JP2004357567A

JP2004357567A - Method for regenerating tooth germ

Info

Publication number: JP2004357567A
Application number: JP2003159187A
Authority: JP
Inventors: Minoru Ueda; 実上田; Hideaki Kagami; 秀明各務; Takayuki Obara; 孝之小原; Yoshinori Ando; 由典安藤
Original assignee: Hitachi Medical Corp
Current assignee: Hitachi Healthcare Manufacturing Ltd
Priority date: 2003-06-04
Filing date: 2003-06-04
Publication date: 2004-12-24

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for regenerating a tooth germ, more concretely, a method for regenerating a tooth germ, by which a patient who is deficient in a tooth or has a damaged tooth by a dental disease such as a marginal periodontitis (pyorrhea alveolaris), dental caries, or the like, is treated. <P>SOLUTION: The method for regenerating the tooth germ comprises culturing at least one kind of tooth germ cells and cells to be differentiated to the cells and a fibrin-containing carrier. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、歯胚の再生方法に関する。より詳細には、本発明は、歯胚細胞をフィブリンから成る担体上もしくは担体中で培養することにより歯胚を再生する方法に関する。本発明はさらに、上記方法により再生された歯胚を用いて歯科患者を治療する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現代社会は高齢化社会であり、数年後には日本国民人口の約２０％が６５歳以上の高齢者になることが予想されている。これら高齢者の大多数は、何らかの理由により一部又は全部の歯牙を喪失しており、多くの人は可綴式義歯（いわゆる入れ歯）を使用している。従来の義歯は、着脱が必要で装着感もよくないなどの実際的問題のみならず、心理的にも老化の象徴といった印象があり、できれば義歯を使用したくないというのが患者の一般的認識である。さらに、全ての歯牙を喪失した場合に、総義歯を装着すると、その咀嚼能力は通常の天然歯牙の約５分の１となることが知られている。多くの高齢者にとって楽しみの一つである食事が歯の喪失のため苦痛となる場合も少なくない。さらに、脳に対する咀嚼刺激は痴呆防止の効果があり、咀嚼力の低下は痴呆の促進になることが明らかになってきている。
【０００３】
これに対して近年、人工歯根が開発され臨床に応用されている。人工歯根の応用により義歯が固定され、維持がよくなり、咀嚼力も改善される。しかし、審美性、装着感に関しては未だ満足のいくものではない。また、手術が必要であること、一定量の骨が必要であり、全身状態によっても制限されること、さらに多額の費用がかかり、信頼できる医療機関も限られることなどの理由から、未だインプラント義歯は広く普及しているとは言えない。その結果、義歯に不満を感じている患者が少なくないにもかかわらず、インプラント義歯の使用者は義歯使用者のうちの極わずかである。
【０００４】
一方、他家移植による歯牙移植の報告はあるが、移植できる健康な抜去歯牙を確保することは困難であるのみならず、感染症の危険もあり、一般的な治療とはなっていない。義歯に不満を感じながらインプラントに踏み込めないか、あるいは条件的にインプラント治療が困難な多数の患者が存在している。
【０００５】
現在までに、歯科に関する再生の研究は、歯周組織の再生に注目が置かれ、骨の再生、歯根膜の再生を中心に研究されてきた。これらの研究の成果として、ＧＴＲ法（ＧｕｉｄｅｄＴｉｓｓｕｅＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ法）が開発された。ＧＴＲ法とは、例えばミリポアフィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＦＩＬＴＥＲ，ミリポア社商品名）などの膜によって、歯根面への上皮細胞等の侵入を抑制し、歯根膜細胞の増殖に必要な空間を形成させる方法である（Ｎｙｍａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，９，２９０（１９８２））。ＧＴＲ法は、歯周病に罹患した歯牙周囲に歯槽骨と歯根膜を再生させることを目的とするものであり、軽症例では大きな成果を挙げている。また、近年、歯根膜再生を可能にするタンパク質が開発され、実用化されている。しかしながら、ＧＴＲ法は、歯牙喪失の原因となる高度の歯槽骨の吸収には応用できず、またう蝕による歯牙の破壊を修復することはできない。
【０００６】
