JP2004501061A - Fragments and antagonists of heat shock protein 60 - Google Patents

Abstract

The present invention identifies fragments of hsp60 that retain the ability of the cells of the innate immune system to induce a proinflammatory immune response. Smaller peptides derived from these fragments of hsp60 can act as antagonists of hsp60 as long as they have the ability to reduce or even prevent the induction of a proinflammatory immune response by hsp60 in cells of the innate immune system. The unexpected finding is further disclosed. It further provides variants, derivatives and analogs of such peptides that can act as antagonists of hsp60 as long as they have the ability to reduce or prevent the induction of a proinflammatory immune response by hsp60 in cells of the immune system. Is disclosed. The present invention also discloses pharmaceutical compositions comprising such peptide fragments or variants, derivatives and analogs thereof, and their use for preventing or ameliorating an inflammatory disease or disorder.

Description

【００６２】
領域２はｓｐａｅｔｚｌｅに対する配列の相同性を示さないが、それでもなお、２個のループ（一方は第一のヘリックスに先行しかつ他方は２個の間）と一緒にｈｓｐ６０内の２個の溶媒に露出されるヘリックスにわたる。ループおよびヘリックスの双方が溶媒に露出され、そして従ってｈｓｐ６０上の潜在的認識部位である。ｓｐａｅｔｚｌｅは４本のヘリックスの束であると予測されるため、同一のレセプターによる認識を可能にする領域２とｓｐａｅｔｚｌｅとの間の構造の相同性が、この領域内の明らかな配列の相同性の欠如にもかかわらず、可能である。
【００６３】
領域３はｓｐａｅｔｚｌｅの単一のフラグメント（スキームＩ中の箱２として印をつけられる）と有意の相同性を示す。この領域は高度に柔軟性であり、ＧＲＯＥＬ結晶構造、そしてこれゆえにｈｓｐ６０モデル中の表面に露出されたループである。領域３に相同な領域中のｓｐａｅｔｚｌｅの二次構造もまたループであると予測される。従って、分析の全部が、このフラグメントがｔｏｌｌレセプターによる認識の見込みのある候補であると示唆する。
【００６４】
領域４は、ｓｐａｅｔｚｌｅの１フラグメント（スキームＩ中の箱３として印をつけられる）と有意の相同性を示す。それはｈｓｐ６０モデル中で部分的にのみ露出される。この領域とｓｐａｅｔｚｌｅ中の対応する領域との間の構造の比較は、このフラグメントの大きな一部分がＧＲＯＥＬ結晶中で乏しい電子密度を示すため、単純でない。
【００６５】
領域５は、相同性を示す短いフラグメントにより尾をつけられるｓｐａｅｔｚｌｅと配列の相同性を示さないｈｓｐ６０の大きなフラグメントにわたる（スキームＩ中の箱４）。このフラグメントのＣ末端部分（箱４配列を包含しかつ上流の付加的な９残基が表面に露出される）。
【００６６】
領域６はｓｐａｅｔｚｌｅの２種のフラグメントとの相同性を示す（スキームＩ中の箱５；矢印は次の行へのこの領域の連続の限界を定める）。該フラグメント全体は、表面に露出されたヘリックス、次いで短いβ−鎖、短い部分的に露出されたループおよび付加的なヘリックスより成る。第一のヘリックスに相同なｓｐａｅｔｚｌｅフラグメントはループであると予測されるが、それでもなおＣ末端ヘリックスに相同なフラグメントもまたヘリックスであると予測される。Ｌｙｓ３５９ないしＡｓｐ３９９にわたるｈｓｐ６０の付加的な一領域はｓｐａｅｔｚｌｅの１フラグメントに対するかなりの程度の相同性を示し、かつ、溶媒に露出される。
を示した。
【００６７】
本発明の現在好ましい一態様において、ヒトｈｓｐ６０タンパク質のフラグメントは、ヒトｈｓｐ６０のトリプシン消化物により、とりわけ、ｈｓｐ６０タンパク質を好ましくは１：５４の酵素／タンパク質重量比でトリプシンで処理すること、反応混合物を３７℃でそれぞれ０．５、１．５、５．４および１６．５時間インキュベートすること、反応を停止した後にこれらの反応混合物を合わせること、それらを遠心分離すること、上清を濾過しそしてそれを０．５ｍｌ／分の速度でＰＢＳを用いてスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５　ＦＰＬＣカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーにかけること、画分を収集すること、場合によってはそれらを濃縮すること、および上述されたところの炎症前応答を誘導するそれらの能力についてそれらをアッセイすることにより、得ることができる。さらなる精製のためには、炎症前応答についての試験で活性である画分を、水中０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル中０．１％ＴＦＡの勾配を用いるＣ−４カラム上での逆相ＨＰＬＣにかけ、画分を収集し、そして炎症前免疫応答を誘導するそれらの能力についてそれらを再度試験することができる。
【００６８】
さらにより好ましい一態様において、本発明のフラグメントは、天然のｈｓｐ６０タンパク質中に存在する以下のアミノ酸伸長：
（ｉ）Ｇｌｕ_１２６ないしＬｙｓ_１５６；
（ｉｉ）Ｌｙｓ_１５７ないしＬｙｓ_１９１；
（ｉｉｉ）Ｇｌｎ_１５８ないしＬｙｓ_１９２；
（ｉｖ）Ｇｌｎ_１５８ないしＬｙｓ_１９１；
（ｖ）Ｐｒｏ_１６１ないしＬｙｓ_１９１；
（ｖｉ）Ｐｒｏ_１６１ないしＬｙｓ_１９２；
（ｖｉｉ）Ｇｌｙ_２２２ないしＬｙｓ_２４９；
（ｖｉｉｉ）Ｌｙｓ_２６９ないしＡｒｇ_２９０；
（ｉｘ）Ｌｙｓ_３１０ないしＬｙｓ_３４４；
（ｘ）Ａｓｐ_３１５ないしＬｙｓ_３４４；
（ｘｉ）Ｌｅｕ_３９０ないしＶａｌ_４２１；および
（ｘｉｉ）Ｔｈｒ_５２７ないしＧｌｙ_５７１
の最低１種を含有し、
ここで、添え字として与えられる数字は、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベース受託番号Ｐ１０８０９に開示されるところのヒトｈｓｐ６０タンパク質の対応するアミノ酸残基の位置を表す。
【００６９】
本発明のｈｓｐ６０フラグメント、ならびにそれらの誘導体および／もしくは変異体は、他の（ポリ）ペプチド配列に連結してよいか、または、融合タンパク質（１種もしくは複数）の一部であってよい。こうした（ポリ）ペプチド／融合タンパク質は、前記フラグメント、誘導体もしくは変異体の特徴を改良するよう工作してよい。例えば、精製、取扱いもしくは貯蔵過程の間の安定性および／もしくは持続性を改良するため、または宿主生物体および／もしくは患者における安定性、半減期および／もしくは持続性を改良するために、さらなるアミノ酸を付加してよい。
【００７０】
さらに、本発明のｈｓｐ６０フラグメント、誘導体および／もしくは変異体は、炎症性免疫応答もしくはそれらの潜在的治療においてある役割を演じる他のタンパク質もしくはペプチドに融合してよい。マーカー分子および／もしくはマーカーアミノ酸配列に連結される本発明のｈｓｐ６０のフラグメント、誘導体もしくは変異体を含んで成る分子もまた本発明の範囲内にある。こうした配列は、限定されるものでないが、ペプチド標識、ヒスチジン標識、蛍光分子、ＧＦＰ、ＦＬＡＧおよびＧＳＴを挙げることができる。
【００７１】
本発明のフラグメントの変異体および誘導体の好ましい一態様において、これらの分子は「主鎖が環化されたペプチド類似物」であるようにさらに改変される。主鎖が環化されたペプチド類似物は、ペプチド主鎖の１個の窒素原子を含有する最低１個の構成単位を組み込む好ましくは５ないし３０アミノ酸のペプチド配列を含んで成る。とりわけ、より大きな特異性をもつペプチド類似物を達成してそれにより高められた臨床選択性を達成することが一般に望ましい。有機化学および分子生物学の大きな進歩の結果として、多くの生物活性ペプチドを、今や、薬理学的および臨床的利用性に十分な量で製造することができる。従って、最近数年間に、ペプチドが関係する疾病の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）および治療（ｔｈｅｒａｐｙ）のための新たな方法が確立された。しかしながら、薬物としてのペプチドの使用は、以下の要因、すなわちａ）消化管および血清中でのタンパク質分解に対するそれらの低い代謝安定性；ｂ）とりわけそれらの比較的大きい分子量もしくは特異的輸送系の欠如または双方による、経口摂取後のそれらの不十分な吸収；ｃ）肝および腎によるそれらの迅速な排泄；ならびにｄ）非標的器官系におけるそれらの所望されない副作用（ペプチドレセプターは生物体中で広範に分布される可能性があるため）により制限される。
【００７２】
従って、天然のペプチド分子の欠点を克服するコンホメーション的に束縛されたペプチド類似物を製造してそれにより改良された治療特性を提供することが、最も有益であるとみられる。ペプチドのコンホメーションの束縛に対する１つの概念的アプローチは、ペプチドの主鎖から主鎖の環化を提案したＧｉｌｏｎら（Ｂｉｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ ３１（１９９１）、７４５）により導入された。この戦略の理論的利点は、所定のペプチドの特異的レセプターとの相互作用に決定的であるかもしれない側鎖を妨害することなく、ペプチド主鎖の炭素もしくは窒素を介して環化を遂げる能力を包含する。この概念は目的のいかなる直鎖状ペプチドにも応用可能であると予見されたが、現実には、提案されたスキーム中の制限要因が、架橋基を介して連結されるべきであるアミノ酸を置き換えるのに使用されなければならない適当な構成単位を利用可能性とした。主鎖環化のこの概念の実務への実際の適応は、当初、グリシン以外のアミノ酸の構成単位のいかなる実際的製造方法も考案することの不可能性により制限された（Ｇｉｌｏｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８７（１９９２）、５６８７）。Ｇｉｌｏｎおよび共同研究者によるさらなる開示（第ＷＯ ９５／３３７６５号、同第ＷＯ ９７／０９３４４号明細書、米国特許第５，７２３，５７５号、同第５，８１１，３９２号および同第５，８８３，２９３号明細書）が、主鎖が環化されたペプチド類似物の合成で必要とされる構成単位の製造方法を提供した。最近、ブラジキニン類似物の主鎖が環化されたペプチド類似物（米国特許第５，８７４，５２９号明細書）、ならびにソマトスタチン活性を有する主鎖が環化されたペプチド類似物（第ＷＯ ９８／０４５８３号明細書および米国特許第５，７７０，６８７号明細書）を製造するためのこれらの方法の成功裏の使用もまた開示された。これらの方法の全部が引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。
【００７３】
本発明はまた、
ａ）細胞表面上に無傷のＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する細胞を、ｈｓｐ６０のフラグメントと接触させること；および
ｂ）該細胞により産生された炎症前メディエーターもしくはエフェクターの量を測定すること
の段階を含んで成る、炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定方法も提供し；
ここで、炎症前メディエーターもしくはエフェクターの産生の増大が炎症前応答を導き出すｈｓｐ６０のフラグメントの能力を暗示する。本方法は、炎症前メディエーターＴＮＦαおよび／もしくはＮＯについて下で例示される。
【００７４】
段階（ａ）で使用されるｈｓｐ６０のフラグメントはｈｓｐ６０のいかなる可能なフラグメントであることもできる。好ましくは、こうしたフラグメントは、最低５アミノ酸残基、より好ましくは最低１０、なおより好ましくは最低２０、および最も好ましくは最低５０アミノ酸残基の長さを有する。こうしたフラグメントは、例えばｈｓｐ６０タンパク質の切断により、例えばトリプシン消化物のようなタンパク質分解性切断により、もしくは例えばＣＮＢｒでの化学的切断により生じさせることができるか、または、それは当業者に公知の方法を使用して化学的に合成することができる。
【００７５】
該方法の段階（ａ）で使用される細胞は、好ましくは、無傷のＴｏｌｌ様レセプター４複合体を担持する細胞である。しかしながら、ヒトにおいてはＴｏｌｌ様レセプター２がｈｓｐ６０レセプターであることが可能であるため、こうしたレセプターを担持する細胞もまた使用してよい。好ましくは、該方法で使用される細胞はリンパ細胞、およびより好ましくはマクロファージ、例えばヒトもしくはマウスのマクロファージである。こうした方法で使用することができる細胞の例は、Ｊ７７４細胞、すなわちジャーマン コレクション オブ ミクロオーガニズムス アンド セル カルチャーズ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＤＳＭＺ、ドイツ・ブラウンシュヴァイク）から購入することができるマウスマクロファージ細胞系Ｊ７７４Ａ．１、もしくは、それぞれブリーディング アンド リサーチ センター Ａ／Ｓ（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ａ／Ｓ）（ボムホルトガード（Ｂｏｍｈｏｔｌｇａｒｄ）、デンマーク・ライ）およびチャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入することができるマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮの骨髄由来マクロファージである。こうした骨髄由来マクロファージの調製法は当業者に公知であり、かつ、実施例１にもまた記述する。
【００７６】
陰性対照として、チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入することができるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの骨髄由来細胞を使用することができる。これらのマクロファージは、機能的に欠陥のあるＴｏｌｌ様レセプター４膜タンパク質を発現し、そしてＴＮＦαおよびＮＯの産生によりｈｓｐ６０に応答しない。
【００７７】
しかしながら、ここに記述される方法は、炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントを同定するのに有用であるのみならず、しかしまた前記分子の特徴づけおよび／もしくはスクリーニングにも使用してよい。
【００７８】
本発明は、さらに、上述された方法の段階（ａ）および（ｂ）、ならびに
ｃ）炎症前応答を導き出す能力を有するとして段階（ａ）で同定されたｈｓｐ６０のフラグメントを製薬学的組成物に処方すること
の段階を含んで成る、製薬学的組成物の製造方法に関する。
【００７９】
前記フラグメントの製薬学的組成物への処方は、製薬学的に許容できる担体、賦形剤および／もしくは希釈剤の添加をさらに含んでよい。記述される方法の助けを借りて、炎症前免疫応答を導き出す能力をなお有するｈｓｐ６０のより小さいフラグメントを同定することが今や可能である。こうしたより小さいフラグメントの助けを借り、また、Ｔｏｌｌ様レセプター４複合体と相互作用するｈｓｐ６０タンパク質の領域を同定することにより、順に、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができるこれらのフラグメントの変異体を設計してそれによりｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防することが可能である。
【００８０】
従って、本発明はまた、とりわけそれらがｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防することができる限りは、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する能力を有する本発明のｈｓｐ６０フラグメントの変異体および誘導体にも関する。この情況で、アンタゴニストは、好ましくはこうした応答を低下もしくは予防するペプチドもしくはペプチド模倣物である。
【００８１】
本発明はまた、それらがｈｓｐ６０による炎症前応答の誘導を低下もしくは予防することができる限りはｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ方法も提供し、ここで、本方法は、
ａ）細胞表面上に無傷のＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する細胞を、試験されるべき化合物の存在下および非存在下で、ｈｓｐ６０もしくは炎症前応答を誘導する能力を有するそのフラグメントと接触させること；ならびに
ｂ）該化合物の存在が炎症前メディエーターもしくはエフェクターの産生に対する影響を有するかどうかを決定すること
の段階を含んで成り、
ここで、炎症前メディエーターもしくはエフェクターの産生の低下もしくは予防が、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する該化合物の能力を暗示する。現在、本発明の方法は、アッセイにおいて前記細胞のＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生を使用して下に例示される。
【００８２】
該方法の段階（ａ）で挙げられた細胞に関して、同一物が、炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定方法に関して上に既に示されたとおり当てはまる。該方法の段階（ａ）で挙げられたｈｓｐ６０のフラグメントは、炎症前免疫応答を導き出す能力を有する本発明のｈｓｐ６０のいかなるフラグメントであることもできる。
【００８３】
細胞により産生されるＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの量の測定は、上および実施例に記述されるとおり実施することができる。
【００８４】
試験されるべき化合物は、いかなる可能な化合物、例えば上述されたところのｈｓｐ６０のフラグメントの変異体および誘導体、無機もしくは有機化合物、抗体、例えばモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメント、可溶性のＴｏｌｌ様レセプター４もしくはＴｏｌｌ様レセプター２、またはこれらのレセプターのフラグメントもしくは複合体などであることもできる。
【００８５】
本発明はさらに、上述された方法の段階（ａ）および（ｂ）、ならびに
ｃ）ｈｓｐ６０のアンタゴニストであるとして段階（ｂ）で同定された化合物を製薬学的組成物に処方すること
の段階を含んで成る、製薬学的組成物の製造方法に関する。
【００８６】
前記化合物の製薬学的組成物への処方は、製薬学的に許容できる担体、賦形剤および／もしくは希釈剤の添加をさらに含んでよい。
【００８７】
炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ方法、または本発明のｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定方法はまた、いわゆる高スループットスクリーニング法、ならびに９６穴、３８４穴、１５３６穴（および他）の商業的に入手可能なプレートを使用して実施される類似のアプローチも含んでよい（とりわけ、Ｓｐｅｎｃｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６１（１９９８）、６１−６７を参照されたい）。本発明で使用されるべきこれらの方法は、限定されるものでないが、高スループットスクリーニングにおける均質な光学密度の読出し（例えばＮＯおよびＴＮＦαについての）を挙げることができる（例えば、Ｐｏｐｅ、ＤＤＴ ４（１９９９）、３５０−３６２を参照されたい）。上および付属として付けられる実施例に記述されるところの細胞に基づくアッセイは、とりわけ、シンチレーション計数、蛍光測定、発光測定もしくは吸光度シグナルの測定のような検出技術と組み合わせてよい。従って、上および付属として付けられる実施例に記述される方法は、高スループットおよび超高スループットスクリーニング方法を誘導する定量的および／もしくは定性的スクリーニング方法に容易に適合させることができる。
【００８８】
さらに、本発明は、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる本発明のフラグメントの変異体、誘導体もしくは類似物、および場合によっては製薬学的に許容できる担体を含んで成る製薬学的組成物に関する。この点での「ｈｓｐ６０のアンタゴニスト」という用語は、好ましくは、これらの分子がｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防することが可能であることを意味する。最後に、本発明はまた、自己免疫疾患（限定されるものでないが糖尿病、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、重症筋無力症および全身性エリテマトーデスを挙げることができる）、慢性炎症（限定されるものでないがアテローム硬化症、炎症性腸疾患、反応性関節炎を挙げることができる）、慢性感染症、移植片拒絶、歯肉炎、胃炎、潰瘍、血栓症、アレルギーならびに急性感染症のような炎症性疾患の治療のための製薬学的組成物の製造のためのｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる本発明のフラグメントの変異体、誘導体もしくは類似物の使用にも関する。
用語および定義：
本明細書に関連して、「ｈｓｐ６０タンパク質」という用語は、熱ショックタンパク質、すなわち、細胞がとりわけ温度の突然の上昇と直面される場合、またはそれらが他の細胞間、細胞内もしくは細胞外のストレスと直面される場合にその発現が細胞中でアップレギュレートされるタンパク質を指す。さらに、「ｈｓｐ６０タンパク質」はミトコンドリアのシャペロンを指す。とりわけ、「ｈｓｐ６０タンパク質」という用語は、約６０ｋＤの分子量を有するタンパク質を意味する。好ましくは、「ｈｓｐ６０タンパク質」という用語は、ヒトｈｓｐ６０タンパク質、好ましくはＪｉｎｄａｌら（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９（１９８９）、２２７９）に開示されるところのアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。
【００８９】
本明細および請求の範囲の目的上、「ヒトｈｓｐ６０」という用語は、６０ｋＤのヒト熱ショックタンパク質のみならず、しかしまたいずれかの種の６０ｋＤの熱ショックタンパク質に対し生じられたポリクローナル抗体と交差反応するヒト血清中で見出されるいずれかの他の関係した分子も包含することを意図している。この定義は、限定されるものでないとは言え、既に発見されている６５ｋＤ、３０ｋＤ、２５ｋＤおよび４７ｋＤのタンパク質を挙げることができることをとりわけ意図している。
【００９０】
ヒトｈｓｐ６０分子はかつてｈｓｐ６５と呼称されたが、しかし、より正確な分子量情報のゆえに今やｈｓｐ６０と呼称され；いずれの呼称によってもタンパク質は同一である。
【００９１】
本発明に関して「フラグメント」という用語は、それが天然のｈｓｐ６０タンパク質中に存在するところの配列中の最低５、より好ましくは最低１０、なおより好ましくは最低２０、および最も好ましくは最低３０の連続するアミノ酸を含んで成るｈｓｐ６０タンパク質の一部、または例えば酵素的にもしくは他の手段によりｈｓｐ６０タンパク質を切断することにより得てよいｈｓｐ６０タンパク質の一部を意味する。この場合、フラグメントは必ずしも連続的アミノ酸配列のみを含有する必要はないが、しかし、例えばジスルフィド結合、ペプチド結合もしくはいずれかの他の共有結合により相互に連結されることができるこうした配列の２種もしくはそれ以上を含有してよい。
【００９２】
本発明に関して「約２０ｋＤもしくはそれ未満の分子量」という用語は、とりわけ質量分析もしくは還元条件下でのＳＤＳ ｐａｇｅにより測定される場合に２２ｋＤ未満、好ましくは２１ｋＤ未満、および最も好ましくは２０ｋＤ未満の分子量を意味する。好ましい一態様において、フラグメントは１５ｋＤ未満、より好ましくは１０ｋＤ未満、およびなおより好ましくは５ｋＤ未満の分子量を有する。
【００９３】
本発明に関して「炎症前応答を誘導するｈｓｐ６０の能力」という用語は、とりわけ、生得の免疫系の細胞において炎症前応答を導き出す能力を意味する。これは、例えばマクロファージ、例えばＣ３Ｈ／ＨｅＮもしくはＣ５７ＢＬ／６マウスのマクロファージまたはＪ７７４細胞におけるＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導により測定することができ（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）、ここで、ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導／増大は炎症前免疫応答を誘導する能力を示す。炎症前応答の誘導の測定は、とりわけ、Ｃｈｅｎら（上記引用文中）もしくは実施例に記述されるとおり実施することができる。従って、ＴＮＦαの誘導は、例えばＣｈｅｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）に記述されるところのサンドイッチＥＬＩＳＡを使用することによりそれぞれのタンパク質への曝露前および後にマクロファージにより産生されるＴＮＦαの量を測定すること、ならびに例えばブランクとしての培地単独に対する組換えサイトカイン（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、英国ケント州）を用いて得られた標準曲線を使用することによりＴＮＦαを定量することにより決定することができる。ＮＯ形成の誘導は、例えば、Ｃｈｅｎら（上記引用文中）に記述されるところの比色的グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応を使用して培養上清中に蓄積された亜硝酸塩（ＮＯ_２ ⁻）の濃度を測定することによりマクロファージにより放出されたＮＯの量を測定することにより、決定することができる。
【００９４】
本発明に関して「ｈｓｐ６０のアンタゴニスト」という用語は、好ましくは、これらの分子がｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防することが可能であることを意味する。この能力は、誘導物質として例えば天然のｈｓｐ６０を使用すること、ならびに試験されるべき変異体もしくは誘導体を添加し、そしてＴＮＦαおよび／もしくはＮＯにより例示されるところの炎症前メディエイターエフェクターの産生に対する影響を、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する試験される分子の能力を暗示する炎症前メディエーターもしくはエフェクター（例えばＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ）産生の減少もしくは阻害を用いて測定することを除き、ｈｓｐ６０のフラグメントが炎症前免疫応答を誘導する能力を有するかどうかを決定するための上述されたと同一のアッセイを使用することにより決定することができる。
【００９５】
タンパク質、タンパク質フラグメントおよび／もしくはペプチドが炎症前応答を誘導するかどうかを決定するためには、細胞、すなわちマクロファージを、例えば９６穴平底マイクロタイタープレートに接種する（ウェルあたり２００μｌ中２×１０^５個の細胞）。２４時間の前インキュベーション（３７℃、５％ ＣＯ_２）後に、試験されるべきタンパク質、タンパク質フラグメントおよび／もしくはペプチドを多様な濃度で培養物に添加し、そしてＴＮＦαおよびＮＯの産生を測定する前に多様な時間間隔の間、インキュベーションを継続する。
【００９６】
本明細書で使用されるところの「ペプチド」はペプチド結合により連結されるアミノ酸の配列を示す。本発明のペプチド類似物は、５ないし３０アミノ酸残基、好ましくは５ないし２４残基、より好ましくは７ないし１８アミノ酸の配列を含んで成り、各残基はアミノおよびカルボキシ末端を有することを特徴とする。
【００９７】
「変異体」という用語は、こうした分子が１個もしくはそれ以上のアミノ酸変化を除き、本発明のフラグメントのアミノ酸配列を有することを意味する。こうした変異体は、例えば、点特異的突然変異誘発により、かように突然変異されたＤＮＡを適切な宿主細胞中で発現させることにより、および産生された（ポリ）ペプチドを細胞培養物から回収することにより、ヒトｈｓｐ６０の対応するフラグメントをコードする対応するＤＮＡ配列を突然変異させることにより生じさせることができる。こうした変異体の生成方法、およびそれらの製造方法、例えば組換えＤＮＡ技術は当業者に公知である。しかしながら、「変異体」という用語は、天然に存在する分子ならびに前記組換え技術により生じさせることができる分子もまた含んで成る。
【００９８】
「誘導体」という用語は、本発明のフラグメントが、それがもはや炎症前免疫応答を誘導することが可能でないがしかしこの点に関してｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができるような方法で改変されることを意味する。こうした改変は、例えば、該フラグメントの１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基の側鎖の改変を包含する。従って、本発明の情況において、「誘導体」という用語は、好ましくは同一の三次元構造を含むかもしれないがしかし化学的および／もしくは物理化学的に改変されるｈｓｐ６０のフラグメントの「誘導体」を含んで成る。さらに、改変技術は遺伝子および／もしくは分子生物学的技術を含んで成る。従って、前記「誘導体」は、突然変異誘発技術、もしくは（側）特異的合成により生じさせることができる。さらに、当該技術分野で公知の技術を使用して、こうした誘導体を検出および／もしくは特徴づけすることができる。これらの技術は、とりわけ、ペプチド模倣物（ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１９９８）、２０５−２２３；Ｂｏｈｍ、Ｊ．Ｃｏｍ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１０（１９９６）、２６５−２７２）もしくはコンビナトリアルライブラリー（例えば、Ｄｏｒｎｅｒ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１９９６）、７０５−７１５を参照されたい）の使用を含んで成る。さらに、本発明のｈｓｐ６０フラグメントの三次元および／もしくは結晶学的構造を使用して、前記「誘導体」を推定および／もしくは生成することができる。適切な「誘導体」の設計はコンピュータに補助されてもよい。
【００９９】
「類似物」という用語は、それらがα−アミノ酸のα−窒素に結合された架橋基をもつ新規構成単位を組み込むことを特徴とするペプチド類似物に関する。とりわけ、これらの化合物は、最低１個の構成単位を組み込む好ましくは５ないし３０アミノ酸のペプチド配列を含んで成る主鎖が環化された類似物であり、前記構成単位は、アミド、チオエーテル、チオエステルもしくはジスルフィドを含んで成る架橋基に連結されたペプチド主鎖の１個の窒素原子を含有し、ここで、最低１個の構成単位が前記架橋基を介して連結されて、第二の構成単位、該配列のアミノ酸残基の側鎖、もしくは末端アミノ酸残基より成る群から選択される一部分をもつ環状構造を形成する。より好ましくは、該ペプチド配列は５〜２４アミノ酸を組み込み、なおより好ましくは、それは７〜１８アミノ酸を組み込む。
【０１００】
「構成単位」という用語は、一般式番号１：
【０１０１】
【化１】

