JP2007104971A

JP2007104971A - Antisense oligonucleotide for splicing control of myostatin

Info

Publication number: JP2007104971A
Application number: JP2005299554A
Authority: JP
Inventors: Masafumi Matsuo; 雅文松尾; Yasuhiro Takeshima; 泰弘竹島; Atsushi Nishiyama; 敦史西山
Original assignee: New Industry Research Organization NIRO
Current assignee: New Industry Research Organization NIRO
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2007-04-26

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an antisense oligonucleotide capable of expressing a myostatin protein capable of preventing muscle atrophy and/or enhancing the development of the muscle while maintaining a part of the myostatin protein; and to provide a medicament for preventing and/or treating muscle atrophy using the antisense oligonucleotide as an active ingredient. <P>SOLUTION: The antisense oligonucleotide has a function for skipping exon 2 in the biosynthesis of a matured mRNA from an mRNA precursor transcribed from a myostatin gene by splicing in a myostatin protein synthetic system. The medicament for preventing and/or treating the muscle atrophy using the antisense oligonucleotide as an active ingredient is also provided. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、ミオスタチンのmRNA前駆体スプライシング制御オリゴヌクレオチドおよびそれを用いることを特徴とする筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤に関する。 The present invention relates to an mRNA precursor splicing control oligonucleotide for myostatin and a drug for preventing and / or treating muscle atrophy characterized by using the oligonucleotide.

成長および分化因子-8（GDF-8またはミオスタチン）（以下、本明細書においてこれらを「ミオスタチン」という。）は、形質転換成長因子-β（TGF-β）スーパーファミリーに属する（非特許文献１）。ヒトのミオスタチン遺伝子はクローニングされており（非特許文献２）、そしてミオスタチンの免疫反応性がヒト骨格筋において１型線維および２型線維の両方で検出され得ることが報告されている。ミオスタチンは、骨格筋の増殖および発達を負に調節することにおいて役割を果たしていると考えられる。筋肉発達の負への調節に関し、ミオスタチンのノックアウトマウスを用いた研究によりミオスタチンが重要な役割を果たし得ることが報告された（非特許文献１）。 Growth and differentiation factor-8 (GDF-8 or myostatin) (hereinafter referred to as “myostatin”) belongs to the transforming growth factor-β (TGF-β) superfamily (Non-patent Document 1). ). The human myostatin gene has been cloned (2) and it has been reported that the immunoreactivity of myostatin can be detected in both type 1 and type 2 fibers in human skeletal muscle. Myostatin is thought to play a role in negatively regulating skeletal muscle proliferation and development. Regarding the negative regulation of muscle development, studies using myostatin knockout mice have reported that myostatin can play an important role (Non-patent Document 1).

上記知見より、例えば、老化、後天性免疫不全症候群（AIDS）、多発性硬化症およびガンなどにより筋肉が縮小した個体において、ミオスタチンを阻害することで、筋肉の発達を促進しうることが考えられた。ミオスタチンの阻害に関し、増殖分化因子インヒビターおよびそれらの用途（特許文献１）、およびミオスタチン遺伝子プロモーターおよびその活性化阻害（特許文献２）が開示されている。また、筋ジストロフィー治療薬として、ミオスタチンに結合し、その活性を抑制するモノクローナル抗体（MYO-029）について、米国ペンシルバニア州のワイス株式会社が国際臨床試験を開始したという報告もある。 Based on the above findings, for example, in individuals whose muscles have contracted due to aging, acquired immune deficiency syndrome (AIDS), multiple sclerosis, cancer, etc., it may be possible to promote muscle development by inhibiting myostatin. It was. Regarding the inhibition of myostatin, growth differentiation factor inhibitors and their uses (Patent Document 1), and myostatin gene promoter and its activation inhibition (Patent Document 2) are disclosed. There is also a report that Wyeth Inc. of Pennsylvania, USA has started an international clinical trial for a monoclonal antibody (MYO-029) that binds to myostatin and suppresses its activity as a muscular dystrophy treatment.

しかしながら、これらの報告は、ミオスタチン活性を阻害するか、またはミオスタチンの発現を阻害するものであって、いずれもミオスタチンmRNA前駆体をターゲットにするものである。
McPherron, et al., Nature 387:83-90(1997) Nestor, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14938-43(1998) 特表2003-517580号公報特表2003-528574号公報 However, these reports either inhibit myostatin activity or inhibit myostatin expression, both targeting myostatin mRNA precursors.
McPherron, et al., Nature 387: 83-90 (1997) Nestor, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 14938-43 (1998) Special Table 2003-517580 Special Table 2003-528574

本発明は、ミオスタチンタンパク質の一部分は保持しつつ、筋肉萎縮の予防および／または筋肉発達の増強を可能とするミオスタチンタンパク質を発現しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することを課題とする。さらには、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an antisense oligonucleotide capable of expressing a myostatin protein that can prevent muscle atrophy and / or enhance muscle development while retaining a part of the myostatin protein. Furthermore, an object of the present invention is to provide a drug for preventing and / or treating muscle atrophy comprising the antisense oligonucleotide as an active ingredient.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ミオスタチンタンパク質合成系において、ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体からスプライシングによる成熟mRNAの生合成において、エクソン２を欠落させうる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより、上記課題を達成しうることを見出し、本発明を完成した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have deleted exon 2 in the biosynthesis of mature mRNA by splicing from the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene in the myostatin protein synthesis system. The inventors have found that the above-described problems can be achieved by using an antisense oligonucleotide having a function capable of achieving the present invention, thereby completing the present invention.

