄液やこれを保存するための洗浄液保存容器が必要となり、コストが余分にかかってしまうという問題がある。

本発明は、上記の事情にかんがみなされたものであり、培養容器を用いて培養した細胞を回収するにあたって、新たな洗浄用の培養液や洗浄液を用いることなく、細胞の回収効率を向上させることが可能な細胞回収方法の提供を目的とする。

上記目的を達成するため、本発明の細胞回収方法は、少なくとも、細胞を培養するための培養容器と、培養後の細胞を回収する細胞回収容器と、培養後の培地を回収する廃液容器とが、導管によって連結されてなる細胞培養用キットを用いて培養された細胞の回収方法であって、培養済みの培養上清を培養容器から廃液容器へ移送する上清排出工程、濃縮された細胞懸濁液を培養容器から細胞回収容器へ移送する細胞回収工程、廃液容器に排出された培養上清の一部を培養容器に戻し、培養容器に残存する細胞を細胞懸濁液に分散させる上清戻し工程、及び残存細胞が分散された細胞懸濁液を培養容器から細胞回収容器に再度移送する再回収工程を含む方法としてある。

本発明によれば、培養容器を用いて培養した細胞を回収するにあたって、新たな洗浄用の培養液や洗浄液を用いることなく、細胞の回収効率を向上させることが可能となる。

本発明の実施形態の細胞回収方法において用いられる細胞培養用キットを示す図である。本発明の第一実施形態の細胞回収方法における洗浄回収手順を示す図である。本発明の第二実施形態の細胞回収方法における静置手順を示す図である。本発明の実施形態の細胞回収方法による実験結果を示す図である。

以下、本発明の細胞回収方法の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。まず、図１を参照して、本実施形態の細胞回収方法において好適に用いることができる細胞培養用キットについて説明する。この細胞培養用キットには、培養容器１０、培地貯蔵容器２０、細胞注入容器３０、細胞回収容器４０、サンプリング容器５０、及びチューブ６０が備えられている。また、培地貯蔵容器２０は廃液容器としても使用される。
本実施形態の細胞回収方法は、このような細胞培養用キットを使用して細胞培養を行った後に、細胞培養用キットにおける培養容器１０から細胞回収容器４０に細胞を回収する場合に用いられる方法である。

なお、本実施形態の細胞回収方法において用いられる細胞培養用キットは、このような構成に限定されるものではなく、例えばサンプリング容器５０を除いたものや、廃液容器を培地貯蔵容器とは別個に備えたもの、培地貯蔵容器２０を複数備えたものなど適宜変更したものを用いることも可能である。

培養容器１０は、培養対象の細胞と培養液を入れて、細胞を大量培養するための容器である。培養容器１０は、可撓性素材を材料として、袋状（バック型）に形成されている。
この培養容器１０は、培養液や細胞の注入、回収などを行うためのポートを備えている。ポートの数は特に限定されないが、１〜３ポートのものが好適に用いられる。図１には１ポートの細胞培養用キットが示されており、このポートを通じてその他の容器と閉鎖系を維持しつつ、培養液や細胞懸濁液等の移送を行うことができるようになっている。
なお、培養対象の細胞としては、浮遊系細胞を好適に用いることができる。培養液としては、一般的な各種培地を用いることができる。

培地貯蔵容器２０は、細胞を培養するための培養液（培地）を培養容器１０へ移送するために格納する容器である。培地貯蔵容器２０は、培養終了後、廃液容器として用いることができる。すなわち、培養容器１０から細胞回収容器４０に細胞を回収するのに先立って、培養液の上清を廃液容器としての培地貯蔵容器２０へ移送することで、その後濃縮された細胞懸濁液を培養容器１０から細胞回収容器４０へ送ることが可能となる。
また、本実施形態の細胞培養用キットにおいて、培地貯蔵容器２０を２以上備えることもできる。これにより、同一の培養液を２倍量以上貯蔵できるほか、それぞれに異なる培養液を貯蔵することで、培養容器１０に様々なバリエーションで培養液を供給することもできる。