【０１０２】
のＮ^αが誘導体化されたα−アミノ酸を示し、
式中、Ｘは、アルキレン、置換アルキレン、アリーレン、シクロアルキレンおよび置換シクロアルキレンより成る群から選択されるスペーサー基であり；Ｒ’は場合によっては特定の保護基と結合されたアミノ酸側鎖であり；そしてＧは、アミン、チオール、アルコール、カルボン酸およびエステル、ならびにアルキルハロゲン化物より成る群から選択される官能基であり；それは該ペプチド配列に組み込まれ、そしてその後、官能基Ｇを介して、前記ペプチド配列中のアミノ酸の側鎖の１つ、もしくは別のωが官能性化されたアミノ酸誘導体と選択的に環化される。構成単位を製造するための方法論は、第ＷＯ　９５／３３７６５号および同第ＷＯ　９８／０４５８３号明細書、ならびに米国特許第５，７７０，６８７号および同第５，８８３，２９３号明細書（その全部は、そっくりそのまま本明細書に示されるかのように、それに引用することにより本明細書に明確に組み込まれる）として公開された国際特許出願に記述される。
【０１０３】
構成単位は、対応する改変されたアミノ酸の三文字記号、次いで反応基の型（アミンについてＮ、カルボキシルについてＣ）、および間のメチレン基の数の表示により略記する。例えば、Ｇｌｙ−Ｃ２は、カルボキシル反応基をもつ改変されたＧｌｙ残基および２個の炭素のメチレンスペーサーを記述し、また、Ｐｈｅ−Ｎ３はアミノ反応基をもつ改変されたフェニルアラニン基および３個の炭素のメチレンスペーサーを呼称する。
【０１０４】
ある種の略語を、本発明ならびにそれの作成および使用の様式を記述するために本明細書で使用する。
【０１０５】
例えば、２Ａｂｕは２−アミノ酪酸を指し、Ａｌｌｏｃはアリルオキシカルボニルを指し、Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル基を指し、ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミンを指し、ＥＤＴはエタンジチオールを指し、Ｆｍｏｃはフルオレニルメトキシカルボニル基を指し、ＨＢＴＵはヘキサフルオロリン酸１−ヒドロキシベンズトリアゾリルテトラメチルウロニウムを指し、ＨＯＢＴは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを指し、ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィーを指し、ｈｓｐは熱ショックタンパク質を指し、ＩＤＤＭはインスリン依存型糖尿病を指し、ｋＤはキロダルトンを指し、ＭＰＳは多重平行合成（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐａｒａｌｌｅｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を指し、ＭＳは質量分析を指し、ＮＭＭはＮ−メチルモルホリンを指し、ＮＭＰは１−メチル−２−ピロリドノンを指し、ＮＯは一酸化窒素を指し、ＰｙＢＯＰはヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリスピロリジノホスホニウムを指し、ＰｙＢｒＯＰはヘキサフルオロリン酸ブロモトリスピロリジノホスホニウムを指し、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸を指し、そしてＴＮＦは腫瘍壊死因子を指す。
【０１０６】
本発明で使用されるアミノ酸は、商業的に入手可能であるかもしくは慣例の合成方法により入手可能であるものである。ある種の残基はペプチドへの特別の組み込み方法を必要とするかもしれず、また、該ペプチド配列への連続的、発散性および収束性のいずれかの合成アプローチが本発明で有用である。天然のコードされるアミノ酸およびそれらの誘導体は、ＩＵＰＡＣの協約に従った三文字記号により表す。表示が存在しない場合、Ｌ異性体を使用した。Ｄ異性体は残基の略記の前の「Ｄ」により示す。
【０１０７】
当業者に既知のところのアミノ酸の保存的置換は本発明の範囲内にある。保存的アミノ酸置換は、同一の型の官能基もしくは側鎖（例えば脂肪族、芳香族、正の電荷をもつ、負の電荷をもつ）を有する別のものでの一アミノ酸の置き換えを包含する。これらの置換はまた、該化合物の生物学的利用性を増大させるためのＰｈｅ残基のＮ−メチル−Ｐｈｅ残基での置き換え、ならびに経口の生物学的利用性を増大させるためのアミノ末端での単糖および二糖部分の結合（Ｎｅｌｓｏｎ−Ｐｉｅｒｃｙら　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ．７８：３２９、１９９４）、もしくは経口の生物学的利用性、中枢神経系への浸透、特定の細胞集団に標的を定めること、などを高めるかもしれないところの他のこうした置換も包含する。
好ましい類似物の記述
本発明のｈｓｐ６０の現在好ましいフラグメント、変異体、誘導体および類似物を今や開示する。
【０１０８】
好ましい態様はヒトｈｓｐ６０の配列由来である。付加的な好ましい態様は細菌のｈｓｐ６０の配列由来である。
【０１０９】
本発明の好ましい態様は：
ａ．ヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１６０。この領域のより好ましい一部分はヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１５６にわたり；
ｂ．ヒトｈｓｐ６０の残基１４０−１９２。この領域のより好ましい部分は、ヒトｈｓｐ６０の残基１５７−１９１、１５８−１９２、１５８−１９１、１６１−１９１および１６１−１９２にわたり；
ｃ．ヒトｈｓｐ６０の残基２２０−２５０。この領域の最も好ましい一部分はヒトｈｓｐ６０の残基２２２−２４９にわたり；
ｄ．ヒトｈｓｐ６０の残基２６９−２９０；
ｅ．ヒトｈｓｐ６０の残基３１０−３４４。この領域の好ましい部分はヒトｈｓｐ６０の残基３１５−３４４にわたり；
ｆ．ヒトｈｓｐ６０の残基３９０−４２１；
ｇ．本発明の現在最も好ましい一態様は、ヒトｈｓｐ６０の残基３５０−４００の誘導体、変異体およびペプチド類似物を含んで成る
より成る群から選択される配列を有するフラグメントの変異体、誘導体および類似物を包含する。
【０１１０】
本発明のさらなる最も好ましいペプチド類似物は；
ｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基２２７−２３６に対応するＴｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ；
ｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３６４−３７３に対応するＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ；
ｉｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３６９−３７８に対応するＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ；
ｉｖ．ヒトｈｓｐ６０の残基３７１−３８０に対応するＩｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ；
ｖ．ヒトｈｓｐ６０の残基３７２−３８１に対応するＧｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ；
ｖｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基４０３−４１２に対応するＶａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ；
ｖｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基４０５−４１４に対応するＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ
である。
【０１１１】
本発明のさらなるより好ましい誘導体、変異体およびペプチド類似物は、ヒトｈｓｐ６０配列の残基３６４−３８１、すなわちＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｈｒに基づく。この配列の好ましいペプチド類似物は、場合によっては最低１個の残基がアラニンで置き換えられた１０〜１８残基のペプチドである。最も好ましいペプチド類似物は：
ｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３６７−３８１に対応するＬｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ；
ｉｉ．ヒトｈｓｐ６０の残基３７２−３８１に対応するＬｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
である。
【０１１２】
本発明の別の好ましい態様は、ヒトｈｓｐ６０の残基４０３−４１２の誘導体、変異体およびペプチド類似物を含んで成る。この領域の最も好ましい類似物は、以下の配列：
ｉ．Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ；
ｉｉ．Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ；
ｉｉｉ．Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ；
ｉｖ．Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ
を包含する。
【０１１３】
本発明のなお他のより好ましい類似物は、ヒトｈｓｐ６０の残基４０８−４１６の主鎖が環化されたペプチド誘導体、変異体および類似物である。これらの類似物は、場合によっては位置４１５にＡｓｎの代わりにＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｅｕもしくは２Ａｂｕ残基を含んで成る。この配列の最も好ましい類似物は、連結されて環状構造を形成する位置：４０８−４１４、４０９−４１６、４０８−４１６および４０９−４１４に２個の架橋基を含んで成るノナペプチドである。他の好ましい主鎖が環化された類似物は５〜１８残基を有し、最低１個の構成単位が末端、側鎖もしくは別の構成単位に連結されて環状ペプチド類似物を形成する。
【０１１４】
上および実施例に列挙される全部の配列はそれ自体有用として、かつ、改良された特性をもつ誘導体、変異体および類似物の設計および合成の基礎としてもまた使用してよい。
一般的方法
ペプチドの合成、精製および特徴づけの一般的方法：
合成：
樹脂：０．２〜０．７ｍｍｏｌ／ｇｒの負荷をもつ１ｇのリンク（Ｒｉｎｋ）アミドもしくはテンタジェル（Ｔｅｎｔａ−ｇｅｌ）樹脂。
Ｆｍｏｃ脱保護：７ｍＬのＮＭＰ中２０％ピペリジンを用いる。振とうしながら１０ｍｌのＮＭＰで２分間の５回の洗浄の後に続く１５分間２回。
カップリング：
１．通常のカップリング（単純なアミノ酸へのカップリング）：７ｍｌのＮＭＰ中に３等量のアミノ酸、３等量のＰｙＢｒｏＰおよび６等量のＤＩＥＡを含有する溶液を用いる。振とうしながら０．５〜２時間。カップリングはニンヒドリン試験によりモニターし、そしてニンヒドリン溶液が黄色になるまで反復する。
２．１０ｍｌのジメチルホルムアミド中に５等量のＤＩＣおよび５等量のＨＯＢＴを含有する溶液を用いるＨｉｓおよびＡｓｎのカップリング。
３．Ｇｌｙ構成単位へのカップリング：７ｍｌのＮＭＰ中に３等量のアミノ酸、３等量のＰｙＢｒｏＰおよび６等量のＤＩＥＡを含有する溶液を用いる。振とうしながら１〜４時間、２回。
４．Ｇｌｙでない構成単位へのカップリング：１５ｍｌのジオキサンもしくはＴＨＦ中に５等量のアミノ酸、１．５等量のチオホスゲンおよび１３等量のコリジンを含有する溶液を用いる。振とうしながら６０℃で４０分間、３回。
【０１１５】
主鎖が環化されたペプチド類似物を合成する態様においては直交する保護が必要とされる。現在の好ましい一態様によれば、アリル／Ａｌｌｏｃ脱保護および環化を以下のとおり実施する。すなわち
構成単位のアリルおよびＡｌｌｏｃ保護基の除去：５％酢酸および２．５％　ＮＭＭを含有する３０ｍｌのジクロロメタン中のペプチドあたり１．５等量のＰｄ（ＰＰｈ３）４を用いる。振とうしながら１〜４時間。
【０１１６】
環化：７ｍｌのＮＭＰ中に３等量のＰｙＢＯＰおよび６等量のＤＩＥＡを含有する溶液を用いる。振とうしながら０．５〜２時間。環化はニンヒドリン試験によりモニターし、そして必要な場合は反復する。
【０１１７】
切断：スカベンジャー、すなわち１〜１５％　Ｈ_２Ｏ、１〜５％ ＴＩＳおよび１〜５％ ＥＤＴを補充された８２〜９５ ％ＴＦＡを用いる。
精製：
各主鎖環状ペプチドの個々の精製方法を、他の粗成分からの環状ペプチドの最大の単離を与えるように分析ＨＰＬＣ上で開発する。分析方法は通常、固定相としてＣ−１８ ヴァイダック（Ｖｙｄａｃ）カラム ２５０×４．６ｍｍおよび０．１％ ＴＦＡを含有する水／ＡＣＮ混合物勾配を使用して実施する。
【０１１８】
調製方法は、２’’のＣ−１８ヴァイダック（Ｖｙｄａｃ）調製方法での分析的分離方法を包含することにより設計する。精製過程の間、環状ペプチドを含有するピークを、半自動化フラクションコレクターを使用して収集する。収集された画分を、純度チェックのため分析的ＨＰＬＣに注入する。純粋な画分を合わせそして凍結乾燥する。
特徴づけ：
合わせられた純粋な凍結乾燥された物質は、ＨＰＬＣ、ＭＳおよびキャピラリー電気泳動により、ならびに、ペプチド含量およびアミノ酸比の決定についてのアミノ酸分析により、純度について分析する。
多重平行合成（ＭＰＳ）形式のライブラリーの合成、精製および特徴づけの一般的方法：
ＭＰＳ手順を慣例のペプチド発生手順として使用する。個々のペプチド、もしくは数種のペプチドの群を、溶媒の通過を可能にするがしかし固相マトリックスの通過を可能にしないフィルターを装備された９６穴マイクロタイタープレート中で合成する。全部の弁の同時の閉鎖および開放を可能にする単純かつ効率的弁装置（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により製造される）を使用する。該系は、ある大きさより大きい粒子を進ませない底の溶媒浸透性の膜を各ウェルに装備するアプローチを利用する。該方法は、ウェル中に樹脂を置き、溶媒中で反応を実施し、そして真空を適用することにより全部のウェルから同時に溶媒を除去することを可能にする。標準的な９６穴形式で利用可能であるこれらの特殊なプレートは、９６種のペプチドの平行した合成を同時に可能にする。該手順の合成スケールはウェルあたり１〜５μモルの範囲にある。標準的な９６穴形式でもまた実施されるＣ１８逆相カラム（セップパック（ＳｅｐＰａｋ）精製）による精製の後に、ペプチドを慣例に１ｍｌの水に溶解して、１〜５ｍＭの理論的粗濃度（合成スケールに依存する）を生じさせる。生じるペプチドの化学的質のモニタリングをＥＳＩ−ＭＳ分析により実施する。異なる操作者により異なる機会に製造された数枚のプレートの分析は、粗調製物中での所望のペプチド質量の存在により判断されるとおり、約８０％の全体的成功率を示した。ＭＰＳからのペプチドのさらなる分析はＬＣ−ＭＳにより実施する。該分析は、大スケールで個別に合成されたペプチドの粗調製物に類似の粗ペプチドの質を示した。多様な段階もしくは完全合成は、今や、自動ペプチド合成機を使用して自動的に実施される。本例示によれば、ペプチドは現在、アドヴァンスト ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）のＡＣＴ ３９６、およびアドヴァンスト ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ）の加熱装置Ｌａｂ Ｔｅｃｈ ４を使用して自動的に合成される。
ＭＰＳ形式での合成についての詳述された手順：
６μモルの容量について、０．６ｍｍｏｌ／ｇｒの置換をもつ１０ｍｇの樹脂を使用する。
【０１１９】
Ｆｍｏｃ脱保護：各ウェルに、５００μｌのＮＭＰ中５％ピペリジンを２回添加する。反応を１５分間振とうする。ＮＭＰを吸引により除去する。
【０１２０】
Ｆｍｏｃ脱保護後の洗浄：樹脂を、各ウェルに６００μｌのＮＭＰを入れること、次いで窒素流による溶液の排出により洗浄する。洗浄過程を４回反復する。
ＨＢＴＵを使用するカップリング：
ウェル容量：６μｍｏｌ
ウェルあたりのカップリングあたりのアミノ酸の量：３０μｍｏｌ
ＮＭＰ濃縮物中のアミノ酸：０．２Ｍ
使用されるアミノ酸容量：１５０μｌ
ＨＢＴＵ量：３０μｍｏｌ
ＨＢＴＵ濃度：０．２Ｍ
使用されるＨＢＴＵ容量：１５０μｌ
添加されるＤＩＥＡ：１５０μｌのＮＭＰ中０．４Ｍ
総反応容量：４５０μｌ
アミノ酸をＮＭＰ中のＨＯＢＴの溶液に溶解する。樹脂を、各ウェルに６００μｌのＮＭＰを入れること、次いで窒素流による溶媒の排出により洗浄する。洗浄過程は４回反復する。カップリング反応を１時間２回反復する。
ムカヤマ試薬を使用するカップリング（ある状況でのみ実施される）：
６５０ｍＭのアミノ酸溶液−４０μｌ
１１１ｍｇ／ｍｌのムカヤマ試薬−６０μｌ
ウェルあたり添加されるコリジン−１５μｌ
ＰｙＢｒｏＰとのカップリングについてと同一の手順。反応温度５０℃、反応時間：第一のカップリング４時間、第二のカップリング１６時間。
【０１２１】
主鎖が環化されたペプチドを合成する態様において、アリル／Ａｌｌｏｃ脱保護および環化を以下のとおり実施する：
アリル Ａｌｌｏｃ脱保護：この段階は、５％酢酸＋２．５％ ＮＭＭを含有する２０ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２中の１．５ｇのＰｄ（ＰＰｈ_３）_４の１８０μｌの溶液の添加により、集成の完了後に実施する。
【０１２２】
環化：この段階は、ＮＭＰ＋ＤＩＥＡ中のＰｙＢｏＰの１００μｌの溶液の添加により実施する。
【０１２３】
樹脂からのペプチドの切断およびセップパック（ＳｅｐＰａｋ）精製：最後のＦｍｏｃ脱保護後に、樹脂を深いウェルのマイクロタイタープレートに移し、各ウェルに、２．５％ ＴＩＳ、２．５％ Ｈ_２Ｏ、２．５％ ＥＤＴを含有する３００μｌのＴＦＡ溶液を添加する。ＴＦＡの除去は凍結乾燥により実施する。切断後、ペプチドをセップパック（ＳｅｐＰａｋ）により精製する。
ｈｓｐ６０のフラグメント、誘導体、変異体および類似物の生物学的スクリーニング
１．炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定： 本方法は、以下の段階、すなわち
ａ）それらの表面上に無傷のＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する細胞をｈｓｐ６０のフラグメントと接触させること；ならびに
ｂ）該細胞により産生されたＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの量を測定することを含んで成る。
【０１２４】
ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生の増大は、炎症前応答を導き出すｈｓｐ６０のフラグメントの能力を暗示する。
【０１２５】
段階（ａ）で使用されるｈｓｐ６０のフラグメントは、ｈｓｐ６０のいずれかの可能なフラグメントであることができる。好ましくは、こうしたフラグメントは最低５アミノ酸残基、より好ましくは最低１０、なおより好ましくは最低２０、および最も好ましくは最低５０アミノ酸残基の長さを有する。こうしたフラグメントは、例えばｈｓｐ６０タンパク質の切断、例えばトリプシン消化物のようなタンパク質分解性切断により、もしくは例えばＣＮＢｒでの化学的切断により生じさせてよいか、またはそれは当業者に公知の方法を使用して化学的に合成することができる。
【０１２６】
該方法の段階（ａ）で使用される細胞は、好ましくは、無傷のＴｏｌｌ様レセプター４を担持する細胞である。しかしながら、ヒトにおいてはＴｏｌｌ様レセプター２がｈｓｐ６０レセプターであることが可能であるため、こうしたレセプターを担持する細胞もまた使用してよい。好ましくは、該方法で使用される細胞はリンパ細胞、およびより好ましくはマクロファージ、例えばヒトもしくはマウスのマクロファージである。こうした方法で使用することができる細胞の例は、Ｊ７７４細胞、すなわちジャーマン コレクション オブ ミクロオーガニズムス アンド セル カルチャーズ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＤＳＭＺ、ドイツ・ブラウンシュヴァイク）から購入することができるマウスマクロファージ細胞系Ｊ７７４Ａ．１、もしくは、それぞれブリーディング アンド リサーチ センター Ａ／Ｓ（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ａ／Ｓ）（ボムホルトガード（Ｂｏｍｈｏｔｌｇａｒｄ）、デンマーク・ライ）およびチャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入することができるマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍおよびＣ３Ｈ／ＨｅＮの骨髄由来マクロファージである。こうした骨髄由来マクロファージの調製法は当業者に公知であり、かつ、実施例１にもまた記述する。
【０１２７】
陰性対照として、チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入することができるＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの骨髄由来細胞を使用することができる。これらのマクロファージは、機能的に欠陥のあるＴｏｌｌ様レセプター４膜タンパク質を発現し、そしてＴＮＦαおよびＮＯの産生によりｈｓｐ６０に応答しない。
【０１２８】
タンパク質、タンパク質フラグメントおよび／もしくはペプチドが炎症前応答を誘導するかどうかを決定するためには、細胞すなわちマクロファージを例えば９６穴平底マイクロタイタープレートに接種する（ウェルあたり２００μｌ中２×１０^５個の細胞）。２４時間の前インキュベーション（３７℃、５％ ＣＯ_２）後に、試験されるべきタンパク質、タンパク質フラグメントおよび／もしくはペプチドを多様な濃度で培養物に添加し、そしてＴＮＦαおよびＮＯの産生を測定する前に多様な時間間隔の間、インキュベーションを継続する。
２．ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ：
ｈｓｐ６０による炎症前免疫応答の誘導を低下もしくは予防するための能力は、誘導物質として例えば天然のｈｓｐ６０を使用すること、ならびに、試験されるべき変異体もしくは誘導体を添加し、そしてｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する試験される分子の能力を暗示するＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生の減少もしくは阻害を用いて、ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生に対する影響を測定することを除き、上述されたところの方法番号１を使用することにより決定することができる。
【０１２９】
該方法は、以下の段階、すなわち
ａ）それらの表面上に無傷のＴｏｌｌ様レセプター複合体を担持する細胞を、試験されるべき化合物の存在下および非存在下で、ｈｓｐ６０もしくは炎症前応答を誘導する能力を有するそのフラグメントと接触させること；ならびに
（ｂ）該化合物の存在が、前記細胞のＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生に対する影響を有するかどうかを決定すること
を含んで成り、
ここで、ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの産生の低下もしくは予防が、ｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用する該化合物の能力を暗示する。
【０１３０】
該方法の段階（ａ）で挙げられた細胞に関して、同一物が上の方法１でのとおり当てはまる。該方法の段階（ａ）で挙げられたｈｓｐ６０のフラグメントは、炎症前免疫応答を導き出す能力を有する本発明のｈｓｐ６０のいかなるフラグメントであることもできる。
【０１３１】
細胞により産生されるＴＮＦαおよび／もしくはＮＯの量の測定は、上および実施例に記述されるとおり実施することができる。
【０１３２】
試験されるべき化合物は、いかなる可能な化合物、例えば上述されたところのｈｓｐ６０のフラグメントの変異体および誘導体、無機もしくは有機化合物、抗体、例えばモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、Ｆａｂフラグメントのような抗体フラグメント、可溶性のＴｏｌｌ様レセプター４もしくはＴｏｌｌ様レセプター２、またはこれらのレセプターのフラグメントもしくは複合体などであることもできる。
３．ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導の測定方法：
ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導は、マクロファージ、例えばＣ３Ｈ／ＨｅＮもしくはＣ５７ＢＬ／６マウスのマクロファージまたはＪ７７４細胞中で測定することができ（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）、ここで、ＴＮＦαおよび／もしくはＮＯ形成の誘導／増大は炎症前免疫応答を誘導する能力を示す。炎症前応答の誘導の測定は、とりわけ、Ｃｈｅｎら（上記引用文中）もしくは実施例に記述されるとおり実施することができる。従って、ＴＮＦαの誘導は、例えばＣｈｅｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）に記述されるところのサンドイッチＥＬＩＳＡを使用することによりそれぞれのタンパク質への曝露前および後にマクロファージにより産生されるＴＮＦαの量を測定すること、ならびに例えばブランクとしての培地単独に対する組換えサイトカイン（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、英国ケント州）を用いて得られた標準曲線を使用することによりＴＮＦαを定量することにより決定することができる。ＮＯ形成の誘導は、例えば、Ｃｈｅｎら（上記引用文中）に記述されるところの比色的グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応を使用して培養上清中に蓄積された亜硝酸塩（ＮＯ_２ ⁻）の濃度を測定することによりマクロファージにより放出されたＮＯの量を測定することにより、決定することができる。
【０１３３】
加えて、ｈｓｐ６０のフラグメント、変異体、誘導体および類似物は、Ｔ細胞増殖応答、マウスモデルにおけるインスリン炎および糖尿病に対する影響、ならびにＰＣＴ特許出願第ＷＯ ９６／１９２３６号および同第ＷＯ ９７／０１９５９号明細書に記述されるところのペプチド安定性についてスクリーニングしてよい。
【０１３４】
炎症前免疫応答を導き出す能力を有するｈｓｐ６０のフラグメントの同定、スクリーニングおよび／もしくは特徴づけ方法、または本発明のｈｓｐ６０のアンタゴニストとして作用することができる化合物の同定方法はまた、いわゆる高スループットスクリーニング法、ならびに９６穴、３８４穴、１５３６穴（および他）の商業的に入手可能なプレートを使用して実施される類似のアプローチも含んでよい（とりわけ、Ｓｐｅｎｃｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６１（１９９８）、６１−６７を参照されたい）。本発明で使用されるべきこれらの方法は、限定されるものでないが、高スループットスクリーニングにおける均質な光学密度の読出し（例えばＮＯおよびＴＮＦαについての）を挙げることができる（例えば、Ｐｏｐｅ、ＤＤＴ ４（１９９９）、３５０−３６２を参照されたい）。上および付属として付けられる実施例に記述されるところの細胞に基づくアッセイは、とりわけ、シンチレーション計数、蛍光測定、発光測定もしくは吸光度シグナルの測定のような検出技術と組み合わせてよい。従って、上および付属として付けられる実施例に記述される方法は、高スループットおよび超高スループットスクリーニング方法を誘導する定量的および／もしくは定性的スクリーニング方法に容易に適合させることができる。
【０１３５】
熱ショックタンパク質のフラグメント、変異体および誘導体は、多数の既知の熱ショックタンパク質の配列に部分的に基づき構築されるか、もしくは、以前に未知の新規配列に基づき、下の実施例に提示される。以下の実施例は該化合物の作成および使用方法、ならびに本発明の方法を具体的に説明することを意図しており、そして、いかなる方法でも制限として解釈されるべきでない。
【０１３６】
実施例
以下の実施例は本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１：ｈｓｐ６０の可能なリガンドとしてのＴｏｌｌ様レセプター４複合体の同定
組換えヒトｈｓｐ６０はストレスジェン バイオテクノロジーズ（ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カナダ・ビクトリア）から得た。ＣｐＧモチーフを含有する、２種の免疫刺激性オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣ ＧＡＴ ＡＡＣ ＧＴＴ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＡＣ Ｇ−３’（Ｐａｌ^＋）（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８（１９９４）、８３１）および５’−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ−３’（ＯＤＮ１６６８）（Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１７（１９９８）、６２３０；Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９７）、１６７１）、ならびにＣｐＧモチーフを欠く対応する非刺激性オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＧＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ−３’（ＯＤＮ１７２０）（Ｈａｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．１７（１９９８）、６２３０；Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１９９７）、１６７１）を、ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ドイツ・カールスルーエ）から購入した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｂ ０．２６からのリポ多糖（ＬＰＳ）はシグマ（Ｓｉｇｍａ）（ドイツ・ダイゼンホーフェン）から得た。
【０１３７】
マウス骨髄由来マクロファージの調製のため、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスをチャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）（ドイツ・ズルツフェルト）から購入し、また、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍマウスを、ブリーディング アンド リサーチ センター Ａ／Ｓ（Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ａ／Ｓ）（ボムホルトガード（Ｂｏｍｈｏｌｔｇａｒｄ）、デンマーク・ライ）から購入した。骨髄細胞は、８〜１２週齢のマウスの大腿骨および脛骨を氷冷ＰＢＳで洗い流すことにより得た。洗浄した後、２．５×１０^６個の骨髄細胞を、５％熱不活性化ウマ血清、１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、１５％ Ｌ９２９細胞馴化培地（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１９８５）、１６００４）、ならびにアンピシリン（２５ｍｇ／ｌ）、ペニシリン（１２０ｍｇ／ｌ）、ストレプトマイシン（２７０ｍｇ／ｌ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（１０ｍｌ／ｌ、１００×）、２４ｍＭ ＮａＨＣＯ_３および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充された６５％ ＲＰＭＩ １６４０を含有する１０ｍｌのプルツニク（Ｐｌｕｚｎｉｋ）培地を用いて、組織培養皿中でインキュベート（３７℃、５％ ＣＯ_２）した。７日の培養後に、付着性の骨髄由来マクロファージを、氷冷のＣａ^＋＋、Ｍｇ^＋＋を含まないハンクス液（ＨＢＳＳ、ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））とともにの１０分間のインキュベーション、次いでＨＢＳＳでの２回の洗浄（５００ｇ、５分）によりはがした。非特異的エステラーゼ染色（Ｌｏｆｆｌｅｒ、Ｋｌｉｎ．Ｗｓｃｈｒ．３９（１９６１）、１２２０）により、＞９８％の細胞がマクロファージの特徴を表した。
【０１３８】
マクロファージの刺激のために、細胞を９６穴平底マイクロタイタープレート（ファルコン／ベクトン ディッキンソン（Ｆａｌｃｏｎ／Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州フランクリンレイクス）に接種した（ウェルあたり２００μｌ中２×１０^５個の細胞）。２４時間の前インキュベーション（３７℃、５％ ＣＯ_２）の後に、多様な濃度のｈｓｐ６０、ＬＰＳおよびオリゴヌクレオチドを培養物に添加し、そしてインキュベーションを異なる時間間隔の間継続した。
【０１３９】
マクロファージから放出されたＴＮＦαの量を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）により定量した。ＴＮＦαは、ブランクとしての培地単独に対する組換えサイトカイン（ジェンザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）、英国ケント州）を用いて得られた標準曲線を使用して定量した。結果は１ｍｌあたりのｐｇのＴＮＦαとして表した。
【０１４０】
亜硝酸塩産生の測定のために、マクロファージにより放出されたＮＯの量を、既に記述された（Ｃｈｅｎら、上記引用文中）ところの比色的グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応を使用して、培養上清中に蓄積された亜硝酸塩（ＮＯ_２ ⁻）の濃度を測定することにより評価した。結果は１ｍｌあたりのＮＯ_２ ⁻のマイクロモルを示す。
【０１４１】
得られたデータは平均＋ＳＤとして表す。統計学的解析は両側のスチューデント検定を使用して実施した。差異はｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【０１４２】
図１から明らかであるとおり、マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６およびＣ３Ｈ／ＨｅＮの骨髄由来マクロファージは、大量のＴＮＦαの迅速な分泌を伴い、ＬＰＳもしくはヒトｈｓｐ６０に応答した。突然変異体のＴｏｌｌ様レセプター４を担持するＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスからのマクロファージの平行した研究は、ＬＰＳもしくはｈｓｐ６０のいずれかに対する応答を示さなかった。しかしながら、これらの細胞は、炎症刺激に対し完全に不応性でなかった。ミコバクテリアの配列（ＯＤＮ１６６８）由来かつ強力な免疫刺激性ＣｐＧモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチドは、ＬＰＳ非応答体系統において強いＴＮＦα応答を誘導した。第二のＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド（Ｐａｌ^＋）はより少なく刺激性であった一方、ＣｐＧの不足した（ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ１７２０）は応答を誘発しなかった（図１）。
【０１４３】
図１は、Ｃ５７ＢＬ／６（細かい平行線を付けられた棒）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（白色の棒）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（黒色の棒）の骨髄由来マクロファージを、培地、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｈｓｐ６０（１０μｇ／ｍｌ）、Ｐａｌ^＋（３０μｇ／ｍｌ）、ＯＤＮ１６６８（３０μｇ／ｍｌ）もしくはＯＤＮ１７２０（３０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートしたを示す。６時間後に、培養上清中のＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。該データは、四重で実施された３ないし４回の実験の平均＋ＳＤを表す。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（およびＣ５７ＢＬ／６）マクロファージに対する有意差を＊＊＊、ｐ＜０．００１として示す。ｈｓｐ６０に対する応答の用量依存性を、２種のＣ３Ｈ系統からのマクロファージを用いてさらに分析した。有意のＴＮＦα応答は、３μｇ／ｍｌのｈｓｐ６０（０．０５μｍｏｌ／ｌ）を用いてＣ３Ｈ／ＨｅＮマクロファージで得られた一方、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマクロファージではこうした応答は１０倍より高いｈｓｐ６０レベルでさえみられなかった（図２Ａ）。力学の分析は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマクロファージにおいて６〜１２時間の間に分泌されたＴＮＦαのピークレベルを示した。ＴＩｒ４欠損マクロファージにおいて、ＴＮＦα産生は７２時間の観察期間を通じて非存在であった（図２Ｂ）。
【０１４４】
図２は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（白丸）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（黒丸）の骨髄由来マクロファージを、増大する濃度のｈｓｐ６０とともに６時間インキュベートした（Ａ）か、もしくはそれらを１０μｇ／ｍｌのｈｓｐ６０の用量で異なる時間間隔の間インキュベートした（Ｂ）を示す。培養上清中のＴＮＦα濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。該データは、三重で実施された３回の実験からの平均＋ＳＤを表す。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ由来マクロファージに対する有意差を＊＊＊、ｐ＜０．００１として示す。
【０１４５】
図３から明らかであるとおり、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（しかしＣ３Ｈ／ＨｅＪでない）のマウスのマクロファージはＬＰＳ攻撃にＮＯ産生を伴い応答し、これはエンドトキシンに誘導されるＮＯ形成がＴｌｒ４依存性であることを示す。
【０１４６】
図３は、Ｃ５７ＢＬ／６（細かい平行線を付けられた棒）、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（白色の棒）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（黒色の棒）の骨髄由来マクロファージを、培地、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ｈｓｐ６０（１０μｇ／ｍｌ）、Ｐａｌ^＋（３０μｇ／ｍｌ）、ＯＤＮ１６６８（３０μｇ／ｍｌ）もしくはＯＤＮ１７２０（３０μｇ／ｍｌ）とともにインキュベートしたを示す。２４時間後に、培養上清中に蓄積された亜硝酸塩の濃度をグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応により測定した。該データは、四重で実施された３ないし４回の実験の平均＋ＳＤを表す。Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（およびＣ５７ＢＬ／６）のマクロファージに対する有意差は＊＊＊、ｐ＜０．００１として示す。
【０１４７】
ｈｓｐ６０を刺激として採用した場合に、同一の結果が、Ｔｌｒ４欠損マクロファージにおける一酸化窒素応答の完全な欠如を伴い得られた。対照的に、２種のマクロファージ型は、強く刺激性のＣｐＧ ＤＮＡ、ＯＤＮ１６６８を刺激として使用した場合に非常に類似のＮＯ応答を示した一方、より小さく刺激性のＣｐＧオリゴヌクレオチドＰａｌ^＋は、ＣｐＧの不足したＯＤＮ１７２０について真実であったとおり、ＮＯ形成を誘導することを失敗した（図３）。ＴＮＦα産生に比較して類似の濃度のｈｓｐ６０（３μｇ／ｍｌ）が、ＮＯを導き出すのに必要とされた。ｈｓｐ６０濃度を１０倍増大させることは、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマクロファージにおける約５倍より高い亜硝酸塩レベルを生じさせた一方、Ｔｌｒ４欠損マクロファージは完全に不応性のままであった（図４Ａ）。上清中の亜硝酸塩の蓄積は、培養の４８と７２時間との間に最大レベルに達した。この期間を通じて、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマクロファージ中でのＮＯ産生の表示は存在しなかった（図４Ｂ）。
【０１４８】
図４は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ（白丸）およびＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（黒丸）の骨髄由来マクロファージを、増大する濃度のｈｓｐ６０とともに２４時間インキュベートした（Ａ）か、もしくはそれらを１０μｇ／ｍｌのｈｓｐ６０の用量で異なる時間間隔の間インキュベートした（Ｂ）を示す。培養上清中に蓄積された亜硝酸塩の濃度をグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）反応により測定した。該データは三重で実施された３回の実験の平均＋ＳＤを表す。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ由来のマクロファージに対する有意差を＊＊＊、ｐ＜０．００１として示す。
【０１４９】
上述された結果は、細胞外のｈｓｐ６０がＴｌｒ４の内在性リガンドであることを示唆する。炎症応答を伴いエンドトキシンに応答する能力が異なる２種の緊密に関係した系統、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣ３Ｈ／ＨｅＪの骨髄由来マクロファージを比較した（Ｓｕｌｔｚｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ２１９（１９６８）、１２５３；ＷａｔｓｏｎとＲｉｂｌｅｔ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４０（１９７４）、１１４７）。この機能的差異は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおける機能的に欠陥のあるＴｌｒ４膜タンパク質によるとして最近同定された。後者の系統において、Ｔｌｒ４のＣ末端部分は、ＬＰＳに誘導されるシグナル伝達を妨害するコドン７１２の突然変異（ｌｐｓ^ｄ）を含有する（Ｐｏｌｔｏｒａｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２（１９９８）、２０８５；Ｑｕｒｅｓｈｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１９９９）、１６５；Ｈｏｓｈｉｎｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３７４９）。興味深いことに、Ｔｌｒ４欠損マクロファージは、エンドトキシンがメタロプロテイナーゼ−９の発現を刺激することがなお可能であるため、ＬＰＳに完全に非応答性であるわけでない（Ｊｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３５９６）。
【０１５０】
実際、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ（Ｉｐｓ^ｄ）マウスからのマクロファージは、ＬＰＳに誘導されるＴＮＦα産生に明瞭に不応性と見出された。興味深いことに、誘導可能なＮＯ形成もまた機能的Ｔｌｒ４に厳密に依存すると見出されたが、とは言えシグナル伝達の要件はＴＮＦαのものと異なる（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）、９７３０；Ｋａｊｉｍｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３（１９９４）、１６１２）。免疫刺激性のＣｐＧ ＤＮＡへのｌｐｓ^ｄマクロファージの曝露は、双方、すなわちＴＮＦαおよびＮＯ産生を刺激し、これは、生得の免疫応答を刺激するためのＴｌｒ４依存性および非依存性の経路がマクロファージ中に共存することを示す。また、これらのデータは、ＣｐＧ ＤＮＡシグナル伝達がＴｌｒ４を介して起こらないことを立証する。一緒にすれば、ヒトｈｓｐ６０によるＴＮＦαもしくはＮＯ応答の刺激が、ここで機能的Ｔｌｒ４膜タンパク質の存在に完全に依存するとして見出された。従って、同一の膜貫通シグナル伝達レセプターがｈｓｐ６０およびＬＰＳに対する生得の免疫応答を媒介するようである。広範囲の制御が、エンドトキシンの汚染の役割を排除するために、細胞外の哺乳動物ｈｓｐ６０の免疫刺激活性の２個の以前の報告で実施された（Ｋｏｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３（１９９９）、５７１；Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９９）、３２１２）。これらの制御は、ＬＰＳの中和のためのポリミキシンＢの使用、もしくはｈｓｐ６０を抑制するがしかしＬＰＳ活性を抑制しない熱処理によるタンパク質の変性を包含する。また、われわれは、別の供給源からのエンドトキシンを含まない調製物（ペプトール リミテッド（Ｐｅｐｔｏｒ Ｌｔｄ．）から、ｈｓｐ６０ １μｇあたり０．１μＥＵ未満のエンドトキシン汚染、未発表データ）を用いて本質的な知見を再現することが可能であった。最後に、エンドトキシンを含まない細菌のリポタンパク質は、Ｔｏｌｌ様レセプター−２経路を介して生得の免疫応答を媒介することが最近、報告されている（Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５（１９９９）、７３６；Ｂｒｉｇｈｉｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５（１９９８）、７３６；Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（１９９９）、２３８２）。これらの観察結果は、Ｔｌｒ４およびＴｌｒ２がＬＰＳのレセプターとして機能するのみならず（Ｐｏｌｔｏｒａｋら、上記引用文中；Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８（１９９８）、２０９１；Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄら、上記引用文中）、しかしタンパク質リガンドの認識にもまた関与することを強調する。
【０１５１】
哺乳動物細胞中のＴｏｌｌ様レセプターの以前に記述されたリガンドは微生物起源のものであり、これは生得の免疫応答におけるこれらのレセプターの機能と調和する。シャペロンｈｓｐ６０が哺乳動物のＴｏｌｌ様レセプターの推定の内在性リガンドであることが今や見出された。この知見は、Ｔｏｌｌ様レセプターが微生物病原体に対する生得の免疫防禦における機能を有するかもしれないのみならず、しかしまた内在性リガンドと相互作用することにより生理学的機能も供給することを示唆する。これは、Ｔｏｌｌが内在性リガンドとしてはたらくｓｐａｅｔｚｌｅでの背腹のパターン形成を制御するドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）での状況を暗示する（ＭａｒｉｓａｔｏとＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ｃｅｌｌ ７６（１９９４）、６７７）一方、成体の昆虫においては、Ｔｏｌｌが抗真菌および抗菌応答を制御する（Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｃｅｌｌ ８６（１９９６）、９７３）。
【０１５２】
双方、すなわちＴｏｌｌ様レセプターおよびｈｓｐ６０が系統発生の初期に見出され、また、双方が顕著に保存された構造のものであることは注目すべきである。これは、それらの相互作用が関連性がありかつまたより原始的な生物体でも起こるかもしれないことを示す。哺乳動物のｈｓｐ６０は通常、シャペロンとして機能するその能力に従って、細胞内部に隔離される。しかしながら、ｈｓｐ６０は、それが炎症の間の組織細胞の壊死の間に自由にされる場合、もしくはｈｓｐ６０が多様な型のストレスに応答して原形質膜に部分的に転移される場合に到達可能になる。従って、自己のｈｓｐ６０は生得の免疫系に対して危険な抗原としてはたらくかもしれないことが提案された（Ｃｈｅｎら、上記引用文中）。
【０１５３】
哺乳動物のｈｓｐ６０とＴｌｒ４複合体との間の相互作用の正確な機構は解明されるべきままである。ＣＤ１４およびＭＤ−２を用いて、Ｔｌｒ４複合体の２メンバーが同定され、その双方がＴｌｒ４のＬＰＳ応答性を強く強化する。ＬＰＳは、ＣＤ １４を介して、ならびにＣＤ １４に依存せずにＴｌｒ４に結合するようである。ヒトＴＩｒ２について、ＬＰＳへの直接結合がインビトロで立証され、また、効率的なシグナル伝達は血清のＣＤ１４を必要とするようである。同様に、細菌のリポタンパク質とＴｌｒ２との間の相互作用の機構は未だ決定されていない。
【０１５４】
要するに、ヒトｈｓｐ６０の炎症前シグナル伝達は機能的Ｔｌｒ４に依存性と見出された。この知見は、Ｔｌｒ４複合体の内在性リガンドの存在、およびストレスをかけられたもしくは損傷された組織細胞に対する正常な組織細胞の生得の免疫識別におけるＴｏｌｌ様レセプターの役割を示唆する。
実施例２：マクロファージにおける炎症前応答を誘導することが可能なヒトｈｓｐ６０のフラグメントの同定
１．トリプシンによるｈｓｐ６０の酵素的タンパク質分解：
Ｈｉｓ標識（ｔａｇ）ｈｓｐ６０（該タンパク質のＮ末端に６個のヒスチジン残基を伴い発現されたｈｓｐ６０）をニッケルカラム上で親和性精製した（ヘキサヒスチジンはニッケルのキレート剤である）。６０μｌのＰＢＳ中４．５ｍｇ／ｍｌを使用して、１：５４の酵素：タンパク質重量比で５０μｇの配列決定等級改変トリプシン（ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）カタログ番号１４１８０２５）を溶解した。混合物を３７℃でインキュベートし、そしてサンプルを０．５、１．５、５．４および１６．５時間後に採取した。サンプルを４℃で一夜保存し、そしてその後−２０℃に移した。各５μｌのサンプルを、５μｌの負荷緩衝液とともに沸騰させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動した（４〜２０％勾配２００Ｖで３０分間、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））。４画分を一緒に合わせ、そして１分間遠心分離した。上清を濾過し、そしてその後、０．５ｍｌ／分の速度でＰＢＳを用いてスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５ ＦＰＬＣカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーにかけた。５個の澄明な画分および２個のピークショルダーを、図５に記述されるとおり得た。第一のピークが無傷のｈｓｐ６０を含有することが（ｈｓｐ６０の類似のゲル濾過クロマトグラフィー後に）見出された。タンパク質濃度をマイクロＢＳＡキット（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））により測定した。結果を表番号１に要約する。
【０１５５】
【表２】

