FR2509177A1 - FISH VACCINE AND PROCESS FOR PREPARING THE SAME - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne un vaccin pour poissons et son procédé de préparation. The present invention relates to a fish vaccine and its preparation process.
Plus particulièrement l'invention concerne des vaccins contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches et son procédé de préparation. L'invention a été réalisée dans le cadre d'un contrat fédéral NOAA Sea Grant nO NA79AA D-00054. More particularly, the invention relates to vaccines against Vibrio anguillarum and other very similar vibrios and its method of preparation. The invention was made under a federal NOAA Sea Grant nO NA79AA D-00054 contract.
Un obstacle majeur du succès de la pisciculture ou de l'aquiculture est la maladie. La vibriose est une maladie dont le taux de mortalité est particulièrement élevé qui atteint les saumons (salmonidés) et de nombreuses autres espèces de poissons anadromes et catadromes (1). Cette maladie est due à une infection à Vibrio anguillarum et à d'autres vibrions très proches. Cette maladie est caractérisée par une septicémie hémorragique et elle s'accompagne d'une destruction massive de cellules et de tissus de types divers (2). A major obstacle to the success of fish farming or aquaculture is disease. Vibriosis is a disease with a particularly high mortality rate which affects salmon (salmonids) and many other species of anadromous and catadromous fish (1). This disease is caused by infection with Vibrio anguillarum and other closely related vibrios. This disease is characterized by hemorrhagic septicemia and is accompanied by massive destruction of cells and tissues of various types (2).
Bien qu'on ait souvent tenté de mettre au point un vaccin efficace contre cette maladie, les résultats ont été décevants. Plus particulièrement, les tentatives de protection contre les formes les plus virulentes de Vibrio anguillarum ont soit échoué soit eu un succès très limité (3), (4). Although attempts have often been made to develop an effective vaccine against this disease, the results have been disappointing. In particular, attempts to protect against the more virulent forms of Vibrio anguillarum have either failed or had very limited success (3), (4).
L'invention a pour objets
un vaccin amélioré contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches
un procédé amélioré pour préparer un vaccin contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches ; et
un vaccin contre Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches qui est très efficace contre beaucoup des couches virulentes.The subject of the invention is
an improved vaccine against Vibrio anguillarum and other closely related vibrios
an improved process for preparing a vaccine against Vibrio anguillarum and other closely related vibrios; and
a vaccine against Vibrio anguillarum and other closely related vibrios which is very effective against many of the virulent layers.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description qui suit faite en regard des dessins annexés dans lesquels
- la figure 1 est un graphique de la cinétique de la fixation du fer radio-actif par des cellules ne se multipliant pas de Vibrio anguillarum dans des conditions de restriction en fer ; et
- la figure 2 est une reproduction photographique illustrant la gamme des concentrations en chlorure de fer dans laquelle la production de protéines de surfaces spécifiques de
Vibrio anguillarum est induite.Other characteristics and advantages of the invention will emerge from the description which follows given with reference to the appended drawings in which
- Figure 1 is a graph of the kinetics of the binding of radioactive iron by non-multiplying cells of Vibrio anguillarum under iron restriction conditions; and
- Figure 2 is a photographic reproduction illustrating the range of iron chloride concentrations in which the production of surface-specific proteins of
Vibrio anguillarum is induced.
De façon très générale, une forme du procédé de l'invention consiste à cultiver des cellules exprimant la protéine OM2 de 86 000 daltons qui est présente dans la membrane ex térieure de Vibrio anguillarum cultivé avec une restriction en fer. Ces cellules peuvent être soit Vibrio anguillarum soit des cellules hôtes non pathogènes ayant un ADN susceptible de rêplication codant pour au moins une portion importante de la protéine OM2. Ensuite, les cellules sont soit atténuées soit tuées et utilisées comme vaccin ou la protéine OM2 est isolée des cellules et utilisée comme vaccin. Very generally, one form of the method of the invention consists in cultivating cells expressing the OM2 protein of 86,000 daltons which is present in the outer membrane of Vibrio anguillarum cultivated with an iron restriction. These cells can be either Vibrio anguillarum or non-pathogenic host cells having DNA capable of replicating encoding at least a large portion of the OM2 protein. Then the cells are either attenuated or killed and used as a vaccine or the OM2 protein is isolated from the cells and used as a vaccine.