すなわち本発明は以下よりなる。
１．ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド。
２．以下の１）〜３）のいずれかより選択される塩基配列を含む前項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド：
１）配列表の配列番号１に記載の塩基配列の471〜620番目の領域から選択される部位とハイブリッド形成し、少なくとも17個のヌクレオチドからなる塩基配列；
２）以下の配列番号２〜４で示される配列のいずれかの塩基配列
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号２）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号３）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号４）；
３．前記オリゴヌクレオチドが、ヌクレオチドの糖部位2', -4'が-CO-架橋により修飾されたLocked Nucleic Acid (LNA)を含むオリゴヌクレオチド類縁体である前項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
４．ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング方法。
５．以下の工程１）〜３）を含むミオスタチン遺伝子のエクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング方法：
１）スクリーニングされるオリゴヌクレオチドをミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２とハイブリッド形成させる工程；
２）上記ハイブリッドされたmRNA前駆体から成熟mRNAを生成させる工程；
３）上記生成された成熟mRNAを用いて、エクソン２のスキッピングを分析する工程。
６．前項１〜３のいずれか一に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤。
７．筋肉萎縮が、老化、筋ジストロフィー、後天性免疫不全症候群(AIDS)、多発性硬化症、癌および外傷から選択される少なくとも一つに起因する筋肉萎縮である前項６に記載の筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤。 That is, this invention consists of the following.
1. An antisense oligonucleotide having a function of skipping exon 2 in the process of biosynthesis of mature mRNA of the myostatin gene by hybridizing with a sequence contained in exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene.
2. The antisense oligonucleotide according to item 1, comprising a base sequence selected from any of the following 1) to 3):
1) A base sequence consisting of at least 17 nucleotides that hybridizes with a site selected from the region 471 to 620 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing;
2) The base sequence of any one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 below
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 2)
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 3)
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 4);
3. 3. The antisense oligonucleotide according to item 1 or 2, wherein the oligonucleotide is an oligonucleotide analog containing Locked Nucleic Acid (LNA) in which the sugar sites 2 ′ and -4 ′ of the nucleotide are modified by —CO-crosslinking.
4). Screening of an antisense oligonucleotide having a function of skipping exon 2 in the process of biosynthesis of mature mRNA of the myostatin gene by hybridizing with a sequence contained in exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene Method.
5. A method for screening an antisense oligonucleotide having a function of skipping exon 2 of the myostatin gene comprising the following steps 1) to 3):
1) The step of hybridizing the oligonucleotide to be screened with exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene;
2) generating a mature mRNA from the hybridized mRNA precursor;
3) A step of analyzing exon 2 skipping using the generated mature mRNA.
6). A drug for preventing and / or treating muscle atrophy comprising the antisense oligonucleotide according to any one of the preceding items 1 to 3 as an active ingredient.
7). 7. The prevention and / or prevention of muscular atrophy according to item 6 above, wherein the muscular atrophy is muscular atrophy caused by at least one selected from aging, muscular dystrophy, acquired immune deficiency syndrome (AIDS), multiple sclerosis, cancer and trauma. Or a therapeutic agent.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いれば、ミオスタチンのタンパク質の一部分は保持しつつ、ミオスタチン本来の機能を喪失し、筋肉萎縮の予防および／または筋肉の発達の増強を可能とするミオスタチンタンパク質を発現しうる。すなわち、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより、エクソン２をスキッピングしたミオスタチンタンパク質を生体内で生合成させることが可能となる。ミオスタチンタンパク質のエクソン２をスキッピングさせることで、筋肉萎縮の予防および／または筋肉の発達を増強させることができる。さらには、ミオスタチンタンパク質の一部分を維持することにより、ミオスタチンタンパク質の全体を阻害することによる予期せぬ副作用の発症を軽減化することが期待され、より適切に筋肉の発達を制御することが可能となる。 The antisense oligonucleotide of the present invention can be used to express myostatin protein that retains a part of the protein of myostatin while losing its original function and prevents muscle atrophy and / or enhances muscle development. sell. That is, by using the antisense oligonucleotide of the present invention, the myostatin protein skipped from exon 2 can be biosynthesized in vivo. By skipping exon 2 of myostatin protein, it is possible to prevent muscle atrophy and / or enhance muscle development. Furthermore, by maintaining a part of myostatin protein, it is expected to reduce the onset of unexpected side effects by inhibiting the entire myostatin protein, and it is possible to control muscle development more appropriately Become.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２の配列部分を含む領域とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程でスプライシングを制御し、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有することを特徴とする。 The antisense oligonucleotide of the present invention controls splicing during the biosynthesis of the mature mRNA of the myostatin gene by hybridizing with the region containing the sequence part of exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene. , Having a function of skipping exon 2.

遺伝子から転写された遺伝情報は、スプライシングによりイントロン配列が除去される等の修飾を受け、エクソン配列のみからなる成熟mRNAとなる。さらに、この成熟mRNAがそのリーディングフレームにしたがって翻訳され、遺伝子にコードされた遺伝情報に忠実に従ったタンパク質の合成が可能となる。mRNA前駆体のスプライシングに関し、mRNA前駆体の塩基配列のうちで、イントロン配列とエクソン配列を正確に決定する機構がある。その機構の一例としてイントロン・エクソン境界部の配列であって、一定ルールで全ての遺伝子に保存されるコンセンサス配列が知られている。 The genetic information transcribed from the gene is modified such that the intron sequence is removed by splicing, and becomes a mature mRNA consisting only of exon sequences. Furthermore, this mature mRNA is translated according to its reading frame, and a protein can be synthesized in accordance with the genetic information encoded by the gene. Regarding the splicing of the mRNA precursor, there is a mechanism for accurately determining the intron sequence and the exon sequence in the base sequence of the mRNA precursor. As an example of the mechanism, a consensus sequence that is conserved in all genes according to a certain rule is known.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、成熟mRNAの生合成の過程で、スプライシングを制御し、エクソン２特異的にスキッピングせしめる機能を有するものであるから、全ての遺伝子に作用するコンセンサス配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは含まれず、ミオスタチン遺伝子のエクソン２の領域から選択される。 Since the antisense oligonucleotide of the present invention has a function of controlling splicing and skipping specific to exon 2 in the process of biosynthesis of mature mRNA, the antisense oligonucleotide for consensus sequences acting on all genes. Nucleotides are not included and are selected from the exon 2 region of the myostatin gene.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、具体的には、以下の１）〜３）のいずれかから選択される塩基配列を含む。 The antisense oligonucleotide of the present invention hybridizes with the sequence contained in exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene, thereby causing exon 2 to be skipped during the biosynthesis of the mature mRNA of the myostatin gene. It is an antisense oligonucleotide having a function, and specifically includes a base sequence selected from any of the following 1) to 3).

１）配列表の配列番号１に表される1128塩基よりなる塩基配列（PNAS. USA, 94 (23), 12457-12461 (1997), GenBank Accession No.AF019627）の471〜620番目の領域から選択される部位とハイブリッド形成し、少なくとも17個のヌクレオチドからなる塩基配列。
２）以下の配列番号２〜４で示される配列のいずれかの塩基配列。
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号２）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号３）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号４） 1) Selected from region 471 to 620 of the base sequence consisting of 1128 bases represented by SEQ ID NO: 1 (PNAS. USA, 94 (23), 12457-12461 (1997), GenBank Accession No. AF019627) A nucleotide sequence consisting of at least 17 nucleotides.
2) The base sequence of any one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 below.
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 2)
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 3)
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 4)

上記１）における少なくとも17個のヌクレオチドとは、17〜100個から選択される数のヌクレオチドをいう。ヌクレオチド数が17個より少なければ、ミオスタチン遺伝子とは異なる遺伝子や、異なる領域とハイブリッド形成する可能性が否定できない。また、100個より多ければ、人工的に合成するのは困難である。合成の容易さを考慮すると、ヌクレオチド数は可能な限り短いのが好ましく、その意味で好適には17〜50個、より好適には17〜25個である。 The at least 17 nucleotides in the above 1) refers to a number of nucleotides selected from 17 to 100. If the number of nucleotides is less than 17, the possibility of hybridizing with a gene different from the myostatin gene or with a different region cannot be denied. Moreover, if there are more than 100, it is difficult to synthesize artificially. Considering the ease of synthesis, the number of nucleotides is preferably as short as possible, and in that sense, it is preferably 17 to 50, more preferably 17 to 25.