【０１５６】
全画分を、双方とも３０００ダルトンのカットオフをもつセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）ＹＭ−３（２ｍｌ容積）、およびその後マイクロコン（ｍｉｃｒｏｃｏｎ）ＹＭ−３（０．５ｍｌ容積）により、約１ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮した。画分を、Ｊ７７４細胞を使用した（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２（１９９）、３２１２）ことを除いて、上述されたとおりにＴＮＦαおよびＮＯの産生を誘導するそれらの能力について試験した。Ｊ７７４マクロファージ培養物に添加されたトリプシンフラグメントの濃度、ならびにこれらの実験の結果を図８および９に示す。画分１および２が活性であることが見出された。
２．逆相ＨＰＬＣによるトリプシン分解されたｈｓｐ６０の画分２の分離
５０μｌの画分２を、４０℃で７５分間の水中０．１％　ＴＦＡおよびアセトニトリル中０．１％　ＴＦＡの勾配を使用して、Ｃ−４カラム（ヴァイダック（Ｖｙｄａｃ）２１４ＴＰ５４、プロテインＲＰ−Ｃ４、２５０×４．６ｍｍ、５μ）上での逆相ＨＰＬＣにより分離した。
【０１５７】
結果（２１５．０ｎｍでの吸光度）を図６に要約する。得られた８個の主ピークを収集し、そしてそれらのＮ末端配列についてエドマン分解により、また、それらの質量についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により分析した。８画分のそれぞれにおいて、１種もしくはそれ以上の質量が見出された。見出された質量をｈｓｐ６０の可能なトリプシンフラグメントに合致させた。一例を図７に示し、これはピーク番号３のＭＳ分析の結果を示す。
【０１５８】
全体として、同定されたフラグメントにより表される５領域が存在する。すなわち
１．Ｅ_１２６−Ｋ_１５６もしくはＬ_３９０−Ｒ_４２０の一方内である１つの質量。
２．４個の正確な質量および１個の可能な質量をもつ領域Ｋ_１５７−Ｋ_１９２。
３．１個の正確な質量をもつ領域Ｇ_２２２−Ｋ_２４９。
４．１個の正確な質量をもつ領域Ｋ_２６９−Ｒ_２９０。
５．２個の正確な質量をもつ領域Ｋ_３１０−Ｋ_３４４。
３．同定されたフラグメントの構造分析
トリプシン消化物の活性の画分の質量分析により同定されたフラグメントは（同一群内のフラグメントは大きな程度の重なりを示すことに注意されたい）：
１）Ｇｌｕ_１２６−Ｌｙｓ_１５６
２）Ｌｙｓ_１５７−Ｌｙｓ_１９１
Ｇｌｎ_１５８−Ｌｙｓ_１９２
Ｇｌｎ_１５８−Ｌｙｓ_１９１
Ｐｒｏ_１６１−Ｌｙｓ_１９１
Ｐｒｏ_１６１−Ｌｙｓ_１９２
３）Ｇｌｙ_２２２−Ｌｙｓ_２４９
４）Ｌｙｓ_２６９−Ａｒｇ_２９０
５）Ｌｙｓ_３１０−Ｌｙｓ_３４４
Ａｓｐ_３１５−Ｌｙｓ_３４４
６）Ｌｅｕ_３９０−Ｖａｌ_４２１
である。
【０１５９】
これらの結果を分析するために、いくつかのアプローチを付随して実行した。すなわち
ａ）ヒトｈｓｐ６０の三次元モデルを、その細菌の相同物の結晶学的に既知の構造ＧＲＯＥＬからの相同性により構成した。これは、トリプシン消化物の活性の画分内で見出されたフラグメントのそれぞれについて、ｈｓｐ６０タンパク質全体の枠組み内でどれが溶媒に露出されていると予測されるかを決定することを可能にした。
ｂ）ｔｏｌｌレセプターの天然のリガンド、ｓｐａｅｔｚｌｅの配列をｈｓｐ６０のものと整列させ、そして変動する程度の相同性の数種のフラグメントを同定した（スキームＩを参照されたい）。これは、消化物の活性の画分内で見出されたｈｓｐ６０フラグメントのどれがｔｏｌｌレセプターの認識部位に潜在的に結合する可能性があるかを決定することを可能にした。
ｃ）ｓｐａｅｔｚｌｅタンパク質の二次構造を予測した。これは、ｓｐａｅｔｚｌｅのフラグメントに対する相同性を示したトリプシン消化物の活性の画分中のフラグメントのそれぞれについて、構造の比較を可能にした。
【０１６０】
上に列挙された６領域の分析は：
領域１はｓｐａｅｔｚｌｅの２フラグメントとのとかなりの程度の相同性を示す（この領域および整列はスキームＩ中の箱１として印をつけられる（説明：＊同一の残基、：非常に類似の残基、．類似の残基）。箱中の矢印はフラグメントが次の行に続くことを示す）。
【０１６１】
領域２はｓｐａｅｔｚｌｅに対する配列の相同性を示さないが、それでもなお、２個のループ（一方は第一のヘリックスに先行しかつ他方は２個の間）と一緒にｈｓｐ６０内の２個の溶媒に露出されるヘリックスにわたる。ループおよびヘリックスの双方が溶媒に露出され、そして従ってｈｓｐ６０上の潜在的認識部位である。ｓｐａｅｔｚｌｅは４本のヘリックスの束であると予測されるため、同一のレセプターによる認識を可能にする領域２とｓｐａｅｔｚｌｅとの間の構造の相同性が、この領域内の明らかな配列の相同性の欠如にもかかわらず可能である。
【０１６２】
領域３はｓｐａｅｔｚｌｅの単一のフラグメント（スキームＩ中の箱２として印をつけられる）との有意の相同性を示す。この領域は高度に柔軟性であり、ＧＲＯＥＬ結晶構造、そしてこれゆえにｈｓｐ６０モデル中の表面に露出されたループである。領域３に相同な領域中のｓｐａｅｔｚｌｅの二次構造もまたループであると予測される。従って、分析の全部が、このフラグメントがｔｏｌｌレセプターによる認識の見込みのある候補であることを示唆する。
【０１６３】
領域４は、ｓｐａｅｔｚｌｅの１フラグメント（スキームＩ中の箱３として印をつけられる）との有意の相同性を示す。それはｈｓｐ６０モデル中で部分的にのみ露出される。この領域とｓｐａｅｔｚｌｅ中の対応する領域との間の構造の比較は、このフラグメントの大きな一部分がＧＲＯＥＬ結晶中で乏しい電子密度を示すため、単純でない。
【０１６４】
領域５は、相同性を示す短いフラグメントにより尾をつけられるｓｐａｅｔｚｌｅと配列の相同性を示さないｈｓｐ６０の大きなフラグメントにわたる（スキームＩ中の箱４）。このフラグメントのＣ末端部分（箱４配列を包含しかつ上流の付加的な９残基が表面に露出される）。
【０１６５】
領域６はｓｐａｅｔｚｌｅの２種のフラグメントとの相同性を示す（スキームＩ中の箱５；矢印は次の行へのこの領域の連続の限界を定める）。該フラグメント全体は、表面に露出されたヘリックス、次いで短いβ−鎖、短い部分的に露出されたループおよび付加的なヘリックスより成る。第一のヘリックスに相同なｓｐａｅｔｚｌｅフラグメントはループであると予測されるが、それでもなおＣ末端ヘリックスに相同なフラグメントもまたヘリックスであると予測される。Ｌｙｓ_３５９ないしＡｓｐ_３９９にわたるｈｓｐ６０の付加的な一領域はｓｐａｅｔｚｌｅの１フラグメントに対するかなりの程度の相同性を示し、かつ、溶媒に露出される。この領域に対応するフラグメントがトリプシン消化物の活性の画分中で観察されなかったという事実にもかかわらず、この領域が活性の原因であるかどうかが検討されるであろう。
を示した。
【０１６６】
これらの分析のそれぞれは若干の程度の不確実性を伴うため、それらの全部と一致するための要件は現実的でない、従って、上の７領域（質量分析からの６個および付加的な挙げられた領域）のそれぞれを、ｈｓｐ６０モデル内のフラグメントの構造を至適に模倣するよう設計された５〜１０残基の大きさ範囲のペプチドループ（１個もしくは複数）の重なり合う主鎖が環化された類似物のアレイ（ａｒｒａｙｓ）の多重平行合成により検討する。該アレイは、天然のものに同一もしくはそれに近い配列を有するがしかしなお変動する束縛されたコンホメーションにこれらの配列を捕捉する、構造化された主鎖が環化された類似物に集中された。活性のペプチド類似物を同定すれば、配列の変動を伴うにもかかわらず活性のものと同一の全体的コンホメーションを有する主鎖が環化された類似物のアレイを設計することができる。これら後者の類似物はｔｏｌｌレセプターに対する親和性を向上させるかもしれない。
実施例３：ｈｓｐ６０のトリプシン消化物およびフラグメントのスクリーニング ｈｓｐ６０のトリプシン消化物フラグメントのより大スケールの１バッチを、実施例番号２に記述されたものに類似の手順を使用して生じさせた。
【０１６７】
３種の主画分１、２および３をサイズ排除ＦＰＬＣ分離により得た。各画分をその後、逆相ＨＰＬＣにより下位分画した。ピークを別個に収集しかつ凍結乾燥した。
【０１６８】
主画分および分離されたピークを、Ｊ７７４Ａ細胞中でのＴＮＦα分泌に対する刺激および阻害効果について試験した。
【０１６９】
結果：刺激活性が画分１および２で検出された。
実施例４：２０−ｍｅｒの重なり合うペプチドの合成およびスクリーニング
１０残基の重なり合い（および隣接するペプチド間の１０残基の移動）を伴う２０残基長さの３６種の重なり合うペプチドを、ヒトｈｓｐ６０の残基１１１−４９０の領域にわたって合成した。
【０１７０】
該ペプチドを、ｈｓｐ６０に誘導されるＴＮＦ分泌の阻害について試験した。
【０１７１】
予備結果を表番号２に要約する：
【０１７２】
【表３】