On a montre que la virulence de Vibrio anguillarum est associée à la présence d'unplasmide particulier dans l'agent pathogène (5). Ce type spécifique de plasmide est absent des souches à faible virulence (6). L'association de ce type de plasmide spécifique et de la virulence de Vibrio anguillarum a été établie (7). On a de plus signalé des preuves établissant que le plasmide de virulence de Vibrio anguillarum détermine un système très efficace de séquestration du fer (7). The virulence of Vibrio anguillarum has been shown to be associated with the presence of a particular plasmid in the pathogen (5). This specific type of plasmid is absent from low virulence strains (6). The association of this type of specific plasmid and the virulence of Vibrio anguillarum has been established (7). There has also been evidence that the virulence plasmid of Vibrio anguillarum determines a very efficient iron sequestration system (7).
Ceci permet à la bactérie de survivre dans des conditions de disponibilité limitée du fer. De ce fait les bactéries peuvent survivre et se développer bien qie les mécanismes de défence de l'hâte provoquent une liaison du fer aux protéines transferrine et lactoferrine.This allows the bacteria to survive under conditions of limited iron availability. As a result, bacteria can survive and develop well, although the defense mechanisms of haste cause binding of iron to the proteins transferrin and lactoferrin.
On a indiqué que beaucoup de souches virulentes de
Vibrio anguillarum du biotype I isolées dans la région nordouest des Etats-Unis bordant le Pacifique hébergent un plasmide spécifique de type pJMl qui est absent des souches à faibles virulence (5). Des expériences suggèrent que la virulence est associée à ce type particulier de plasmide. Le mécanisme de la virulence semble être la capacité que présentent les souches virulentes contenant le plasmide, à fixer le fer bien que les mécanismes de défense du poisson hotte infecté produisent de la transferrine et de la lactoferrine pour fixer le fer (6). Comme Vibrio anguillarum contenant ce plasmide est capable de se développer dans des conditions de restriction en fer, en récupérant le fer uni à une protéine fixant le fer, les bactéries envahissantes sont capables de proliférer dans les humeurs et les tissus. It has been reported that many virulent strains of
Vibrio anguillarum of biotype I isolated in the north-western region of the United States bordering the Pacific harbor a specific plasmid of the pJMl type which is absent from the low virulence strains (5). Experiments suggest that virulence is associated with this particular type of plasmid. The mechanism of virulence appears to be the ability of virulent strains containing the plasmid to fix iron, although the defense mechanisms of infected hooded fish produce transferrin and lactoferrin to fix iron (6). As Vibrio anguillarum containing this plasmid is able to develop under iron restriction conditions, by recovering iron united with an iron-binding protein, invasive bacteria are able to proliferate in moods and tissues.
On a découvert que les souches de Vibrio anguillarum qui sont caractérisées par le système de fixation à médiation plasmidique ont certaines protéines de membrane extérieure spécifiques dont au moins une est produite lorsque le plasmide de virulence est présent. Ces protéines de la membrane extérieure semblent être associées à la fonction de fixation du fer. I1 semble que ces protéines de la membrane extérieure forment un récepteur pour le sidérophore ferrique (composés fixant le fer produits par les bactéries) nécessaire à son transport dans la cellule. It has been discovered that strains of Vibrio anguillarum which are characterized by the plasmid mediated binding system have certain specific outer membrane proteins of which at least one is produced when the virulence plasmid is present. These outer membrane proteins appear to be associated with the binding function of iron. It appears that these proteins from the outer membrane form a receptor for the ferric siderophore (iron-binding compounds produced by bacteria) necessary for its transport in the cell.
