ITTO20070201A1 - NEW DNA METHODATION MARKERS USEFUL FOR DIAGNOSIS OF NEOPLASTIC DISEASES - Google Patents
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Description
"Nuovi marcatori di metilazione del DNA utili per la diagnosi di malattie neoplastiche" "New DNA methylation markers useful for the diagnosis of neoplastic diseases"
DESCRIZIONE DESCRIPTION
La presente invenzione riguarda un procedimento in vitro per la rivelazione di neoplasie dell'uomo tramite analisi dello stato di metilazione del DNA di specifiche regioni del DNA tumorale, nonché acidi nucleici e oligonucleotidi utili in tale procedimento e kit comprendenti tali oligonucleotidi. The present invention relates to an in vitro process for the detection of human neoplasms by analyzing the methylation status of the DNA of specific regions of the tumor DNA, as well as nucleic acids and oligonucleotides useful in this process and kits comprising such oligonucleotides.
La metilazione del DNA, ossia il legame di gruppi metilici (-CH3) a citosine presenti nel DNA nel contesto del dinucleotide CpG (C = citosina; G = guanina; p = monofosfato) è la più comune e nota modificazione epigenetica a cui il DNA può andare incontro nelle cellule di mammifero. Di norma, una volta stabilito lo schema di metilazione del DNA, la cellula madre lo trasmette fedelmente a tutte le cellule figlie. DNA methylation, i.e. the binding of methyl groups (-CH3) to cytosines present in DNA in the context of the CpG dinucleotide (C = cytosine; G = guanine; p = monophosphate) is the most common and known epigenetic modification to which DNA can be encountered in mammalian cells. As a rule, once the DNA methylation pattern is established, the parent cell faithfully transmits it to all daughter cells.
Nel genoma umano, sono presenti numerose migliaia di regioni particolarmente ricche di CpG - le cosiddette isole CpG (CpG islands). Queste regioni, spesso locallizate nei promotori genici, sono generalmente prive di metilazione. In the human genome, there are numerous thousands of regions particularly rich in CpG - the so-called CpG islands (CpG islands). These regions, often located in gene promoters, are generally devoid of methylation.
E' noto dalla letteratura scientifica che svariate isole CpG presentano metilazione aberrante nei tumori umani. Ciò spesso si associa con l'inibizione della trascrizione dei geni ad esse collegate, suggerendo che l'alterato stato di metilazione del DNA riscontrato nei tumori umani possa avere un ruolo nel processo tumorigenico. In ogni caso, la presenza di alterata metilazione si presenta come un utile marcatore di diagnosi di malattie neoplastiche nell'uomo, inoltre, poiché alterazioni nello stato di metilazione si riscontrano già nelle fasi iniziali del processo neoplastico, questi marcatori sono utili anche per una diagnosi precoce. It is known from the scientific literature that several CpG islands exhibit aberrant methylation in human tumors. This is often associated with inhibition of transcription of related genes, suggesting that the altered DNA methylation status found in human tumors may play a role in the tumorigenic process. In any case, the presence of altered methylation is presented as a useful diagnostic marker of neoplastic diseases in humans, moreover, since alterations in the state of methylation are found already in the initial stages of the neoplastic process, these markers are also useful for a diagnosis early.
La letteratura scientifica e brevettuale riporta infatti numerosi studi sullo stato di metilazione di geni implicati nello sviluppo di tumori umani e sui metodi utili per la loro rivelazione. In fact, the scientific and patent literature reports numerous studies on the methylation status of genes involved in the development of human tumors and on the methods useful for their detection.
Vi è peraltro la continua necessità di individuare nuovi marcatori di malattie neoplastiche che da un lato consentano di ampliare le conoscenze attualmente disponibili sui meccanismi molecolari alla base della canceroge nesi, e dall'altro contribuiscano a fornire nuovi strumenti per la diagnosi precoce di tumori umani. Furthermore, there is a continuing need to identify new markers of neoplastic diseases which, on the one hand, allow for the broadening of the knowledge currently available on the molecular mechanisms underlying carcinogenicity, and on the other, contribute to providing new tools for the early diagnosis of human tumors.
La presente invenzione si basa su studi effettuati dai presenti inventori, con i quali è stato identificato un gruppo di isole CpG associate a geni umani {elencati in tabella 1) che si sono rivelati utili come marcatori di metilazione del DNA. Specificamente, tutte le isole CpG elencate in tabella 1 sono state inizialmente identificate attraverso un unico esperimento di analisi del profilo trascrizionale nella linea cellulare umana RKO trattata con farmaco demetilante. The present invention is based on studies carried out by the present inventors, with which a group of CpG islands associated with human genes (listed in table 1) has been identified which have proved useful as DNA methylation markers. Specifically, all the CpG islands listed in Table 1 were initially identified through a single transcription profile analysis experiment in the demethylating drug-treated human RKO cell line.
Più specificamente, gli inventori hanno trovato che lo stato di metilazione delle isole CpG elencate in tabella 1 è alterato in tumori umani e che l'analisi dello stato di metilazione delle isole CpG di tali geni costituisce un marcatore utile per la diagnosi di diversi tipi di neoplasie umane, comprendenti sia tumori solidi sia neoplasie ematologiche. More specifically, the inventors found that the methylation status of the CpG islands listed in Table 1 is altered in human tumors and that the analysis of the methylation status of the CpG islands of these genes constitutes a useful marker for the diagnosis of different types of human neoplasms, including both solid tumors and haematological neoplasms.
Più specificamente, gli inventori hanno trovato che le isole CpG riportate in tabella 1 presentano, in cellule derivate da neoplasie umane, una frequenza di metilazione superiore a quella osservata nei controlli normali, che risultano non metilati o metilati con bassa frequenza. Lo stato di metilazione di tali isole CpG, la cui localizzazione genomica ed estensione è specificata in tabella 1, costituiscono quindi un utile marcatore di tumori solidi e neoplasie ematologiche nell'uomo. More specifically, the inventors have found that the CpG islands reported in table 1 show, in cells derived from human neoplasms, a frequency of methylation higher than that observed in normal controls, which are unmethylated or methylated with a low frequency. The methylation status of these CpG islands, whose genomic localization and extension is specified in table 1, therefore constitute a useful marker of solid tumors and haematological neoplasms in humans.
Le isole CpG si trovano tutte all'estremità 5' di geni umani elencati in tabella 1 e coprono regioni variabili da circa 1,3 kb a circa 7,5 kb. The CpG islands are all located at the 5 'end of human genes listed in Table 1 and cover regions ranging from about 1.3 kb to about 7.5 kb.
Un oggetto della presente invenzione è quindi un procedimento per la diagnosi di tumori solidi e neoplasie ematologiche, caratterizzato dal fatto di comprendere, in un campione di DNA genomico, la fase di analizzare lo stato di metilazione dell'isola CpG di un gene scelto dal gruppo che consiste dei geni umani elencati in tabella 1, la localizzazione genomica dell'isola CpG di ciascuno di detti geni umani essendo come indicata in tabella 1, la metilazione di detta isola CpG essendo indicativa di malattia neoplastica. An object of the present invention is therefore a procedure for the diagnosis of solid tumors and haematological neoplasms, characterized by the fact of including, in a sample of genomic DNA, the step of analyzing the methylation state of the CpG island of a gene selected from the group which consists of the human genes listed in Table 1, the genomic localization of the CpG island of each of said human genes being as indicated in Table 1, the methylation of said CpG island being indicative of neoplastic disease.