上記１）のオリゴヌクレオチドとして、以下の配列番号５〜１７５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが例示される。
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG （配列番号５）
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG G （配列番号６）
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA （配列番号７）
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT （配列番号８）
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T （配列番号９） Examples of the oligonucleotide 1) include an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 to 175 below.
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG (SEQ ID NO: 5)
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG G (SEQ ID NO: 6)
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA (SEQ ID NO: 7)
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT (SEQ ID NO: 8)
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T (SEQ ID NO: 9)

AT AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号１０）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG （配列番号１１）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG G （配列番号１２）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA （配列番号１３）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT （配列番号１４）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T （配列番号１５）
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TT （配列番号１６） AT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 10)
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG (SEQ ID NO: 11)
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG G (SEQ ID NO: 12)
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA (SEQ ID NO: 13)
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT (SEQ ID NO: 14)
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T (SEQ ID NO: 15)
AT AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TT (SEQ ID NO: 16)

T AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号１７）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG （配列番号１８）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG G （配列番号１９）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA （配列番号２０）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT （配列番号２１）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T （配列番号２２）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TT （配列番号２３）
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TTG （配列番号２４） T AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 17)
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG (SEQ ID NO: 18)
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG G (SEQ ID NO: 19)
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA (SEQ ID NO: 20)
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT (SEQ ID NO: 21)
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T (SEQ ID NO: 22)
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TT (SEQ ID NO: 23)
T AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TTG (SEQ ID NO: 24)

AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号２５）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG （配列番号２６）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG G （配列番号２７）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA （配列番号２８）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT （配列番号２９）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T （配列番号３０）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TT （配列番号３１）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TTG （配列番号３２）
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TTG C （配列番号３３） AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 25)
AGG TTT GAT GAG TCT CAG (SEQ ID NO: 26)
AGG TTT GAT GAG TCT CAG G (SEQ ID NO: 27)
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GA (SEQ ID NO: 28)
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT (SEQ ID NO: 29)
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT T (SEQ ID NO: 30)
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TT (SEQ ID NO: 31)
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TTG (SEQ ID NO: 32)
AGG TTT GAT GAG TCT CAG GAT TTG C (SEQ ID NO: 33)

T CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号３４）
TT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号３５）
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号３６）
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号３７）
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号３８） T CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 34)
TT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 35)
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 36)
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 37)
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 38)

CAT AGG TTT GAT GAG TCT C （配列番号３９）
T CAT AGG TTT GAT GAG TCT C （配列番号４０）
TT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C （配列番号４１）
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C （配列番号４２）
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C （配列番号４３）
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C （配列番号４４）
GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C （配列番号４５） CAT AGG TTT GAT GAG TCT C (SEQ ID NO: 39)
T CAT AGG TTT GAT GAG TCT C (SEQ ID NO: 40)
TT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C (SEQ ID NO: 41)
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C (SEQ ID NO: 42)
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C (SEQ ID NO: 43)
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C (SEQ ID NO: 44)
GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT C (SEQ ID NO: 45)

CAT AGG TTT GAT GAG TCT （配列番号４６）
T CAT AGG TTT GAT GAG TCT （配列番号４７）
TT CAT AGG TTT GAT GAG TCT （配列番号４８）
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT （配列番号４９）
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT （配列番号５０）
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT （配列番号５１）
GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT （配列番号５２）
C GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT （配列番号５３） CAT AGG TTT GAT GAG TCT (SEQ ID NO: 46)
T CAT AGG TTT GAT GAG TCT (SEQ ID NO: 47)
TT CAT AGG TTT GAT GAG TCT (SEQ ID NO: 48)
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT (SEQ ID NO: 49)
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT (SEQ ID NO: 50)
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT (SEQ ID NO: 51)
GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT (SEQ ID NO: 52)
C GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TCT (SEQ ID NO: 53)

CAT AGG TTT GAT GAG TC （配列番号５４）
T CAT AGG TTT GAT GAG TC （配列番号５５）
TT CAT AGG TTT GAT GAG TC （配列番号５６）
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC （配列番号５７）
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC （配列番号５８）
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC （配列番号５９）
GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC （配列番号６０）
C GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC （配列番号６１）
CC GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC （配列番号６２） CAT AGG TTT GAT GAG TC (SEQ ID NO: 54)
T CAT AGG TTT GAT GAG TC (SEQ ID NO: 55)
TT CAT AGG TTT GAT GAG TC (SEQ ID NO: 56)
TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC (SEQ ID NO: 57)
C TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC (SEQ ID NO: 58)
TC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC (SEQ ID NO: 59)
GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC (SEQ ID NO: 60)
C GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC (SEQ ID NO: 61)
CC GTC TTT CAT AGG TTT GAT GAG TC (SEQ ID NO: 62)

GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC （配列番号６３）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC A （配列番号６４）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA （配列番号６５）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA （配列番号６６）
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T （配列番号６７） GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC (SEQ ID NO: 63)
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC A (SEQ ID NO: 64)
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA (SEQ ID NO: 65)
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA (SEQ ID NO: 66)
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T (SEQ ID NO: 67)

TA GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号６８）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC （配列番号６９）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC A （配列番号７０）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA （配列番号７１）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA （配列番号７２）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T （配列番号７３）
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TA （配列番号７４） TA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 68)
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC (SEQ ID NO: 69)
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC A (SEQ ID NO: 70)
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA (SEQ ID NO: 71)
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA (SEQ ID NO: 72)
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T (SEQ ID NO: 73)
TA GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TA (SEQ ID NO: 74)

A GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号７５）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC （配列番号７６）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC A （配列番号７７）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA （配列番号７８）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA （配列番号７９）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T （配列番号８０）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TA （配列番号８１）
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TAT （配列番号８２） A GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 75)
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC (SEQ ID NO: 76)
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC A (SEQ ID NO: 77)
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA (SEQ ID NO: 78)
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA (SEQ ID NO: 79)
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T (SEQ ID NO: 80)
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TA (SEQ ID NO: 81)
A GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TAT (SEQ ID NO: 82)

GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号８３）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC （配列番号８４）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC A （配列番号８５）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA （配列番号８６）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA （配列番号８７）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T （配列番号８８）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TA （配列番号８９）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TAT （配列番号９０）
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TAT A （配列番号９１） GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 83)
GGA GTC TCG ACG GGT CTC (SEQ ID NO: 84)
GGA GTC TCG ACG GGT CTC A (SEQ ID NO: 85)
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AA (SEQ ID NO: 86)
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA (SEQ ID NO: 87)
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA T (SEQ ID NO: 88)
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TA (SEQ ID NO: 89)
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TAT (SEQ ID NO: 90)
GGA GTC TCG ACG GGT CTC AAA TAT A (SEQ ID NO: 91)

T GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号９２）
TT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号９３）
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号９４）
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号９５）
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号９６） T GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 92)
TT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 93)
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 94)
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 95)
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 96)

GTA GGA GTC TCG ACG GGT C （配列番号９７）
T GTA GGA GTC TCG ACG GGT C （配列番号９８）
TT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C （配列番号９９）
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C （配列番号１００）
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C （配列番号１０１）
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C （配列番号１０２）
ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C （配列番号１０３） GTA GGA GTC TCG ACG GGT C (SEQ ID NO: 97)
T GTA GGA GTC TCG ACG GGT C (SEQ ID NO: 98)
TT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C (SEQ ID NO: 99)
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C (SEQ ID NO: 100)
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C (SEQ ID NO: 101)
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C (SEQ ID NO: 102)
ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT C (SEQ ID NO: 103)