L'analyse des protéines de la membrane extérieure présentes dans Vibrio anguillarum contenant les plasmides de virulence, montre qu'au moins deux protéines de membrane extérieure sont induites dans des conditions de culture où la teneur en fer est limitée å certaines valeurs. Une de ces protéines, appelée 0012, a un poids moléculaire de 86 000 daltons et est associée à la présence du plasmide pJMl. Bien que cette protéine ne soit présente que dans les souches contenant le plasmide, on ne sait pas de façon certaine si le plasmide code pour cette protéine et si elle est induite en réponse à une baisse de la concentration en fer, ou s'il s'agit d'un produit d'origine chromosomique. Analysis of the outer membrane proteins present in Vibrio anguillarum containing the virulence plasmids, shows that at least two outer membrane proteins are induced under culture conditions where the iron content is limited to certain values. One of these proteins, called 0012, has a molecular weight of 86,000 daltons and is associated with the presence of the plasmid pJM1. Although this protein is only present in strains containing the plasmid, it is unclear whether the plasmid codes for this protein and whether it is induced in response to a drop in iron concentration, or whether it 'is a product of chromosomal origin.
La seconde protéine détectée dans la membrane extérieure a été appelée OM3 et a un poids moléculaire de 79 000 daltons. The second protein detected in the outer membrane was called OM3 and has a molecular weight of 79,000 daltons.
L'association de cette protéine et du plasmide pJMl demeure obscure.The association of this protein and the plasmid pJM1 remains unclear.
Selon l'invention, on prépare le vaccin à partir de cultures de cellules cultivées de telle sorte que la protéine
OM2 soit exprimée. De préférence ces cellules sont des cellules de Vibrio anguillarum cultivées avec une restriction en fer suffisante pour induire l'expression de la protéine OM2.According to the invention, the vaccine is prepared from cultures of cultured cells such that the protein
OM2 is expressed. Preferably, these cells are Vibrio anguillarum cells cultivated with an iron restriction sufficient to induce the expression of the OM2 protein.
Cependant on peut également produire la protéine par production d'une cellule hôte ayant un ADN susceptible de replica- tion codant pour au moins une portion importante de la pro téine OM2. Les techniques de recombinaison d' ADN sont bien connues de l'homme de l'art et peuvent être utilisées pour produire de telles cellules hâtes. Dans les deux cas, on atténue ou tue ensuite les cellules et on les utilise comme vaccins ou on isole la protéine OM2 des cellules et on l'utilise comme vaccin.Par exemple on a étudié de la façon suivante des souches de Vibrio anguillarum dont certaines contiennent le plasmide de virulence et certaines sont des dérivés peu virulents de souches portant le plasmide
Corrélation entre la fixation du fer, la présence du
plasmide et la virulence de souches de Vibrio anguillarum
Souche de Présence du Fixation de
Vibrio plasmide de 55 b c anguillarum virulence a Fe 50
(cpm/min) 775 (pJMl) + 11 500 1,0 x 133S (pJMl) + 12 000 1,3 x 103
LS174 (pJMl) + 15 000 5,0 x 10
LS174-WTI - 700 2,0 x 107
H775-3 - 550 3 x
H775-8 - 450 2,5 rl06
E775-100 - 600 2 x 10
a L'ADN du plasmide a été déterminé selon une méthode d'
électrophorèse sur agarose comme décrit en (6).However, the protein can also be produced by production of a host cell having DNA capable of replication encoding at least a large portion of the OM2 protein. DNA recombination techniques are well known to those skilled in the art and can be used to produce such hasty cells. In both cases, the cells are either attenuated or killed and used as vaccines or the OM2 protein is isolated from the cells and used as a vaccine. For example, strains of Vibrio anguillarum were studied as follows contain the virulence plasmid and some are low-virulent derivatives of strains carrying the plasmid
Correlation between iron fixation, the presence of
plasmid and virulence of Vibrio anguillarum strains
Fixation Presence Strain
Vibrio plasmid of 55 bc anguillarum virulence at Fe 50
(cpm / min) 775 (pJMl) + 11,500 1.0 x 133S (pJMl) + 12,000 1.3 x 103
LS174 (pJMl) + 15,000 5.0 x 10
LS174-WTI - 700 2.0 x 107
H775-3 - 550 3 x
H775-8 - 450 2.5 rl06
E775-100 - 600 2 x 10
a The plasmid DNA was determined according to a method of
agarose electrophoresis as described in (6).