上記した問題点を根本的に解決する方策として、歯胚そのものを再生する方法が提案され、検討が行われているが（Ｃ．Ｓ．ＹｏｕｎｇｅｔａｌＪ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．８１（１０），６９５−２０００，２００２）、未だ小さな組織が形成できたのみで、実際の治療に供することが可能な程の大きさの組織形成はできていなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｎｙｍａｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，９，２９０（１９８２）
【非特許文献２】
Ｃ．Ｓ．ＹｏｕｎｇｅｔａｌＪ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．８１（１０），６９５−２０００，２００２
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、歯胚を再生する方法を提供すること、より具体的には、歯槽膿漏やう蝕などの歯科疾患により歯牙を欠損又は損傷した患者を治療することを可能にする歯胚の再生方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、再生した歯胚を用いて歯牙を欠損又は損傷した患者を治療する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、歯胚細胞をフィブリンから成る担体上もしくは担体中で培養することにより、ポリグリコール酸（以下、ＰＧＡと略す）から成る担体を使用した場合と比較して高い細胞接着能および低い細胞毒性、更に高い細胞増殖能が示されること見出し、これにより歯胚細胞から歯胚を効率よく形成できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明によれば、歯胚細胞およびこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類をフィブリンを含む担体と一緒に培養することで歯胚を再生する方法が提供される。
好ましくは、上記少なくとも１種類の細胞は上記担体の上又は中で培養される。
好ましくは、上記少なくとも１種類の細胞は、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄あるいは歯乳頭細胞、歯嚢細胞、又はこれらの前駆細胞である。
【００１１】
本発明によればさらに、歯胚細胞およびこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも１種類を培養して増殖させた後に担体上もしくは担体中に播種して培養することを特徴とする歯胚を再生する方法が提供される。
好ましくは、上記担体上で培養した少なくとも１種類の細胞を動物の体内に移植して該動物の体内で歯胚に再生させる。
好ましくは、上記担体について、形状は再生する歯胚の目的形状でありかつ血行の導入部分を有する担体を用いる。
【００１２】
本発明によればさらに、上記した本発明による歯胚の再生方法により再生された歯胚が提供される。
【００１３】
本発明によればさらに、上記した何れかの方法により再生した歯胚を歯牙の欠損又は損傷を有する患者の顎骨に移植することを含む、歯科患者の治療方法が提供される。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明による歯胚の再生方法は、歯胚細胞をフィブリンから成る担体と一緒に（好ましくは、該担体の上又はその中で）培養することを特徴とするものである。
組織工学による組織再生の成否を決める要因の一つに担体が挙げられる。特に生体に移植後の残存細胞数は重要な要素であり、これには担体の細胞親和性および担体自身の持つ細胞増殖促進効果、分化誘導効果あるいは毒性が影響を与える。従って、担体の選択は、これらの要素を検討の上決定する必要がある。
【００１５】
移植初期における残存細胞数を決定する要因としては、細胞の担体への接着能と、担体の細胞毒性とが考えられる。そこで、本発明では、ＰＧＡメッシュとフィブリンゲルを用いて，培養歯胚細胞播種後の細胞数の変化を比較検討した。その結果、ＰＧＡメッシュを用いた場合と比較してフィブリンゲルを用いた場合の方が、多数の細胞が担体上に維持されることが判明した。
【００１６】
歯胚の再生に用いる担体としては、歯胚の形成に必要とされる時間を耐久することができ、かつその後、速やかに吸収されるものが好ましい。即ち、胃大網又は顎骨内などの生体内において適切な吸収速度と特性を有し、かつ細胞と高い親和性を有する材料から成る担体を使用することが好ましい。フィブリンから成る担体はこれらの条件を満たすものである。
【００１７】
担体は細胞を移植しやすい形状に加工したものが好ましく、板状、球状あるいは中空で一端が開放されており、周囲から血行が導入しやすくなっているものが好ましい。
担体は、目的に適合した形態のものを作製することが好ましい。このためには、目的とする形態をレジンで作製した後に印象材を用いて型を取得する。その後、レジンの型を取り出し、担体を構成する合成材料を流しこむことによって目的の形態を再現することができる。
【００１８】
本発明で用いる歯胚細胞としては、歯胚を構成する細胞あるいはこれらの細胞に分化することができる細胞であれば特にその種類は限定されず、例えば、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄あるいは歯乳頭細胞、歯嚢細胞、又はこれらの前駆細胞を使用することができる。これらの細胞は、１種類の細胞から成る単一の細胞として培養してもよいし、２種類以上の細胞から成る細胞混合物として培養してもよい。
【００１９】