In una forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene AR-HGAP20 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 42.661 e 45.840 della sequenza Genbank AP003460, versione 3 (SEQ ID NO: 1), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In one embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the AR-HGAP20 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to the nucleotides 42.661 and 45.840 of the Genbank AP003460, version 3 sequence (SEQ ID NO : 1), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene CDH11 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 52.081e 55.500 della sequenza Genbank AC137643, versione 3 (SEQ ID NO: 2), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the CDH11 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to the nucleotides 52.081 and 55.500 of the Genbank AC137643, version 3 sequence (SEQ ID NO : 2), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene FLI1 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 40.001 e 47.460 della sequenza Genbank AP001122, versione 5 {SEQ ID NO: 3), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the FLI1 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to nucleotides 40.001 and 47.460 of the sequence Genbank AP001122, version 5 {SEQ ID NO : 3), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene F0SL2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 52.801 e 57.000 della sequenza Genbank AC104695, versione 2 (SEQ ID NO: 4), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the F0SL2 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to nucleotides 52.801 and 57.000 of the Genbank AC104695, version 2 sequence (SEQ ID NO : 4), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene HES2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 31.741 e 34.020 della sequenza Genbank AL031848, versione 11 (SEQ ID NO: 5), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the HES2 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to nucleotides 31.741 and 34.020 of the sequence Genbank AL031848, version 11 (SEQ ID NO : 5), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene HTR6 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 92.521 e 95.340 della sequenza Genbank ALO31727, versione 43 (SEQ ID NO: 6), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the HTR6 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to the nucleotides 92.521 and 95.340 of the sequence Genbank ALO31727, version 43 (SEQ ID NO : 6), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
in un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene LHX3 conpresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 111.001 e 116.040 della sequenza Genbank AL138781, versione 13 {SEQ ID NO: 7), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. in another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the LHX3 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to nucleotides 111.001 and 116.040 of the sequence Genbank AL138781, version 13 {SEQ ID NO : 7), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene LOC51149 conpresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 117.001 e 119.700 della sequenza Genbank AC008393, versione 7 (SEQ ID NO: 8), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the LOC51149 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to the nucleotides 117.001 and 119.700 of the Genbank sequence AC008393, version 7 (SEQ ID NO : 8), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene MAP1B compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 39.361 e 41.460 della sequenza Genbank AGO93218, versione 2 (SEQ ID NO: 9), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the MAP1B gene comprised between the nucleotide positions corresponding to the nucleotides 39.361 and 41.460 of the sequence Genbank AGO93218, version 2 (SEQ ID NO : 9), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione conprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene MDM2 conpresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 140.401 e 141.660 della sequenza Genbank AC025423, versione 32 (SEQ ID NO: 10), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the MDM2 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to the nucleotides 140.401 and 141.660 of the Genbank sequence AC025423, version 32 (SEQ ID NO : 10), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene NID1 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 36.661 e 38.520 della sequenza Genbank AL122018, versione 37 (SEQ ID NO: 11), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the NID1 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to nucleotides 36.661 and 38.520 of the sequence Genbank AL122018, version 37 (SEQ ID NO : 11), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene NID2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 75.001 e 77.340 della sequenza Genbank AL008557, versione 5 (SEQ ID NO: 12), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the NID2 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to nucleotides 75.001 and 77.340 of the sequence Genbank AL008557, version 5 (SEQ ID NO : 12), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene FNUTL2 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 108.541 e 111.200 della sequenza Genbank AC005666, versione 1 {SEQ ID NO: 13), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the FNUTL2 gene between the nucleotide positions corresponding to the nucleotides 108.541 and 111.200 of the Genbank AC005666 sequence, version 1 {SEQ ID NO : 13), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PRPH compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 149.821 e 152.460 della sequenza Genbank AC125611, versione 4 {SEQ ID NO: 14), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the PRPH gene comprised between the nucleotide positions corresponding to nucleotides 149.821 and 152.460 of the sequence Genbank AC125611, version 4 {SEQ ID NO : 14), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione comprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PTGER3 compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 123.001 e 124.560 della sequenza Genbank AL031429, versione 11 (SEQ ID NO: 15), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the PTGER3 gene comprised between the nucleotide positions corresponding to the nucleotides 123.001 and 124.560 of the sequence Genbank AL031429, version 11 (SEQ ID NO : 15), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
In un'altra forma di attuazione, il procedimento dell'invenzione conprende la fase di analizzare lo stato di metilazione della sequenza nucleotidica del gene PTPRM compresa tra le posizioni nucleotidiche corrispondenti ai nucleotidi 64.321 e 66.660 della sequenza Genbank AP001091, versione 5 {SEQ ID NO: 16), la metilazione di detta sequenza essendo indicativa di malattia neoplastica. In another embodiment, the process of the invention comprises the step of analyzing the methylation state of the nucleotide sequence of the PTPRM gene comprised between the nucleotide positions corresponding to the nucleotides 64.321 and 66.660 of the Genbank AP001091 sequence, version 5 {SEQ ID NO : 16), the methylation of said sequence being indicative of neoplastic disease.
La tabella 1 riassume la corrispondenza delle isole CpG di ciascuno dei geni sopra menzionati con le coordinate nucleotidiche delle rispettive sequenze Genbank. Table 1 summarizes the correspondence of the CpG islands of each of the above mentioned genes with the nucleotide coordinates of the respective Genbank sequences.
Lo stato di metilazione dell'isola CpG viene analizzato utilizzando tecniche che includono il trattamento chimico del DNA con un reagente capace di trasformare le differenze di metilazione in differenze di sequenza. Preferibilmente, a tale scopo viene utilizzato un reagente chimico capace di trasformare le basi citosina non metilate in uracile od altra base atta ad appaiarsi con una base diversa da guanina. The methylation state of the CpG island is analyzed using techniques that include chemical treatment of the DNA with a reagent capable of transforming methylation differences into sequence differences. Preferably, for this purpose a chemical reagent capable of transforming the non-methylated cytosine bases into uracil or other base capable of pairing with a base other than guanine is used.
Un reagente preferito per questo scopo è il bisolfito, preferibilmente sodio bisolfito, in combinazione con idrochinone. In questa reazione chimica, le citosine non metilate presenti nel DNA vengono infatti deaminate ad uracile che, in termini di appaiamento delle basi, corrisponde alla timidina. Le citosine metilate sono invece resistenti al trattamento chimico e pertanto non subiscono alcuna modificazione. Conseguentemente, le metilcitosine presenti nel DNA originario, che inizialmente non potevano essere distinte dalle citosine poiché presentavano le stesse proprietà di appaiamento, rimangono le uniche citosine presenti nel DNA trattato chimicamente e possono quindi essere identificate utilizzando tecniche standard di biologia molecolare. A preferred reagent for this purpose is bisulfite, preferably sodium bisulfite, in combination with hydroquinone. In this chemical reaction, the unmethylated cytosines present in the DNA are in fact deaminated to uracil which, in terms of base pairing, corresponds to thymidine. On the other hand, methylated cytosines are resistant to chemical treatment and therefore do not undergo any modification. Consequently, the methylcytosins present in the original DNA, which initially could not be distinguished from the cytosines because they had the same pairing properties, remain the only cytosines present in the chemically treated DNA and can therefore be identified using standard molecular biology techniques.
La sequenza di basi del DNA trattato chimicamente può ad esempio essere analizzata mediante sequenziamento diretto. In alternativa possono essere utilizzate tecniche, quale ad esempio la Methylation Specific PCR {MSP), basate sull'amplificazione metilazione-specifica di segmenti dell'isola CpG del DNA campione trattato chimicamente. Tali tecniche utilizzano oligonucleotidi capaci di ibridarsi selettivamente alle sequenze modificate dell'isola CpG metilata o non metilata ottenute mediante il trattamento chimico sopra descritto. The base sequence of chemically treated DNA can for example be analyzed by direct sequencing. Alternatively, techniques such as Methylation Specific PCR (MSP), based on the methylation-specific amplification of CpG island segments of the chemically treated sample DNA, can be used. These techniques use oligonucleotides capable of selectively hybridizing to the modified sequences of the methylated or unmethylated CpG island obtained by the chemical treatment described above.