b Les valeurs ont été obtenues à partir d'expériences ci
nétiques semblables à celles illustrées par la figure
1, par détermination du rapport 55Fe cpm/temps au point
20 minutes.b The values were obtained from experiments ci
similar to those illustrated in the figure
1, by determining the ratio 55Fe cpm / time at point
20 minutes.
DL50 déterminées comme décrit ci-dessous. LD50 determined as described below.
Comme le montre le tableau, on a étudié la capacité de fixation du fer et la dose létale moyenne des souches particulières. La mesure de la fixation du fer a été effectuée de la façon suivante
On cultive les souches bactériennes pendant plusieurs gé nérations à 220C dans un milieu minimal à faible teneur en fer (14) (teneur en fer 2 uM) additionné de 0,5% (p/v) de glucose et des amino-acides nécessaires, d'acide aspartique et d'histidine à 20 ug/ml. On centrifuge les cultures en croissance exponentielle, on lave les cellules et on les remet en suspension à la densité de 0,4 x 108 cellules/ml dans un milieu semblable si ce n'est que la teneur en fer est alors inférieure à 0,5 M de fer. Après une nouvelle incubation de 2 heures à 250C pour épuiser les réserves intracellulaires de fer, on centrifuge les cultures, on lave les cellules et on les remet 8 en suspension à une densité de 4 x 108 cellules/ml dans un mi- lieu semblable dépourvu d'amino-acides essentiels mais 100 pM en nitrilotriacétate de sodium. Dans certaines expériences,on ajoute à ce stade 2 St de KCN (inhibiteur respiratoire).On ajoute en agitant aux suspensions cellulaires du 55fez13 sans support (1 uCi/ml), on prélève des échantillons de 1 ml à divers intervalles et on les filtre sur des membranes filtrantes Millipare (taille des pores : 0,45 um). On lave les filtres avec du citrate de sodium 100 mEI, on sèche et on compte avec un compteur à scintillation liquide Packard-TriCarb avec un cocktail de scintillation à base de toluène contenant de l'Omnifluor (New England Nuclear) à 4 g/l.As shown in the table, the iron binding capacity and the average lethal dose of the particular strains were studied. The measurement of the iron fixation was carried out as follows
The bacterial strains are cultivated for several generations at 220 ° C. in a minimal medium with low iron content (14) (iron content 2 μM) supplemented with 0.5% (w / v) of glucose and the necessary amino acids, aspartic acid and histidine at 20 µg / ml. The cultures in exponential growth are centrifuged, the cells are washed and they are resuspended at the density of 0.4 × 10 8 cells / ml in a similar medium except that the iron content is then less than 0, 5 M of iron. After a further incubation for 2 hours at 250 ° C. to exhaust the intracellular iron reserves, the cultures are centrifuged, the cells are washed and they are resuspended at a density of 4 × 10 8 cells / ml in a similar medium lacking of essential amino acids but 100 pM in sodium nitrilotriacetate. In some experiments, 2 St of KCN (respiratory inhibitor) are added at this stage. Stirless 55fez13 (1 uCi / ml) is added to the cell suspensions, 1 ml samples are taken at various intervals and filtered. on Millipare filter membranes (pore size: 0.45 µm). The filters are washed with 100 mEI sodium citrate, dried and counted with a Packard-TriCarb liquid scintillation counter with a toluene scintillation cocktail containing Omnifluor (New England Nuclear) at 4 g / l .