歯胚細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、豚など）の下顎骨から採取することができる。埋伏歯を無菌的に取り出し、Ｈａｎｋｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）溶液などの適当な保存液で保存する。歯牙の中の石灰化した部分を取り除き，メスにて組織を小片にして、ＨＢＳＳ溶液などを用いて組織を洗浄する。次いで、コラゲナーゼを用いて組織を酵素処理することが好ましい。酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収することができる。
【００２０】
本発明の方法に従って再生した歯胚は、歯科患者（即ち、歯牙の欠損又は損傷を有する患者）に移植することにより、該患者の治療のために用いられる。この場合、移植に伴う生体適合性などの観点から、再生に用いる歯胚細胞は、該患者に由来する自分の歯胚細胞を用いることが好ましい。歯胚を構成する細胞あるいは歯胚に分化する細胞は、親知らず（智歯）からも採取することができる。
【００２１】
また、歯牙は、発生から成熟するまでに５つの段階を経て形成されることが知られている。第一期は、開始期と呼ばれ、基底膜に上皮組織と間葉組織が誘導される。第二期は、蕾状期と呼ばれエナメル器が作られる。第三期は帽状期と呼ばれ、歯乳頭が形成され、歯胚が形成される。第四期は鐘状期と呼ばれ、歯胚からエナメル質を形成する細胞への分化と歯乳頭から象牙質と歯髄を形成する細胞への分化が開始される。第五期は成熟期と呼ばれ、エナメル質と象牙質と歯髄などの歯牙を構成する組織へと分化する。本発明においては、これらのうちの好適な時期の細胞を採取して用いることができる。また、歯胚が存在していない症例では、歯根より歯髄を摘出して細胞を分離採取することができる。なお、歯牙からの歯髄の摘出は、ＡｂｏｕｔＩ．，他Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｅｌｌｒｅｓｅａｒｃｈ．２５８．３３−４１，２０００に記載の方法に従って行うことができる。
なお、本発明で言う「歯胚の再生」とは、上記５段階のうちの第二期以降の歯胚を再生することを言う。
【００２２】
細胞の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温から３７℃の温度；５％ＣＯ_２インキュベーター内など）の下で行うことができる。
【００２３】
本発明の方法では、分離した歯胚細胞を培養して増殖させた後に、フィブリンから成る担体上もしくは担体中に播種して培養することが好ましい。担体上もしくは担体中に播種する前に培養を行うことにより、担体上で生育するのに十分な数の細胞を取得することが可能になる。分離した歯胚細胞の培養は、上記と同様、通常の動物細胞の培養条件に準じて行うことができる。
【００２４】
フィブリンから成る担体としては、生体組織接着剤等として市販されている血漿分画製剤が使用可能である。フィブリンから成る担体の調製は、通常のフィブリンゲル調製法で行われるが、例えば、フィブリノゲンの溶解液とトロンビンの溶解液の両液を等量混ぜることにより、フィブリンゲルを調製することが可能である。
【００２５】
本発明の方法では、歯胚細胞をフィブリンから成る担体上もしくは担体中で培養した後に、該培養細胞を担体と一緒に移植動物に移植し、該移植動物の体内で歯胚を再生させてもよいし、該培養細胞を担体と一緒に直接患者の顎骨に移植してもよい。あるいはさらに好ましくは、分離した歯胚細胞を培養して増殖させた後にフィブリンから成る担体上もしくは担体中に播種して、または播種後培養し、次いで該培養細胞を担体と一緒に移植動物に移植し、該移植動物の体内で歯胚を再生させることができる。
【００２６】
移植動物の種類は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物であり、例えば、ラット（ヌードラットなど）、ウサギ又はマウスなどのげっ歯類動物を使用することができる。移植の部位としては、歯胚の形成に必要な因子を供給しやすい部位が好ましく、具体的には、血流の豊富な部位が好ましく、例えば、腹腔下の胃大網などが特に好ましい。このような部位に移植することにより、歯胚細胞の成長を促進することができ、歯胚の形成を早めることが可能である。
【００２７】
上記した本発明による歯胚の再生方法により再生した歯胚（歯胚細胞をフィブリンから成る担体上もしくは担体中に播種し培養して得られる歯胚組織、あるいはこの歯胚組織を移植動物に移植し、該移植動物の体内でさらに再生させた歯胚組織のどれでもよい）は、歯牙の欠損又は損傷を有する患者の顎骨に移植することによって、該歯科患者を治療することができる。即ち、本発明による歯胚の再生方法により得られた歯胚を用いる歯科患者の治療方法も本発明の範囲内のものである。歯科患者の顎骨内に移植された後も歯胚の成長を継続させることにより、歯牙を形成させることができる。あるいは歯根までを患者の体外で形成させた後、これを患者の顎骨内に移植し、従来の歯科的な手法により歯冠を形成してもよい。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００２８】
【実施例】
実施例１：フィブリンとコラーゲンコートＰＧＡとの接着性・増殖性の比較
生後６ヶ月の新鮮豚から下顎骨を採取した。実験に使用するまでは４℃の冷蔵庫にて保存し、運搬中は氷上にて保存した。埋伏歯を無菌的に取り出し、Ｈａｎｋｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）溶液にて保存した。歯胚の中の石灰化した部分を取り除き，メスにて組織を約２ｍｍの小片にした。ＨＢＳＳ溶液にて小片にした組織を約５回洗浄した。