【０１７３】
実施例５：ヒトｈｓｐ６０の重なり合う１０−ｍｅｒペプチドフラグメントの設計
ｈｓｐ６０の活性の短いフラグメントを見出すために、ヒトｈｓｐ６０の１８２種のペプチドフラグメントを、表番号３に示されるところの入手可能な全部のデータの統合に基づき設計した。これは：
１）ｈｓｐ６０の第一の断片化（トリプシン消化）研究の結果（活性およびＭＳ分析）。
２）ｈｓｐ６０の三次元モデル；とりわけ上のフラグメントのそれぞれの表面到達可能性の分析。
３）ｓｐａｅｔｚｌｅに対する相同性（ｓｐａｅｔｚｌｅのモデルに基づく配列上および構造的の双方）。
４）ヒトｈｓｐ６０の残基１１１−４９０にわたる２０−ｍｅｒの重なり合うペプチドの活性の結果
を包含する。
【０１７４】
【表４】

【０１７５】
注：
１）領域１−６は断片化研究に一致する。領域７は断片化研究で現れなかったが、それでもなおｓｐａｅｔｚｌｅとのその相同性およびその見かけの表面露出は、それがスクリーニングに値する領域であることを示唆した。
２）ｓｐａｅｔｚｌｅに対する構造の相同性は第一の近似モデルに基づく。
３）全部の配列はヒトｈｓｐ６０の配列を指す（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベース受託番号Ｐ１０８０９およびスキームＩ）．
４）ｎ．ｔ．＝試験されない
５）全部で１８２種のペプチドが存在する
６）１０種のペプチドをプレート中で２回反復した（２枚の９６穴プレートについて１９２種を生じる）：
２０−ｍｅｒの活性ペプチドの第一の領域からの５種のペプチド。
上の領域７の中央部分からの５種のペプチド。
【０１７６】
プレート１＋２は１９２種のデカペプチドを含有する。すなわち、５８種のペプチドはヒトｈｓｐ６０の残基１２６−１９２にわたり、２２種は残基２２０−２５０にわたり、１３種は残基２６９−２９０にわたり、２６種のペプチドは残基３１０−３４４にわたり、そして６３種のペプチドは残基３５０−４２１にわたり、全部は１アミノ酸の移動を伴う。（１０種の付加的ペプチドは、領域２からの５種のペプチドおよび領域７からの５種の反復物である）。
実施例６：１０−ｍｅｒの１９２種のペプチドの合成
ペプチドを、自動ペプチド合成機（アドヴァンスト　ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）のＡＣＴ　３９６）および加熱装置（アドヴァンスト　ケムテック（Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＣｈｅｍＴｅｃｈ）のＬａｂ　Ｔｅｃｈ　４）を使用する多重平行合成（ＭＰＳ）形式で合成した。各９６種のペプチドの２枚のプレートを合成した。ペプチドは、合成機の製造元により推奨される手順、簡潔には：
合成スケール：ウェルあたり６μｍｏｌのペプチド。
樹脂：リンク（Ｒｉｎｋ）アミド
化学：Ｆｍｏｃ化学、ＮＭＰ中２５％ピペリジンでの脱保護。
カップリング：カップリング試薬として５等量のＨＢＴＵ／ＨＯＢＴおよび塩基として１０等量のＤＩＥＡを用いる。
切断：９２．５％　ＴＦＡ、２．５％　Ｈ２Ｏ、２．５％　ＴＩＳ、２．５％　ＥＤＴの溶液を用いる。
部分的精製：切断されたペプチドを、セップパック（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）（Ｃ−１８）プレートカラムを通過させることにより実施された。
を使用する固相法により合成した。
【０１７７】
ペプチドを、質量スペクトル分析により試験した。大部分のペプチドの期待された質量が見出された。
実施例７：ｈｓｐ６０の阻害についての１０−ｍｅｒペプチドのスクリーニング　粗ペプチドを５００μｌの水に再懸濁し、そして（出願の実施例番号１に記述されたとおり）Ｊ７７４細胞中でｈｓｐ６０に誘導されるＴＮＦαおよび一酸化窒素（ＮＯ）分泌の阻害について、１：１０の希釈で試験した。選択されたペプチドを、ＣｐＧに誘導されるＴＮＦα分泌の阻害についてもまた（同等なアッセイで）試験した。ＣｐＧは、配列：５’−ＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＧＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧ−３’（Ｋｒｉｅｇ　ＡＭ．ＣｐＧ　ＤＮＡ：ａ　ｎｏｖｅｌ　ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１９９９；７：６４−５）をもつ非特異的免疫刺激性オリゴヌクレオチドモチーフである。ＣｐＧは、Ｊ７７４細胞を刺激して、ｈｓｐ６０により使用されるものと異なる機構でＴＮＦαを産生させ、そして従ってＴＮＦ分泌の非選択的阻害（ｈｓｐ６０の特異的阻害により媒介されない）に対する陰性対照としてはたらく。本発明の好ましいペプチドは、ｈｓｐ６０により誘導されるＴＮＦα分泌を阻害するが、しかしＣｐＧに誘導されるＴＮＧα分泌を阻害しない。
【０１７８】
選択されたペプチドの活性の結果を図１０に要約する。ペプチド配列は表番号４に要約する。この図中のペプチドは、合成された全１９２種のペプチドのスクリーニングにおいて見出された活性に基づき再スクリーニングのため選択した。該結果は、ｈｓｐ６０もしくはＣｐＧでの誘導に応答してのＴＮＦ分泌の阻害パーセントとして提示され、そして２回の反復物の平均である。
【０１７９】
【表５】

【０１８０】
【表６】

【０１８１】
この組のペプチドからの最も活性かつ特異的な類似物は：
ｈｓｐ６０の残基２２７−２３６にわたるペプチド番号６６
ｈｓｐ６０の残基３６４−３７３にわたるペプチド番号１３４
ｈｓｐ６０の残基３６９−３７８にわたるペプチド番号１３９
ｈｓｐ６０の残基３７１−３８０にわたるペプチド番号１４１
ｈｓｐ６０の残基３７２−３８１にわたるペプチド番号１４２
ｈｓｐ６０の残基４０３−４１２にわたるペプチド番号１７３
ｈｓｐ６０の残基４０５−４１４にわたるペプチド番号１７５
である。
実施例８：ヒトｈｓｐ６０の残基３６４−３８１からの付加的ペプチドの設計
第二世代の重なり合うペプチドを、１０−ｍｅｒペプチドのスクリーニングに基づき設計した。この組は、ヒトｈｓｐ６０配列の残基３６４−３８１（ＫＡＱＩＥＫＲＩＱＥＩＩＥＱＬＤＶＴ）にわたる領域を研究することを目的とする。この領域内で数種のペプチドがＴＮＦ分泌の特異的阻害を立証したからである。
【０１８２】
図１１は：
Ｉ．ｈｓｐ６０モデルのこの領域中で見出されるヘリックス全体にわたる１８−ｍｅｒのペプチド；
ＩＩ．野性型ペプチドおよび１アミノ酸がアラニンで置き換えられたペプチドを包含する１０、１３および１５残基の三組の重なり合うペプチド（アラニン−スキャン（Ａｌａｎｉｎ−ｓｃａｎ）、Ａはアラニンで置き換えられた位置を表す）；
ＩＩＩ．野性型ペプチドおよび２アミノ酸がアラニンで置き換えられたペプチドを包含する１０および１３残基の二組の重なり合うペプチド（二重位置アラニン−スキャン）
を包含する９６種のペプチドを記述する；
実施例９：主鎖が環化されたペプチドの設計
領域７由来の第二世代のペプチドもまた設計した。この領域内にｈｓｐ６０を阻害するペプチドが見出されたからである（表４のペプチド１７３および１７５）。該プレートは、ｈｓｐ６０の残基４０８−４１６の配列に基づく主鎖が環化されたペプチドを含有する。該ペプチド（表５）は、位置４０８−４１４、４０９−４１６、４０８−４１６および４０９−４１４の間を架橋する４種の型の環化を伴う９残基長である。数種の型の構成単位（表５中で太字で標識される）を、異なる架橋の大きさおよび型を形成するために架橋基として利用している。位置４１５のＡｓｎ残基を、合成の考慮によりＧｌｎもしくは別の残基で置き換えている。加えて（表６）、ｈｓｐ６０の残基４０３−４１２に基づく直鎖状ペプチドを設計した。
【０１８３】
【表７】