Pour déterminer si la capacité des souches de Vibrio anguillarum à forte virulence porteuses de plasmide dans des conditions de restriction en fer est due à un système efficace de fixation du fer, on mesure directement la fixation du fer radio-actif par des cellules ne se multipliant pas. On cultive dans un milieu minimal environ 2 vM en FeC13 (concentration minimale en fer pour laquelle la souche H775-3 peut se développer) pendant plusieurs générations Vibrio anguillarum 775 portant le plasmide (pJM1) et le dérivé sans plasmide H775-3. To determine whether the capacity of plasmid-carrying Vibrio anguillarum strains with high virulence under iron restriction conditions is due to an efficient iron binding system, the binding of radioactive iron by non-multiplying cells is directly measured. not. About 2 vM of FeCl3 (minimum iron concentration for which the strain H775-3 can develop) is cultivated in a minimal medium for several generations Vibrio anguillarum 775 carrying the plasmid (pJM1) and the derivative without plasmid H775-3.
On centrifuge les cultures en phase exponentielle, on lave les cellules avec un milieu à faible teneur en fer (teneur en fer inférieure à 0,5 vM) et on remet en suspension à la densité de 0,4 x 108 cellules/ml dans un milieu semblable ayant une teneur en fer inférieure à 0,5 vM. Après incubation dans ce milieu pour épuiser les réserves intracellulaires de fer, on centrifuge les cultures, on lave les cellules et on les remet en suspension à la densité de 4 x 108 cellules/ ml dans un milieu semblable dépourvu d'amino-acides essentiels mais contenant du nitrilotriacétate puis on les met en 55 présence de Fe comme décrit précédemment.La figure 1 et le tableau précédent montrent que dans les mêmes conditions de fixation, les cellules ne se multipliant pas de Vibrio anguillarum à grande virulence portant le plasmide 775 (pJMl), 133S (pJMl) ou LS174 (pJMl) fixent le fer radio-actif plus rapidement que le dérivé à faible virulence isogène sans plasmide H775-3. On obtient des fixations faibles semblables avec les autres dérivés à faible virulence sans plasmide figurant dans le tableau. The cultures are centrifuged in the exponential phase, the cells are washed with a medium with a low iron content (iron content less than 0.5 vM) and resuspended at a density of 0.4 × 10 8 cells / ml in a similar medium with an iron content of less than 0.5 vM. After incubation in this medium to exhaust the intracellular iron reserves, the cultures are centrifuged, the cells are washed and they are resuspended at a density of 4 × 10 8 cells / ml in a similar medium devoid of essential amino acids but containing nitrilotriacetate and then they are put in the presence of Fe as described above. FIG. 1 and the preceding table show that under the same binding conditions, the cells which do not multiply of highly virulent Vibrio anguillarum carrying the plasmid 775 (pJMl ), 133S (pJMl) or LS174 (pJMl) fix the radioactive iron more quickly than the isogenic low virulence derivative without plasmid H775-3. Similar weak bindings are obtained with the other low virulence derivatives without the plasmid listed in the table.
Une information complémentaire relative au phénomène provoquant l'accumulation de fer a été obtenue par emploi de l'inhibiteur respiratoire qu'est le KCN. Un processus à dépendance énergétique de transport du fer à l'intérieur de la cellule est inhibé par le XCN tandis que la fixation du fer à la membrane bactérienne qui est sans dépendance énergétique n'est pas inhibée. La figure 1 montre que l'accumulation du fer par la souche portant le plasmide de Vibrio anguillarum 775 (pJMl) est fortement inhibée par 2 mM de KCN ce qui suggère que le processus est une fixation et non une simple liaison aux membranes bactériennes, bien que la présence de la petite quantité d'accumulation de fer sans dépendance énergétique (en présence de KCN) pourrait être due à un certain type d'association semblant également avoir une médiation plasmidique. Additional information relating to the phenomenon causing the accumulation of iron was obtained by using the respiratory inhibitor that is KCN. An energy-dependent process of transporting iron within the cell is inhibited by XCN while the binding of iron to the bacterial membrane which is energy-dependent is not inhibited. FIG. 1 shows that the accumulation of iron by the strain carrying the plasmid of Vibrio anguillarum 775 (pJMl) is strongly inhibited by 2 mM of KCN which suggests that the process is a fixation and not a simple binding to the bacterial membranes, although that the presence of the small amount of iron accumulation without energy dependence (in the presence of KCN) could be due to a certain type of association also seeming to have a plasmid mediation.