GTA GGA GTC TCG ACG GGT （配列番号１０４）
T GTA GGA GTC TCG ACG GGT （配列番号１０５）
TT GTA GGA GTC TCG ACG GGT （配列番号１０６）
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT （配列番号１０７）
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT （配列番号１０８）
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT （配列番号１０９）
ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT （配列番号１１０）
C ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT （配列番号１１１） GTA GGA GTC TCG ACG GGT (SEQ ID NO: 104)
T GTA GGA GTC TCG ACG GGT (SEQ ID NO: 105)
TT GTA GGA GTC TCG ACG GGT (SEQ ID NO: 106)
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT (SEQ ID NO: 107)
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT (SEQ ID NO: 108)
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT (SEQ ID NO: 109)
ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT (SEQ ID NO: 110)
C ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GGT (SEQ ID NO: 111)

GTA GGA GTC TCG ACG GG （配列番号１１２）
T GTA GGA GTC TCG ACG GG （配列番号１１３）
TT GTA GGA GTC TCG ACG GG （配列番号１１４）
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG （配列番号１１５）
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG （配列番号１１６）
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG （配列番号１１７）
ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG （配列番号１１８）
C ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG （配列番号１１９）
AC ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG （配列番号１２０） GTA GGA GTC TCG ACG GG (SEQ ID NO: 112)
T GTA GGA GTC TCG ACG GG (SEQ ID NO: 113)
TT GTA GGA GTC TCG ACG GG (SEQ ID NO: 114)
GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG (SEQ ID NO: 115)
T GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG (SEQ ID NO: 116)
CT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG (SEQ ID NO: 117)
ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG (SEQ ID NO: 118)
C ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG (SEQ ID NO: 119)
AC ACT GTT GTA GGA GTC TCG ACG GG (SEQ ID NO: 120)

AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC （配列番号１２１）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC G （配列番号１２２）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA （配列番号１２３）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC （配列番号１２４）
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G （配列番号１２５） AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC (SEQ ID NO: 121)
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC G (SEQ ID NO: 122)
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA (SEQ ID NO: 123)
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC (SEQ ID NO: 124)
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G (SEQ ID NO: 125)

AA CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号１２６）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC （配列番号１２７）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC G （配列番号１２８）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA （配列番号１２９）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC （配列番号１３０）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G （配列番号１３１）
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC GG （配列番号１３２） AA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 126)
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC (SEQ ID NO: 127)
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC G (SEQ ID NO: 128)
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA (SEQ ID NO: 129)
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC (SEQ ID NO: 130)
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G (SEQ ID NO: 131)
AA CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC GG (SEQ ID NO: 132)

A CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号１３３）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC （配列番号１３４）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC G （配列番号１３５）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA （配列番号１３６）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC （配列番号１３７）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G （配列番号１３８）
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC GG （配列番号１３９） A CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 133)
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC (SEQ ID NO: 134)
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC G (SEQ ID NO: 135)
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA (SEQ ID NO: 136)
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC (SEQ ID NO: 137)
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G (SEQ ID NO: 138)
A CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC GG (SEQ ID NO: 139)

CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号１４０）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC （配列番号１４１）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC G （配列番号１４２）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA （配列番号１４３）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC （配列番号１４４）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G （配列番号１４５）
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC GG （配列番号１４６） CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 140)
CAC TGT TGT AGG AGT CTC (SEQ ID NO: 141)
CAC TGT TGT AGG AGT CTC G (SEQ ID NO: 142)
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GA (SEQ ID NO: 143)
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC (SEQ ID NO: 144)
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC G (SEQ ID NO: 145)
CAC TGT TGT AGG AGT CTC GAC GG (SEQ ID NO: 146)

C AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号１４７）
AC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号１４８）
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号１４９）
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号１５０）
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号１５１） C AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 147)
AC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 148)
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 149)
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 150)
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 151)

AAA CAC TGT TGT AGG AGT C （配列番号１５２）
C AAA CAC TGT TGT AGG AGT C （配列番号１５３）
AC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C （配列番号１５４）
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C （配列番号１５５）
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C （配列番号１５６）
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C （配列番号１５７）
TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C （配列番号１５８） AAA CAC TGT TGT AGG AGT C (SEQ ID NO: 152)
C AAA CAC TGT TGT AGG AGT C (SEQ ID NO: 153)
AC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C (SEQ ID NO: 154)
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C (SEQ ID NO: 155)
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C (SEQ ID NO: 156)
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C (SEQ ID NO: 157)
TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT C (SEQ ID NO: 158)

AAA CAC TGT TGT AGG AGT （配列番号１５９）
C AAA CAC TGT TGT AGG AGT （配列番号１６０）
AC AAA CAC TGT TGT AGG AGT （配列番号１６１）
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT （配列番号１６２）
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT （配列番号１６３）
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT （配列番号１６４）
TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT （配列番号１６５）
T TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT （配列番号１６６） AAA CAC TGT TGT AGG AGT (SEQ ID NO: 159)
C AAA CAC TGT TGT AGG AGT (SEQ ID NO: 160)
AC AAA CAC TGT TGT AGG AGT (SEQ ID NO: 161)
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT (SEQ ID NO: 162)
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT (SEQ ID NO: 163)
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT (SEQ ID NO: 164)
TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT (SEQ ID NO: 165)
T TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AGT (SEQ ID NO: 166)

AAA CAC TGT TGT AGG AG （配列番号１６７）
C AAA CAC TGT TGT AGG AG （配列番号１６８）
AC AAA CAC TGT TGT AGG AG （配列番号１６９）
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG （配列番号１７０）
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG （配列番号１７１）
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG （配列番号１７２）
TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG （配列番号１７３）
T TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG （配列番号１７４）
AT TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG （配列番号１７５） AAA CAC TGT TGT AGG AG (SEQ ID NO: 167)
C AAA CAC TGT TGT AGG AG (SEQ ID NO: 168)
AC AAA CAC TGT TGT AGG AG (SEQ ID NO: 169)
CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG (SEQ ID NO: 170)
G CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG (SEQ ID NO: 171)
TG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG (SEQ ID NO: 172)
TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG (SEQ ID NO: 173)
T TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG (SEQ ID NO: 174)
AT TTG CAC AAA CAC TGT TGT AGG AG (SEQ ID NO: 175)

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを合成する通常の方法にしたがって調製することができる。例えば市販の自動合成機等一般に用いられるヌクレオチドの合成手法により、合成することができる。また、合成されたオリゴヌクレオチドは、通常この分野で用いられる方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、溶媒抽出、塩析等を用いて精製することができる。 The antisense oligonucleotide of the present invention can be prepared according to a conventional method for synthesizing oligonucleotides. For example, it can be synthesized by a commonly used nucleotide synthesis method such as a commercially available automatic synthesizer. The synthesized oligonucleotide can be purified by a method usually used in this field, for example, high performance liquid chromatography, polyacrylamide gel electrophoresis, solvent extraction, salting out and the like.