【０１８４】
【表８】

【０１８５】
【表９】

【０１８６】
【表１０】

【０１８７】
本発明はある種の好ましい態様および実施例について記述された一方、多くの変更および改変を、本発明のペプチドおよび類似物の活性を至適化するために実施してよいことが当業者により認識されるであろう。該実施例は非制限的として解釈されるべきであり、かつ、本発明により開示される原理の具体的説明の目的上のみはたらき、その範囲は後に続く請求の範囲により規定される。
【図面の簡単な説明】
本発明は、後に続く図面および好ましい態様の詳述された記述に関して、より良好に理解されるであろう：
【図１】
発明にかかる、野性型もしくは突然変異体のＴｌｒ４をもつ骨髄由来マクロファージからのＴＮＦα産生に対するヒトｈｓｐ６０の示差的効果を示す。
【図２】
発明にかかる、ｈｓｐ６０に誘導されるＴＮＦα産生の用量依存性および時間経過を示す。
【図３】
発明にかかる、野性型もしくは突然変異体のＴｌｒ４をもつ骨髄由来マクロファージからのＮＯ産生に対するヒトｈｓｐ６０の示差的効果を示す。
【図４】
発明にかかる、ｈｓｐ６０に誘導されるＮＯ産生の用量依存性および時間経過を示す。
【図５】
発明にかかる、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５　ＦＰＬＣカラム上でのｈｓｐ６０のトリプシンフラグメントのゲル濾過クロマトグラフィーの溶出プロフィルを示す（実施例２、節１に記述される）。
【図６】
発明にかかる、ｈｓｐ６０から得られたトリプシンフラグメントの下位画分のＣ−４カラム上での逆相ＨＰＬＣの結果を示す（実施例２、節２に記述される）。
【図７】
発明にかかる、３４１１ダルトンの分子量を示す（Ｇｌｕ_１２６ないしＬｙｓ_１５６もしくはＬｅｕ_３９０ないしＡｒｇ_４２０に対応する）ＨＰＬＣ分離（図６）中のピーク番号３の質量スペクトル分析を示す。
【図８】
発明にかかる、マクロファージにおけるＴＮＦαの産生を誘導するそれらの能力についてのｈｓｐ６０およびｈｓｐ６０のトリプシンフラグメントの試験の結果を示す（実施例１、節１）。
【図９】
発明にかかる、マクロファージにおけるＮＯの産生を誘導するそれらの能力についてのｈｓｐ６０およびｈｓｐ６０のトリプシンフラグメントの試験の結果を示す（実施例１、節１）。
【図１０】
発明にかかる、ｈｓｐ６０の阻害についてのデカペプチドのスクリーニングの結果を記述する（実施例７）。
【図１１】
発明にかかる、ヒトｈｓｐ６０の残基３６４−３８１の領域に基づく９６種のペプチド類似物の設計を図解で記述する（実施例８）。[0001]
(Field of the Invention)
The present invention relates to peptides and peptide analogs capable of acting as antagonists of hsp60, characterized in that they have the ability to reduce or prevent the induction of the proinflammatory response of the innate immune system by hsp60. The invention further relates to pharmaceutical compositions comprising such peptides and peptide analogs or variants and derivatives thereof, useful for the prevention or treatment of inflammatory disorders and autoimmune diseases.
[0002]
(Background of the Invention)
Heat shock protein
Heat shock proteins (hsp) are ubiquitous polypeptides produced by all cells of all species. Heat shock proteins are component proteins that act as molecular chaperones (Becker {J. and Craig} AE,Eur. J. Biochem.219; 11, 1994) and inducible stress proteins, and are therefore also referred to as stress proteins. Up-regulation of hsp expression in cells was first described when cells were exposed to a sudden increase in temperature. It was later found that other insults could also induce hsp synthesis.
[0003]
Molecular chaperones are responsible for the post-translational assembly of oligomeric proteins in a complex, the intracellular folding and transport of proteins, and the denaturing of proteins from misfolding (denaturation) or unnecessary protein-protein interactions. It is a protein that plays an essential role in "protection."
[0004]
Heat shock proteins are one of the best phylogenetically conserved proteins, both on the one hand and the function on the other hand. Human and bacterial heat shock proteins are more than 50% homologous (Jindal et al.,).Mol Cell Biol.9: 2279, 1989).
Hsp60 in autoimmunity and inflammation
hsp60 is a mitochondrial chaperone with a major role in protein folding and denaturation, and in the transfer of proteins to mitochondria. In mitochondria, it facilitates the refolding of these proteins and, if necessary, their subsequent assembly into oligomeric complexes.
[0005]
hsp60 is found in the cytoplasm of cells under stressful and inflammatory conditions; cellular infection or elevated cytokine levels can induce cellular stress responses. Therefore, it is not surprising that hsp60 is a highly immunogenic protein. That is, it is the "common antigen" of Gram-negative bacteria. The immunological reactivity of both bacteria and autologous to hsp60 is highly prevalent in the general population. Because the immune response directed at the pathogen can easily convert to an autoimmune response due to the high homology.
[0006]
T cell responses to multiple hsp60 epitopes have been demonstrated in type 1 diabetes (Elias et al.).Proc Natl Acad Sci88: 3088, 1991), including rheumatoid arthritis and juvenile arthritis, multiple sclerosis, ankylosing spondylitis, infertility associated with pelvic inflammation, inflammatory bowel disease, atherosclerosis, graft rejection, and more. , A variety of autoimmune and inflammatory diseases (van {Eden et al.}Immunology Today{19; 303, 1998). The immune system reacts with hsp60 epitopes that are either cross-reactive or specific between human and bacterial analogs.
[0007]
Immunological tolerance has not previously reached the hsp60 epitope in the experimental system, indicating that the immune system is predisposed to recognize this particular protein. It is a strongly immunogenic protein in the general (healthy) population as well as in patients with inflammatory disorders.
[0008]
Continuous exposure to benign and pathogenic bacteria acts as a booster to the hsp60 response by re-exposing the host to bacterial hsp60. In addition, inflammatory cytokines secreted during infection increase local tissue expression of autologous hsp60. Cells damaged during inflammation release large amounts of autologous hsp60 to an immunologically active environment, leading to immunity.
[0009]
Inflammatory diseases with hsp60 expression in target tissues include:
(I) Autoimmune disease: diabetes (Birk et al.Proc Natl Acad Sci93: 1032, 1996), multiple sclerosis, rheumatoid arthritis (van Eden et al. Nature, 331: 171, 1988), juvenile chronic arthritis
(Ii) Chronic inflammation: inflammatory bowel disease, reactive arthritis.
(Iii) Graft rejection (Birk et al. Proc Natl Acad Sci, 96: 5159, 1999).
(Iv) Atherosclerosis
Is included.
hsp60 and atherosclerosis:
hsp60 has been implicated in atherosclerosis as autoantibodies to human hsp60 have been demonstrated to correlate with the clinical status of patients and experimental animal models. The suggested mechanism was that autoreactive hsp60-specific T cells respond to hsp60 that is overexpressed on aortic intima endothelial cells. One alternative mechanism is suggested by the finding that hsp60 is expressed in 89% of atheroma macrophages. In addition, hsp60 may stimulate atherosclerosis-related macrophage functions such as the production of TNFα, IL-6 and matrix-degrading metalloproteinases. hsp60 also acts on endothelial cells to induce the production of E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 and IL-6. Adhesion molecules enhance the transfer of monocytes and lymphocytes to atheroma, while proinflammatory cytokines can increase plaque instability and thrombosis. Thus, hsp60 may activate the expression of numerous molecules that promote atherogenesis in both target and effector cells.
Use of heat shock proteins in therapy
Some disclosures claim the use of heat shock proteins as immunomodulators in the diagnosis, treatment or prevention of autoimmune diseases. Most of the patent documents relate to bacterial heat shock proteins 60, also previously known as hsp65, or fragments of these proteins.
[0010]
For example, certain proteins produced by the human body during the onset of IDDM, which serve as diagnostic markers of the development of IDDM, are human heat shock proteins (human hsp65) having a size of about 65 kD, or EP 0417271. No. 5,114,844; US Pat. No. 5,671,848; US Pat. No. 5,578,303 and US Pat. No. 5,780,034. Sex antigen.
[0011]
It is disclosed that fragments of the present hsp60 protein may act as therapeutically useful entities in the prevention or alleviation of IDDM and host versus graft disease (International Patent Applications WO 96/19236, WO 97 / 01959 and WO 98/08536).
[0012]
In addition, fragments of hsp60 increase the immunogenicity of poorly immunogenic antigens as disclosed in US Pat. Nos. 5,736,146 and 5,869,058. May be used as carriers for the development of synthetic vaccines.
[0013]
EP 0 262 710 discloses polypeptides useful for palliating, treating and diagnosing autoimmune arthritis and similar autoimmune diseases. The claimed polypeptide is derived from a bacterial protein designated "antigen A" (later identified as mycobacterial hsp60).
[0014]
PCT application WO 92/04049 discloses a peptide of at least 7 amino acids homologous to a fragment of Mycobacterium tuberculosis hsp60, which inhibits T lymphocyte activation and proliferation, and It can protect against reaction and immune related diseases.
[0015]
PCT Applications WO 89/12455 and WO 94/29459 describe the prevention or treatment of autoimmune diseases, as well as the prevention or treatment of autoimmune diseases, as well as the generation or enhancement of immune responses or induction of immune tolerance, and the treatment of infectious diseases or cancer. Disclosed are the use of stress proteins and the like to treat or prevent. A fusion protein comprising a stress protein fused to a protein against which an immune response is desired is claimed.
[0016]
PCT Application No. WO 95/25744 discloses microorganisms containing epitopes homologous to the relevant mammalian epitopes used for treating and preventing inflammatory autoimmune diseases and for preventing graft rejection. Are disclosed. Protective epitopes are located in short 5-15 AA regions of stress proteins, which are highly conserved between microorganisms and animals.
[0017]
PCT Applications WO 97/11966 and WO 96/10039 describe polypeptides of up to 21 amino acids from microbial heat shock proteins that are useful for the prevention or treatment of autoimmune diseases, especially arthritis. Disclose.
[0018]
PCT Application No. WO 96/16083 describes a 10 kD heat shock protein (hsp10) of Mycobacterium tuberculosis which is useful in pharmaceutical products for the treatment of inflammatory conditions, especially rheumatoid arthritis. ) Is disclosed.
[0019]
PCT Application No. WO 91/02542 discloses a mycobacterium pakke (C) for treating chronic inflammatory disorders caused or associated with abnormally high release of IL-6 and / or TNFα.mycobacterium vaccae) Are disclosed, as well as the use of hsp60, among others.
[0020]
PCT Application No. WO 96/18646 describes 9-20 derived from mycobacterial hsp60 used for the treatment or prevention of autoimmune CNS diseases such as multiple sclerosis, chronic inflammatory CNS diseases and primary brain tumors. Disclosed are amino acid peptides.
[0021]
Other inventors use heat shock proteins other than hsp60 for therapy. For example, US Pat. No. 5,348,945 is stressed using heat shock proteins for the treatment of atherosclerosis, arterial restenosis and hypoxic nerve injury using exogenous hsp70. Methods for reducing mortality in tissues are disclosed.
[0022]
Other inventions (eg, Japanese Patent Nos. 10212230 and 09241159) inhibit the expression of proteins belonging to the hsp60 or hsp27 family, and are thus useful for the treatment of autoimmune diseases and cancer. Disclosed are natural compounds and extracts.
Toll protein
International Patent Application No. WO 99/20756 discloses DNA sequences encoding human Toll proteins and antibodies that specifically bind these proteins. The polypeptides are used to identify other proteins involved in Toll-mediated transduction (eg, natural ligands), to screen for mimetics of receptors and ligands, and to generate antibodies. .
[0023]
International Patent Application No. WO 98/50547 discloses human DNA for Toll-like receptors and proteins and peptides derived therefrom. The compounds are claimed for use in altering phosphate metabolism, inflammatory function or innate immune response. Also disclosed are compounds that bind, preferably antibodies or antibody fragments that specifically bind to these proteins or peptides.
[0024]
However, the exact role of the Toll protein in the above process has not been elucidated.
[0025]
Thus, modulating the role of self hsp60 and possibly the Toll-like receptor complex in affecting certain diseases, and especially in modulating the proinflammatory immune response, and inhibiting or even preventing such responses There is a need to provide molecules that are useful for:
[0026]
Any of the background art teaches the hsp60 peptides, variants, derivatives and analogs disclosed herein that are useful as antagonists of hsp60 and have the ability to reduce or prevent the induction of a proinflammatory immune response by hsp60. Or do not suggest.
[0027]
(Summary of the Invention)
To provide a novel anti-inflammatory peptide of hsp60 capable of acting as an antagonist of hsp60, characterized in that it has the ability to reduce or prevent the induction of a pre-inflammatory immune response of cells of the innate immune system by hsp60. Is an object of the present invention. Provided are variants, derivatives and analogs of peptides of hsp60, which are capable of acting as antagonists of hsp60, characterized in that they have the ability to reduce or prevent the induction of a pre-inflammatory innate immune response by hsp60. Is another object of the present invention. The antagonists of the present invention preferably comprise peptides comprising 5 to 30 amino acid residues, more preferably 5 to 25 amino acid residues, most preferably 7 to 18 amino acid residues, and variants, derivatives or analogs thereof. Can be.
[0028]
A further object of the invention relates to the identification of parts of hsp60 that are suitable for eliciting a pro-inflammatory immune response and to provide molecules that reduce or prevent such a response. Accordingly, it is another object of the present invention to provide fragments of the human hsp60 protein that have a molecular weight of about 20 kD or less and retain the ability of hsp60 to induce a pre-inflammatory innate immune response. These fragments are particularly useful according to the invention for the design of mutants, derivatives and analogs characterized in that they serve as antagonists of the inflammatory response induced by hsp60.
[0029]
In accordance with the principles of the present invention, certain proinflammatory fragments of hsp60 have been identified to serve as useful guides in the design of inhibitory mutants, derivatives and analogs. Unexpectedly, it is now disclosed that shorter peptides from within these fragments possess anti-inflammatory activity, characterized in that they can reduce or even prevent the pro-inflammatory response induced by hsp60. You. These shorter peptides can be referred to herein as hsp60 anti-inflammatory peptides.
[0030]
In general, the anti-inflammatory peptides, derivatives and variants of the present invention can be derived from an epitope of hsp60 that is processed and not necessarily exposed in the native protein. Conversely, they can be derived from epitopes or loops of the protein exposed on the surface of the hsp60 molecule.
[0031]
In accordance with the present invention, it is now disclosed that currently more preferred analogs are designed to mimic certain epitopes of the molecule designated hsp60. Most preferred peptides include analogs of human hsp60, while additional preferred analogs include analogs of bacterial hsp60.
[0032]
According to a most preferred embodiment of the invention, the anti-inflammatory peptides, and variants, derivatives and analogs of the disclosed and claimed fragments, are characterized by their ability to act as antagonists of the inflammatory response induced by hsp60. And
[0033]
It is yet another object of the present invention to provide cyclic derivatives and analogs of heat shock proteins or peptides derived therefrom, which have improved properties compared to the corresponding linear sequences. The improved properties may include, but are not limited to, prolonged metabolic stability, or enhanced selectivity of action.
[0034]
In one preferred embodiment of the variants and derivatives of the fragments of the invention, these molecules have a backbone that incorporates at least one structural unit containing one nitrogen atom of the peptide backbone linked to a bridging group. Further modified to be a peptidized analog of the peptide. Preferably, these cyclic peptide analogs can correspond to 5 to 30 amino acid residues of a linear peptide sequence. More preferred backbone cyclized analogs have from 5 to 18 residues, with at least one structural unit linked to the terminal, side chain, or another structural unit to form a cyclic peptide analog. In particular, it is generally desirable to reach peptide analogs with greater specificity, thereby achieving enhanced clinical selectivity.
[0035]
The presently most preferred anti-inflammatory peptides of the present invention and variants, derivatives or analogs of the peptide sequences are now disclosed. That is,
A preferred embodiment is derived from the sequence of human hsp60. An additional preferred embodiment is derived from the sequence of bacterial hsp60.
[0036]
Preferred embodiments of the present invention are:
a. Residues 126-160 of human hsp60. A more preferred portion of this region spans residues 126-156 of human hsp60.
b. Residues 140-192 of human hsp60. A more preferred portion of this region comprises analogs spanning residues 157-191, 158-192, 158-191, 161-191 and 161-192 of human hsp60.
c. Residues 220-250 of human hsp60. The most preferred portion of this region spans residues 222-249 of human hsp60.
d. Residues 269-290 of human hsp60.
e. Residues 310-344 of human hsp60. A preferred portion of this region spans residues 315-344 of human hsp60.
f. Residues 390-421 of human hsp60.
g. One currently most preferred embodiment of the present invention comprises derivatives, variants and peptide analogs corresponding to residues 350-400 of human hsp60.
Anti-inflammatory peptides, variants, derivatives and analogs of fragments having a sequence selected from the group consisting of:
[0037]
Additional most preferred peptides and peptide analogs of the invention are:
i. Tyr-Phe-Ile-Asn-Thr-Ser-Lys-Gly-Gln-Lys corresponding to residues 227-236 of human hsp60
ii. Lys-Ala-Gln-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Gln-Glu corresponding to residues 364-373 of human hsp60
iii. Lys-Arg-Ile-Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu corresponding to residues 369-378 of human hsp60
iv. Ile-Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu-Asp-Val corresponding to residues 371-380 of human hsp60
v. Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu-Asp-Val-Thr corresponding to residues 372-381 of human hsp60
vi. Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val corresponding to residues 403-412 of human hsp60
vii. Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Glu-Val corresponding to residues 405-414 of human hsp60
It is.
[0038]
Additional more preferred derivatives, variants and peptidomimetics of the invention are residues 364-381 of the human hsp60 sequence, ie, Lys-Ala-Gln-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Gln-Glu-Ile. Based on -Ile-Glu-Gln-Leu-Asp-Val-Thr. Preferred anti-inflammatory peptides and peptide analogs of this sequence comprise 10 to 18 amino acid residues, optionally with at least one residue replaced by alanine. The currently most preferred peptide analogs are:
i. Lys-Ala-Gln-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Gln-Glu-Ile-Ile-Ala-Gln-Leu corresponding to residues 367-381 of human hsp60;
ii. Lys-Arg-Ala-Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Alu-Leu corresponding to residues 372-381 of human hsp60
It is.
[0039]
Another preferred embodiment of the present invention comprises derivatives, variants and peptide analogs of residues 403-412 of human hsp60. The most preferred analogs of this region have the following sequence:
i. Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Glu-Val-Asn;
ii. Ala-Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Glu-Val;
iii. Val-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Val;
iv. Gly-Val-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val
Is included.
[0040]
Still other more preferred analogs of the present invention are peptide derivatives, variants and analogs in which the backbone of residues 408-416 of human hsp60 is cyclized. These analogs optionally have one Gln, Ser, Thr, Ala, Leu or 2Abu residue instead of Asn at position 415.
[0041]
The presently most preferred analogs of this sequence include two bridging groups at positions selected from the group consisting of: residues 408 and 414, residues 409-416, residues 408-416, and residues 409-414. And a nonapeptide having a main chain cyclized. Other preferred backbone cyclized analogs have from 5 to 18 residues, with at least one structural unit linked to the terminal, side chain, or another structural unit to form a cyclic peptide analog.
[0042]
All sequences listed above and in the examples are useful per se and may also be used as the basis for the design and synthesis of derivatives, variants and analogs with improved properties.
[0043]
Another object of the present invention is a pharmaceutical composition comprising a variant, derivative or analog of the fragment of the invention capable of acting as an antagonist of hsp60, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier. It is to provide.
[0044]
The present invention further relates to a method of preparing a pharmaceutical composition comprising a variant or derivative of the fragment of the invention.
[0045]
Formulation of the compound into a pharmaceutical composition may further include the addition of pharmaceutically acceptable carriers, excipients, and / or diluents.
[0046]
Pharmaceutical compositions comprising pharmacologically active analogs of heat shock proteins and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent are useful for treating chronic inflammatory diseases, graft rejection and graft rejection using such compositions. As is the case with the method of treating autoimmune diseases, it represents another aspect of the present invention.
[0047]
The pharmaceutical compositions of the invention advantageously comprise at least one anti-inflammatory peptide or peptide analog, the sequence of which is derived from or mimics a portion of a heat shock protein molecule. These pharmaceutical compositions may be administered by any suitable route of administration, including orally, topically or systemically. Preferred modes of administration can include, but are not limited to, parenteral routes such as intravenous and intramuscular injection. Additional preferred routes of administration include, but are not limited to, administration via nasal inhalation or ingestion.
[0048]
It is another object of the present invention to provide methods for identifying, screening and / or characterizing compounds that can act as antagonists of hsp60 as long as they can reduce or prevent the induction of a proinflammatory response by hsp60. Is the purpose. The compound to be tested may be any possible compound, for example, variants and derivatives of fragments of hsp60 as described above, inorganic or organic compounds, antibodies, eg, monoclonal or polyclonal antibodies, antibody fragments such as Fab fragments. , Soluble Toll-like receptor 4 or Toll-like receptor 2, or fragments or complexes of these receptors.
[0049]
Methods for identifying, screening and / or characterizing fragments of hsp60 that are capable of eliciting a pro-inflammatory immune response, and / or for identifying compounds capable of acting as hsp60 antagonists of the present invention, also have high throughput and High throughput quantitative and / or qualitative screening methods may be included.
[0050]
The compounds of the present invention are useful as active ingredients in pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of diseases associated with heat shock proteins in their etiology or pathology.
[0051]
In this regard, it is an object of the present invention to provide molecules that are useful in controlling or preventing certain diseases and conditions in which hsp60 is responsible for inducing a proinflammatory immune response in cells of the innate immune system. It is.
[0052]
The present invention therefore relates to autoimmune diseases, including but not limited to diabetes, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis and systemic lupus erythematosus, chronic inflammation (limited But not limited to atherosclerosis, inflammatory bowel disease, reactive arthritis), chronic infections, graft rejection, gingivitis, gastritis, ulcers, thrombosis, allergies and inflammatory diseases such as acute infections The use of a variant, derivative or analog of a fragment of hsp60 of the invention for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of
[0053]
The disclosure in the background art relates to a number of specific peptides derived from hsp60, which are useful in the treatment of certain diseases or disorders based on their interaction with specific T cell receptors. The present invention is directed to novel peptides of hsp60 that are useful in suppressing or preventing the innate immune response mediated by other cells of the immune system and has previously claimed for their ability to modulate T cell responses. Exclude all known hsp60 peptides.
[0054]
(Detailed Description of the Invention)
The present invention relates to the identification of fragments of hsp60 capable of inducing a pro-inflammatory immune response by cells of the innate immune system. More specifically, the present invention relates to the smaller anti-inflammatory of these fragments capable of acting as antagonists of hsp60 as long as they have the ability to reduce or prevent the induction of a proinflammatory immune response by hsp60. It relates to peptides, variants and even derivatives. The present invention also relates to pharmaceutical compositions comprising such peptides or variants and their derivatives.
[0055]
The present invention is based on the finding that hsp60 binds to the Toll-like receptor 4 complex and consequently elicits a strong pro-inflammatory response in cells of the innate immune system as exemplified below. It was further found that such a response could also be elicited by a smaller fragment of hsp60 as described above. Using the knowledge provided by the present invention, it is now possible to identify regions of hsp60 that are important in eliciting a pro-inflammatory response in cells of the innate immune system.
[0056]
Unexpectedly, it is possible to identify even smaller peptides of hsp60 that possess anti-inflammatory properties, and that these peptides reduce or prevent the inflammatory response elicited by exposure to intact hsp60. What is possible is now disclosed.
[0057]
One approach is to construct a three-dimensional model of hsp60 and to determine which of the aforementioned amino acid extensions of (a) to (l) are expected to be exposed to the solvent. The three-dimensional model of hsp60 is described in the GROEL protein database entry PDB @ 1gr1. ent (see also Braig et al., Nature 371 (1994), 578), constructed from homology from crystallographically known structures. Thus, for example, chemically synthesizing amino acid extensions identified as being exposed to a solvent, and smaller fragments thereof, and either pro-inflammatory or anti-inflammatory using assays as described above. It is possible to test them for their ability to elicit a response.
[0058]
Furthermore, based on the knowledge that hsp60 binds to the Toll-like receptor 4 complex, the sequence of hsp60 can be used to determine the native nature of the Toll receptor in the genus Drosophila, where Toll controls dorso-ventral patterning. It is now possible to compare to that of the spaetzle protein (Marisato and Anderson, Cell # 76 (1994), 677) which is a ligand of By this comparison (see Scheme I), the homology of the six regions can be determined, thereby allowing the amino acid sequence within hsp60 to potentially bind to the recognition site of the Toll-like receptor 4 complex. Enable identification.
[0059]
It is possible that the smaller hsp60 peptides identified within these epitopes or fragments of hsp60 can themselves exert anti-inflammatory activity as long as they reduce or prevent the response to hsp60, as exemplified extensively below. , Was unexpectedly discovered.
[0060]
Furthermore, it is possible to predict the secondary structure of the spaetzle protein. This allows the identification of fragments of hsp60 that show structural similarity to the corresponding part of the spaetzle protein. The analysis of the six areas is:
Region 1 shows a considerable degree of homology with the two fragments of spaetle (this region and the alignment are marked as Box 1 in Scheme I. The arrow in the box indicates that the fragment To follow).
[0061]
[Table 1]