Trattando chimicamente come descritto sopra un campione di DNA genomico includente l'isola CpG di uno dei geni descritti in tabella 1, si ottengono per ciascun gene due filamenti modificati, ciascuno dei quali è derivato da imo dei due filamenti del DNA genomico trattato, i quali tuttavia non sono più tra loro complementari. By chemically treating as described above a sample of genomic DNA including the CpG island of one of the genes described in table 1, two modified strands are obtained for each gene, each of which is derived from imo of the two strands of the treated genomic DNA, which however they are no longer complementary to each other.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene ARHGAP20 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the ARHGAP20 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene ARHGAP20 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the ARHGAP20 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene CDH11 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the CDH11 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene CDH11 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the CDH11 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FLI1 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the FLI1 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FLI1 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the FLI1 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FOSL2 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the FOSL2 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FOSL2 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the FOSL2 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene HES2 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the HES2 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene HES2 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the HES2 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ XD NO: 37 e SEQ ID NO: 38 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene HTR6 sono metilati. The sequences named SEQ XD NO: 37 and SEQ ID NO: 38 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the HTR6 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene HTR6 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the HTR6 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene LHX3 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 41 and SEQ ID NO: 42 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the LHX3 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene LHX3 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the LHX3 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 46 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene LOC51149 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 45 and SEQ ID NO: 46 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the LOC51149 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene L0C51149 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the L0C51149 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene MAP1B sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 49 and SEQ ID NO: 50 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the MAP1B gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene MAP1B è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 52 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the MAP1B gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene MDM2 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 53 and SEQ ID NO: 54 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the MDM2 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene MDM2 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the MDM2 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 57 e SEQ ID NO: 58 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene NIDI sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 57 and SEQ ID NO: 58 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the NIDI gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene NIDI è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 60 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the NIDI gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene NID2 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 62 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the NID2 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene NID2 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 64 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the NID2 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 66 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene FNUTL2 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 65 and SEQ ID NO: 66 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the FNUTL2 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 68 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PNUTL2 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 68 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the PNUTL2 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 70 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PRPH sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 70 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the PRPH gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PRPH è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the PRPH gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 73 e SEQ ID NO: 74 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PTGER3 sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 73 and SEQ ID NO: 74 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the PTGER3 gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 56 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PTGER3 è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 75 and SEQ ID NO: 56 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the PTGER3 gene is methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 78 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando tutti i dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PTPRM sono metilati. The sequences named SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 78 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when all the dinucleotides of the original CpG island of the PTPRM gene are methylated.
Le sequenze denominate SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80 sono le sequenze nucleotidiche dei due filamenti modificati che si ottengono quando nessuno dei dinucleotidi dell'isola CpG originaria del gene PTPRM è metilato. The sequences named SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 80 are the nucleotide sequences of the two modified strands that are obtained when none of the dinucleotides of the original CpG island of the PTPRM gene is methylated.
Le sequenze SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AP003460, versione 3 (nucleotidi 42661-45840) del gene ARHGAP20. The sequences SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 were determined based on the sequence Genbank AP003460, version 3 (nucleotides 42661-45840) of the ARHGAP20 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC137643, versione 3 (nucleotidi 52081-55500) del gene CDHll. The sequences SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 were determined on the basis of the sequence Genbank AC137643, version 3 (nucleotides 52081-55500) of the CDHll gene.
Le sequenze SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 28 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AP001122, versione 5 (nucleotidi 40001-47460) del gene FLI1. The sequences SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 were determined on the basis of the sequence Genbank AP001122, version 5 (nucleotides 40001-47460) of the FLI1 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC104695, versione 2 (nucleotidi 52801-57000) del gene FOSL2. The sequences SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32 were determined on the basis of the sequence Genbank AC104695, version 2 (nucleotides 52801-57000) of the FOSL2 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 e SEQ ID NO: 36 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL031848, versione 11 (nucleotidi 31741-34020) del gene HES2. The sequences SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 were determined on the basis of the sequence Genbank AL031848, version 11 (nucleotides 31741-34020) of the HES2 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL031727, versione 43 (nucleotidi 92521-95340) del gene HTR6. The sequences SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 40 were determined on the basis of the sequence Genbank AL031727, version 43 (nucleotides 92521-95340) of the HTR6 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 44 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL138781, versione 13 (nucleotidi 111001-116040) del gene LHX3. The sequences SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 and SEQ ID NO: 44 were determined on the basis of the sequence Genbank AL138781, version 13 (nucleotides 111001-116040) of the LHX3 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 e SEQ ID NO: 48 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC008393, versione 7 (nucleotidi 117001-119700) del gene LOC51149. The sequences SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 and SEQ ID NO: 48 were determined on the basis of the sequence Genbank AC008393, version 7 (nucleotides 117001-119700) of the LOC51149 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 e SEQ ID NO: 52 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC093218, versione 2 (nucleotidi 39361-41460) del gene MAP1B. The sequences SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 52 were determined on the basis of the sequence Genbank AC093218, version 2 (nucleotides 39361-41460) of the MAP1B gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 e SEQ ID NO: 56 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC025423 versione 32 (nucleotidi 140401-141660) del gene MDM2. The sequences SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 and SEQ ID NO: 56 were determined on the basis of the sequence Genbank AC025423 version 32 (nucleotides 140401-141660) of the MDM2 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL122018, versione 37 (nucleotidi 36661-38520) del gene NIDI. The sequences SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 60 were determined on the basis of the sequence Genbank AL122018, version 37 (nucleotides 36661-38520) of the NIDI gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL118557, versione 5 (nucleotidi 75001-77340) del gene NID2. The sequences SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 and SEQ ID NO: 64 were determined on the basis of the sequence Genbank AL118557, version 5 (nucleotides 75001-77340) of the NID2 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 68 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC005666, versione 1 (nucleotidi 108541-111200) del gene PNUTL2. The sequences SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 68 were determined on the basis of the sequence Genbank AC005666, version 1 (nucleotides 108541-111200) of the PNUTL2 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AC125611, versione 4 (nucleotidi 149821-152460) del gene PRPH. The sequences SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 and SEQ ID NO: 72 were determined on the basis of the sequence Genbank AC125611, version 4 (nucleotides 149821-152460) of the PRPH gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 e SEQ ID NO: 76 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AL031429, versione 11 (nucleotidi 123001124560) del gene PTGER3. The sequences SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 and SEQ ID NO: 76 were determined on the basis of the sequence Genbank AL031429, version 11 (nucleotides 123001124560) of the PTGER3 gene.
Le sequenze SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80 sono state determinate sulla base della sequenza Genbank AP001091, versione 5 (nucleotidi 64321-66660) del gene PTPRM. The sequences SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 80 were determined on the basis of the sequence Genbank AP001091, version 5 (nucleotides 64321-66660) of the PTPRM gene.
La tabella 1 riassume la corrispondenza tra i diversi geni e le SEQ ID. Table 1 summarizes the correspondence between the different genes and the SEQ IDs.
Oligonucleotidi di almeno 10 nucleotidi di lunghezza complementari o identici ad un segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 e SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80 costituiscono un utile strumento per l'analisi dello stato di metilazione delle isole CpG dei geni elencati in tabella 1 in un campione di DNA genomico, poiché la loro ibridazione dipende dallo stato di metilazione dell'isola CpG originaria del campione. Tali oligonucleotidi rientrano nell'ambito della presente invenzione. Preferibilmente, gli oligonucleotidi dell'invenzione sono complementari o identici a un segmento di una sequenza bersaglio come definita sopra comprendente almeno un dinucleotide CpG. Oligonucleotides of at least 10 nucleotides of length complementary or identical to a segment of a target sequence chosen from the group consisting of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 , SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 , SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO : 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 80 are a useful tool for the analysis of the methylation status of the CpG islands of the genes listed in table 1 in a sample of genomic DNA, since their hybridization depends on the methylation status of the original CpG island of the sample. Such oligonucleotides fall within the scope of the present invention. Preferably, the oligonucleotides of the invention are complementary or identical to a segment of a target sequence as defined above comprising at least one CpG dinucleotide.
Nel procedimento diagnostico dell'invenzione, gli oligonucleotidi sopra definiti possono essere utilizzati come primers di amplificazione o come sonde di ibridazione. Nel secondo caso, essi hanno preferibilmente una lunghezza di almeno 18 nucleotidi. In the diagnostic method of the invention, the oligonucleotides defined above can be used as amplification primers or as hybridization probes. In the second case, they preferably have a length of at least 18 nucleotides.