細胞注入容器３０は、培養開始時に必要となる細胞と培養液が入った容器である。この細胞注入容器３０における細胞と培養液を培養容器１０へ移送することで、細胞の培養が開始される。細胞注入容器３０には少なくとも１つのポートが備えられ、このポートを介して細胞と培養液が移送される。

細胞回収容器４０は、培養終了後に、培養液の一部と培養された細胞とが含まれる細胞懸濁液を培養容器１０から回収するための容器である。細胞回収容器４０には、少なくとも１つのポートが備えられ、このポートを介して、培養容器１０から細胞回収容器４０へ培養液の一部と培養された細胞とが含まれる細胞懸濁液が移送される。

サンプリング容器５０は、細胞の培養中や培養終了後に、培養容器１０における細胞懸濁液の一部を移送してサンプリングを行うための容器である。このサンプリング容器５０へ移送するサンプルとしての細胞懸濁液には、培養された細胞と培養液が含まれる。サンプリング容器５０には、少なくとも１つのポートが備えられ、培養容器１０と連結する導管（チューブ）が接続され、培養容器１０から細胞懸濁液がサンプリング容器５０へ送られる。
チューブ６０は、細胞培養用キットにおける各容器を連結する導管である。

次に、本実施形態の細胞回収方法が行われる細胞培養装置の構成について、図２を参照して説明する。同図には、細胞培養装置が模式的に示されている。この細胞培養装置に、上述した細胞培養用キットにおける培養容器１０が配置され、細胞の培養が行われる。細胞培養装置は、図２に示すように、培養容器１０、積載台１１、固定部材１２、攪拌部材１３、仕切部材１４、及びチューブ６０を備えている。

積載台１１は、その上面に培養容器１０が載置され、さらにその培養容器１０の上面に攪拌部材１３や仕切部材１４が配設される平面の台である。
固定部材１２は、培養容器１０を積載台１１に固定するための部材である。図２において、固定部材１２は、クランプとして示されているが、培養容器１０の四隅に孔を備え、これに通して固定するためのピンなどの止め部材として構成することもできる。

攪拌部材１３は、培養容器１０へ外力を与えることにより、培養容器１０内の細胞懸濁液を攪拌する。これによって、培養容器１０における細胞を細胞懸濁液内に分散させ、細胞回収容器４０へ移送されやすくすることができる。また、培養容器１０の内面に付着した細胞を細胞懸濁液に分散させて、細胞回収容器４０へ移送されやすくすることも可能となる。この攪拌部材１３による培養容器１０内の細胞懸濁液の攪拌は、細胞懸濁液の移送前など適切なタイミングで行うようにすることができる。

この攪拌部材１３としては、例えばローラを使用することができる。そして、培養容器１０の上面を攪拌部材１３により所定の深さまで押圧し、かつ攪拌部材１３を積載台１１と平行に移動させることで、細胞懸濁液を攪拌することができる。
なお、図示していないが、攪拌部材１３は、支持台などによって培養容器１０上に配置させることができる。そして、この支持台を、駆動装置によって上下方向と水平方向に移動させ、攪拌部材１３による攪拌を行うことが可能である。

仕切部材１４は、培養容器１０の上面と下面が密着するまで培養容器１０の端部から培養容器１０を押圧し、かつ積載台１１に対して水平方向に移動することで、培養容器１０の底面積を増減させることができる部材である。
培養容器１０が可撓性素材からなるため、仕切部材１４によって培養容器１０の底面積を縮小させると、培養容器１０内では細胞懸濁液が上方に押し上げられて、培養容器１０の厚みがやや増加した状態となる。