天然型（リボースまたはデオキシリボース）糖およびホスホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清および細胞内のヌクレアーゼにより速やかに分解される。このことは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として、例えば医薬として生体に投与するには、有用性を制限することとなる。 Oligonucleotides containing natural (ribose or deoxyribose) sugars and phosphodiester bonds are rapidly degraded by nucleases in serum and cells. This limits the usefulness of administering an antisense oligonucleotide as an active ingredient, for example, as a medicine to a living body.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾されたオリゴヌクレオチド類縁体も含む。ヌクレアーゼ安定性を改善するために、糖部分、塩基部分の修飾、および／またはヌクレオチド間ホスホジエステル結合を修飾し、オリゴヌクレオチド類縁体とすることができる。代表的なものとして、天然型ヌクレオチドの糖部位2', -4'を-CO-で架橋したLNA(Locked Nucleic Acid )や、糖部位2', -4'をエチレンで架橋したENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids)などのオリゴヌクレオチド類縁体が挙げられる。特に好適にはLNAであり、DNAと同様にアミダイト体として存在するので、ホスホアミダイト法により、合成することができる。精製は、逆相カラムによるHPLCの手法により行うことができる。その他の代表的なオリゴヌクレオチド類縁体として、ホスホジエステル結合の酸素の一部または全部を硫黄原子で置換したホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート型のオリゴヌクレオチドが挙げられる。そのほか、ボラノホスフェート、ホスホロセレネート、アミデート結合を含むオリゴヌクレオチドも利用することができる。 The antisense oligonucleotides of the invention also include modified oligonucleotide analogs. To improve nuclease stability, sugar moieties, base moiety modifications, and / or internucleotide phosphodiester linkages can be modified into oligonucleotide analogs. Typical examples include LNA (Locked Nucleic Acid) in which sugar sites 2 'and -4' of natural nucleotides are cross-linked with -CO-, and ENA (2 'in which sugar sites 2' and -4 'are cross-linked with ethylene. -O, 4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids). Particularly preferred is LNA, which is present as an amidite like DNA, and can be synthesized by the phosphoamidite method. Purification can be performed by HPLC using a reverse phase column. Other typical oligonucleotide analogues include phosphorothioate or phosphorodithioate type oligonucleotides in which part or all of the oxygen in the phosphodiester bond is substituted with a sulfur atom. In addition, boranophosphate, phosphoroselenate, and an oligonucleotide containing an amidate bond can also be used.

さらに、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容しうる塩の形態で修飾されていてもよい。薬学的に許容される塩とは、薬学的に許容される無機および有機酸および塩基などをいう。具体的には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸およびベンゼンスルホン酸などが挙げられる。適当な塩基の例として、アルカリ金属(例えばナトリウム)、アルカリ土類金属(例えばマグネシウム)、アンモニウムおよびNR⁴⁺(ここで、RはC_1-4アルキル)塩などが挙げられる。 Furthermore, the antisense oligonucleotide of the present invention may be modified in the form of a pharmaceutically acceptable salt. Pharmaceutically acceptable salts refer to pharmaceutically acceptable inorganic and organic acids and bases and the like. Specifically, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, Examples include citric acid, methanesulfonic acid, formic acid, benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, and benzenesulfonic acid. Examples of suitable bases include alkali metal (eg sodium), alkaline earth metal (eg magnesium), ammonium and NR ⁴⁺ (where R is C _1-4 alkyl) salts and the like.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、該アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とする筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤に利用することができる。筋肉萎縮は、筋ジストロフィー、後天性免疫不全症候群(AIDS)、多発性硬化症、癌などの疾患に起因するものに限られず、例えば老化や外傷などに起因するものも挙げられる。 The antisense oligonucleotide of the present invention can be used as a preventive and / or therapeutic agent for muscle atrophy containing the antisense oligonucleotide as an active ingredient. Muscle atrophy is not limited to those caused by diseases such as muscular dystrophy, acquired immune deficiency syndrome (AIDS), multiple sclerosis, and cancer, and examples thereof include those caused by aging and trauma.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として、上記予防および／または治療用薬剤として利用するために、製剤として薬学的に許容される担体と、そして所望により他の予防的および／または治療的成分と共に含むことができる。薬学的に許容できる担体は受容者に有害でなく、また他の予防的および／若しくは治療的成分を含む場合に、これら他の成分と適合することが必要とされる。 In order to use the antisense oligonucleotide of the present invention as an active ingredient, as a prophylactic and / or therapeutic agent, a pharmaceutically acceptable carrier as a preparation, and optionally other prophylactic and / or therapeutic ingredients Can be included. Pharmaceutically acceptable carriers are not harmful to the recipient and are required to be compatible with these other ingredients if they contain other prophylactic and / or therapeutic ingredients.

本発明の予防および／または治療用薬剤は、適宜、担体、香料、色素等を用いて、ペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、ゼラチン等で被覆してカプセルに加工して利用することもできる。薬剤の形態として、当業者に公知の種々の形態の医薬製剤、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤及びトローチ剤等の経口剤、並びに軟膏、ローション、クリーム等の経皮吸収剤、注射剤、および坐剤等の非経口剤が挙げられる。 The preventive and / or therapeutic agent of the present invention may be used by appropriately processing into pellets, tablets, granules, etc. using carriers, fragrances, pigments, etc., or coated with gelatin or the like and processed into capsules. it can. As pharmaceutical forms, various forms of pharmaceutical preparations known to those skilled in the art, such as tablets, granules, fine granules, powders, capsules, pills, solutions, emulsions, suspensions, syrups and lozenges, etc. And oral preparations such as ointments, lotions and creams, and parenteral preparations such as injections and suppositories.

筋肉内、皮下および静脈内投与に適した予防および／または治療用薬剤としては、アンプル、充填済注射器、少量輸液などの投与形態とすることができる。安定性の点から、バイアル、アンプル、充填済注射器等に充填後、冷凍し、通常の凍結乾燥処理により水分を除き、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。薬剤は、医薬の分野で自体公知の方法により、あるいは今後開発される方法により製剤化することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンの形であってもよく、懸濁、安定化および／または分散剤のような製剤用薬剤であってもよい。 Prophylactic and / or therapeutic agents suitable for intramuscular, subcutaneous and intravenous administration can be administration forms such as ampoules, prefilled syringes and small infusions. From the viewpoint of stability, it can be frozen after filling into vials, ampoules, filled syringes, etc., and the liquid can be re-prepared from the lyophilized product immediately before use by removing water by ordinary lyophilization treatment. The drug can be formulated by a method known per se in the field of medicine or a method developed in the future. The composition may be in the form of a suspension, solution or emulsion in an oily or aqueous medium, and may be a pharmaceutical agent such as a suspension, stabilization and / or dispersion agent.

経口投与用の錠剤およびカプセルは、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤または湿潤剤のような慣用の賦形剤を含むことができる。錠剤は当分野で既知の方法によりコーティングすることができる。経口液体製剤は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップまたはエリキシルの形であってもよく、または使用前に水または適当な媒体で構成するための乾燥製品であってもよい。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性媒体または防腐剤のような慣用の添加剤を含んでいてもよい。 Tablets and capsules for oral administration can contain conventional excipients such as binders, fillers, lubricants, disintegrants, or wetting agents. The tablets can be coated by methods known in the art. Oral liquid formulations may be, for example, in the form of an aqueous or oily suspension, solution, emulsion, syrup or elixir, or a dry product for constitution with water or a suitable medium prior to use. . Such liquid preparations may contain conventional additives such as suspending agents, emulsifying agents, non-aqueous media or preservatives.