A titolo di esempio, la tabella 2a riporta primers oligonucleotidici specifici basati su alcune delle sequenze bersaglio sopra elencate, utili nel procedimento diagnostico dell'invenzione. By way of example, Table 2a reports specific oligonucleotide primers based on some of the target sequences listed above, useful in the diagnostic process of the invention.
Le caratteristiche del prodotto amplificato con i primers della tabella 2a sono riportate in tabella 2b. The characteristics of the product amplified with the primers of table 2a are shown in table 2b.
Il procedimento diagnostico dell'invenzione può ad esempio essere un procedimento di rivelazione basato sull’amplificazione del DNA, eventualmente seguito da rivelazione dei frammenti di DNA amplificati tramite ima sonda di ibridazione. In tale procedimento un campione di DNA genomico da esaminare viene pre-trattato chimicamente con un reagente atto a convertire le basi citosina non metilate in uracile od altra base atta ad appaiarsi con una base diversa da guanina. Il campione di DNA genomico da analizzare è preferibilmente ottenuto da una fonte quale sangue, siero, plasma, lavaggio bronchiale, espettorato, saliva, lavaggio intestinale, urina, feci, eiaculato, tamponi di varia origine, ago aspirati, biopsie linfonodali, o loro combinazioni. Il suddetto pretrattamento chimico del DNA genomico viene effettuato preferibilmente con sodio bisolfito e idrochinone. A seguito del pretrattamento chimico, dal DNA genomico originario a doppio filamento si ottengono due filamenti modificati che tuttavia non sono più tra loro campiementari. The diagnostic procedure of the invention can for example be a detection procedure based on the amplification of the DNA, possibly followed by the detection of the amplified DNA fragments by means of a hybridization probe. In this process, a sample of genomic DNA to be examined is chemically pre-treated with a reagent suitable for converting the non-methylated cytosine bases into uracil or other base suitable for pairing with a base other than guanine. The genomic DNA sample to be analyzed is preferably obtained from a source such as blood, serum, plasma, bronchial lavage, sputum, saliva, intestinal lavage, urine, faeces, ejaculate, swabs of various origins, needle aspirations, lymph node biopsies, or combinations thereof . The aforementioned chemical pretreatment of the genomic DNA is preferably carried out with sodium bisulfite and hydroquinone. Following the chemical pretreatment, two modified strands are obtained from the original double-stranded genomic DNA which, however, are no longer samples.
Dopo la fase di pretrattamento chimico, uno qualsiasi dei filamenti modificati ottenuti dal pretrattamento del DNA genomico può essere sottoposto a una reazione di amplificazione degli acidi nucleici, utilizzando come primers di amplificazione una coppia di oligonucleotidi di almeno 10 nucleotidi di lunghezza, in cui uno di detti o ligonucleotidi è complementare a un primo segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 78 e l'altro di detti oligonucleotidi è identico a un secondo segmento di detta sequenza bersaglio, il secondo segmento essendo localizzato a valle del primo segmento. After the chemical pretreatment step, any of the modified strands obtained from the pretreatment of genomic DNA can be subjected to a nucleic acid amplification reaction, using as amplification primers a pair of oligonucleotides of at least 10 nucleotides in length, in which one of said or ligonucleotides is complementary to a first segment of a target sequence chosen from the group consisting of SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 , SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 77 and SEQ ID NO: 78 and the other of said oligonucleotides is identical to a second segment of said target sequence, the second segment being located downstream of the first segment.
Secondo una forma di attuazione, almeno uno di detti primo e secondo segmento della sequenza bersaglio comprende almeno un dinucleotide CpG. In tal caso, la reazione di amplificazione è metilazione-specifica, nel senso che la coppia di primers oligonucleotidici utilizzata è disegnata per amplificare specificamente un filamento modificato derivante dalla sequenza dell'isola CpG originaria metilata. In questa forma di attuazione, la rivelazione dei frammenti di DNA amplificati, se presenti, può essere effettuata con qualsiasi procedimento di per sé noto, ad esempio mediante elettroforesi su gel di agarosio e colorazione con un agente intercalante del DNA, quale ad esempio bromuro di etidio. According to an embodiment, at least one of said first and second segments of the target sequence comprises at least one CpG dinucleotide. In this case, the amplification reaction is methylation-specific, meaning that the pair of oligonucleotide primers used are designed to specifically amplify a modified strand resulting from the original methylated CpG island sequence. In this embodiment, the detection of the amplified DNA fragments, if present, can be carried out by any procedure known per se, for example by electrophoresis on agarose gel and staining with a DNA intercalating agent, such as bromide of ethidium.
Secondo un'altra forma di attuazione, né il primo né il secondo segmento della sequenza bersaglio comprende un dinucleotide CpG. In tal caso la reazione di amplificazione non è metilazione-specifica. Conseguentemente, la rivelazione dei frammenti amplificati, se presenti, verrà effettuata mediante ibridazione con una sonda oligonucleotidìca di almeno 18 nucleotidi di lunghezza complementare a un terzo segmento della sequenza bersaglio, detto terzo segmento essendo situato tra i suddetti primo e secondo segmento e comprendendo almeno un dinucleotide CpG. Il terzo segmento della sequenza bersaglio può eventualmente essere parzialmente sovrapposto al primo o al secondo segmento. According to another embodiment, neither the first nor the second segment of the target sequence comprises a CpG dinucleotide. In this case the amplification reaction is not methylation-specific. Consequently, the detection of the amplified fragments, if present, will be carried out by hybridization with an oligonucleotide probe of at least 18 nucleotides of length complementary to a third segment of the target sequence, said third segment being located between the aforementioned first and second segments and comprising at least one dinucleotide CpG. The third segment of the target sequence can optionally be partially superimposed on the first or second segment.
In entrambe le forme di attuazione sopra descritte, la reazione di amplificazione è preferibilmente una reazione a catena della polimerasi (PCR). Ancora più preferibilmente, è ima reazione di amplificazione in due fasi che comprende una PCR primaria seguita da una PCR secondaria semi nested o nested. In both embodiments described above, the amplification reaction is preferably a polymerase chain reaction (PCR). Even more preferably, it is a two-step amplification reaction comprising a primary PCR followed by a semi-nested or nested secondary PCR.
Poiché il DNA modificato che costituisce il bersaglio della reazione di amplificazione è inizialmente a singolo filamento, nel primo ciclo di PCR al filamento bersaglio si ibriderà inizialmente uno solo dei due primers. Il primo primer ibridato verrà esteso da una polimerasi utilizzando come stampo il filamento bersaglio. Successivamente, il secondo primer si ibriderà alla catena neosintetizzata e verrà esteso dalla polimerasi utilizzando come stampo la catena neosintetizzata. In tal modo, il DNA.bersaglio iniziale a singolo filamento verrà trasformato in DNA a doppio filamento. Invece, nei successivi cicli della reazione PCR i due primers di amplificazione si ibrideranno simultaneamente ciascuno ad un filamento del DNA bersaglio a doppio filamento. Since the modified DNA that constitutes the target of the amplification reaction is initially single-stranded, only one of the two primers will initially hybridize to the target strand in the first PCR cycle. The first hybridized primer will be extended by a polymerase using the target strand as a template. Subsequently, the second primer will hybridize to the newly synthesized chain and will be extended by the polymerase using the newly synthesized chain as a template. In doing so, the initial single-stranded DNA will be transformed into double-stranded DNA. Instead, in the subsequent rounds of the PCR reaction the two amplification primers will each hybridize simultaneously to one strand of the double-stranded target DNA.
In tabella 2a sono riportati alcuni esempi specifici di oligonucleotidi adatti come primers o sonde nel procedimento diagnostico dell'invenzione. Table 2a shows some specific examples of oligonucleotides suitable as primers or probes in the diagnostic process of the invention.