[0062]
Region 2 does not show sequence homology to spaetzle, but nevertheless binds two solvents in hsp60 together with two loops, one preceding the first helix and the other between two. Spans the exposed helix. Both the loop and helix are exposed to the solvent and are therefore potential recognition sites on hsp60. Since the spaetle is predicted to be a bundle of four helices, the structural homology between region 2 and spaetle, which allows recognition by the same receptor, is determined by the apparent sequence homology within this region. Despite the lack, it is possible.
[0063]
Region 3 shows significant homology with a single fragment of spatzle (marked as box 2 in Scheme I). This region is highly flexible, the GROEL crystal structure, and therefore the surface exposed loops in the hsp60 model. The secondary structure of spaetle in the region homologous to region 3 is also expected to be a loop. Thus, all of the analyzes suggest that this fragment is a potential candidate for recognition by the toll receptor.
[0064]
Region 4 shows significant homology with one fragment of spaetle (marked as box 3 in Scheme I). It is only partially exposed in the hsp60 model. A structural comparison between this region and the corresponding region in spatzle is not straightforward because a large portion of this fragment exhibits poor electron density in the GROEL crystal.
[0065]
Region 5 spans a large fragment of hsp60 that shows no sequence homology with spaetle, which is tailed by a short fragment showing homology (Box 4 in Scheme I). The C-terminal portion of this fragment (including the Box 4 sequence and an additional 9 residues upstream are exposed on the surface).
[0066]
Region 6 shows homology with the two fragments of spatzle (box 5 in Scheme I; the arrow defines the continuity limit of this region to the next row). The entire fragment consists of a surface exposed helix, followed by a short β-strand, a short partially exposed loop and additional helices. Spaetzle fragments homologous to the first helix are predicted to be loops, but fragments still homologous to the C-terminal helix are also predicted to be helices. An additional region of hsp60, from Lys359 to Asp399, shows a considerable degree of homology to one fragment of spaetle and is solvent exposed.
showed that.
[0067]
In one currently preferred embodiment of the invention, the fragment of the human hsp60 protein is obtained by digesting the human hsp60 protein with trypsin, in particular treating the hsp60 protein with trypsin, preferably at an enzyme / protein weight ratio of 1:54, Incubate at 37 ° C. for 0.5, 1.5, 5.4 and 16.5 hours respectively, combine the reaction mixtures after stopping the reaction, centrifuge them, filter the supernatant and Subjecting it to gel filtration chromatography on a Superdex-75 @ FPLC column using PBS at a rate of 0.5 ml / min, collecting the fractions, and possibly concentrating them; And their ability to induce a pro-inflammatory response as described above By assaying them with, it can be obtained. For further purification, the fractions active in the test for pro-inflammatory response were subjected to reverse phase HPLC on a C-4 column using a gradient of 0.1% TFA in water and 0.1% TFA in acetonitrile. Fractions can be collected and tested again for their ability to induce a pro-inflammatory immune response.
[0068]
In an even more preferred embodiment, the fragment of the invention comprises the following amino acid extension present in a native hsp60 protein:
(I) Glu₁₂₆Or Lys₁₅₆;
(Ii) Lys₁₅₇Or Lys₁₉₁;
(Iii) Gln₁₅₈Or Lys₁₉₂;
(Iv) Gln₁₅₈Or Lys₁₉₁;
(V) Pro₁₆₁Or Lys₁₉₁;
(Vi) Pro₁₆₁Or Lys₁₉₂;
(Vii) Gly₂₂₂Or Lys₂₄₉;
(Viii) Lys₂₆₉Or Arg₂₉₀;
(Ix) Lys₃₁₀Or Lys₃₄₄;
(X) Asp₃₁₅Or Lys₃₄₄;
(Xi) Leu₃₉₀Or Val₄₂₁;and
(Xii) Thr₅₂₇Or Gly₅₇₁
Containing at least one of
Here, the numbers given as subscripts indicate the positions of the corresponding amino acid residues of the human hsp60 protein as disclosed in SWISSPROT database accession number P10809.
[0069]
The hsp60 fragments of the present invention, and their derivatives and / or variants, may be linked to other (poly) peptide sequences or may be part of the fusion protein (s). Such (poly) peptide / fusion proteins may be engineered to improve the characteristics of the fragment, derivative or variant. For example, additional amino acids to improve stability and / or persistence during the purification, handling or storage process, or to improve stability, half-life and / or persistence in the host organism and / or patient. May be added.
[0070]
Further, the hsp60 fragments, derivatives and / or variants of the present invention may be fused to other proteins or peptides that play a role in the inflammatory immune response or their potential treatment. Molecules comprising a fragment, derivative or variant of hsp60 of the invention linked to a marker molecule and / or marker amino acid sequence are also within the scope of the invention. Such sequences include, but are not limited to, peptide labels, histidine labels, fluorescent molecules, GFP, FLAG and GST.
[0071]
In one preferred embodiment of the variants and derivatives of the fragment of the invention, these molecules are further modified to be "backbone cyclized peptide analogs". The backbone cyclized peptide analog comprises a peptide sequence of preferably 5 to 30 amino acids incorporating at least one building block containing one nitrogen atom of the peptide backbone. In particular, it is generally desirable to achieve peptide analogs with greater specificity, thereby achieving enhanced clinical selectivity. As a result of the great advances in organic chemistry and molecular biology, many bioactive peptides can now be produced in quantities sufficient for pharmacological and clinical utility. Thus, in recent years, new methods have been established for the treatment and therapy of peptide-related diseases. However, the use of peptides as drugs depends on the following factors: a) their low metabolic stability against proteolysis in the gastrointestinal tract and serum; b) their relatively large molecular weight or lack of specific transport systems, among others. Or their poor absorption following oral ingestion; c) their rapid excretion by the liver and kidneys; and d) their unwanted side effects in non-target organ systems (peptide receptors are widespread in organisms). Because they may be distributed).
[0072]
Thus, it would be most beneficial to produce conformationally constrained peptide analogs that overcome the shortcomings of natural peptide molecules and thereby provide improved therapeutic properties. One conceptual approach to constraining the conformation of a peptide was introduced by Gilon et al. (Bio-polymers 31 (1991), 745) who proposed backbone-to-backbone cyclization. The theoretical advantage of this strategy is that the ability to effect cyclization via the carbon or nitrogen of the peptide backbone without interfering with the side chains that may be critical for the interaction of a given peptide with a specific receptor. Is included. Although this concept was envisaged to be applicable to any linear peptide of interest, in reality the limiting factor in the proposed scheme replaces amino acids that should be linked via a bridging group Appropriate building blocks that must be used to make them available. The practical adaptation of this concept of backbone cyclization to practice was initially limited by the inability to devise any practical method of making amino acid building blocks other than glycine (Gilon et al., J. Org. Chem 587 (1992), 5687). Further disclosures by Gilon and co-workers (WO 95/33765, WO 97/09344, U.S. Patent Nos. 5,723,575, 5,811,392 and 5,883). , 293) provided a method for producing a structural unit required for the synthesis of a peptide analog having a main chain cyclized. Recently, the backbone cyclized peptide analogs of bradykinin analogs (US Pat. No. 5,874,529), and backbone cyclized peptide analogs having somatostatin activity (WO 98 / The successful use of these methods to produce 04583 and U.S. Pat. No. 5,770,687) was also disclosed. All of these methods are hereby incorporated by reference in their entirety.
[0073]
The present invention also provides
a) contacting a cell carrying an intact Toll-like receptor complex on the cell surface with a fragment of hsp60;
b) measuring the amount of proinflammatory mediator or effector produced by the cell
Also provided is a method of identifying a fragment of hsp60 capable of eliciting a pro-inflammatory immune response, comprising the steps of:
Here, increased production of pro-inflammatory mediators or effectors implies the ability of fragments of hsp60 to elicit a pro-inflammatory response. The method is exemplified below for the proinflammatory mediators TNFα and / or NO.
[0074]
The fragment of hsp60 used in step (a) can be any possible fragment of hsp60. Preferably, such fragments have a length of at least 5 amino acid residues, more preferably at least 10, even more preferably at least 20, and most preferably at least 50 amino acid residues. Such fragments can be generated, for example, by cleavage of the hsp60 protein, by proteolytic cleavage, for example, tryptic digest, or by chemical cleavage, for example, with CNBr, or by methods known to those skilled in the art. And can be chemically synthesized.
[0075]
The cells used in step (a) of the method are preferably cells carrying an intact Toll-like receptor 4 complex. However, since it is possible in humans that Toll-like receptor 2 is an hsp60 receptor, cells carrying such a receptor may also be used. Preferably, the cells used in the method are lymphocytes, and more preferably macrophages, such as human or mouse macrophages. An example of a cell that can be used in such a method is J774 cell, which can be purchased from German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany). The resulting mouse macrophage cell line J774A. 1, or purchased from the Breeding & Research Center A / S (Bomhotlgard, Rye, Denmark) and Charles River (Sulzfeld, Germany), respectively. Bone marrow derived macrophages of the possible mouse strains C57BL / 6JBom and C3H / HeN. Methods for preparing such bone marrow-derived macrophages are known to those skilled in the art and are also described in Example 1.
[0076]
As a negative control, bone marrow-derived cells of C3H / HeJ mice, which can be purchased from Charles River (Sulzfeld, Germany), can be used. These macrophages express a functionally defective Toll-like receptor 4 membrane protein and do not respond to hsp60 due to the production of TNFα and NO.
[0077]
However, the methods described herein are not only useful for identifying fragments of hsp60 that have the ability to elicit a pro-inflammatory immune response, but also can be used to characterize and / or screen said molecules. Good.
[0078]
The invention further relates to steps (a) and (b) of the method described above, and
c) formulating a fragment of hsp60 identified in step (a) as having the ability to elicit a pro-inflammatory response into a pharmaceutical composition
And a method for producing a pharmaceutical composition.
[0079]
Formulation of the fragment into a pharmaceutical composition may further include the addition of a pharmaceutically acceptable carrier, excipient and / or diluent. With the help of the described method, it is now possible to identify smaller fragments of hsp60 that still have the ability to elicit a pro-inflammatory immune response. With the help of these smaller fragments and by identifying regions of the hsp60 protein that interact with the Toll-like receptor 4 complex, in turn, variants of these fragments that can act as antagonists of hsp60 have been designed. Thus, it is possible to reduce or prevent the induction of a pre-inflammatory immune response by hsp60.
[0080]
Accordingly, the present invention also relates to variants and derivatives of the hsp60 fragments of the present invention which are capable of acting as antagonists of hsp60, especially as long as they are able to reduce or prevent the induction of a proinflammatory immune response by hsp60. Related. In this context, the antagonist is preferably a peptide or peptidomimetic that reduces or prevents such a response.
[0081]
The present invention also provides methods for identifying, screening and / or characterizing compounds that can act as antagonists of hsp60 as long as they can reduce or prevent the induction of a proinflammatory response by hsp60, , The method
a) contacting cells bearing an intact Toll-like receptor complex on the cell surface with hsp60 or a fragment thereof capable of inducing a pro-inflammatory response in the presence and absence of the compound to be tested. ; And
b) determining whether the presence of the compound has an effect on the production of pro-inflammatory mediators or effectors
Comprising the steps of
Here, the reduction or prevention of the production of pro-inflammatory mediators or effectors implies the ability of the compound to act as an antagonist of hsp60. Currently, the method of the present invention is exemplified below using the production of TNFα and / or NO in said cells in an assay.
[0082]
For the cells listed in step (a) of the method, the same applies as already indicated above for the method of identifying fragments of hsp60 having the ability to elicit a pro-inflammatory immune response. The fragment of hsp60 listed in step (a) of the method can be any fragment of hsp60 of the invention that has the ability to elicit a pro-inflammatory immune response.
[0083]
Measurement of the amount of TNFα and / or NO produced by the cells can be performed as described above and in the Examples.
[0084]
The compound to be tested can be any possible compound, for example, variants and derivatives of the fragments of hsp60 as described above, inorganic or organic compounds, antibodies, eg, monoclonal or polyclonal antibodies, antibody fragments such as Fab fragments, soluble It may be Toll-like receptor 4 or Toll-like receptor 2, or a fragment or complex of these receptors.
[0085]
The invention further relates to steps (a) and (b) of the method described above, and
c) formulating the compound identified in step (b) as an antagonist of hsp60 into a pharmaceutical composition
And a method for producing a pharmaceutical composition.
[0086]
Formulation of the compound into a pharmaceutical composition may further include the addition of pharmaceutically acceptable carriers, excipients, and / or diluents.
[0087]
Methods for identifying, screening and / or characterizing fragments of hsp60 capable of eliciting a pro-inflammatory immune response, or for identifying compounds capable of acting as antagonists of hsp60 of the present invention, are also known as high-throughput screening methods, and Similar approaches performed using 96-well, 384-well, 1536-well (and other) commercially available plates may also be included (see, inter alia, Spencer, Biotechnol. Bioeng. 61 (1998), 61-). 67). These methods to be used in the present invention include, but are not limited to, readout of homogeneous optical density in high throughput screening (eg, for NO and TNFα) (eg, Pope, DDT 4 ( 1999), 350-362). Cell-based assays as described in the examples above and in the appendix may be combined with detection techniques such as scintillation counting, fluorescence measurement, luminescence measurement or measurement of absorbance signal, among others. Thus, the methods described in the examples above and in the appended examples can be readily adapted to quantitative and / or qualitative screening methods that derive high-throughput and ultra-high-throughput screening methods.
[0088]
Furthermore, the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising a variant, derivative or analog of the fragment of the present invention, which can act as an antagonist of hsp60, and optionally a pharmaceutically acceptable carrier. The term "antagonist of hsp60" in this regard preferably means that these molecules are capable of reducing or preventing the induction of a proinflammatory immune response by hsp60. Finally, the invention also relates to autoimmune diseases (including but not limited to diabetes, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis and systemic lupus erythematosus), chronic inflammation (limited But not limited to atherosclerosis, inflammatory bowel disease, reactive arthritis), chronic infections, graft rejection, gingivitis, gastritis, ulcers, thrombosis, allergies and inflammatory diseases such as acute infections It also relates to the use of a variant, derivative or analog of a fragment of the present invention which can act as an antagonist of hsp60 for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of a disease.
Terms and definitions:
In the context of the present specification, the term “hsp60 protein” is used to describe heat shock proteins, ie, when cells are subjected to, inter alia, a sudden rise in temperature or when they are intercellular with other cells, intracellularly or extracellularly. Refers to a protein whose expression is upregulated in cells when faced with stress. Further, "hsp60 protein" refers to mitochondrial chaperone. In particular, the term “hsp60 protein” refers to a protein having a molecular weight of about 60 kD. Preferably, the term "hsp60 protein" refers to a human hsp60 protein, preferably a protein having an amino acid sequence as disclosed in Jindal et al. (Mol. Cell Biol. 9 (1989), 2279).
[0089]
For the purposes of this specification and the claims, the term "human hsp60" refers to not only the 60 kD human heat shock protein, but also cross-reacts with polyclonal antibodies raised against the 60 kD heat shock protein of any species. It is intended to include any other related molecules found in human serum. This definition is specifically intended to include, but is not limited to, the previously discovered 65 kD, 30 kD, 25 kD and 47 kD proteins.
[0090]
The human hsp60 molecule was once designated as hsp65, but is now designated as hsp60 because of more accurate molecular weight information; the protein is identical by either designation.
[0091]
In the context of the present invention, the term "fragment" refers to at least 5, more preferably at least 10, even more preferably at least 20, and most preferably at least 30 contiguous sequences in the sequence in which it occurs in the native hsp60 protein. A portion of the hsp60 protein comprising amino acids, or a portion of the hsp60 protein that may be obtained, for example, by enzymatically or other means of cleaving the hsp60 protein. In this case, the fragments need not necessarily contain only the contiguous amino acid sequence, but two or more of these sequences can be interconnected, for example, by disulfide bonds, peptide bonds, or any other covalent bond. It may contain more.
[0092]
The term “molecular weight of about 20 kD or less” in the context of the present invention refers to a molecular weight of less than 22 kD, preferably less than 21 kD, and most preferably less than 20 kD, especially as determined by SDS page under mass spectrometry or reducing conditions. means. In one preferred embodiment, the fragment has a molecular weight of less than 15 kD, more preferably less than 10 kD, and even more preferably less than 5 kD.
[0093]
The term "ability of hsp60 to induce a pro-inflammatory response" in the context of the present invention means, inter alia, the ability to elicit a pro-inflammatory response in cells of the innate immune system. This can be measured, for example, by induction of TNFα and / or NO formation in macrophages, such as macrophages of C3H / HeN or C57BL / 6 mice or J774 cells (Chen et al., J. Immunol. 162 (1999), 3212). Here, induction / enhancement of TNFα and / or NO formation indicates the ability to induce a pro-inflammatory immune response. Measuring the induction of a pro-inflammatory response can be performed, inter alia, as described in Chen et al. (Cited above) or in the Examples. Thus, induction of TNFα may be induced by TNFα produced by macrophages before and after exposure to the respective protein, for example by using a sandwich ELISA as described in Chen et al. (J. Immunol. 162 (1999), 3212). And determination by quantifying TNFα, for example, by using a standard curve obtained with recombinant cytokines (Genzyme, Kent, UK) against medium alone as a blank Can be. Induction of NO formation can be achieved by accumulating nitrite (NO.sub.3) in the culture supernatant using, for example, a colorimetric Griess reaction as described in Chen et al.₂ ⁻) Can be determined by measuring the amount of NO released by macrophages by measuring the concentration of
[0094]
The term "antagonist of hsp60" in the context of the present invention preferably means that these molecules are capable of reducing or preventing the induction of a proinflammatory immune response by hsp60. This ability is due to the use of, for example, native hsp60 as inducer, and to the addition of the variant or derivative to be tested, and the effect on the production of proinflammatory mediator effectors as exemplified by TNFα and / or NO. A fragment of hsp60 can be used for pro-inflammatory immunity, except as measured using a decrease or inhibition of pro-inflammatory mediators or effectors (eg, TNFα and / or NO) production, which implies the ability of the tested molecule to act as an antagonist of hsp60. The determination can be made by using the same assay as described above to determine if it has the ability to induce a response.
[0095]
To determine whether a protein, protein fragment and / or peptide induces a pro-inflammatory response, cells, ie, macrophages, are seeded into, for example, a 96-well flat-bottom microtiter plate (2 × 10 5 in 200 μl per well).⁵Cells). 24 hour pre-incubation (37 ° C., 5% CO 2₂3.) Later, the protein, protein fragment and / or peptide to be tested is added to the culture at various concentrations and the incubation is continued for various time intervals before measuring the production of TNFα and NO.
[0096]
As used herein, “peptide” refers to a sequence of amino acids linked by peptide bonds. The peptide analogs of the present invention comprise a sequence of 5 to 30 amino acid residues, preferably 5 to 24 residues, more preferably 7 to 18 amino acids, wherein each residue has an amino and carboxy terminus. And
[0097]
The term "variant" means that such a molecule has the amino acid sequence of a fragment of the invention, except for one or more amino acid changes. Such variants are obtained, for example, by point-directed mutagenesis, by expressing the mutated DNA in a suitable host cell, and recovering the (poly) peptide produced from the cell culture. It can be generated by mutating the corresponding DNA sequence encoding the corresponding fragment of human hsp60. Methods for producing such variants, and methods for their production, eg, recombinant DNA technology, are known to those skilled in the art. However, the term "variant" also comprises naturally occurring molecules as well as molecules which can be produced by said recombinant techniques.
[0098]
The term "derivative" means that the fragment of the invention is modified in such a way that it is no longer able to induce a proinflammatory immune response, but in this regard it can act as an antagonist of hsp60. means. Such alterations include, for example, alterations in the side chain of one or more amino acid residues of the fragment. Thus, in the context of the present invention, the term "derivative" includes "derivatives" of fragments of hsp60 which may preferably comprise the same three-dimensional structure, but are modified chemically and / or physicochemically. Consists of Further, the modification techniques comprise genetic and / or molecular biological techniques. Thus, said "derivatives" can be generated by mutagenesis techniques or (side) specific synthesis. In addition, such derivatives can be detected and / or characterized using techniques known in the art. These techniques are, inter alia, peptidomimetics (al-Obeidi, Mol. Biotechnol. 9 (1998), 205-223; Bohm, J. Com. Aided Mol. Des. 10 (1996), 265-272) or combinatorial. The use of a library (see, for example, Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 705-715). Furthermore, the three-dimensional and / or crystallographic structure of the hsp60 fragment of the invention can be used to deduce and / or generate said "derivative". The design of a suitable "derivative" may be computer aided.
[0099]
The term "analogs" relates to peptide analogs, which are characterized in that they incorporate a new building block with a bridging group attached to the α-nitrogen of the α-amino acid. In particular, these compounds are analogues in which the main chain is cyclized, preferably comprising a peptide sequence of preferably 5 to 30 amino acids, incorporating at least one structural unit, said structural units being amides, thioethers, thioesters Or one nitrogen atom of the peptide backbone linked to a bridging group comprising disulfide, wherein at least one structural unit is linked via said bridging group to form a second structural unit To form a cyclic structure having a part selected from the group consisting of the side chains of the amino acid residues of the sequence or the terminal amino acid residues. More preferably, the peptide sequence incorporates 5 to 24 amino acids, even more preferably it incorporates 7 to 18 amino acids.
[0100]
The term "structural unit" is defined by the general formula number 1:
[0101]
Embedded image