２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼをＨＢＳＳ溶液に溶解した酵素溶液を用いて、洗浄した組織を５０分間酵素処理した。
【００２９】
２５ｍｌ用のピペットを用いて１０分間ピペッティングした。２５ｍｌの上澄み液を遠心（１５００ｒｐｍ，５分）して細胞を回収した。１０％血清入り培地にて３回洗浄した後に遠心することによって細胞を回収した。
【００３０】
回収した細胞を、７５ｍｌのフラスコにて培養した。細胞の培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍに１０％牛胎児血清と抗生剤を加えたものを用いた。また、細胞の培養は、３７^ｏＣ，５％ＣＯ_２という条件下で行った。
【００３１】
７５ｃｍ^２フラスコにて培養した細胞は、コンフルエントになる前に、トリプシン処理し、フラスコから剥離した後、ＰＧＡメッシュ担体（体積密度５０％〜６０％，厚さ２ｍｍ、ＡｌｂａｎｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、又はフィブリンゲル（化学及血清療法研究所製ボルヒール。フィブリノゲンの溶解液とトロンビンの溶解液の両液を等量混ぜることにより、フィブリンゲルを調製）担体に播種した。細胞懸濁液の密度は５．０×１０^４個／ｍｌに調整し、１ｍｌを１個の担体に播種した。
【００３２】
播種後の細胞の培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍに１０％牛胎児血清と抗生剤を加えたものを用いた。また、細胞の培養は、３７^ｏＣ，５％ＣＯ_２という条件下で行った。播種後経時的に接着細胞数を測定した。結果を図１に示す。
【００３３】
図１の結果から、培養２４時間後の初期の段階において、ＰＧＡメッシュ群と比較して、フィブリンゲル上での細胞数が多いことが分かる。更に時間が経過するごとに、接着している細胞数に顕著な差が現れる。この結果は、フィブリンが歯胚細胞に対するより高い細胞接着能、低い細胞毒性、更に高い細胞増殖能を示したものと考えられる。この結果より、歯胚再生において培養および分離歯胚細胞の担体としてフィブリンがＰＧＡより有利であることが判明した。
【００３４】
実施例２：ｉｎｖｉｖｏでの担体評価
実施例１の方法にてブタ歯胚細胞を単離した後、１．５×１０^７個／１００μｌの細胞懸濁液を調整しＰＧＡメッシュ群に細胞を播種した。一方、フィブリンゲルには、ＰＧＡと同じく実施例１の方法にてブタ歯胚細胞を単離した後、フィブリノゲンの溶解した液にて細胞懸濁液を１．５×１０^７個／５０μｌに調整し、トロンビンが溶解した液を５０μｌ混ぜることにより、細胞をフィブリンゲルの中に閉じ込めた。細胞を播種した担体は、静置培養を２４時間行った。細胞の培養培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍに１０％牛胎児血清と抗生剤を加えたものを用いた。また、細胞の培養は、３７^ｏＣ，５％ＣＯ_２という条件下で行った。
【００３５】
移植動物としては、ＫＳＮ／ｓｌｃヌードマウスを用いた。ヌードマウスの表皮を切開した後、筋層と表皮を剥離し、その空いたスペースにＰＧＡメッシュ及びフィブリンゲルを移植し、移植後４週にて担体を取り出した。取り出した組織の直径は、約８ｍｍであり、以前の報告（Ｃ．Ｓ．ＹｏｕｎｇｅｔａｌＪ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．８１（１０）２００２）記載の移殖後２５週時の直径２ｍｍよりも顕著に大きくなった（図２）。また、この組織にヘマトキシリン・エオジン染色を施した所、硬組織の存在も確認され、歯胚再生の速度も速くなったことが確認された（図３）。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の方法を利用して、移植動物の体内または培地上で象牙質、歯乳頭、エナメル髄などの歯胚構造を形成してから、あるいは歯胚構造を形成するように分化誘導された細胞塊を担体とともに科患者の顎骨内に移植することにより、歯根または歯牙を再生させることができる。この結果、歯牙を欠損した患者の咀嚼能力の回復に極めて有効な治療となる。また、審美的な回復も見込まれ、患者のＱｕａｌｉｔｙｏｆＬｉｆｅ（ＱＯＬ）の向上に大きく貢献する。また、本発明の方法では、増殖、転写因子など生理活性物質を用いることにより再生に要する期間を短縮し、あるいは分化誘導を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、１２穴プレート中の担体に各５×１０^４個歯胚細胞を播種し、各担体における細胞の接着性・増殖性を測定した結果を示す。
【図２】図２は、ヌードマウス皮下に移植後、４週にて取り出した移植体を示す。
【図３】図３は、図２の移植体の組織像（ヘマトキシリン・エオジン染色）を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for regenerating tooth germ. More specifically, the present invention relates to a method for regenerating tooth germ by culturing tooth germ cells on or in a carrier comprising fibrin. The present invention further relates to a method for treating a dental patient using the tooth germ regenerated by the above method.