Gli oligonucleotidi ARHGAP20_MF (SEQ ID NO: 81) e AR-HGAP20_MR (SEQ ID NO: 82) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 18. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi ARHGAP20_MF e ARHGAP20_MR anplifica una sequenza di 153 bp compresa tra il nucleotide 1777 ed il nucleotide 1930 di SEQ ID NO: 18. The ARHGAP20_MF (SEQ ID NO: 81) and AR-HGAP20_MR (SEQ ID NO: 82) oligonucleotides were designed to specifically hybridize in SEQ ID NO: 18. When used as primers in a PCR amplification, the ARHGAP20_MF and ARHGAP20_MR oligonucleotides pair amplifies a 153 bp sequence between nucleotide 1777 and nucleotide 1930 of SEQ ID NO: 18.
Gli oligonucleotidi CDH11_MF (SEQ ID NO: 83) e CDH11_MR (SEQ ID NO: 84) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 21. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi CDH11_MF e CDH11_MR anplifica una sequenza di 246 bp compresa tra il nucleotide 2098 e il nucleotide 2343 di SEQ 1D NO: 21. The CDH11_MF (SEQ ID NO: 83) and CDH11_MR (SEQ ID NO: 84) oligonucleotides were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 21. When used as primers in a PCR amplification, the CDH11_MF and CDH11_MR oligonucleotide pair amplify a sequence of 246 bp between nucleotide 2098 and nucleotide 2343 of SEQ 1D NO: 21.
Gli oligonucleotidi FLI1_MF {SEQ ID NO: 85) e FLI1_MR {SEQ ID NO: 86) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 25. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi FLI1_MF e FLI1_MR amplifica una sequenza di 199 bp compresa tra il nucleotide 5744 ed il nucleotide 5909 di SEQ ID NO: 25. The oligonucleotides FLI1_MF {SEQ ID NO: 85) and FLI1_MR {SEQ ID NO: 86) were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 25. When used as primers in a PCR amplification, the pair of FLI1_MF and FLI1_MR oligonucleotides amplify a 199 bp sequence between nucleotide 5744 and nucleotide 5909 of SEQ ID NO: 25.
Gli oligonucleotidi FOSL2_MF (SEQ ID NO: 87) e FOSL2_MR {SEQ ID NO: 88) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 29. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi FOSL2_MF e FOSL2_MR amplifica una sequenza di 264 bp compresa tra il nucleotide 2496 e il nucleotide 2760 di SEQ ID NO: 29. The oligonucleotides FOSL2_MF (SEQ ID NO: 87) and FOSL2_MR {SEQ ID NO: 88) were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 29. When used as primers in a PCR amplification, the pair of oligonucleotides FOSL2_MF and FOSL2_MR amplify a 264 bp sequence between nucleotide 2496 and nucleotide 2760 of SEQ ID NO: 29.
Gli oligonucleotidi HES2_MF (SEQ ID NO: 89) e HES2_MR (SEQ ID NO: 90) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 33. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi HES2_MF e HES2_MR amplifica una sequenza di 205 bp compresa tra il nucleotide 972 e il nucleotide 1177 di SEQ ID NO: 33. The HES2_MF (SEQ ID NO: 89) and HES2_MR (SEQ ID NO: 90) oligonucleotides were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 33. When used as primers in a PCR amplification, the pair of HES2_MF and HES2_MR oligonucleotides amplify a 205 bp sequence between nucleotide 972 and nucleotide 1177 of SEQ ID NO: 33.
Gli oligonucleotidi HTR6_MF (SEQ ID NO: 91) e HTR6_MR (SEQ ID NO: 92) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 37. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi HTR6_MF e HTR6_MR amplifica una sequenza di 134 bp conpresa tra il nucleotide 719 e il nucleotide 853 di SEQ ID NO: 37. The HTR6_MF (SEQ ID NO: 91) and HTR6_MR (SEQ ID NO: 92) oligonucleotides were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 37. When used as primers in a PCR amplification, the pair of HTR6_MF and HTR6_MR oligonucleotides amplify a 134 bp sequence between nucleotide 719 and nucleotide 853 of SEQ ID NO: 37.
Gli oligonucleotidi LHX3_MF (SEQ ID NO: 93) e LHX3_MR (SEQ ID NO: 94) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 42. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi LHX3_MF e LHX3_MR amplifica una sequenza di 164 bp conpresa tra il nucleotide 2814 e il nucleotide 2978 di SEQ ID NO: 42. The LHX3_MF (SEQ ID NO: 93) and LHX3_MR (SEQ ID NO: 94) oligonucleotides were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 42. When used as primers in a PCR amplification, the LHX3_MF and LHX3_MR oligonucleotide pair amplify a 164 bp sequence between nucleotide 2814 and nucleotide 2978 of SEQ ID NO: 42.
Gli oligonucleotidi LOC51149_MF (SEQ ID NO: 95) e LOC51149_MR (SEQ ID NO: 96) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 46. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi L0C51149_MF e LOC51l49_MR amplifica una sequenza di 176 bp compresa tra il nucleotide 1284 e il nucleotide 1460 di SEQ ID NO: 46. The LOC51149_MF (SEQ ID NO: 95) and LOC51149_MR (SEQ ID NO: 96) oligonucleotides were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 46. When used as primers in a PCR amplification, the L0C51149_MF and LOC51l49_MR oligonucleotide pair amplify a 176 bp sequence between nucleotide 1284 and nucleotide 1460 of SEQ ID NO: 46.
Gli oligonucleotidi MAP1B_MF (SEQ ID NO: 97) e MAP1B_MR (SEQ ID NO: 98) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 49. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi MAP1B_MF e MAP1B_MR amplifica una sequenza di 216 bp compresa tra il nucleotide 315 e il nucleotide 531 di SEQ ID NO: 49. The MAP1B_MF (SEQ ID NO: 97) and MAP1B_MR (SEQ ID NO: 98) oligonucleotides were designed to specifically hybridize in SEQ ID NO: 49. When used as primers in a PCR amplification, the MAP1B_MF and MAP1B_MR oligonucleotide pair amplify a 216 bp sequence between nucleotide 315 and nucleotide 531 of SEQ ID NO: 49.
Gli oligonucleotidi MDM2_MF {SEQ ID NO: 99) e MDM2_MR (SEQ ID NO: 100) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 54. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi MDM2_MF e MDM2_MR amplifica una sequenza di 328 bp compresa tra il nucleotide 578 e il nucleotide 906 di SEQ ID NO: 54. The MDM2_MF {SEQ ID NO: 99) and MDM2_MR (SEQ ID NO: 100) oligonucleotides were designed to specifically hybridize in SEQ ID NO: 54. When used as primers in a PCR amplification, the pair of MDM2_MF and MDM2_MR oligonucleotides amplify a 328 bp sequence between nucleotide 578 and nucleotide 906 of SEQ ID NO: 54.
Gli oligonucleotidi NID1_MF (SEQ ID NO: 101) e NID1_MR (SEQ ID NO: 102) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 57. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi NID1_MF e NID1_MR amplifica una sequenza di 144 bp compresa tra il nucleotide 1228 e il nucleotide 1371 di SEQ ID NO: 57. The oligonucleotides NID1_MF (SEQ ID NO: 101) and NID1_MR (SEQ ID NO: 102) were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 57. When used as primers in a PCR amplification, the pair of oligonucleotides NID1_MF and NID1_MR amplify a 144 bp sequence between nucleotide 1228 and nucleotide 1371 of SEQ ID NO: 57.
Gli oligonucleotidi NID2_MF (SEQ ID NO: 103) e NID2_MR (SEQ ID NO: 104) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 61 Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi NID2_MF e NID2_MR amplifica una sequenza di 140 bp compresa tra il nucleotide 1237 e il nucleotide 1377 di SEQ ID NO: 61. Oligonucleotides NID2_MF (SEQ ID NO: 103) and NID2_MR (SEQ ID NO: 104) were designed to specifically hybridize in SEQ ID NO: 61 When used as primers in a PCR amplification, the pair of NID2_MF and NID2_MR oligonucleotides amplify a sequence of 140 bp between nucleotide 1237 and nucleotide 1377 of SEQ ID NO: 61.