後述する静置工程においては、培養容器１０をこのような状態にして静置した後に、培養容器１０内の細胞懸濁液の培養上清を廃液容器へ移送することができる。
このようにして培養上清の廃液容器への移送を行うと、培養容器１０の底面積を縮小させることなく培養上清を廃液容器へ移送する場合に比較して、培養容器１０における細胞懸濁液の細胞濃度を高めることができる。
これは、培養容器１０における底面積に対する上清の量を増やすことができ、培養上清の排出量を増やすことができるためである。その結果、細胞回収容器４０へ回収される細胞懸濁液の細胞濃度が高まり、より少量の液量で細胞を回収することが可能となっている。

この仕切部材１４は、攪拌部材１３と同様にローラなどにより構成することができる。図２には、培養容器１０を２個のローラによって上下から挟み込む仕切部材１４が示されているが、これに限定されるものではなく、培養容器１０の底面積を縮小可能なものであれば良い。なお、仕切部材１４の駆動も、攪拌部材１３と同様に行うことができる。

チューブ６０は、図２において、培養容器１０と、細胞回収容器、及び廃液容器等とを連結している。同図の例では、チューブ６０は、Ａ，Ｂ，Ｃに分かれ、Ａは細胞回収容器に連結され、Ｃは廃液容器に連結されている。また、Ｂは例えばサンプリング容器に連結するものとして用いることができる。

［第一実施形態］
次に、本発明の細胞回収方法の第一実施形態について、図２を参照して説明する。本明細書において、以下の上清戻し工程、及び再回収工程を含む細胞回収方法を、洗浄回収と称する場合がある。

（１）上清排出工程
まず、培養容器１０を静止させて細胞を下方に沈降させた後に、細胞懸濁液の上清を培養容器１０から廃液容器へ移送させる。
これによって、培養容器１０における細胞懸濁液を濃縮することができ、細胞の濃度を高めることが可能となる。この培養上清の排出は、チューブ６０におけるチューブポンプを作動させて行うことができる。なお、以下に説明する細胞懸濁液の移送や、培養上清の戻しについても、チューブ６０におけるチューブポンプを作動させることにより行うことができる。

（２）細胞回収工程
次に、培養容器１０から細胞懸濁液を細胞回収容器へ移送する。この移送を終了した状態において、培養容器１０内には、培養細胞が含まれる細胞懸濁液が一部残存している。

（３）上清戻し工程
次に、廃液容器から培養容器１０へ培養上清を一部戻して、培養容器１０を攪拌部材１３により攪拌する。これにより、培養容器１０内の壁面に付着した細胞など、培養容器１０内に残存した細胞を細胞懸濁液内に懸濁させることができる。なお、攪拌は必要に応じて行えばよい。

（４）再回収工程
次に、残存細胞が懸濁した細胞懸濁液を培養容器１０から細胞回収容器へ再度移送する。これにより、本実施形態の細胞回収方法によれば、新たな培養液や洗浄液を用いることなく、細胞回収工程において培養容器１０に残存した細胞を回収することができ、細胞の回収効率を向上させることが可能となっている。

また、上記細胞回収方法において、上清戻し工程と再回収工程を２回以上繰り返して行うことも好ましい。このように上清戻し工程と再回収工程を２回以上繰り返せば、その都度培養容器１０に残存している細胞をさらに回収することができるため、回収効率を一層向上させることが可能となる。

さらに、上記細胞回収方法において、上清戻し工程と再回収工程を同時に行うことも好ましい。このように上清戻し工程と再回収工程を同時に行えば、培養上清を流しながら細胞を再回収でき、培養容器１０内に残存している細胞を細胞回収容器４０へ移送させやすくすることが可能となる。

［第二実施形態］
次に、本発明の細胞回収方法の第二実施形態について、図３を参照して説明する。
本実施形態の細胞回収方法は、以下のように、上清排出工程を行う前に静置工程を有している点で第一実施形態と異なる。その他の点については、第一実施形態と同様である。

（１）静置工程
第二実施形態の細胞回収方法における上清排出工程を行う前に、仕切部材１４を用いて、培養容器１０の底面積を縮小させる。具体的には、仕切部材１４により培養容器１０の端部から表面と裏面を密着させながら、仕切部材１４を培養容器１０上で移動させることで、培養容器１０の底面積を縮小させることができる。そして、培養容器１０を静置させて細胞を下方に沈降させる。
その後、第二実施形態で説明した上清排出工程、細胞回収工程、上清戻し工程、及び再回収工程を行う。また、上清戻し工程、及び再回収工程を繰り返し行うことも好ましい。