[0002]
[Prior art]
Modern society is an aging society, and it is expected that about 20% of the Japanese population will be older than 65 years old in a few years. The majority of these elderly people have lost some or all of their teeth for some reason, and many use removable dentures (so-called dentures). Conventional dentures not only have practical problems such as the necessity of putting on and taking off and the feeling of wearing is not good, but also have the impression that they are a symbol of aging psychologically, and it is generally accepted by patients that they do not want to use dentures if possible It is. Furthermore, it is known that when all the teeth are lost, when a complete denture is worn, the chewing ability is about one-fifth that of a normal natural tooth. Diet, which is one of the pleasures of many elderly people, is often painful due to tooth loss. Furthermore, it has become clear that mastication stimulation of the brain has an effect of preventing dementia, and that reduction of mastication power promotes dementia.
[0003]
On the other hand, in recent years, artificial dental roots have been developed and applied to clinical practice. The application of artificial roots fixes the denture, improves the maintenance and improves the mastication power. However, the aesthetics and the feeling of wearing are still unsatisfactory. In addition, implant dentures are still required because of the need for surgery, the need for a certain amount of bone, the limitations of general condition, the high cost and the limited number of reliable medical institutions. Is not widely spread. As a result, despite the fact that many patients are dissatisfied with dentures, only a small percentage of denture users use implant dentures.
[0004]
On the other hand, there have been reports of tooth transplantation by allogeneic transplantation, but it is not only difficult to secure healthy extracted teeth that can be transplanted, but also there is a risk of infectious diseases, and it has not been a general treatment. There are many patients who are unhappy with dentures and cannot step into the implant, or conditionally have difficulty treating the implant.
[0005]
To date, regenerative research on dentistry has focused on the regeneration of periodontal tissue and has focused on bone regeneration and periodontal regeneration. As a result of these studies, the GTR method (guided tissue regeneration method) was developed. The GTR method is a method of suppressing the invasion of epithelial cells and the like to the root surface by using a membrane such as a Millipore filter (MILLIPORE FILTER, trade name of Millipore) to form a space necessary for proliferation of periodontal ligament cells. (Nyman et al., J. Clin. Periodontol., 9 , 290 (1982)). The GTR method aims at regenerating alveolar bone and periodontal ligament around a tooth affected by periodontal disease, and has achieved great results in mild cases. In recent years, proteins that enable periodontal ligament regeneration have been developed and put to practical use. However, the GTR method cannot be applied to the resorption of high alveolar bone that causes tooth loss, and it cannot repair the destruction of teeth due to dental caries.
[0006]
As a method for fundamentally solving the above problems, a method of regenerating tooth germ itself has been proposed and studied (CS Young et al J. Dent. Res. 81 (10), 695-2000, 2002), only a small tissue could be formed, and a tissue large enough to be used for actual treatment could not be formed.
[0007]
[Non-patent document 1]
Nyman et al. Clin. Periodontol. , 9 , 290 (1982)
[Non-patent document 2]
C. S. Young et al. Dent. Res. 81 (10), 695-2000, 2002
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems of the conventional technology. That is, the present invention provides a method for regenerating a tooth germ, and more specifically, a tooth germ capable of treating a patient whose teeth have been lost or damaged due to a dental disease such as alveolar pyorrhea or dental caries. The problem to be solved is to provide a method of reproducing the above. Further, the present invention has been made to solve the problem of providing a method for treating a patient having a tooth deficient or damaged using a regenerated tooth germ.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems. As a result, by culturing tooth germ cells on or in a carrier made of fibrin, a carrier made of polyglycolic acid (hereinafter abbreviated as PGA) was obtained. It has been found that higher cell adhesion ability, lower cytotoxicity, and higher cell proliferation ability are exhibited as compared with the case where the germ cells are used, and that tooth germs can be efficiently formed from tooth germ cells. The present invention has been completed based on these findings.
[0010]
That is, the present invention provides a method for regenerating tooth germ by culturing at least one of tooth germ cells and cells that can be differentiated into these cells together with a carrier containing fibrin.
Preferably, said at least one cell is cultured on or in said carrier.
Preferably, the at least one cell is an odontoblast, an ameloblast, a dental pulp or papillary cell, a dental sac cell, or a precursor cell thereof.