Gli oligonucleotidi PNUTL2_MF (SEQ ID NO: 105) e PNUTL2_MR (SEQ ID NO: 106) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 66. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi PNUTL2_MF e PNUTL2_MR amplifica una sequenza di 216 bp compresa tra il nucleotide 826 e il nucleotide 1042 di SEQ ID NO: 66. The PNUTL2_MF (SEQ ID NO: 105) and PNUTL2_MR (SEQ ID NO: 106) oligonucleotides were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 66. When used as primers in a PCR amplification, the pair of PNUTL2_MF and PNUTL2_MR oligonucleotides amplify a 216 bp sequence between nucleotide 826 and nucleotide 1042 of SEQ ID NO: 66.
Gli oligonucleotidi PRPH_MF (SEQ ID NO: 107) e PRPHMR (SEQ ID NO: 108) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 70. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi PRPH_MF e PRPH_MR amplifica una sequenza di 198 bp compresa tra il nucleotide 100 e il nucleotide 297 di SEQ ID NO: 70. The PRPH_MF (SEQ ID NO: 107) and PRPHMR (SEQ ID NO: 108) oligonucleotides were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 70. When used as primers in a PCR amplification, the pair of PRPH_MF and PRPH_MR oligonucleotides amplify a 198 bp sequence between nucleotide 100 and nucleotide 297 of SEQ ID NO: 70.
Gli oligonucleotidi PTGER3_MF (SEQ ID NO: 109) e PTGER3_MR (SEQ ID NO: 110) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 74. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi PTGER3_MF e PTGER3_MR amplifica una sequenza di 191 bp compresa tra il nucleotide 388 e il nucleotide 579 di SEQ ID NO: 74. The PTGER3_MF (SEQ ID NO: 109) and PTGER3_MR (SEQ ID NO: 110) oligonucleotides were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 74. When used as primers in a PCR amplification, the pair of PTGER3_MF and PTGER3_MR oligonucleotides amplify a 191 bp sequence between nucleotide 388 and nucleotide 579 of SEQ ID NO: 74.
Gli oligonucleotidi PTPRM_MF (SEQ ID NO: 111) e PTPRM_MR (SEQ ID NO: 112) sono stati disegnati per ibridarsi specificamente in SEQ ID NO: 77. Quando utilizzati come primers in una amplificazione PCR, la coppia di oligonucleotidi PTPRMMF e PTPRMMR amplifica una sequenza di 245 bp compresa tra il nucleotide 741 e il nucleotide 986 di SEQ ID NO: 77. The oligonucleotides PTPRM_MF (SEQ ID NO: 111) and PTPRM_MR (SEQ ID NO: 112) were designed to hybridize specifically in SEQ ID NO: 77. When used as primers in a PCR amplification, the oligonucleotide pair PTPRMMF and PTPRMMR amplify a 245 bp sequence between nucleotide 741 and nucleotide 986 of SEQ ID NO: 77.
Nell'ambito della presente invenzione rientra inoltre un kit per 1'esecuzione del procedimento diagnostico del1'invenzione, che può essere composto, ad esempio, da una coppia di primers di amplificazione come definiti in precedenza eventualmente in combinazione con un reagente atto a convertire le basi citosina non metilate in uracile od altra base atta ad appaiarsi con una base diversa da guanina, ad esempio sodio bisolfito in combinazione con idrochinone. Il kit può inoltre comprendere mezzi di rivelazione del DNA, come ad esempio una sonda di ibridazione metilazione-specifica come definita in precedenza, e/o mezzi di amplificazione del DNA, ad esempio un enzima polimerasi. in alternativa alla sonda di ibridazione, il kit può comprendere un reagente di rivelazione del DNA quale un agente intercalante del DNA, per esempio bromuro di etidio. The scope of the present invention also includes a kit for carrying out the diagnostic procedure of the invention, which can be composed, for example, of a pair of amplification primers as defined above, possibly in combination with a reagent suitable for converting the unmethylated cytosine bases in uracil or other base capable of pairing with a base other than guanine, for example sodium bisulfite in combination with hydroquinone. The kit may further comprise DNA detection means, such as for example a methylation-specific hybridization probe as defined above, and / or DNA amplification means, for example a polymerase enzyme. as an alternative to the hybridization probe, the kit may comprise a DNA detection reagent such as a DNA intercalating agent, for example ethidium bromide.
Il kit dell'invenzione può anche comprendere una seconda coppia di primers di amplificazione di almeno 10 nucleotidi di lunghezza, uno di detti oligonucleotidi essendo complementare a un primo segmento di una sequenza bersaglio scelta dal gruppo che consiste di SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80 e l'altro oligonucleotide essendo identico a un secondo segmento di detta sequenza bersaglio, il secondo segmento essendo localizzato a valle del primo segmento. Preferibilmente, almeno uno di tali primo e secondo segmento della sequenza bersaglio comprende almeno un dinucleotide TpG. La seconda coppia di primers è utilizzata come controllo dell'avvenuta modifica del DNA a seguito del trattamento con bisolfito, permettendo la convalida di un risultato negativo dell'amplificazione con primers disegnati sulla base delle sequenze nucleotidiche modificate derivate dall'isola CpG metilata. The kit of the invention can also comprise a second pair of amplification primers of at least 10 nucleotides in length, one of said oligonucleotides being complementary to a first segment of a target sequence chosen from the group consisting of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60 SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO : 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 80 and the other oligonucleotide being identical to a second segment of said target sequence, the second segment being located downstream of the first segment. Preferably, at least one of such first and second segments of the target sequence comprises at least one TpG dinucleotide. The second pair of primers is used as a check of the DNA modification following the bisulfite treatment, allowing the validation of a negative amplification result with primers designed on the basis of the modified nucleotide sequences derived from the methylated CpG island.
Sezione sperimentale (esempi) Experimental section (examples)
E' stato analizzato lo stato di metilazione delle isole CpG dei geni indicati in tabella 1 in campioni tumorali e normali umani, utilizzando i primers e le condizioni di reazione indicate in tabella 2. I risultati ottenuti sono riassunti sotto in tabella 3. The methylation status of the CpG islands of the genes indicated in table 1 in tumor and normal human samples was analyzed, using the primers and reaction conditions indicated in table 2. The results obtained are summarized below in table 3.
Dall'analisi effettuata su campioni tumorali e normali si evincono le percentuali di metilazione per ciascun gene nei diversi tessuti analizzati. I tessuti analizzati derivano da colon, stomaco, fegato e mammella. Questo risultato indica che le isole CpG elencate in tabella 1 sono frequentemente metilate in almeno uno dei tessuti tumorali analizzati. Questi tumori sono da considerarsi un esempio indicativo della alta frequenza con cui questi geni sono metilati in malattie neoplastiche non limitatamente agli esempi descritti in tabella 3. From the analysis carried out on tumor and normal samples, the percentages of methylation for each gene in the various tissues analyzed are deduced. The tissues analyzed come from the colon, stomach, liver and breast. This result indicates that the CpG islands listed in Table 1 are frequently methylated in at least one of the tumor tissues analyzed. These tumors are to be considered an indicative example of the high frequency with which these genes are methylated in neoplastic diseases not limited to the examples described in table 3.