[0102]
N^αRepresents a derivatized α-amino acid,
Wherein X is a spacer group selected from the group consisting of alkylene, substituted alkylene, arylene, cycloalkylene and substituted cycloalkylene; R ′ is an amino acid side chain, optionally attached to a particular protecting group And G is a functional group selected from the group consisting of amines, thiols, alcohols, carboxylic acids and esters, and alkyl halides; it is incorporated into the peptide sequence and then, via the functional group G, One of the side chains of the amino acids in the peptide sequence, or another ω, is selectively cyclized with the functionalized amino acid derivative. Methodologies for producing the building blocks are described in WO 95/33765 and WO 98/04583, and U.S. Pat. Nos. 5,770,687 and 5,883,293, which are incorporated herein by reference. All are described in an international patent application published as such, which is hereby expressly incorporated by reference herein in its entirety.
[0103]
The building blocks are abbreviated by the three letter code of the corresponding modified amino acid, followed by the type of reactive group (N for amine, C for carboxyl) and the number of methylene groups in between. For example, Gly-C2 describes a modified Gly residue with a carboxyl reactive group and a two carbon methylene spacer, and Phe-N3 has a modified phenylalanine group with an amino reactive group and three A carbon methylene spacer is referred to.
[0104]
Certain abbreviations are used herein to describe the invention and the mode of making and using it.
[0105]
For example, 2Abu refers to 2-aminobutyric acid, Alloc refers to allyloxycarbonyl, Boc refers to t-butyloxycarbonyl group, DIEA refers to diisopropylethylamine, EDT refers to ethanedithiol, and Fmoc refers to fluorenylmethoxy. HBTU refers to 1-hydroxybenztriazolyltetramethyluronium hexafluorophosphate, HOBT refers to 1-hydroxybenzotriazole, HPLC refers to high performance liquid chromatography, hsp refers to heat shock protein. IDDM refers to insulin-dependent diabetes mellitus, kD refers to kilodalton, MPS refers to Multiple parallel synthesis, MS refers to mass spectrometry, NMM refers to N-methyl. Refers to ruphorin, NMP refers to 1-methyl-2-pyrrolidone, NO refers to nitric oxide, PyBOP refers to benzotriazol-1-yloxytrispirolidinophosphonium hexafluorophosphate, PyBrOP refers to hexafluorophosphate Bromotrispirolidinophosphonium, TFA refers to trifluoroacetic acid, and TNF refers to tumor necrosis factor.
[0106]
The amino acids used in the present invention are those that are commercially available or that can be obtained by conventional synthetic methods. Certain residues may require special methods of incorporation into the peptide, and any continuous, divergent or convergent synthetic approach to the peptide sequence is useful in the present invention. Naturally encoded amino acids and their derivatives are designated by the three letter symbol according to the IUPAC agreement. If no label was present, the L isomer was used. The D isomer is indicated by a "D" before the residue abbreviation.
[0107]
Conservative substitutions of amino acids known to those of skill in the art are within the scope of the invention. Conservative amino acid substitutions include the replacement of one amino acid with another having the same type of functional group or side chain (eg, aliphatic, aromatic, positively charged, negatively charged). These substitutions may also include replacing the Phe residue with an N-methyl-Phe residue to increase the bioavailability of the compound, as well as at the amino terminus to increase oral bioavailability. Of the mono- and disaccharide moieties of Nelson-Piercy et al.J. Clin. Endocrinol. And Metab.78: 329, 1994) or other such substitutions that may enhance oral bioavailability, penetration into the central nervous system, targeting to specific cell populations, and the like.
Description of preferred analogues
Presently preferred fragments, variants, derivatives and analogs of hsp60 of the present invention are now disclosed.
[0108]
A preferred embodiment is derived from the sequence of human hsp60. An additional preferred embodiment is derived from the sequence of bacterial hsp60.
[0109]
Preferred embodiments of the present invention are:
a. Residues 126-160 of human hsp60. A more preferred portion of this region spans residues 126-156 of human hsp60;
b. Residues 140-192 of human hsp60. A more preferred portion of this region spans residues 157-191, 158-192, 158-191, 161-191 and 161-192 of human hsp60;
c. Residues 220-250 of human hsp60. The most preferred portion of this region spans residues 222-249 of human hsp60;
d. Residues 269-290 of human hsp60;
e. Residues 310-344 of human hsp60. A preferred portion of this region spans residues 315-344 of human hsp60;
f. Residues 390-421 of human hsp60;
g. One presently most preferred embodiment of the present invention comprises derivatives, variants and peptide analogs of residues 350-400 of human hsp60.
And variants and derivatives and analogs of fragments having a sequence selected from the group consisting of:
[0110]
Further most preferred peptide analogs of the invention are;
i. Tyr-Phe-Ile-Asn-Thr-Ser-Lys-Gly-Gln-Lys corresponding to residues 227-236 of human hsp60;
ii. Lys-Ala-Gln-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Gln-Glu corresponding to residues 364-373 of human hsp60;
iii. Lys-Arg-Ile-Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu corresponding to residues 369-378 of human hsp60;
iv. Ile-Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu-Asp-Val corresponding to residues 371-380 of human hsp60;
v. Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu-Asp-Val-Thr corresponding to residues 372-381 of human hsp60;
vi. Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val corresponding to residues 403-412 of human hsp60;
vii. Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Glu-Val corresponding to residues 405-414 of human hsp60
It is.
[0111]
Still more preferred derivatives, variants and peptidomimetics of the present invention are residues 364-381 of the human hsp60 sequence, ie, Lys-Ala-Gln-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Gln-Glu-Ile-Ile. -Based on Glu-Gln-Leu-Asp-Val-Thr. Preferred peptide analogs of this sequence are peptides of 10 to 18 residues, optionally with at least one residue replaced by alanine. The most preferred peptide analogs are:
i. Lys-Ala-Gln-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Gln-Glu-Ile-Ile-Ala-Gln-Leu corresponding to residues 367-381 of human hsp60;
ii. Lys-Arg-Ala-Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Alu-Leu corresponding to residues 372-381 of human hsp60
It is.
[0112]
Another preferred embodiment of the present invention comprises derivatives, variants and peptide analogs of residues 403-412 of human hsp60. The most preferred analogs of this region have the following sequence:
i. Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Glu-Val-Asn;
ii. Ala-Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Glu-Val;
iii. Val-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Val;
iv. Gly-Val-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val
Is included.
[0113]
Still other more preferred analogs of the present invention are peptide derivatives, variants and analogs in which the backbone of residues 408-416 of human hsp60 is cyclized. These analogs optionally comprise a Gln, Ser, Thr, Ala, Leu or 2Abu residue at position 415 instead of Asn. The most preferred analogs of this sequence are nonapeptides comprising two bridging groups at the positions linked together to form a cyclic structure: 408-414, 409-416, 408-416 and 409-414. Other preferred backbone cyclized analogs have from 5 to 18 residues, with at least one structural unit linked to the terminal, side chain, or another structural unit to form a cyclic peptide analog.
[0114]
All sequences listed above and in the examples may be used as such and as a basis for the design and synthesis of derivatives, variants and analogs with improved properties.
General method
General methods for peptide synthesis, purification and characterization:
Synthesis:
Resin: 1 g of Rink amide or Tenta-gel resin with a load of 0.2-0.7 mmol / gr.
Fmoc deprotection: use 7 mL of 20% piperidine in NMP. 5 washes with 10 ml of NMP for 2 minutes with shaking, followed by 2 times for 15 minutes.
Coupling:
1. Normal coupling (coupling to simple amino acids): Use a solution containing 3 equivalents of amino acid, 3 equivalents of PyBrop and 6 equivalents of DIEA in 7 ml of NMP. 0.5 to 2 hours with shaking. Coupling is monitored by the ninhydrin test and repeated until the ninhydrin solution turns yellow.
2. Coupling of His and Asn using a solution containing 5 equivalents of DIC and 5 equivalents of HOBT in 10 ml of dimethylformamide.
3. Coupling to Gly building block: Use a solution containing 3 equivalents of amino acid, 3 equivalents of PyBrop and 6 equivalents of DIEA in 7 ml of NMP. Twice for 1-4 hours with shaking.
4. Coupling to non-Gly building blocks: A solution containing 5 equivalents of amino acid, 1.5 equivalents of thiophosgene and 13 equivalents of collidine in 15 ml of dioxane or THF is used. 3 times at 60 ° C. for 40 minutes with shaking.
[0115]
In embodiments where peptide backbones are synthesized with cyclized backbones, orthogonal protection is required. According to one currently preferred aspect, the allyl / Alloc deprotection and cyclization is performed as follows. Ie
Removal of allyl and Alloc protecting groups of building blocks: Use 1.5 equivalents of Pd (PPh3) 4 per peptide in 30 ml of dichloromethane containing 5% acetic acid and 2.5% @NMM. 1-4 hours with shaking.
[0116]
Cyclization: Use a solution containing 3 equivalents of PyBOP and 6 equivalents of DIEA in 7 ml of NMP. 0.5 to 2 hours with shaking. Cyclization is monitored by the ninhydrin test and repeated if necessary.
[0117]
Cutting: Scavenger, ie 1-15% @H₂Use 82-95% TFA supplemented with O, 1-5% TIS and 1-5% EDT.
Purification:
An individual purification method for each backbone cyclic peptide is developed on analytical HPLC to give maximum isolation of the cyclic peptide from other crude components. Analytical methods are usually performed using a C-18 Vydac column 250 × 4.6 mm as a stationary phase and a water / ACN mixture gradient containing 0.1% TFA.
[0118]
The preparation method is designed by including the analytical separation method in the 2-18 C-18 Vydac preparation method. During the purification process, the peak containing the cyclic peptide is collected using a semi-automated fraction collector. The collected fractions are injected on an analytical HPLC for purity check. The pure fractions are combined and lyophilized.
Characterization:
The combined pure lyophilized material is analyzed for purity by HPLC, MS and capillary electrophoresis, and by amino acid analysis for determination of peptide content and amino acid ratio.
General methods for the synthesis, purification and characterization of libraries in multiple parallel synthesis (MPS) format:
The MPS procedure is used as a conventional peptide generation procedure. Individual peptides, or groups of several peptides, are synthesized in a 96-well microtiter plate equipped with a filter that allows the passage of the solvent but not the solid phase matrix. Uses a simple and efficient valve device (manufactured by Millipore) that allows simultaneous closing and opening of all valves. The system utilizes an approach in which each well is equipped with a bottom solvent permeable membrane that does not allow particles larger than a certain size to proceed. The method allows for placing the resin in the wells, performing the reaction in a solvent, and simultaneously removing the solvent from all wells by applying a vacuum. These special plates, available in a standard 96-well format, allow for the parallel synthesis of 96 peptides simultaneously. The synthetic scale of the procedure is in the range of 1-5 mol per well. After purification on a C18 reverse phase column (SepPak purification), which is also performed in a standard 96-well format, the peptide is conventionally dissolved in 1 ml of water to give a theoretical crude concentration of 1-5 mM (synthesis). Scale dependent). Monitoring of the chemical quality of the resulting peptide is performed by ESI-MS analysis. Analysis of several plates made by different operators on different occasions showed an overall success rate of about 80%, as judged by the presence of the desired peptide mass in the crude preparation. Further analysis of the peptide from MPS is performed by LC-MS. The analysis showed a crude peptide quality similar to the crude preparation of individually synthesized peptides on a large scale. The various steps or complete synthesis are now performed automatically using an automated peptide synthesizer. According to this illustration, peptides are currently automatically synthesized using ACT 396 from Advanced ChemTech and LabTech 4 heating device from Advanced ChemTech.
Detailed procedure for synthesis in MPS format:
For a volume of 6 μmol, use 10 mg of resin with a substitution of 0.6 mmol / gr.
[0119]
Fmoc deprotection: To each well, add 500 μl of 5% piperidine in NMP twice. Shake the reaction for 15 minutes. NMP is removed by suction.
[0120]
Wash after Fmoc deprotection: The resin is washed by placing 600 μl of NMP in each well and then draining the solution with a stream of nitrogen. The washing process is repeated four times.
Coupling using HBTU:
Well volume: 6 μmol
Amount of amino acid per coupling per well: 30 μmol
Amino acids in NMP concentrate: 0.2M
Amino acid volume used: 150 μl
HBTU amount: 30 μmol
HBTU concentration: 0.2M
HBTU volume used: 150 μl
DIEA added: 0.4 M in 150 μl NMP
Total reaction volume: 450 μl
Amino acids are dissolved in a solution of HOBT in NMP. The resin is washed by placing 600 μl of NMP in each well, then draining the solvent with a stream of nitrogen. The washing process is repeated four times. The coupling reaction is repeated twice for 1 hour.
Coupling using mucayama reagent (performed only in certain situations):
650 mM amino acid solution-40 μl
111 mg / ml mukayama reagent-60 μl
Collidine added per well-15 μl
Same procedure as for coupling with PyBroP. Reaction temperature 50 ° C., reaction time: 4 hours for the first coupling, 16 hours for the second coupling.
[0121]
In an embodiment for synthesizing a peptide whose main chain is cyclized, allyl / Alloc deprotection and cyclization are performed as follows:
Allyl Alloc deprotection: This step consists of 20 ml of CH containing 5% acetic acid + 2.5% NMM.₂Cl₂1.5 g of Pd (PPh₃)₄Performed after completion of assembly by adding 180 μl of solution of
[0122]
Cyclization: This step is performed by the addition of a 100 μl solution of PyBoP in NMP + DIEA.
[0123]
Cleavage of the peptide from the resin and SepPak purification: After the last Fmoc deprotection, transfer the resin to a deep well microtiter plate and add 2.5% TIS, 2.5% H₂O, 300 μl of TFA solution containing 2.5% EDT is added. Removal of TFA is performed by lyophilization. After cleavage, the peptide is purified by Seppak.
Biological screening for fragments, derivatives, variants and analogs of hsp60
1. Identification of fragments of hsp60 capable of eliciting a pro-inflammatory immune response: The method comprises the following steps:
a) contacting cells bearing intact Toll-like receptor complexes on their surface with fragments of hsp60;
b) measuring the amount of TNFα and / or NO produced by the cells.
[0124]
Increased production of TNFα and / or NO is indicative of the ability of fragments of hsp60 to elicit a pro-inflammatory response.
[0125]
The fragment of hsp60 used in step (a) can be any possible fragment of hsp60. Preferably, such fragments have a length of at least 5 amino acid residues, more preferably at least 10, even more preferably at least 20, and most preferably at least 50 amino acid residues. Such fragments may be generated, for example, by cleavage of the hsp60 protein, eg, by proteolytic cleavage, such as a tryptic digest, or by chemical cleavage, eg, with CNBr, or using methods known to those of skill in the art. Can be chemically synthesized.
[0126]
The cells used in step (a) of the method are preferably cells bearing intact Toll-like receptor 4. However, since it is possible in humans that Toll-like receptor 2 is an hsp60 receptor, cells carrying such a receptor may also be used. Preferably, the cells used in the method are lymphocytes, and more preferably macrophages, such as human or mouse macrophages. An example of a cell that can be used in such a method is J774 cell, which can be purchased from German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany). The resulting mouse macrophage cell line J774A. 1, or purchased from the Breeding & Research Center A / S (Bomhotlgard, Rye, Denmark) and Charles River (Sulzfeld, Germany), respectively. Bone marrow derived macrophages of the possible mouse strains C57BL / 6JBom and C3H / HeN. Methods for preparing such bone marrow-derived macrophages are known to those skilled in the art and are also described in Example 1.
[0127]
As a negative control, bone marrow-derived cells of C3H / HeJ mice, which can be purchased from Charles River (Sulzfeld, Germany), can be used. These macrophages express a functionally defective Toll-like receptor 4 membrane protein and do not respond to hsp60 due to the production of TNFα and NO.
[0128]
To determine whether a protein, protein fragment and / or peptide induces a pro-inflammatory response, cells or macrophages are seeded into, for example, a 96-well flat bottom microtiter plate (2 × 10 5 in 200 μl per well).⁵Cells). 24 hour pre-incubation (37 ° C., 5% CO 2₂3.) Later, the protein, protein fragment and / or peptide to be tested is added to the culture at various concentrations and the incubation is continued for various time intervals before measuring the production of TNFα and NO.
2. Identification, screening and / or characterization of compounds capable of acting as antagonists of hsp60:
The ability to reduce or prevent the induction of a pro-inflammatory immune response by hsp60 is due to the use of e.g. native hsp60 as inducer, as well as the addition of the variant or derivative to be tested and the action as an antagonist of hsp60 Method No. 1 as described above, except that the effect on TNFα and / or NO production is measured using a decrease or inhibition of TNFα and / or NO production that is indicative of the ability of the molecule being tested to It can be determined by use.
[0129]
The method comprises the following steps:
a) contacting cells carrying intact Toll-like receptor complexes on their surface with hsp60 or a fragment thereof capable of inducing a pro-inflammatory response in the presence and absence of the compound to be tested That; and
(B) determining whether the presence of the compound has an effect on the production of TNFα and / or NO in the cell
And comprises
Here, reducing or preventing the production of TNFα and / or NO is indicative of the ability of the compound to act as an antagonist of hsp60.
[0130]
For the cells listed in step (a) of the method, the same applies as in method 1 above. The fragment of hsp60 listed in step (a) of the method can be any fragment of hsp60 of the invention that has the ability to elicit a pro-inflammatory immune response.
[0131]
Measurement of the amount of TNFα and / or NO produced by the cells can be performed as described above and in the Examples.
[0132]
The compound to be tested can be any possible compound, for example, variants and derivatives of the fragments of hsp60 as described above, inorganic or organic compounds, antibodies, eg, monoclonal or polyclonal antibodies, antibody fragments such as Fab fragments, soluble It may be Toll-like receptor 4 or Toll-like receptor 2, or a fragment or complex of these receptors.
3. Methods for measuring the induction of TNFα and / or NO formation:
Induction of TNFα and / or NO formation can be measured in macrophages, such as macrophages of C3H / HeN or C57BL / 6 mice or J774 cells (Chen et al., J. Immunol. 162 (1999), 3212). Induction / increase in TNFα and / or NO formation indicates the ability to induce a pro-inflammatory immune response. Measuring the induction of a pro-inflammatory response can be performed, inter alia, as described in Chen et al. (Cited above) or in the Examples. Thus, induction of TNFα may be induced by TNFα produced by macrophages before and after exposure to the respective protein, for example by using a sandwich ELISA as described in Chen et al. (J. Immunol. 162 (1999), 3212). And determination by quantifying TNFα, for example, by using a standard curve obtained with recombinant cytokines (Genzyme, Kent, UK) against medium alone as a blank Can be. Induction of NO formation can be achieved by accumulating nitrite (NO.sub.3) in the culture supernatant using, for example, a colorimetric Griess reaction as described in Chen et al.₂ ⁻) Can be determined by measuring the amount of NO released by macrophages by measuring the concentration of
[0133]
In addition, fragments, variants, derivatives and analogs of hsp60 have been shown to affect T cell proliferative responses, insulitis and diabetes in a mouse model, and PCT patent applications WO 96/19236 and WO 97/01959. Screening for peptide stability as described herein.
[0134]
Methods for identifying, screening and / or characterizing fragments of hsp60 capable of eliciting a pro-inflammatory immune response, or for identifying compounds capable of acting as antagonists of hsp60 of the present invention, are also known as high-throughput screening methods, and Similar approaches performed using 96-well, 384-well, 1536-well (and other) commercially available plates may also be included (see, inter alia, Spencer, Biotechnol. Bioeng. 61 (1998), 61-). 67). These methods to be used in the present invention include, but are not limited to, readout of homogeneous optical density in high throughput screening (eg, for NO and TNFα) (eg, Pope, DDT 4 ( 1999), 350-362). Cell-based assays as described in the examples above and in the appendix may be combined with detection techniques such as scintillation counting, fluorescence measurement, luminescence measurement or measurement of absorbance signal, among others. Thus, the methods described in the examples above and in the appended examples can be readily adapted to quantitative and / or qualitative screening methods that derive high-throughput and ultra-high-throughput screening methods.
[0135]
Fragments, variants and derivatives of heat shock proteins are constructed in part based on the sequence of a number of known heat shock proteins or based on previously unknown new sequences and are presented in the examples below. . The following examples are intended to illustrate how to make and use the compounds, as well as the methods of the present invention, and should not be construed as limiting in any way.
[0136]
Example
The following examples further illustrate the invention.
Example 1: Identification of Toll-like receptor 4 complex as a potential ligand for hsp60
Recombinant human hsp60 was obtained from StressGen Biotechnologies (Victoria, Canada). Two immunostimulatory oligonucleotides containing the CpG motif 5'-ACC GAT AAC GTT GCC GGT GAC G-3 '(Pal⁺38) (Yamamoto et al., Microbiol. Immunol. 38 (1994), 831) and 5'-TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT-3 '(ODN1668) (Hacker et al., EMBO J. 17 (1998), 6230; Sparwasser et al.). J. Immunol. 27 (1997), 1671), as well as the corresponding non-stimulatory oligonucleotide 5'-TCC ATG AGC TTC CTG ATG CT-3 '(ODN1720) lacking the CpG motif (Hacker et al., EMBO J. 17 (1998). J. Immunol. 27 (1997), 1671) from Life Technologies (Karlsruhe, Germany). It was purchased. Lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli B 0.26 was obtained from Sigma (Daisenhofen, Germany).
[0137]
For the preparation of mouse bone marrow-derived macrophages, C3H / HeN and C3H / HeJ mice were purchased from Charles River (Sulzfeld, Germany), and C57BL / 6JBom mice were purchased from the Breeding and Research Center A / S (Breeding). & Research Center A / S) (Bomholtgard, Rye, Denmark). Bone marrow cells were obtained by flushing femurs and tibias of 8-12 week old mice with ice-cold PBS. After washing, 2.5 × 10⁶Individual bone marrow cells were treated with 5% heat-inactivated horse serum, 15% fetal calf serum (FCS, Life Technologies), 15% L929 cell conditioned medium (Burgess et al., J. Biol. Chem. 260 (1985). ), 16004), and ampicillin (25 mg / l), penicillin (120 mg / l), streptomycin (270 mg / l), 1 mM sodium pyruvate, 2 mM L-glutamine, non-essential amino acids (10 ml / l, 100 ×), 24 mM NaHCO₃And incubated in tissue culture dishes with 10 ml of Pluznik medium containing 65% RPMI 1640 supplemented with 10 mM HEPES (37 ° C., 5% CO 2).₂)did. After 7 days of culture, adherent bone marrow-derived macrophages were transformed with ice-cold Ca⁺⁺, Mg⁺⁺For 10 minutes with Hank's solution (HBSS, Life Technologies) containing no, followed by two washes with HBSS (500 g, 5 minutes). Non-specific esterase staining (Loffler, Klin. Wschr. 39 (1961), 1220) revealed that> 98% of the cells exhibited macrophage characteristics.
[0138]
For macrophage stimulation, cells were seeded into 96-well flat-bottom microtiter plates (Falcon / Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) (2 × 10 5 in 200 μl per well).⁵Cells). 24 hour pre-incubation (37 ° C., 5% CO 2₂After), various concentrations of hsp60, LPS and oligonucleotides were added to the culture and the incubation was continued for different time intervals.
[0139]
The amount of TNFα released from macrophages was quantified by a sandwich ELISA (Chen et al., J. Immunol. 162 (1999), 3212). TNFα was quantified using a standard curve obtained with recombinant cytokines (Genzyme, Kent, UK) against medium alone as a blank. The results were expressed as pg TNFα / ml.
[0140]
For the determination of nitrite production, the amount of NO released by macrophages was determined in the culture supernatant using the colorimetric Griess reaction described previously (Chen et al., Supra). Nitrite (NO₂ ⁻) Was evaluated by measuring the concentration. The result is NO per ml₂ ⁻Are shown in micromolar.
[0141]
The data obtained is expressed as mean + SD. Statistical analysis was performed using a two-tailed Student's test. Differences were considered statistically significant at p <0.05.
[0142]
As is evident from FIG. 1, bone marrow-derived macrophages of mouse strains C57BL / 6 and C3H / HeN responded to LPS or human hsp60 with rapid secretion of large amounts of TNFα. Parallel studies of macrophages from C3H / HeJ mice carrying the mutant Toll-like receptor 4 showed no response to either LPS or hsp60. However, these cells were not completely refractory to inflammatory stimuli. Oligodeoxynucleotides derived from a mycobacterial sequence (ODN1668) and containing a potent immunostimulatory CpG motif induced a strong TNFα response in LPS non-responder lines. An oligonucleotide containing the second CpG (Pal⁺) Was less irritating, whereas the CpG-deficient oligonucleotide (ODN1720) did not elicit a response (FIG. 1).
[0143]
FIG. 1 shows that bone marrow-derived macrophages of C57BL / 6 (fine parallel bars), C3H / HeN (white bars) and C3H / HeJ mice (black bars) were cultured in medium, LPS (10 ng / ml). , Hsp60 (10 μg / ml), Pal⁺(30 μg / ml), incubated with ODN1668 (30 μg / ml) or ODN1720 (30 μg / ml). Six hours later, the TNFα concentration in the culture supernatant was measured by ELISA. The data represent the mean + SD of three to four experiments performed in quadruplicate. Significant differences for C3H / HeN (and C57BL / 6) macrophages are indicated as ***, p <0.001. The dose dependence of the response to hsp60 was further analyzed using macrophages from two C3H strains. Significant TNFα responses were obtained in C3H / HeN macrophages using 3 μg / ml hsp60 (0.05 μmol / l), whereas in C3H / HeJ macrophages such a response was not even seen at hsp60 levels higher than 10-fold. (FIG. 2A). Analysis of the kinetics showed peak levels of secreted TNFα in C3H / HeN macrophages between 6-12 hours. In TIr4-deficient macrophages, TNFα production was absent throughout the 72-hour observation period (FIG. 2B).
[0144]
FIG. 2 shows that bone marrow-derived macrophages of C3H / HeN (open circles) and C3H / HeJ mice (closed circles) were incubated with increasing concentrations of hsp60 for 6 hours (A) or they were incubated at a dose of 10 μg / ml hsp60. (B) Incubated for different time intervals. The TNFα concentration in the culture supernatant was measured by ELISA. The data represent the mean + SD from three experiments performed in triplicate. Significant differences from C3H / HeJ-derived macrophages are indicated as ***, p <0.001.
[0145]
As can be seen from FIG. 3, mouse macrophages of C57BL / 6, C3H / HeN (but not C3H / HeJ) respond to LPS challenge with NO production, indicating that endotoxin-induced NO formation is Tlr4-dependent. It is shown that.
[0146]
FIG. 3 shows that bone marrow-derived macrophages of C57BL / 6 (bars with fine parallel lines), C3H / HeN (white bars) and C3H / HeJ mice (black bars) were cultured in medium, LPS (10 ng / ml). , Hsp60 (10 μg / ml), Pal⁺(30 μg / ml), incubated with ODN1668 (30 μg / ml) or ODN1720 (30 μg / ml). Twenty-four hours later, the concentration of nitrite accumulated in the culture supernatant was measured by a Griess reaction. The data represent the mean + SD of three to four experiments performed in quadruplicate. Significant differences of C3H / HeN (and C57BL / 6) relative to macrophages are indicated as ***, p <0.001.
[0147]
Identical results were obtained with a complete lack of nitric oxide response in Tlr4-deficient macrophages when hsp60 was employed as a stimulus. In contrast, the two macrophage types showed very similar NO responses when the strongly stimulatory CpG DNA, ODN1668, was used as a stimulus, while the smaller, stimulatory CpG oligonucleotide Pal⁺Failed to induce NO formation, as was true for the CpG-deficient ODN1720 (FIG. 3). Similar concentrations of hsp60 (3 μg / ml) compared to TNFα production were required to derive NO. Increasing hsp60 concentration by 10-fold resulted in nitrite levels approximately 5-fold higher in C3H / HeN macrophages, while Tlr4-deficient macrophages remained completely refractory (FIG. 4A). Nitrite accumulation in the supernatant reached a maximum level between 48 and 72 hours of culture. Throughout this period, there was no indication of NO production in C3H / HeJ macrophages (FIG. 4B).
[0148]
FIG. 4 shows that bone marrow-derived macrophages of C3H / HeN (open circles) and C3H / HeJ mice (closed circles) were incubated with increasing concentrations of hsp60 for 24 hours (A) or they were incubated at a dose of 10 μg / ml hsp60. (B) Incubated for different time intervals. The concentration of nitrite accumulated in the culture supernatant was measured by a Griess reaction. The data represent the mean + SD of three experiments performed in triplicate. Significant differences from C3H / HeJ-derived macrophages are indicated as ***, p <0.001.
[0149]
The results described above suggest that extracellular hsp60 is an endogenous ligand for Tlr4. Bone marrow-derived macrophages of two closely related lines, C3H / HeN and C3H / HeJ, with different abilities to respond to endotoxin with an inflammatory response were compared (Sultzer, Nature 219 (1968), 1253; Watson and Riblet, J. Exp.Med.140 (1974), 1147). This functional difference was recently identified as being due to a functionally defective Tlr4 membrane protein in C3H / HeJ mice. In the latter strain, the C-terminal portion of Tlr4 has a mutation at codon 712 (lps) that prevents LPS-induced signaling.^d(Poltorak et al., Science 282 (1998), 2085; Qureshi et al., J. Exp. Med. 189 (1999), 165; Hoshino et al., J. Immunol. 162 (1999), 3749). Interestingly, Tlr4-deficient macrophages are not completely unresponsive to LPS because endotoxin is still able to stimulate metalloproteinase-9 expression (Jin et al., J. Immunol. 162 (1999). ), 3596).
[0150]
In fact, C3H / HeJ (Ips^d) Macrophages from mice were found to be distinctly refractory to LPS-induced TNFα production. Interestingly, inducible NO formation was also found to be strictly dependent on functional Tlr4, although signaling requirements differed from those of TNFα (Lowenstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 9730; Kajimo et al., Science 263 (1994), 1612). Ips to immunostimulatory CpG DNA^dExposure of macrophages stimulated both, TNFα and NO production, indicating that Tlr4-dependent and -independent pathways to stimulate innate immune responses coexist in macrophages. These data also demonstrate that CpG DNA signaling does not occur through Tlr4. Taken together, stimulation of a TNFα or NO response by human hsp60 was found here to be entirely dependent on the presence of a functional Tlr4 membrane protein. Thus, it appears that the same transmembrane signaling receptor mediates the innate immune response to hsp60 and LPS. Extensive control was performed in two previous reports of the extracellular mammalian hsp60 immunostimulatory activity to eliminate the role of endotoxin contamination (Kol et al., J. Clin. Invest. 103 (1999). Chen et al., J. Immunol.162 (1999), 3212). These controls include the use of polymyxin B to neutralize LPS or denaturation of the protein by heat treatment that suppresses hsp60 but not LPS activity. We have also obtained essential findings using an endotoxin-free preparation from another source (less than 0.1 μEU endotoxin contamination per μg of hsp60 from Peptor Ltd., unpublished data). It was possible to reproduce. Finally, endotoxin-free bacterial lipoproteins have recently been reported to mediate innate immune responses via the Toll-like receptor-2 pathway (Aliprantis et al., Science 285 (1999), 736; Brigill). Hirschfeld et al., J. Immunol. 163 (1999), 2382), Science 285 (1998), 736. These observations indicate that Tlr4 and Tlr2 not only function as LPS receptors (Poltorak et al., Supra; Kirschning et al., J. Exp. Med. 188 (1998), 2091; Hirschfeld et al., Supra). It emphasizes, however, that it is also involved in the recognition of protein ligands.
[0151]
Previously described ligands for Toll-like receptors in mammalian cells are of microbial origin, which is consistent with the function of these receptors in the innate immune response. It has now been found that the chaperone hsp60 is a putative endogenous ligand of the mammalian Toll-like receptor. This finding suggests that not only Toll-like receptors may have functions in innate immune defense against microbial pathogens, but also provide physiological functions by interacting with endogenous ligands. This implies a situation in Drosophila that controls dorsoventral patterning in spaetles in which Toll acts as an endogenous ligand (Marisato and Anderson, Cell 76 (1994), 677), while adult insects , Toll regulates antifungal and antimicrobial responses (Lemaitre et al., Cell 86 (1996), 973).
[0152]
It is noteworthy that both, Toll-like receptor and hsp60, were found early in phylogeny, and that both were of significantly conserved structure. This indicates that their interactions are relevant and may also occur in more primitive organisms. Mammalian hsp60 is normally sequestered inside cells according to its ability to function as a chaperone. However, hsp60 can be reached when it is liberated during necrosis of tissue cells during inflammation or when hsp60 is partially translocated to the plasma membrane in response to various types of stress become. Therefore, it was proposed that autologous hsp60 may serve as a dangerous antigen for the innate immune system (Chen et al., Cited above).
[0153]
The exact mechanism of the interaction between mammalian hsp60 and the Tlr4 complex remains to be elucidated. Using CD14 and MD-2, two members of the Tlr4 complex were identified, both of which strongly enhance Tlr4's LPS responsiveness. LPS appears to bind to Tlr4 via CD14 as well as independent of CD14. For human TIr2, direct binding to LPS has been demonstrated in vitro, and efficient signaling appears to require serum CD14. Similarly, the mechanism of the interaction between bacterial lipoproteins and Tlr2 has not been determined.
[0154]
In short, human hsp60 pre-inflammatory signaling was found to be functional Tlr4 dependent. This finding suggests the presence of an endogenous ligand for the Tlr4 complex and a role for Toll-like receptors in innate immune discrimination of normal tissue cells against stressed or damaged tissue cells.
Example 2: Identification of a fragment of human hsp60 capable of inducing a pro-inflammatory response in macrophages
1. Enzymatic proteolysis of hsp60 by trypsin:
His-tagged (tag) hsp60 (hsp60 expressed with six histidine residues at the N-terminus of the protein) was affinity purified on a nickel column (hexa-histidine is a chelator of nickel). 4.5 μg / ml in 60 μl of PBS was used to dissolve 50 μg of sequencing-grade modified trypsin (Boehringer Cat. No. 1418025) at a 1:54 enzyme: protein weight ratio. The mixture was incubated at 37 ° C. and samples were taken after 0.5, 1.5, 5.4 and 16.5 hours. Samples were stored at 4 ° C overnight and then transferred to -20 ° C. Each 5 μl sample was boiled with 5 μl loading buffer and run on SDS-PAGE (4-20% gradient 200 V for 30 min, BioRad). The four fractions were combined together and centrifuged for 1 minute. The supernatant was filtered and then subjected to gel filtration chromatography on a Superdex-75 FPLC column using PBS at a rate of 0.5 ml / min. Five clear fractions and two peak shoulders were obtained as described in FIG. The first peak was found to contain intact hsp60 (after similar gel filtration chromatography of hsp60). The protein concentration was measured with a micro BSA kit (Pierce). The results are summarized in Table 1.
[0155]
[Table 2]