[0011]
According to the present invention, furthermore, a tooth germ characterized in that at least one of tooth germ cells and cells that can be differentiated into these cells is cultured and expanded, and then seeded and cultured on or in a carrier. Is provided.
Preferably, at least one type of cells cultured on the carrier is transplanted into an animal body and regenerated into a tooth germ in the animal body.
Preferably, for the carrier, a carrier having a target shape of a tooth germ to be regenerated and having a blood introduction part is used.
[0012]
According to the present invention, there is further provided a tooth germ regenerated by the above-described method for regenerating a tooth germ according to the present invention.
[0013]
According to the present invention, there is further provided a method for treating a dental patient, comprising transplanting the tooth germ regenerated by any of the above methods into the jaw bone of a patient having a tooth defect or damage.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
The method for regenerating tooth germ according to the present invention is characterized by culturing tooth germ cells together with a carrier comprising fibrin (preferably on or in the carrier).
One of the factors that determines the success or failure of tissue regeneration by tissue engineering is a carrier. In particular, the number of remaining cells after transplantation into a living body is an important factor, and this affects the cell affinity of the carrier and the cell growth promoting effect, differentiation inducing effect or toxicity of the carrier itself. Therefore, the selection of the carrier needs to be determined by considering these factors.
[0015]
Factors that determine the number of remaining cells in the early stage of transplantation include the ability of cells to adhere to the carrier and the cytotoxicity of the carrier. Therefore, in the present invention, a change in the number of cells after seeding of cultured tooth germ cells was compared using a PGA mesh and fibrin gel. As a result, it was found that a larger number of cells were maintained on the carrier when fibrin gel was used than when PGA mesh was used.
[0016]
As the carrier used for the regeneration of the tooth germ, a carrier that can withstand the time required for the formation of the tooth germ and that is rapidly absorbed thereafter is preferable. That is, it is preferable to use a carrier that has a suitable absorption rate and characteristics in a living body such as the stomach omentum or the jawbone, and is made of a material having high affinity for cells. A carrier composed of fibrin meets these requirements.
[0017]
The carrier is preferably processed into a shape in which cells can be easily transplanted, and is preferably a plate, a sphere, or a hollow, one end of which is open, so that blood circulation can be easily introduced from the periphery.
The carrier is preferably prepared in a form suitable for the purpose. For this purpose, a mold is obtained using an impression material after the desired form is made of resin. Thereafter, the desired form can be reproduced by removing the resin mold and pouring the synthetic material constituting the carrier.
[0018]
The type of tooth germ cells used in the present invention is not particularly limited as long as the cells constitute tooth germ or cells capable of differentiating into these cells. For example, odontoblasts, ameloblasts, pulp or Tooth papilla cells, tooth sac cells, or precursor cells thereof can be used. These cells may be cultured as a single cell composed of one type of cell, or may be cultured as a cell mixture composed of two or more types of cells.
[0019]
Tooth germ cells can be collected from the mandible of mammals (eg, humans, pigs, etc.). The impacted teeth are aseptically removed and stored in a suitable preservation solution such as a Hanks balanced salt solution (HBSS) solution. The calcified portion of the tooth is removed, the tissue is cut into small pieces with a scalpel, and the tissue is washed using an HBSS solution or the like. Next, it is preferable to subject the tissue to enzyme treatment using collagenase. After the enzyme treatment, the cells can be collected by pipetting and centrifugation.
[0020]
The tooth germ regenerated according to the method of the present invention is used for the treatment of a dental patient (ie, a patient having a tooth defect or damage) by transplanting the tooth germ into the patient. In this case, from the viewpoint of the biocompatibility associated with the transplantation, it is preferable to use the own tooth germ cells derived from the patient as the tooth germ cells used for regeneration. Cells constituting the tooth germ or cells that differentiate into the tooth germ can also be collected from wisdom teeth (wisdom teeth).
[0021]
In addition, it is known that teeth are formed through five stages from development to maturity. The first phase, called the onset phase, induces epithelial and mesenchymal tissue in the basement membrane. The second stage is called the bud stage and enamel is made. The third stage is called the cap stage, where the papillae of the teeth are formed and the tooth germ is formed. The fourth stage is called the bell stage, in which differentiation from tooth germ to cells forming enamel and differentiation from tooth papilla to cells forming dentin and pulp are initiated. The fifth stage, called the maturation period, differentiates into tissues that make up the teeth, such as enamel, dentin, and pulp. In the present invention, cells at a suitable time can be collected and used. In the case where no tooth germ is present, the pulp can be removed from the tooth root and the cells can be separated and collected. The extraction of the pulp from the tooth is described in About I. et al. , Et al. Experimental cell research. 258. 33-41, 2000.