Le sequenze nucleotidiche a cui si fa riferimento nella presente descrizione sono illustrate nell'annessa lista delle sequenze, in cui: The nucleotide sequences referred to in this description are illustrated in the attached list of sequences, in which:
SEQ ID NO. 1 è la CpG island di ARHGAP20, corrispondente al segmento di 3.180 nt compreso tra i nt 45840-42661 della versione 3 della sequenza Genbank AP003460; SEQ ID NO. 2 è la CpG Island del gene CDH11, corrispondente al segmento di 3.420 nt compreso tra i nt 52021-55500 della versione 3 della sequenza Genbank AC137643; SEQ ID NO: 3 è la CpG Island di FLI1 corrispondente al segmento di 7.460 nt compreso tra i nt 40001-47460 della versione 5 della sequenza Genbank AP001122; SEQ ID NO: 4 è la CpG Island di FOSL2 corrispondente al segmento di 4.200 nt compreso tra i nt 52801-57000 della versione 2 della sequenza Genbank AC104695; SEQ ID NO: 5 è la CpG Island di HES2 corrispondente al segmento di 2.280 nt compreso tra i nt 31741-34020 della versione 11 della sequenza Genbank AL031848; SEQ ID NO: 6 è la CpG Island di HTR6 corrispondente al segmento di 2.820 nt compreso tra i nt 92521-95340 della versione 43 della sequenza Genbank AL031727; SEQ ID NO: 7 è la CpG Island di LHX3 corrispondente al segmento di 5.040 nt compreso tra i nt 111001-116040 della versione 13 della sequenza Genbank AL138781; SEQ ID NO: 8 è la CpG Island di LOC51149 corrispondente al segmento di 2.700 nt conpreso tra i nt 117001-119700 della versione 7 della sequenza Genbank AC008393; SEQ ID NO: 9 è la CpG I-sland di MAP1B corrispondente al segmento di 2.100 nt compreso tra i nt 39361-41460 della versione 2 della sequenza Genbank AC093218; SEQ ID NO: 10 è la CpG Island di MDM2 corrispondente al segmento di 1.260 nt compreso tra i nt 140401-141660 della versione 32 della sequenza Genbank AC025423; SEQ ID NO. 11 è la CpG island del gene NIDI, corrispondente al segmento di 1.860 nt compreso tra i nt 36661-38520 della sequenza Genbank AL122018, versione 37; SEQ ID NO. 12 è la CpG island del gene NID2, corrispondente al segmento di 2.340 nt compreso tra i nt 75001-77340 di Genbank AL118557, versione 5; SEQ ID NO. 13 è la CpG island del gene FNUTL2, corrispondente al segmento di 2.660 nt compreso tra i nt 108541-111200 di Genbank AC005666, versione 1; SEQ ID NO. 14 è la CpG island del gene PRPH, corrispondente al segmento di 2.640 nt compreso tra i nt 149821-152460 di Genbank AC125611, versione 4; SEQ ID NO. 15 è la CpG island del gene PTGER3, corrispondente al segmento di 1.560 nt compreso tra i nt 123001-124560 di Genbank AL031429, versione 11; SEQ ID NO. 16 è la CpG island del gene PTPRM, corrispondente al segmento di 2.340 nt compreso tra i nt 64321-66660 di Genbank AP001091, versione 5; SEQ ID NO. 17 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene ARHGAP20 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 18 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene ARHGAP20 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 19 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene AR-HGAP20 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. SEQ ID NO. 1 is the CpG island of ARHGAP20, corresponding to the segment of 3,180 nt between nt 45840-42661 of version 3 of the Genbank AP003460 sequence; SEQ ID NO. 2 is the CpG Island of the CDH11 gene, corresponding to the 3,420 nt segment between nt 52021-55500 of version 3 of the Genbank AC137643 sequence; SEQ ID NO: 3 is the CpG Island of FLI1 corresponding to the segment of 7.460 nt between 40001-47460 nt of version 5 of the Genbank AP001122 sequence; SEQ ID NO: 4 is the CpG Island of FOSL2 corresponding to the segment of 4,200 nt between nt 52801-57000 of version 2 of the Genbank AC104695 sequence; SEQ ID NO: 5 is the CpG Island of HES2 corresponding to the segment of 2.280 nt between nt 31741-34020 of version 11 of the Genbank AL031848 sequence; SEQ ID NO: 6 is the CpG Island of HTR6 corresponding to the 2.820 nt segment between 92521-95340 nt of version 43 of the Genbank AL031727 sequence; SEQ ID NO: 7 is the CpG Island of LHX3 corresponding to the segment of 5.040 nt between 111001-116040 nt of version 13 of the Genbank AL138781 sequence; SEQ ID NO: 8 is the CpG Island of LOC51149 corresponding to the segment of 2,700 nt included between nt 117001-119700 of version 7 of the Genbank AC008393 sequence; SEQ ID NO: 9 is the CpG I-sland of MAP1B corresponding to the segment of 2,100 nt between nt 39361-41460 of version 2 of the Genbank AC093218 sequence; SEQ ID NO: 10 is the CpG Island of MDM2 corresponding to the segment of 1.260 nt between nt 140401-141660 of version 32 of the Genbank AC025423 sequence; SEQ ID NO. 11 is the CpG island of the NIDI gene, corresponding to the 1,860 nt segment between nt 36661-38520 of the Genbank AL122018 sequence, version 37; SEQ ID NO. 12 is the CpG island of the NID2 gene, corresponding to the 2,340 nt segment between nt 75001-77340 of Genbank AL118557, version 5; SEQ ID NO. 13 is the CpG island of the FNUTL2 gene, corresponding to the segment of 2.660 nt between nt 108541-111200 of Genbank AC005666, version 1; SEQ ID NO. 14 is the CpG island of the PRPH gene, corresponding to the segment of 2.640 nt between nt 149821-152460 of Genbank AC125611, version 4; SEQ ID NO. 15 is the CpG island of the PTGER3 gene, corresponding to the 1,560 nt segment between nt 123001-124560 of Genbank AL031429, version 11; SEQ ID NO. 16 is the CpG island of the PTPRM gene, corresponding to the 2,340 nt segment between nt 64321-66660 of Genbank AP001091, version 5; SEQ ID NO. 17 is the sequence derived from the methylated sequence of the ARHGAP20 gene (top strand), derived from SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 18 is the sequence derived from the methylated sequence of the ARHGAP20 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 19 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the AR-HGAP20 gene (top strand), derived from SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO.
20 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene ARHGAP20 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 21 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene CDH11 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 20 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the ARHGAP20 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 21 is the sequence derived from the methylated sequence of the CDH11 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.