本発明は、ミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２に含まれる配列とハイブリッド形成することにより、該ミオスタチン遺伝子の成熟mRNAの生合成の過程で、エクソン２をスキッピングせしめる機能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドのスクリーニング方法にも及ぶ。 The present invention relates to an antisense having a function of skipping exon 2 in the process of biosynthesis of mature mRNA of the myostatin gene by hybridizing with a sequence contained in exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene. It also extends to oligonucleotide screening methods.

スクリーニングの方法は、以下の工程１）〜３）を含む方法による。
１）スクリーニングされるオリゴヌクレオチドをミオスタチン遺伝子から転写されたmRNA前駆体のエクソン２とハイブリッド形成させる工程；
２）上記ハイブリッドされたmRNA前駆体から成熟mRNAを生成させる工程；
３）上記生成された成熟mRNAを用いて、エクソン２のスキッピングを分析する工程。 The screening method is based on a method including the following steps 1) to 3).
1) The step of hybridizing the oligonucleotide to be screened with exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene;
2) generating a mature mRNA from the hybridized mRNA precursor;
3) A step of analyzing exon 2 skipping using the generated mature mRNA.

エクソン２のスキッピングの分析は、成熟mRNAを、例えばRT-PCRなどの核酸増幅手段を用いて増幅した核酸の塩基配列を分析したり、電気泳動による分析法により行うことができる。 Analysis of exon 2 skipping can be performed by analyzing the base sequence of a nucleic acid obtained by amplifying mature mRNA using a nucleic acid amplification means such as RT-PCR, or by an analysis method by electrophoresis.

以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the scope of the present invention is not limited to these examples.

（実施例１）アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
以下のMyo 11, Myo 13, Myo 21 のオリゴヌクレオチドを各々調製した。
以下のオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列表の配列番号１に示すミオスタチン遺伝子（GenBank Accession No.AF019627）のヌクレオチド番号521〜540、481〜500、491〜510各々に相補的な配列である。これらのオリゴヌクレオチドは、天然型ヌクレオチドの糖部位2', -4'を-CO-で架橋したオリゴヌクレオチド類縁体（Locked Nucleic Acid (LNA)）からなる。
(Myo 11) CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA （配列番号２）
(Myo 13) GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT （配列番号３）
(Myo 21) AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT （配列番号４） (Example 1) Preparation of antisense oligonucleotides The following Myo 11, Myo 13 and Myo 21 oligonucleotides were prepared.
The nucleotide sequences of the following oligonucleotides are complementary sequences to nucleotide numbers 521 to 540, 481 to 500, and 491 to 510 of the myostatin gene (GenBank Accession No. AF019627) shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. These oligonucleotides are composed of oligonucleotide analogues (Locked Nucleic Acid (LNA)) in which sugar sites 2 ′ and -4 ′ of natural nucleotides are cross-linked with —CO—.
(Myo 11) CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 2)
(Myo 13) GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 3)
(Myo 21) AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 4)

上記オリゴヌクレオチドは、核酸自動合成機（パーキンエルマー社製ABI model 394 DNA/RNA synthesizer）を用い、40 nmolスケールで調製した。LNAは、DNAと同様にアミダイト体としてあるので、これをホスホアミダイト法を用いて合成し、オリゴヌクレオチド類縁体とした。 The oligonucleotide was prepared on a 40 nmol scale using an automatic nucleic acid synthesizer (ABI model 394 DNA / RNA synthesizer manufactured by PerkinElmer). Since LNA is in the form of an amidite like DNA, it was synthesized using the phosphoamidite method to obtain an oligonucleotide analogue.

目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を濃アンモニア水で処理することによってオリゴマーを支持体から切り出すとともに、リン原子上の保護基シアノエチル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相HPLC（島津製作所製LC-10VP、カラム（Merck, Chromolith Performance RP-18e(4.6×100mm)）、A溶液：5%アセトニトリル、0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7.0、B溶液:25％アセトニトリル、B％:10％→45％(10min, linear gradient); 60℃; 2ml/min; 254nm)にて精製し、各々目的分画を回収した。溶媒を減圧留去した後、80％酢酸水を加え２０分放置し、DMTr基を除去した。溶媒留去後、水0.5mLに溶解し、Ultrafree-MC（ミリポア製、product No. UFC4 OHV25）でろ過し、溶媒留去後目的の化合物（オリゴヌクレオチド）を得た。本化合物は、逆相HPLC（カラム（Merck, Chromolith Performance RP-18e(4.6×100mm)）、A溶液：5％アセトニトリル、0.1M酢酸トリエチルアミン水溶液(TEAA), pH7.0、B溶液:25％アセトニトリル、0.1M TEAA、B％:15％→60％(10min, linear gradient); 60℃; 2ml/min; 254nm)により溶出した。 The oligomer was excised from the support by treating the protected oligonucleotide analog having the target sequence with concentrated aqueous ammonia, and the protecting group cyanoethyl group on the phosphorus atom and the protecting group on the nucleobase were removed. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the remaining residue was reversed-phase HPLC (LC-10VP, manufactured by Shimadzu Corporation, column (Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6 × 100 mm)), solution A: 5% acetonitrile, 0.1M triethylamine acetate Purify with aqueous solution (TEAA), pH 7.0, B solution: 25% acetonitrile, B%: 10% → 45% (10 min, linear gradient); 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm). It was collected. After the solvent was distilled off under reduced pressure, 80% aqueous acetic acid was added and the mixture was allowed to stand for 20 minutes to remove the DMTr group. After the solvent was distilled off, the residue was dissolved in 0.5 mL of water and filtered through Ultrafree-MC (Millipore, product No. UFC4 OHV25), and the target compound (oligonucleotide) was obtained after the solvent was distilled off. This compound is reverse phase HPLC (column (Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6 × 100mm)), solution A: 5% acetonitrile, 0.1M triethylamine acetate aqueous solution (TEAA), pH 7.0, solution B: 25% acetonitrile. , 0.1M TEAA, B%: 15% → 60% (10 min, linear gradient); 60 ° C .; 2 ml / min; 254 nm).

（実施例２）エクソン２が欠落したミオスタチンmRNAの確認
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した筋芽細胞初代培養系で発現したmRNAについて確認した。 (Example 2) Confirmation of myostatin mRNA lacking exon 2 The mRNA expressed in the myoblast primary culture system into which the antisense oligonucleotide of the present invention was introduced was confirmed.