In addition, "regeneration of tooth germ" in the present invention refers to regeneration of tooth germ in the second and subsequent stages among the above five stages.
[0022]
Cultivation of the cells should be performed using normal serum-containing medium used for culturing animal cells under normal conditions for culturing animal cells (eg, room temperature to 37 ° C .; in a 5% CO ₂ incubator). Can be.
[0023]
In the method of the present invention, it is preferable that the isolated tooth germ cells are cultured and expanded, and then seeded and cultured on or in a carrier made of fibrin. By performing the culture before seeding on or in the carrier, it is possible to obtain a sufficient number of cells to grow on the carrier. The culture of the separated tooth germ cells can be performed according to the usual conditions for culturing animal cells, as described above.
[0024]
As a carrier composed of fibrin, a plasma fraction preparation commercially available as a biological tissue adhesive or the like can be used. The preparation of the carrier composed of fibrin is carried out by a usual fibrin gel preparation method.For example, it is possible to prepare a fibrin gel by mixing equal amounts of both a solution of fibrinogen and a solution of thrombin. .
[0025]
In the method of the present invention, after culturing tooth germ cells on or in a carrier comprising fibrin, the cultured cells are transplanted together with the carrier into a transplanted animal, and the tooth germ is regenerated in the transplanted animal. Alternatively, the cultured cells may be directly transplanted into a patient's jawbone together with a carrier. Alternatively and more preferably, the isolated tooth germ cells are cultured and expanded, and then seeded on or in a carrier composed of fibrin, or cultured after seeding, and then the cultured cells are transplanted together with the carrier into a transplanted animal. In addition, the tooth germ can be regenerated in the body of the transplanted animal.
[0026]
The type of the transplanted animal is not particularly limited, but is preferably a mammal, and for example, a rodent such as a rat (eg, a nude rat), a rabbit or a mouse can be used. As a site for transplantation, a site that easily supplies factors necessary for the formation of tooth germ is preferable, and specifically, a site with abundant blood flow is preferable, and for example, gastric omentum below the abdominal cavity is particularly preferable. By transplanting to such a site, the growth of tooth germ cells can be promoted, and the formation of tooth germ can be hastened.
[0027]
Tooth germ (tooth germ tissue obtained by seeding and culturing tooth germ cells on or in a carrier made of fibrin by the above-described method for regenerating tooth germ according to the present invention, or transplanting this tooth germ tissue into a transplanted animal However, any dental germ tissue that has been further regenerated in the body of the transplanted animal can be used to treat the dental patient by transplanting it into the jaw bone of a patient having a tooth defect or damage. That is, a method for treating a dental patient using a tooth germ obtained by the method for regenerating a tooth germ according to the present invention is also within the scope of the present invention. The teeth can be formed by continuing the growth of the tooth germ even after being implanted in the jaw bone of a dental patient. Alternatively, the tooth root may be formed outside the patient's body, and then implanted into the patient's jawbone to form a crown by a conventional dental technique.
The present invention will be described more specifically with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the examples.
[0028]
【Example】
Example 1 Comparison of Adhesion and Proliferation between Fibrin and Collagen-Coated PGA The mandible was collected from a 6-month-old fresh pig. They were stored in a refrigerator at 4 ° C. until use in experiments, and stored on ice during transportation. The impacted teeth were aseptically removed and stored in a Hanks balanced salt solution (HBSS) solution. The calcified portion of the tooth germ was removed, and the tissue was cut into small pieces of about 2 mm with a scalpel. The small pieces of tissue were washed about 5 times with the HBSS solution.
The washed tissue was subjected to an enzyme treatment for 50 minutes using an enzyme solution in which 2 mg / ml collagenase was dissolved in an HBSS solution.
[0029]
Pipetting was performed for 10 minutes using a pipette for 25 ml. 25 ml of the supernatant was centrifuged (1500 rpm, 5 minutes) to collect the cells. After washing three times with a medium containing 10% serum, the cells were collected by centrifugation.
[0030]
The collected cells were cultured in a 75 ml flask. As a culture medium for cells, Dulbecco's Modified Eagle Medium supplemented with 10% fetal bovine serum and an antibiotic was used. The cells were cultured under the conditions of 37 ^° C. and 5% CO ₂ .
[0031]
Cells cultured in a 75 cm ² flask are treated with trypsin before becoming confluent, peeled from the flask, and then subjected to a PGA mesh carrier (volume density 50% to 60%, thickness 2 mm, Albany International Research, Mass., USA). Or fibrin gel (Bolhir, manufactured by Chemistry and Serum Therapy Laboratory, a fibrin gel was prepared by mixing equal amounts of both a solution of fibrinogen and a solution of thrombin). The density of the cell suspension was adjusted to 5.0 × 10 ⁴ cells / ml, and 1 ml was inoculated on one carrier.