2; SEQ ID NO. 22 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene CDH11 (bottom strand) , derivata da SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 23 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene CDH11 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 24 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene CDH11 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 25 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene FLI1 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 3; SEQ 1D NO. 26 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene FLI1 (bottorristrand), derivata da SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 27 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene FLI1 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 28 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene FLI1 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO: 29 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene F0SL2 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 30 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene FOSL2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 31 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene FOSL2 (top strand), derivata da SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 32 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene FOSL2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 33 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene HES2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 34 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene HES2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 35 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene HES2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 36 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene HES2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 37 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene HTR6 (top strand), derivata da SEQ ID NO.6; SEQ ID NO: 38 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene HTR6 (bottonistrand), derivata da SEQ ID NO.6; SEQ ID NO: 39 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene HTR6 (top strand), derivata da SEQ ID NO.6; SEQ ID NO: 40 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene HTR6 (bottom strand), SEQ ID NO: 41 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene LHX3 (top strand), derivata da SEQ ID NO.7; SEQ ID NO: 42 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene LHX3 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.7; SEQ ID NO: 43 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene LHX3 (top strand), derivata da SEQ ID NO.7; SEQ ID NO: 44 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene LHX3 (bottom strand), SEQ ID NO: 45 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene LOC51149 (top strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 46 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene LOC51149 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 47 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene LOC51149 (top strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 48 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene LOC51149 (bottom strand), SEQ ID NO: 49 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene MAP1B (top strand), derivata da SEQ ID NO.9; SEQ ID NO: 50 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene MAP1B {bottoni strand), derivata da SEQ ID NO.9; SEQ ID NO: 51 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene MAP1B (top strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 52 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene MAP1B {bottom strand), derivata da SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 53 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene MDM2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 54 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene MDM2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 55 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene MDM2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 56 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene MDM2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 57 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene NIDI (top strand), derivata da SEQ ID NO.11; SEQ ID NO: 58 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene NIDI (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.11; SEQ ID NO: 59 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene NIDI (top strand), derivata da SEQ ID NO.il; SEQ ID NO: 60 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene NIDI (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.11; SEQ ID NO: 61 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene NID2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 62 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene NID2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 63 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene NXD2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 64 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene NID2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 65 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PNUTL2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 66 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene FNUTL2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 67 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PNUTL2 (top strand), derivata da SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 68 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PNUTL2 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 69 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PRPH (top strand), derivata da SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 70 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PRPH (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 71 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PRPH (top strand), derivata da SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 72 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PRPH (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 73 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PTGER3 (top strand), derivata da SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 74 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PTGER3 (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 75 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PTGER3 (top strand), derivata da SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 76 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PTGER3 (bottonistrand), derivata da SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 77 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PTPRM (top strand), derivata da SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 78 è la sequenza derivata dalla sequenza metilata del gene PTPRM (bottom strand), derivata da SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 79 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PTPRM (top strand), derivata da SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 80 è la sequenza derivata dalla sequenza non metilata del gene PTPRM (bottoni strand), derivata da SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 81 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 82 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:18; SEQ ID NO: 83 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 84 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:21; SEQ ID NO: 85 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:25; SEQ ID NO: 86 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:25; SEQ ID NO: 87 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:29; SEQ ID NO: 88 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:29; SEQ ID NO: 89 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:33; SEQ ID NO: 90 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:33; SEQ ID NO: 91 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:37; SEQ ID NO: 92 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:37; SEQ ID NO: 93 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:42; SEQ ID NO: 94 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:42; SEQ ID NO: 95 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:46; SEQ ID NO: 96 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:46; SEQ ID NO: 97 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:49; SEQ ID NO: 98 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:49; SEQ ID NO: 99 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:54; SEQ ID NO: 100 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:54; SEQ ID NO: 101 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:57; SEQ ID NO: 102 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:57; SEQ ID NO: 103 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:61; SEQ ID NO: 104 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:61; SEQ ID NO: 105 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:66; SEQ ID NO: 106 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:66; SEQ ID NO: 107 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:70; SEQ ID NO: 108 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:70; SEQ ID NO: 109 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:74; SEQ ID NO: 110 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:74; SEQ ID NO: 111 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su SEQ ID NO:77; SEQ ID NO: 112 è la sequenza oligonucleotidica per Methylation-Specific PCR (MSP) disegnata su complementare invertita di SEQ ID NO:77. 2; SEQ ID NO. 22 is the sequence derived from the methylated sequence of the CDH11 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 23 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the CDH11 gene (top strand), derived from SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 24 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the CDH11 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 25 is the sequence derived from the methylated sequence of the FLI1 gene (top strand), derived from SEQ ID NO. 3; SEQ 1D NO. 26 is the sequence derived from the methylated sequence of the FLI1 gene (bottorristrand), derived from SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 27 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the FLI1 gene (top strand), derived from SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 28 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the FLI1 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO: 29 is the sequence derived from the methylated sequence of the F0SL2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 30 is the sequence derived from the methylated sequence of the FOSL2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 31 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the FOSL2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 32 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the FOSL2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO: 33 is the sequence derived from the methylated sequence of the HES2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 34 is the sequence derived from the methylated sequence of the HES2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 35 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the HES2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 36 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the HES2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.5; SEQ ID NO: 37 is the sequence derived from the methylated sequence of the HTR6 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.6; SEQ ID NO: 38 is the sequence derived from the methylated sequence of the HTR6 gene (bottonistrand), derived from SEQ ID NO.6; SEQ ID NO: 39 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the HTR6 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.6; SEQ ID NO: 40 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the HTR6 gene (bottom strand), SEQ ID NO: 41 is the sequence derived from the methylated sequence of the LHX3 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.7; SEQ ID NO: 42 is the sequence derived from the methylated sequence of the LHX3 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.7; SEQ ID NO: 43 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the LHX3 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.7; SEQ ID NO: 44 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the LHX3 gene (bottom strand), SEQ ID NO: 45 is the sequence derived from the methylated sequence of the LOC51149 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 46 is the sequence derived from the methylated sequence of the LOC51149 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 47 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the LOC51149 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 48 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the LOC51149 gene (bottom strand), SEQ ID NO: 49 is the sequence derived from the methylated sequence of the MAP1B gene (top strand), derived from SEQ ID NO.9; SEQ ID NO: 50 is the sequence derived from the methylated sequence of the MAP1B gene (button strand), derived from SEQ ID NO.9; SEQ ID NO: 51 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the MAP1B gene (top strand), derived from SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 52 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the MAP1B (bottom strand) gene, derived from SEQ ID NO.8; SEQ ID NO: 53 is the sequence derived from the methylated sequence of the MDM2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 54 is the sequence derived from the methylated sequence of the MDM2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 55 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the MDM2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 56 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the MDM2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.10; SEQ ID NO: 57 is the sequence derived from the methylated sequence of the NIDI gene (top strand), derived from SEQ ID NO.11; SEQ ID NO: 58 is the sequence derived from the methylated sequence of the NIDI gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.11; SEQ ID NO: 59 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the NIDI gene (top strand), derived from SEQ ID NO.il; SEQ ID NO: 60 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the NIDI gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.11; SEQ ID NO: 61 is the sequence derived from the methylated sequence of the NID2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 62 is the sequence derived from the methylated sequence of the NID2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 63 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the NXD2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 64 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the NID2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.12; SEQ ID NO: 65 is the sequence derived from the methylated sequence of the PNUTL2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 66 is the sequence derived from the methylated sequence of the FNUTL2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 67 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the PNUTL2 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 68 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the PNUTL2 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.13; SEQ ID NO: 69 is the sequence derived from the methylated sequence of the PRPH gene (top strand), derived from SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 70 is the sequence derived from the methylated sequence of the PRPH gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 71 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the PRPH gene (top strand), derived from SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 72 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the PRPH gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.14; SEQ ID NO: 73 is the sequence derived from the methylated sequence of the PTGER3 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 74 is the sequence derived from the methylated sequence of the PTGER3 gene (bottom strand), derived from SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 75 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the PTGER3 gene (top strand), derived from SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 76 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the PTGER3 gene (bottonistrand), derived from SEQ ID NO.15; SEQ ID NO: 77 is the sequence derived from the methylated sequence of the PTPRM gene (top strand), derived from SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 78 is the sequence derived from the methylated sequence of the PTPRM (bottom strand) gene, derived from SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 79 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the PTPRM gene (top strand), derived from SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 80 is the sequence derived from the unmethylated sequence of the PTPRM gene (strand buttons), derived from SEQ ID NO.16; SEQ ID NO: 81 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 82 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 83 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 84 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 85 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 86 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on the inverted complement of SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 87 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 88 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 89 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 90 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 91 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 92 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on the inverted complement of SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 93 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 94 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 95 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 96 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 97 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 98 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 99 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 100 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 101 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 102 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 103 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 104 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 105 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 106 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 107 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 108 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 109 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 110 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on the inverted complement of SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 111 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on SEQ ID NO: 77; SEQ ID NO: 112 is the oligonucleotide sequence for Methylation-Specific PCR (MSP) drawn on inverted complement of SEQ ID NO: 77.
Lista delle sequenze nucleotidiche List of nucleotide sequences
Claims (38)
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| ITTO20070201 ITTO20070201A1 (en) | 2007-03-19 | 2007-03-19 | NEW DNA METHODATION MARKERS USEFUL FOR DIAGNOSIS OF NEOPLASTIC DISEASES |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
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Family
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Family Applications (1)
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| ITTO20070201 ITTO20070201A1 (en) | 2007-03-19 | 2007-03-19 | NEW DNA METHODATION MARKERS USEFUL FOR DIAGNOSIS OF NEOPLASTIC DISEASES |
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| Country | Link |
|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4301419A4 (en) * | 2021-03-05 | 2025-05-21 | Mayo Foundation for Medical Education and Research | CERVICAL CANCER DETECTION |
| US12442043B2 (en) | 2019-10-31 | 2025-10-14 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting ovarian cancer |
| US12584177B2 (en) | 2019-01-24 | 2026-03-24 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting endometrial cancer |
-
2007
- 2007-03-19 IT ITTO20070201 patent/ITTO20070201A1/en unknown
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| US12442043B2 (en) | 2019-10-31 | 2025-10-14 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detecting ovarian cancer |
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