１．筋芽細胞初代培養系作製
以下のようにして、筋芽細胞の初代培養系を作製した。
１）デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者より無菌的に採取した筋組織を細切し、リン酸緩衝液(PBS)によって２回洗浄した。
２）１）の筋組織をDifco Bacto^TM トリプトン250の5％溶液により37℃で30分間処理することにより、酵素的に遊離細胞を得た。
３）２）の遊離細胞を20％ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM培地（SIGMA社）により２回洗浄した。
４）３）の細胞を20％FBS及び4％ ultroserG（CIPHERGEN社）を含むDMEM培地に浮遊させた。
５）４）の浮遊細胞を、メッシュ（セルストレイナー35-2360 (Becton Dekinson社)）を通して遊離細胞のみ回収した。
６）５）で回収した細胞を20％FBSを含むDMEM培地で、ゼラチンコートしたディッシュに播種した。
７）上記細胞を37℃ 5％CO₂ in air中にて培養した。
８）培養細胞を６穴プレート（ゼラチンコート）に播き、コンフルエントになるまで37℃ 5％CO₂ in air中にて培養した。 1. Production of primary culture system of myoblasts A primary culture system of myoblasts was produced as follows.
1) Muscle tissue collected aseptically from a Duchenne muscular dystrophy patient was minced and washed twice with phosphate buffered saline (PBS).
2) The free tissue was obtained enzymatically by treating the muscle tissue of 1) with a 5% solution of Difco Bacto ^™ Tryptone 250 at 37 ° C. for 30 minutes.
3) The free cells of 2) were washed twice with DMEM medium (SIGMA) containing 20% fetal bovine serum (FBS).
4) The cells in 3) were suspended in a DMEM medium containing 20% FBS and 4% ultroserG (CIPHERGEN).
5) Only free cells were collected from the floating cells in 4) through a mesh (Cell Strainer 35-2360 (Becton Dekinson)).
6) The cells collected in 5) were seeded in a gelatin-coated dish with DMEM medium containing 20% FBS.
7) The cells were cultured at 37 ° C. in 5% CO ₂ in air.
8) The cultured cells were seeded in a 6-well plate (gelatin coat) and cultured at 37 ° C. in 5% CO ₂ in air until confluent.

２．トランスフェクション
以下のようにして、実施例１で調製した各オリゴヌクレオチドを筋芽細胞にトランスフェクションした。
１）Opti-MEN 培地(GIBCO-BRL社) 100μlに、実施例１で調製したオリゴヌクレオチド（Milli Q滅菌水で100pmol/μlとしたもの）を各々200pmol溶解した。
２）１）の溶液へ6μlのプラス試薬(plus reagent:GIBCO-BRL社)を加え、15分間室温で放置した。
３）別のチューブで、Opti-MEN培地(GIBCO-BRL社) 100μlにリポフェクタミン(GIBCO-BRL社) 8μlを溶解した。
４）２）の処理後、処理液に３）を加え、さらに15分間室温で放置した。
５）筋芽細胞をPBSによって１回洗浄した後、Opti-MEN培地(GIBCO-BRL社) 800μlを加えた。
６）４）の処理後、処理液を５）の細胞に加えた。
７）６）の細胞を37℃ 5％CO₂ in air中にて３時間培養した後、60％FBSを含むDMEM培地を500μl各ウェルに加えた。
８）さらに培養を継続した。 2. Transfection Each of the oligonucleotides prepared in Example 1 was transfected into myoblasts as follows.
1) 200 pmol of the oligonucleotide prepared in Example 1 (100 pmol / μl with Milli Q sterilized water) was dissolved in 100 μl of Opti-MEN medium (GIBCO-BRL).
2) 6 μl of a plus reagent (GIBCO-BRL) was added to the solution of 1) and left at room temperature for 15 minutes.
3) In a separate tube, 8 μl of Lipofectamine (GIBCO-BRL) was dissolved in 100 μl of Opti-MEN medium (GIBCO-BRL).
4) After the treatment of 2), 3) was added to the treatment solution, and the mixture was further left at room temperature for 15 minutes.
5) Myoblasts were washed once with PBS, and then 800 μl of Opti-MEN medium (GIBCO-BRL) was added.
6) After the treatment of 4), the treatment solution was added to the cells of 5).
7) After culturing the cells of 6) in 37 ° C., 5% CO ₂ in air for 3 hours, 500 μl of DMEM medium containing 60% FBS was added to each well.
8) The culture was further continued.

３．RNAの抽出
以下のようにしてRNAの抽出を行った。
１）各オリゴヌクレオチドをトランスフェクションした細胞を、各々２日間培養した後、PBSにて１回洗浄し、RNA抽出用試薬(ISOGEN; ニッポンジーン社）500μlを細胞に添加した。
２）５分間室温に放置した後、ウェル内のRNA抽出用試薬をチューブに回収した。
３）ISOGENのプロトコールに従ってRNAを抽出した。
４）最終的にDEPW（ジエチルピロカーボネイト処理滅菌水）20μlにRNAを溶解した。 3. RNA extraction RNA was extracted as follows.
1) Cells transfected with each oligonucleotide were cultured for 2 days, washed once with PBS, and 500 μl of RNA extraction reagent (ISOGEN; Nippon Gene) was added to the cells.
2) After leaving at room temperature for 5 minutes, the RNA extraction reagent in the well was collected in a tube.
3) RNA was extracted according to the ISOGEN protocol.
4) Finally, RNA was dissolved in 20 μl of DEPW (diethyl pyrocarbonate-treated sterilized water).

４．逆転写反応
以下のようにして逆転写反応を行った。
１)RNA 2μgにDEPWを加え、7μlとした。
２)１)の溶液に、ランダムヘキサマー（random hexmer; Invitrogen社）3μg/μl（Milli Q滅菌水で20倍希釈したもの）を1μl、dNTPs（Takara Ex Taq(タカラバイオ社)に添付）4μlを加えた。
３）65℃で5分間加熱した。
４）上記の反応液に、M-MLV Reverse Transcriptase 200U/μl(MMLV RT 200U/μl; Invitrogen社) 1μl、ヒト胎盤由来RNA分解酵素阻害剤(ヒト胎盤由来Ribonuclease Inhibitor;タカラバイオ製 40U/μl) 1μl、ジチオスレイトール100mM(DTT 100mM; MMLV RTに添付) 2μl、緩衝液 (250 mM Tris-HCl(pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂; MMLV RTに添付) 4μlを加え、25℃で10分間おいた。
５）37℃で55分間保温し、その後70℃で15分間加熱した。
６）反応後は-20℃で保存した。 4). Reverse transcription reaction The reverse transcription reaction was performed as follows.
1) DEPW was added to 2 μg of RNA to make 7 μl.
2) 1 μl of random hexamer (Invitrogen) 3 μg / μl (20-fold diluted with Milli Q sterilized water), dNTPs (attached to Takara Ex Taq (Takara Bio)) 4 μl Was added.
3) Heated at 65 ° C. for 5 minutes.
4) In the above reaction solution, M-MLV Reverse Transcriptase 200 U / μl (MMLV RT 200 U / μl; Invitrogen) 1 μl, human placenta-derived RNase inhibitor (human placenta-derived Ribonuclease Inhibitor; manufactured by Takara Bio 40 U / μl) 1 μl, dithiothreitol 100 mM (DTT 100 mM; attached to MMLV RT) 2 μl, buffer (250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl ₂ ; attached to MMLV RT) 4 μl, add 25 ° C For 10 minutes.
5) Incubated at 37 ° C for 55 minutes, then heated at 70 ° C for 15 minutes.
6) After the reaction, it was stored at -20 ° C.