このように培養容器１０の底面積を縮小してから洗浄回収を行うことで、底面積に対する上清の量を増やすことができ、培養上清の排出量を増やすことができる。このため細胞回収工程において回収される細胞懸濁液の細胞濃度を高めることができ、細胞の回収効率を向上させることが可能となる。

以上の通り、上記各実施形態の細胞回収方法によれば、新たな洗浄用の培養液や洗浄液を用いることなく、細胞の回収効率を向上させることが可能となっている。

上述した実施形態の細胞回収方法による洗浄回収を行って培養容器から細胞を回収する場合と、洗浄回収を行うことなく培養容器から細胞を回収する場合とを比較し、洗浄回収による効果を検証した。その結果を図４に示す。この実験は、２２×６６ｃｍの培養容器を用い、これに２０００ｍＬの培養液と、８．００Ｅ＋０９個の細胞を封入して行った。

（比較例１）
第一実施形態の細胞回収方法における上清排出工程と細胞回収工程のみを行って、洗浄回収を行うことなく培養容器から細胞を回収した。
その結果、廃液容器へ排出された培養上清は１６００ｍＬであり、これに２．００Ｅ＋０８の細胞が含まれており、その細胞数の百分率は２．５％であった。細胞回収容器に回収された細胞懸濁液は３５０ｍＬであり、これに６．８３Ｅ＋０９の細胞が含まれており、その細胞数の百分率は８５．３１％であった。また、培養容器に残存した細胞懸濁液は５０ｍＬであり、これに９．７５Ｅ＋０８の細胞が含まれており、その細胞数の百分率は１２．１９％であった。

（実施例１）
第一実施形態の細胞回収方法における上清排出工程、細胞回収工程、上清戻し工程、及び再回収工程をそれぞれ１回行うことにより、洗浄回収を１回行って、培養容器から細胞を回収した。
廃液容器へ排出された培養上清は１５５０ｍＬであり、これに１．９４Ｅ＋０８の細胞が含まれており、その細胞数の百分率は２．４２％であった。細胞回収容器に回収された細胞懸濁液は４００ｍＬであり、これに７．３２Ｅ＋０９の細胞が含まれており、その細胞数の百分率は９１．４５％であった。また、培養容器に残存した細胞懸濁液は５０ｍＬであり、これに４．９１Ｅ＋０８の細胞が含まれており、その細胞数の百分率は６．１３％であった。

（実施例２）
第一実施形態の細胞回収方法において、上清排出工程、細胞回収工程、上清戻し工程、及び再回収工程をそれぞれ１回行った後に、上清戻し工程と再回収工程をさらに１回繰り返すことにより、洗浄回収を２回行って、培養容器から細胞を回収した。
廃液容器へ排出された培養上清は１５００ｍＬであり、これに１．８８Ｅ＋０８の細胞が含まれており、その細胞数の百分率は２．３４％であった。細胞回収容器に回収された細胞懸濁液は４５０ｍＬであり、これに７．５６Ｅ＋０９の細胞が含まれており、その細胞数の百分率は９４．５５％であった。また、培養容器に残存した細胞懸濁液は５０ｍＬであり、これに２．４８Ｅ＋０８の細胞が含まれており、その細胞数の百分率は３．１１％であった。

比較例１では、培養容器に細胞懸濁液が５０ｍｌ残存している。これは液量が少なくなると培養容器が閉塞して細胞回収容器に細胞懸濁液を移送できなくなるためである。
実施例１では、廃液容器から培養上清５０ｍｌを培養容器に移送して、培養容器を懸濁して洗浄し、細胞回収容器にさらに５０ｍｌを回収している。これにより培養容器に細胞懸濁液が５０ｍｌ残存している。実施例２では、実施例１の動作を再度繰り返して、２回の洗浄回収を行っている。