[0156]
All fractions were centrifuged at a concentration of about 1 mg / ml with Centricon YM-3 (2 ml volume), both with a cut-off of 3000 Daltons, and then with microcon YM-3 (0.5 ml volume). Concentrated. Fractions were tested for their ability to induce the production of TNFα and NO as described above, except that J774 cells were used (Chen et al., J. Immunol. 162 (199), 3212). The concentration of trypsin fragment added to the J774 macrophage culture and the results of these experiments are shown in FIGS. Fractions 1 and 2 were found to be active.
2. Separation of trypsin-degraded hsp60 fraction 2 by reverse phase HPLC
50 μl of Fraction 2 was applied to a C-4 column (Vydac 214TP54, Protein RP-C4 using a gradient of 0.1% TFA in water and 0.1% TFA in acetonitrile at 40 ° C. for 75 minutes. , 250 × 4.6 mm, 5μ).
[0157]
The results (absorbance at 215.0 nm) are summarized in FIG. The eight major peaks obtained were collected and analyzed by Edman degradation for their N-terminal sequence and by MALDI-TOF mass spectrometry for their mass. One or more masses were found in each of the eight fractions. The mass found was matched to a possible tryptic fragment of hsp60. An example is shown in FIG. 7, which shows the result of MS analysis of peak number 3.
[0158]
Overall, there are 5 regions represented by the identified fragments. Ie
1. E₁₂₆-K₁₅₆Or L₃₉₀-R₄₂₀One mass that is within one of
2.4 region K with four correct masses and one possible mass₁₅₇-K₁₉₂.
3. One region G with the correct mass₂₂₂-K₂₄₉.
4. Region K with one exact mass₂₆₉-R₂₉₀.
5. Region K with two exact masses₃₁₀-K₃₄₄.
3. Structural analysis of identified fragments
Fragments identified by mass spectrometry of the active fractions of the trypsin digest (note that fragments within the same group show a large degree of overlap):
1) Glu₁₂₆-Lys₁₅₆
2) Lys₁₅₇-Lys₁₉₁
Gln₁₅₈-Lys₁₉₂
Gln₁₅₈-Lys₁₉₁
Pro₁₆₁-Lys₁₉₁
Pro₁₆₁-Lys₁₉₂
3) Gly₂₂₂-Lys₂₄₉
4) Lys₂₆₉-Arg₂₉₀
5) Lys₃₁₀-Lys₃₄₄
Asp₃₁₅-Lys₃₄₄
6) Leu₃₉₀-Val₄₂₁
It is.
[0159]
To analyze these results, several approaches were followed. Ie
a) A three-dimensional model of human hsp60 was constructed by homology from its crystallographically known structure GROEL of its bacterial homolog. This allowed for each of the fragments found in the active fraction of the trypsin digest to determine which would be expected to be solvent exposed within the framework of the entire hsp60 protein. .
b) The sequence of spaetle, a natural ligand of the toll receptor, was aligned with that of hsp60 and several fragments of varying degrees of homology were identified (see Scheme I). This allowed us to determine which of the hsp60 fragments found in the active fraction of the digest could potentially bind to the recognition site of the toll receptor.
c) The secondary structure of the spaetzle protein was predicted. This allowed a structural comparison for each of the fragments in the active fraction of the tryptic digest that showed homology to the fragment of spaetle.
[0160]
The analysis of the six domains listed above is:
Region 1 shows a considerable degree of homology with the two fragments of spaetle (this region and alignment are marked as Box 1 in Scheme I (Description: * identical residues, very similar residues) Group, .similar residue). The arrow in the box indicates that the fragment continues on the next line).
[0161]
Region 2 does not show sequence homology to spaetzle, but nevertheless binds two solvents in hsp60 together with two loops, one preceding the first helix and the other between two. Spans the exposed helix. Both the loop and helix are exposed to the solvent and are therefore potential recognition sites on hsp60. Since the spaetle is predicted to be a bundle of four helices, the structural homology between region 2 and spaetle, which allows recognition by the same receptor, is determined by the apparent sequence homology within this region. It is possible despite the lack.
[0162]
Region 3 shows significant homology with a single fragment of spaetle (marked as box 2 in Scheme I). This region is highly flexible, the GROEL crystal structure, and therefore the surface exposed loops in the hsp60 model. The secondary structure of spaetle in the region homologous to region 3 is also expected to be a loop. Thus, all of the analyzes suggest that this fragment is a potential candidate for recognition by the toll receptor.
[0163]
Region 4 shows significant homology with one fragment of spaetle (marked as box 3 in Scheme I). It is only partially exposed in the hsp60 model. A structural comparison between this region and the corresponding region in spatzle is not straightforward because a large portion of this fragment exhibits poor electron density in the GROEL crystal.
[0164]
Region 5 spans a large fragment of hsp60 that shows no sequence homology with spaetle, which is tailed by a short fragment showing homology (Box 4 in Scheme I). The C-terminal portion of this fragment (including the Box 4 sequence and an additional 9 residues upstream are exposed on the surface).
[0165]
Region 6 shows homology with the two fragments of spatzle (box 5 in Scheme I; the arrow defines the continuity limit of this region to the next row). The entire fragment consists of a surface exposed helix, followed by a short β-strand, a short partially exposed loop and additional helices. Spaetzle fragments homologous to the first helix are predicted to be loops, but fragments still homologous to the C-terminal helix are also predicted to be helices. Lys₃₅₉Or Asp₃₉₉An additional region of hsp60 spans a considerable degree of homology to one fragment of spaetle and is solvent exposed. Despite the fact that no fragment corresponding to this region was observed in the active fraction of the tryptic digest, it will be considered whether this region is responsible for the activity.
showed that.
[0166]
Since each of these analyzes involves some degree of uncertainty, the requirement to match all of them is not realistic, and therefore the top seven regions (six from mass spectrometry and additional ) Are cyclized with the overlapping backbone of a peptide loop (s) ranging in size from 5 to 10 residues designed to optimally mimic the structure of the fragment in the hsp60 model. Are examined by multiple parallel synthesis of arrays of similar analogs. The array is centered on structured backbone cyclized analogs that have sequences that are the same as or close to those of nature, but still capture these sequences in a constrained conformation that varies. Was. Having identified the active peptide analog, one can design an array of backbone cyclized analogs that have the same overall conformation as the active, albeit with sequence variations. These latter analogs may improve affinity for the toll receptor.
Example 3: Screening of tryptic digests and fragments of hsp60 One larger scale batch of tryptic digest fragments of hsp60 was generated using a procedure similar to that described in Example No. 2.
[0167]
Three main fractions 1, 2 and 3 were obtained by size exclusion FPLC separation. Each fraction was then sub-fractionated by reverse phase HPLC. Peaks were collected separately and lyophilized.
[0168]
The main fraction and the separated peaks were tested for stimulatory and inhibitory effects on TNFα secretion in J774A cells.
[0169]
Results: Stimulating activity was detected in fractions 1 and 2.
Example 4: Synthesis and screening of 20-mer overlapping peptides
Twenty-six overlapping peptides, 20 residues in length, with a 10-residue overlap (and a 10-residue shift between adjacent peptides) were synthesized over the region of residues 111-490 of human hsp60.
[0170]
The peptides were tested for inhibition of hsp60-induced TNF secretion.
[0171]
The preliminary results are summarized in Table No. 2:
[0172]
[Table 3]

[0173]
Example 5: Design of overlapping 10-mer peptide fragments of human hsp60
To find short fragments of hsp60 activity, 182 peptide fragments of human hsp60 were designed based on the integration of all available data as shown in Table No. 3. this is:
1) Results of the first fragmentation (trypsin digestion) study of hsp60 (activity and MS analysis).
2) A three-dimensional model of hsp60; especially the surface accessibility analysis of each of the above fragments.
3) Homology to spaetle (both sequence and structural based on spaetle model).
4) Results of the activity of the 20-mer overlapping peptides spanning residues 111-490 of human hsp60
Is included.
[0174]
[Table 4]

[0175]
note:
1) Regions 1-6 are consistent with fragmentation studies. Region 7 did not appear in fragmentation studies, but nonetheless its homology with spaetle and its apparent surface exposure suggested that it was a region worthy of screening.
2) Structural homology to spaetle is based on a first approximation model.
3) All sequences refer to the sequence of human hsp60 (SWISSPROT database accession number P10809 and Scheme I).
4) n. t. = Not tested
5) There are a total of 182 peptides
6) The 10 peptides were repeated twice in the plate (resulting in 192 for two 96-well plates):
5 peptides from the first region of the 20-mer active peptide.
Five peptides from the central part of region 7 above.
[0176]
Plate 1 + 2 contains 192 decapeptides. That is, 58 peptides span residues 126-192 of human hsp60, 22 span residues 220-250, 13 span residues 269-290, 26 peptides span residues 310-344, and The 63 peptides span residues 350-421, all with one amino acid shift. (The ten additional peptides are five peptides from region 2 and five repeats from region 7).
Example 6: Synthesis of 192 peptides of 10-mer
Peptides were synthesized in a multiple parallel synthesis (MPS) format using an automated peptide synthesizer (ACT @ 396 from Advanced ChemTech) and a heating device (Lab @ Tech # 4 from Advanced ChemTech). Two plates of each of the 96 peptides were synthesized. The peptide was prepared according to the procedure recommended by the synthesizer manufacturer, briefly:
Synthetic scale: 6 μmol peptide per well.
Resin: Link amide
Chemistry: Fmoc chemistry, deprotection with 25% piperidine in NMP.
Coupling: Use 5 equivalents of HBTU / HOBT as coupling reagent and 10 equivalents of DIEA as base.
Cleavage: Use a solution of 92.5% @ TFA, 2.5% @ H2O, 2.5% @ TIS, 2.5% @ EDT.
Partial purification: was performed by passing the cleaved peptide through a Sep-Pak (C-18) plate column.
Was synthesized by the solid-phase method.
[0177]
The peptides were tested by mass spectroscopy. The expected mass of most peptides was found.
Example 7: Screening of 10-mer peptide for inhibition of hsp60-Crude peptide is resuspended in 500 [mu] l water and TNF [alpha] induced by hsp60 in J774 cells (as described in Example No. 1 of the application) And for inhibition of nitric oxide (NO) secretion at a dilution of 1:10. Selected peptides were also tested (in an equivalent assay) for inhibition of CpG-induced TNFα secretion. CpG is a non-specific immunostimulatory oligonucleotide motif with the sequence: 5'-TCCATAACGTTGCAAACGTCTCG-3 '(Krieg \ AM.CpG \ DNA: a \ novel \ immunomodulator \ Trends \ Microbiol \ 1999; 7: 64-5). CpG stimulates J774 cells to produce TNFα by a different mechanism than that used by hsp60, and thus serves as a negative control for non-selective inhibition of TNF secretion (not mediated by specific inhibition of hsp60). Preferred peptides of the invention inhibit hsp60-induced TNFα secretion, but do not inhibit CpG-induced TNGα secretion.
[0178]
The results of the activity of the selected peptides are summarized in FIG. The peptide sequences are summarized in Table No. 4. The peptides in this figure were selected for re-screening based on the activity found in screening all 192 synthesized peptides. The results are presented as percent inhibition of TNF secretion in response to induction with hsp60 or CpG, and are the average of duplicates.
[0179]
[Table 5]

[0180]
[Table 6]

[0181]
The most active and specific analogs from this set of peptides are:
Peptide No. 66 spanning residues 227-236 of hsp60
peptide number 134 spanning residues 364-373 of hsp60
Peptide no. 139 spanning residues 369-378 of hsp60
Peptide No. 141 spanning residues 371-380 of hsp60
Peptide number 142 spanning residues 372-381 of hsp60
Peptide number 173 spanning residues 403-412 of hsp60
Peptide number 175 spanning residues 405-414 of hsp60
It is.
Example 8: Design of additional peptides from residues 364-381 of human hsp60
A second generation overlapping peptide was designed based on a 10-mer peptide screen. This set is intended to study the region spanning residues 364-381 (KAQIEKRIXEIIEQLDVT) of the human hsp60 sequence. Within this region several peptides have demonstrated specific inhibition of TNF secretion.
[0182]
Figure 11:
I. an 18-mer peptide spanning the helix found in this region of the hsp60 model;
II. Three sets of overlapping peptides of 10, 13, and 15 residues including the wild-type peptide and the peptide with one amino acid replaced by alanine (Alanin-scan, A represents the position replaced by alanine) ;
III. Two sets of overlapping peptides of 10 and 13 residues (double position alanine-scan), including the wild-type peptide and peptides in which two amino acids have been replaced by alanine
Describe 96 peptides, including:
Example 9: Design of a peptide whose main chain is cyclized
A second generation peptide from region 7 was also designed. This is because a peptide that inhibits hsp60 was found in this region (peptides 173 and 175 in Table 4). The plate contains a backbone cyclized peptide based on the sequence of residues 408-416 of hsp60. The peptide (Table 5) is 9 residues long with four types of cyclization bridging between positions 408-414, 409-416, 408-416 and 409-414. Several types of building blocks (labeled in bold in Table 5) are utilized as bridging groups to form different bridging sizes and types. The Asn residue at position 415 has been replaced with Gln or another residue due to synthetic considerations. In addition (Table 6), a linear peptide based on residues 403-412 of hsp60 was designed.
[0183]
[Table 7]

[0184]
[Table 8]

[0185]
[Table 9]

[0186]
[Table 10]

[0187]
While the invention has been described with respect to certain preferred embodiments and examples, those skilled in the art will recognize that many changes and modifications may be made to optimize the activity of the peptides and analogs of the invention. Will be done. The embodiments are to be construed as non-limiting and serve only for the purpose of illustrating the principles disclosed by the present invention, the scope of which is defined by the claims that follow.
[Brief description of the drawings]
The invention will be better understood with regard to the following drawings and detailed description of the preferred embodiments:
FIG.
1 shows the differential effect of human hsp60 on TNFα production from bone marrow-derived macrophages with wild-type or mutant Tlr4 according to the invention.
FIG. 2
2 shows the dose dependence and time course of hsp60-induced TNFα production according to the invention.
FIG. 3
1 shows the differential effect of human hsp60 on NO production from bone marrow-derived macrophages with wild-type or mutant Tlr4 according to the invention.
FIG. 4
2 shows the dose dependence and time course of hsp60-induced NO production according to the invention.
FIG. 5
Figure 3 shows the elution profile of gel filtration chromatography of trypsin fragment of hsp60 on a Superdex-75 @ FPLC column according to the invention (described in Example 2, Section 1).
FIG. 6
Figure 3 shows the results of reverse phase HPLC on a C-4 column of a subfraction of a trypsin fragment obtained from hsp60 according to the invention (described in Example 2, Section 2).
FIG. 7
According to the invention, it shows a molecular weight of 3411 Dalton (Glu₁₂₆Or Lys₁₅₆Or Leu₃₉₀Or Arg₄₂₀7 shows a mass spectral analysis of peak number 3 during HPLC separation (corresponding to FIG. 6).
FIG. 8
Figure 4 shows the results of testing hsp60 and trypsin fragments of hsp60 for their ability to induce the production of TNFα in macrophages according to the invention (Example 1, Section 1).
FIG. 9
Figure 4 shows the results of testing hsp60 and trypsin fragments of hsp60 for their ability to induce the production of NO in macrophages according to the invention (Example 1, Section 1).
FIG. 10
The results of a screening of decapeptides for hsp60 inhibition according to the invention are described (Example 7).
FIG. 11
The design of 96 peptide analogs based on the region of residues 364-381 of human hsp60 according to the invention is illustrated graphically (Example 8).

Claims (21)

A variant, derivative, analog or peptide fragment of hsp60 that has the ability to act as an antagonist of hsp60 and is characterized by its ability to reduce or prevent the induction of a proinflammatory immune response of cells of the innate immune system by hsp60. 2. An antagonist of hsp60 according to claim 1, comprising a peptide sequence of 5 to 30 amino acids. 2. The hsp60 antagonist of claim 1, comprising a peptide sequence of 5 to 25 amino acids. 2. The hsp60 antagonist of claim 1, comprising a peptide sequence of 7 to 18 amino acids. (I) residues 126-160 of human hsp60;
(Ii) residues 140-192 of human hsp60;
(Iii) residues 220-250 of human hsp60;
(Iv) residues 269-290 of human hsp60;
(V) residues 310-344 of human hsp60;
(Vi) residues 390-421 of human hsp60; and (vii) residues 350-400 of human hsp60.
The hsp60 antagonist according to any one of claims 2 to 4, having a peptide sequence derived from a fragment of hsp60 selected from the group consisting of: The fragment of hsp60 is:
(I) residues 126-156 of human hsp60;
(Ii) residues 157-191 of human hsp60;
(Iii) residues 158-192 of human hsp60;
(Iv) residues 158-191 of human hsp60;
(V) residues 161 to 191 of human hsp60;
(Vi) residues 161-192 of human hsp60;
(Vii) residues 222-249 of human hsp60;
(Viii) residues 310-344 of human hsp60; and (ix) residues 315-344 of human hsp60;
The antagonist of claim 5, wherein the antagonist is selected from the group consisting of: (I) Tyr-Phe-Ile-Asn-Thr-Ser-Lys-Gly-Gln-Lys;
(Ii) Lys-Ala-Gln-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Gln-Glu;
(Iii) Lys-Arg-Ile-Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu;
(Iv) Ile-Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu-Asp-Val;
(V) Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Gln-Leu-Asp-Val-Thr;
(Vi) Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val;
(Vii) Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Glu-Val;
(Viii) Lys-Ala-Gln-Ile-Glu-Lys-Arg-Ile-Gln-Glu-Ile-Ile-Ala-Gln-Leu;
(Ix) Lys-Arg-Ala-Gln-Glu-Ile-Ile-Glu-Ala-Leu;
(X) Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Glu-Val-Asn;
(Xi) Ala-Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Glu-Val;
(Xii) Val-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly-Thr-Ser-Asp-Val-Val; and (xiii) Gly-Val-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Gly-Gly. -Thr-Ser-Asp-Val
7. The hsp60 antagonist of claim 6, having a sequence selected from the group consisting of: A peptide analog in which the backbone of the fragment of hsp60 is cyclized, said analog incorporating at least one structural unit, wherein said structural unit comprises a bridging group comprising an amide, thioether, thioester or disulfide. A peptide comprising at least one nitrogen atom of the linked peptide backbone, wherein at least one structural unit is linked via the bridging group to form a second structural unit, one of the sequences Forming a cyclic structure with a side chain of amino acid residues or a portion selected from the group consisting of terminal amino acid residues, and reducing its ability to reduce or prevent the induction of a pre-inflammatory immune response of cells of the innate immune system by hsp60. An analogue having the ability to act as an antagonist of hsp60, which is characterized by. 9. The backbone cyclized peptide analog according to claim 8, wherein the fragment of hsp60 has the sequence according to any one of claims 5-7. Peptide analogs in which the backbone of residues 408-416 of hsp60 is cyclized. The ring structure is:
(I) residues 408 and 414 of hsp60;
(Ii) residues 409 and 416 of hsp60;
(Iii) residues 408 and 416 of hsp60; and (iv) residues 409 and 414 of hsp60.
The backbone cyclized peptide analog of claim 10, formed by crosslinking two structural units located at positions selected from the group consisting of: (A) contacting cells of the innate immune system carrying an intact Toll-like receptor complex on the cell surface with a fragment of hsp60; and (b) the amount of a proinflammatory mediator or effector produced by the cells. Measuring the
Here, a method of identifying a fragment of hsp60 having the ability to elicit a proinflammatory immune response, wherein an increase in the production of said proinflammatory mediator or effector indicates the ability of the fragment of hsp60 to elicit a proinflammatory response by the innate immune system. Step (b) comprises measuring the amount of TNFα and / or NO produced by the cells;
Here, increased production of TNFα and / or NO indicates the ability of fragments of hsp60 to elicit a pro-inflammatory response by the innate immune system.
The method according to claim 12. (A) transforming cells of the innate immune system carrying the Toll-like receptor complex on the cell surface in the presence and absence of the compound to be tested, into hsp60, or its ability to induce a pro-inflammatory response; Contacting with a fragment; and (b) determining whether the presence of said compound has an effect on the production of a pro-inflammatory mediator or effector by said cell;
Wherein the reduction or prevention of the production of said pro-inflammatory mediator or effector indicates the ability of said compound to act as an antagonist of hsp60;
A method for identifying, screening and / or characterizing compounds capable of acting as an antagonist of hsp60, characterized in that they are capable of reducing or preventing the induction of a proinflammatory response by hsp60. Step (b) comprises measuring the amount of TNFα and / or NO produced by the cells;
Wherein reduction or prevention of produced TNFα and / or NO indicates the ability of the compound to act as an antagonist of hsp60.
The method according to claim 14. Pharmaceutical composition comprising an hsp60 antagonist according to any one of claims 1 to 11 as an active ingredient. Use of an antagonist of hsp60 according to any one of claims 1 to 11 for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of an inflammatory disease or disorder. Inflammatory diseases: autoimmune diseases, diabetes, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, chronic inflammation, atherosclerosis, inflammatory bowel disease, reactive arthritis, chronic infection, transplantation 18. The use according to claim 17, which is selected from hemi-rejection, gingivitis, gastritis, ulcer, thrombosis, allergy and acute infection. A method of treating a patient in need thereof, using as an active ingredient a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of an antagonist of hsp60 according to any one of claims 1-11. Autoimmune disease, diabetes, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus, chronic inflammation, atherosclerosis, gingivitis, inflammatory bowel disease, reactive arthritis, chronic infection, graft rejection 20. The method according to claim 19, for the treatment of an inflammatory disease selected from: gastritis, ulcer, thrombosis, allergy and acute infection. A method for treating a patient in need thereof, using a pharmaceutical composition comprising an hsp60 antagonist according to any one of claims 1 to 11 as an active ingredient.

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