５．ポリメラーゼチェーンリアクション(PCR)反応
以下のようにしてPCR反応を行った。
１）下記成分を混和後、94℃で4分間加熱した。
逆転写反応産物3μl
フォワードプライマー（10pmol/μl）1μl
リバースプライマー（10pmol/μl）1μl
PCR用DNA ポリメラーゼ(Takara Ex Taq; タカラバイオ社) 0.1μl
dNTPs (Takara Ex Taqに添付) 2μl
20mM Tris-HCl 緩衝液(pH8.0) (Takara Ex Taqに添付) 2μl
Milli Q滅菌水11μl
２）94℃1分・60℃1分・72℃1分の処理を35サイクル行った。
３）72℃で7分間加熱した。
なお、PCR反応に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
フォワードプライマー：TTC GTC TGG AAA CAG CTC CT（exon 1）（配列番号１７６）
リバースプライマー：AGA GGG TAA CGA CAG CAT CG（exon 3）（配列番号１７７） 5. Polymerase chain reaction (PCR) reaction The PCR reaction was performed as follows.
1) The following components were mixed and heated at 94 ° C for 4 minutes.
Reverse transcription reaction product 3μl
Forward primer (10 pmol/μl) 1μl
Reverse primer (10 pmol/μl) 1μl
DNA polymerase for PCR (Takara Ex Taq; 0.1 μl)
dNTPs (attached to Takara Ex Taq) 2μl
20 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) (attached to Takara Ex Taq) 2 μl
Milli Q sterile water 11μl
2) 35 cycles of 94 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute were performed.
3) Heated at 72 ° C. for 7 minutes.
The base sequences of the forward primer and reverse primer used for the PCR reaction are as follows.
Forward primer: TTC GTC TGG AAA CAG CTC CT (exon 1) (SEQ ID NO: 176)
Reverse primer: AGA GGG TAA CGA CAG CAT CG (exon 3) (SEQ ID NO: 177)

６．PCR反応の反応産物の確認
１）PCR反応の反応産物を2％アガロースゲル電気泳動によって解析した。
泳動したゲルをエチジウムブロミドで染色し、得られたエクソン２がスキップしたバンド(A)と得られたエクソン２がスキップしなかったバンド(B)をゲル撮影装置を用いて可視化した。その結果を図１に示した。
２）得られたエクソン２がスキップしたmRNA (A)と得られたエクソン２がスキップしなかったmRNA (B)についてのPCR反応の反応産物をBig Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing kit （アプライドバイオシステムズ社）を用い、ABI PRISM 310 Genetic analyzer（アプライドバイオシステムズ社）によってシークエンス反応を行って、塩基配列を確認した。反応手順はマニュアルに従った。その結果を図２および３に示した。 6). Confirmation of PCR reaction product 1) PCR reaction product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis.
The electrophoresed gel was stained with ethidium bromide, and a band (A) where exon 2 was skipped and a band (B) where exon 2 was not skipped were visualized using a gel imaging device. The results are shown in FIG.
2) Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) using PCR reaction products of mRNA (A) skipped by exon 2 and mRNA (B) skipped by exon 2 The base sequence was confirmed by performing a sequence reaction with ABI PRISM 310 Genetic analyzer (Applied Biosystems). The reaction procedure followed the manual. The results are shown in FIGS.

本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いれば、ミオスタチンのタンパク質の一部分は保持しつつ、筋肉萎縮の予防および／または筋肉の発達の増強を可能とするミオスタチンタンパク質を発現しうる。すなわち、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより、エクソン２がスキッピングされたミオスタチンタンパク質を生体内で生合成させることが可能となる。ミオスタチンタンパク質のエクソン２をスキッピングさせることで、筋肉萎縮の予防および／または筋肉の発達を増強させることができる。 The antisense oligonucleotide of the present invention can be used to express a myostatin protein that can prevent muscle atrophy and / or enhance muscle development while retaining a portion of the myostatin protein. That is, by using the antisense oligonucleotide of the present invention, it is possible to biosynthesize myostatin protein with exon 2 skipped in vivo. By skipping exon 2 of myostatin protein, it is possible to prevent muscle atrophy and / or enhance muscle development.

したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として、筋肉萎縮の予防および／または治療用薬剤として利用することができる。筋肉萎縮は、筋ジストロフィー、後天性免疫不全症候群(AIDS)、多発性硬化症、癌などの疾患に起因するものに限られず、例えば老化や外傷などに起因するものも挙げられる。このような分野に利用されることにより、ミオスタチンの全体を阻害することによる予期せぬ副作用の発症が軽減化され、より適切に筋肉の発達を制御可能となることが期待される。 Therefore, the antisense oligonucleotide of the present invention can be used as an active ingredient for preventing and / or treating muscle atrophy. Muscle atrophy is not limited to those caused by diseases such as muscular dystrophy, acquired immune deficiency syndrome (AIDS), multiple sclerosis, and cancer, and examples thereof include those caused by aging and trauma. By being used in such fields, it is expected that the onset of unexpected side effects due to inhibition of myostatin as a whole will be reduced, and muscle development can be more appropriately controlled.

PCR反応産物の電気泳動よる解析結果を示した図である。（実施例２）It is the figure which showed the analysis result by electrophoresis of a PCR reaction product. (Example 2) エクソン２がスキップしたmRNA (A)の塩基配列（配列番号１７８）を示す図である。（実施例２）It is a figure which shows the base sequence (sequence number 178) of mRNA (A) which exon 2 skipped. (Example 2) エクソン２がスキップしなかったmRNA (B)の塩基配列（配列番号１７９、１８０）を示す図である。（実施例２）It is a figure which shows the base sequence (sequence number 179, 180) of mRNA (B) which exon 2 did not skip. (Example 2)

Claims

An antisense oligonucleotide having a function of skipping exon 2 in the process of biosynthesis of mature mRNA of the myostatin gene by hybridizing with a sequence contained in exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene.

The antisense oligonucleotide according to claim 1, comprising a base sequence selected from any of the following 1) to 3):
1) A base sequence consisting of at least 17 nucleotides that hybridizes with a site selected from the region 471 to 620 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing;
2) The base sequence of any one of the sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 below
CAT AGG TTT GAT GAG TCT CA (SEQ ID NO: 2)
GTA GGA GTC TCG ACG GGT CT (SEQ ID NO: 3)
AAA CAC TGT TGT AGG AGT CT (SEQ ID NO: 4);

The antisense oligonucleotide according to claim 1 or 2, wherein the oligonucleotide is an oligonucleotide analog containing Locked Nucleic Acid (LNA) in which the sugar sites 2 'and -4' of the nucleotide are modified by -CO-crosslinking. .

Screening of an antisense oligonucleotide having a function of skipping exon 2 in the process of biosynthesis of mature mRNA of the myostatin gene by hybridizing with a sequence contained in exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene Method.

A method for screening an antisense oligonucleotide having a function of skipping exon 2 of the myostatin gene comprising the following steps 1) to 3):
1) The step of hybridizing the oligonucleotide to be screened with exon 2 of the mRNA precursor transcribed from the myostatin gene;
2) generating a mature mRNA from the hybridized mRNA precursor;
3) A step of analyzing exon 2 skipping using the generated mature mRNA.

A medicament for preventing and / or treating muscle atrophy comprising the antisense oligonucleotide according to any one of claims 1 to 3 as an active ingredient.

The prevention of muscular atrophy according to claim 6, wherein the muscular atrophy is muscular atrophy caused by at least one selected from aging, muscular dystrophy, acquired immune deficiency syndrome (AIDS), multiple sclerosis, cancer and trauma. / Or therapeutic agent.