細胞回収容器に回収された細胞の数の百分率は、比較例１，実施例１，実施例２の順に、８５．３１％，９１．４５％，９４．５５％であった。
また、廃液容器へ排出された細胞の数の百分率は、比較例１，実施例１，実施例２の順に、２．５％，２．４２％，２．３４％であった。
さらに、培養容器に残存した細胞の数の百分率は、比較例１，実施例１，実施例２の順に、１２．１９％，６．１３％，３．１１％であった。

このように、上記実施形態の細胞回収方法によれば、細胞回収容器への細胞の回収効率は、洗浄回収を行わない場合に比較して、６％以上増加している。また、洗浄回収を１回行う場合と２回行う場合を比較すると、細胞の回収効率は、さらに３％以上増加している。また、廃液容器へ排出された細胞は、比較例１，実施例１，実施例２の順で低減しており、特に、培養容器に残存した細胞は、比較例１，実施例１，実施例２の順で大きく低減している。
以上の結果から、本実施形態の細胞回収方法における洗浄回収によって、新たな洗浄用の培養液や洗浄液を用いることなく、細胞の回収効率が向上していることが分かる。

本発明は、以上の実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。
例えば、図２，３では上清戻し工程において、ローラ型の攪拌部材を用いて攪拌を行っているが、積載台を振とうするなどその他の方法で培養容器を攪拌しても良く、また各工程においてさらに攪拌を行うなど適宜変更することが可能である。

本発明は、大量の細胞を培養する必要のあるバイオ医薬や再生医療、免疫療法等の分野において、好適に利用することが可能である。

１０培養容器
１１積載台
１２固定部材
１３攪拌部材
１４仕切部材
２０培地貯蔵容器（廃液容器）
３０細胞注入容器
４０細胞回収容器
５０サンプリング容器
６０チューブ

Claims

少なくとも、細胞を培養するための培養容器と、培養後の細胞を回収する細胞回収容器と、培養後の培地を回収する廃液容器とが、導管によって連結されてなる細胞培養用キットを用いて培養された細胞の回収方法であって、
培養済みの培養上清を前記培養容器から前記廃液容器へ移送する上清排出工程、
濃縮された細胞懸濁液を前記培養容器から前記細胞回収容器へ移送する細胞回収工程、
前記廃液容器に排出された培養上清の一部を前記培養容器に戻し、前記培養容器に残存する細胞を細胞懸濁液に懸濁させる上清戻し工程、及び
残存細胞が懸濁した細胞懸濁液を前記培養容器から前記細胞回収容器に再度移送する再回収工程を、含む
ことを特徴とする細胞回収方法。
請求項１記載の細胞回収方法において、前記上清戻し工程及び前記再回収工程を２回以上繰り返すことを特徴とする細胞回収方法。
培地等を貯蔵しておくための培地貯蔵容器が、前記廃液容器として用いられることを特徴とする請求項１又は２記載の細胞回収方法。
前記上清戻し工程において、所定の懸濁部材を用いて、前記培養容器の表面が所定の深さに下降する位置まで前記培養容器の表面を押圧しながら、前記懸濁部材を前記培養容器上で水平方向に往復移動させ、前記培養容器に残存する細胞を細胞懸濁液に分散させる
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の細胞回収方法。
前記上清排出工程の前に、前記培養容器の底面積を縮小させ、前記培養容器を静置させる静置工程を行う
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の細胞回収方法。
前記静置工程において、所定の仕切部材を用いて、前記培養容器の端部から表面と裏面を密着させながら前記仕切部材を前記培養容器上で移動させ、前記培養容器の底面積を縮小させる
ことを特徴とする請求項５記載の細胞回収方法。
前記上清戻し工程における前記培養容器に残存する細胞の細胞懸濁液での分散と、前記再回収工程における培養容器から前記細胞回収容器への細胞懸濁液の移送を、同時に行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の細胞回収方法。