[0032]
As a culture medium for the cells after seeding, a culture medium obtained by adding 10% fetal bovine serum and an antibiotic to Dulbecco's Modified Eagle Medium was used. The cells were cultured under the conditions of 37 ^° C. and 5% CO ₂ . The number of adherent cells was measured over time after seeding. The results are shown in FIG.
[0033]
From the results of FIG. 1, it can be seen that the number of cells on the fibrin gel is larger in the initial stage after 24 hours of culture than in the PGA mesh group. Over time, a noticeable difference in the number of adherent cells appears. This result suggests that fibrin exhibited higher cell adhesion to tooth germ cells, lower cytotoxicity, and higher cell proliferation. These results revealed that fibrin is more advantageous than PGA as a carrier for cultured and isolated tooth germ cells in tooth germ regeneration.
[0034]
Example 2 Evaluation of Carrier in Vivo After porcine tooth germ cells were isolated by the method of Example 1, 1.5 × 10 ⁷ cells / 100 μl of a cell suspension were prepared, and the cells were placed in a PGA mesh group. Seeded. On the other hand, in the fibrin gel, porcine tooth germ cells were isolated by the method of Example 1 as in PGA, and the cell suspension was adjusted to 1.5 × 10 ⁷ cells / 50 μl with a solution in which fibrinogen was dissolved. Then, the cells were confined in fibrin gel by mixing 50 μl of the solution in which thrombin was dissolved. The carrier on which the cells were seeded was subjected to stationary culture for 24 hours. As a culture medium for cells, Dulbecco's Modified Eagle Medium supplemented with 10% fetal bovine serum and an antibiotic was used. The cells were cultured under the conditions of 37 ^° C. and 5% CO ₂ .
[0035]
KSN / slc nude mice were used as transplant animals. After incising the epidermis of the nude mouse, the muscular layer and epidermis were peeled off, PGA mesh and fibrin gel were implanted in the vacant space, and the carrier was taken out 4 weeks after implantation. The diameter of the removed tissue is about 8 mm, which is more remarkable than the diameter of 2 mm 25 weeks after transplantation described in a previous report (CS Young et al. J. Dent. Res. 81 (10) 2002). It became larger (Fig. 2). Further, when the tissue was stained with hematoxylin and eosin, the presence of hard tissue was also confirmed, and it was confirmed that the speed of tooth germ regeneration was also increased (FIG. 3).
[0036]
【The invention's effect】
Utilizing the method of the present invention, cells that have been induced to form tooth germ structures such as dentin, tooth papillae, and enamel pulp in the body of a transplanted animal or on a medium or to form tooth germ structures By implanting the mass together with the carrier into the jaw bone of the dentist, the roots or teeth can be regenerated. As a result, this is an extremely effective treatment for restoring the masticatory ability of a patient having a tooth loss. In addition, an aesthetic recovery is also expected, which greatly contributes to the improvement of the patient's quality of life (QOL). In the method of the present invention, the period required for regeneration can be shortened or differentiation induction can be promoted by using a physiologically active substance such as a growth factor or a transcription factor.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the results of seeding 5 × 10 ⁴ tooth germ cells on a carrier in a 12-well plate and measuring the adhesiveness / proliferation of the cells on each carrier.
FIG. 2 shows a transplant taken out 4 weeks after subcutaneous transplantation into a nude mouse.
FIG. 3 shows a histological image (hematoxylin and eosin staining) of the transplant of FIG. 2;

Claims

A method for regenerating tooth germ by culturing at least one of tooth germ cells and cells capable of differentiating these cells together with a carrier containing fibrin.

The method of claim 1, wherein the at least one cell is cultured on or in the carrier.

The tooth germ according to claim 1 or 2, wherein the at least one cell is an odontoblast, an ameloblast, a dental pulp or a papilla cell, a dental sac cell, or a precursor cell thereof. How to play.

A method for regenerating tooth germ, comprising culturing and growing at least one of tooth germ cells and cells that can be differentiated into these cells, and then seeding and culturing the cells on or in a carrier.

The method for regenerating a tooth germ according to any one of claims 1 to 4, comprising transplanting at least one kind of cells cultured on the carrier into an animal and regenerating the tooth germ in the animal.

The method for regenerating a tooth germ according to any one of claims 1 to 5, wherein the carrier is a carrier having a target shape of a tooth germ to be regenerated and having a blood introduction part.

A tooth germ regenerated by the method according to claim 1.