Ces résultats montrent que la présence du plasmide de virulence dans Vibrio anguillarum implique une fixation du fer plus rapide et plus efficace. Cette observation explique la capacité de Vibrio anguillarum portant le plasmide à se développer en présence de chélateurs du fer. These results show that the presence of the virulence plasmid in Vibrio anguillarum implies faster and more efficient iron fixation. This observation explains the capacity of Vibrio anguillarum carrying the plasmid to develop in the presence of iron chelators.
Pour effectuer une étude complémentaire de la présence d'un système de fixation du fer à médiation plasmidique dans
Vibrio anguillarum, on a recherché si une protéine d'enveloppe cellulaire spécifique était induite dans les conditions de restriction en fer, comme c'est le 'cas des systèmes de fixation du fer de certaines antérobactéries. Pour cela on cultive
Vibrio anguillarum 775 (pJMl) et son dérivé à faible virulence sans plasmide H775-3 dans un milieu minimal auquel on ajoute du fer sous forme de Fez13 à diverses concentrations. Dans certains cas on ajoute 3 pM de transferrine au milieu de culture. On prépare à partir des cellules cultivées dans ces diverses conditions les enveloppes cellulaires totales ainsi que les membranes extérieures et on les analyse par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide.Sur la figure 2 les pistes A à H montrent les enveloppes cellulaires totales des deux souches àdifférentes concentrations en FeC13 ; tandis que les pistes I et J montrent les protéines de la membrane extérieure obtenues à partir de cellules cultivées avec 2 uM de FeC13. Cinq protéines principales de la membrane extérieure (OM1-5) sont présentes dans les souches portant le plasmide cultivé avec 2 pM de FeC13. Une de ces protéines, 1'OM2, n' existe pas dans le dérivé sans plasmide.To conduct a further study of the presence of a plasmid-mediated iron binding system in
Vibrio anguillarum, it was investigated whether a specific cell envelope protein was induced under iron restriction conditions, as is the case with the iron binding systems of certain anterobacteria. For this we cultivate
Vibrio anguillarum 775 (pJMl) and its low virulence derivative without plasmid H775-3 in a minimal medium to which iron in the form of Fez13 is added at various concentrations. In some cases 3 µM transferrin is added to the culture medium. The cell envelopes as well as the outer membranes are prepared from the cells cultivated under these various conditions and analyzed by electrophoresis on SDS-polyacrylamide gel. In FIG. 2 tracks A to H show the total cell envelopes of the two strains at different FeC13 concentrations; while lanes I and J show the proteins of the outer membrane obtained from cells cultured with 2 μM of FeC13. Five main proteins of the outer membrane (OM1-5) are present in the strains carrying the plasmid cultivated with 2 μM of FeC13. One of these proteins, OM2, does not exist in the plasmid-free derivative.
L'analyse des enveloppes cellulaires totales de la souche contenant le plasmide montre nettement qu'il existe un seuil de la concentration en Fez13 (en dessous de 4 vM) pour lequel 1'OM2 et 1'OM3 sont inductibles alors que ces protéines ne sont pas détectables à des concentrations en fer supérieures dans les souches portant le plasmide (pistes A-F). La piste A montre que comme prévu 1'OM2 et 1'OM3 sont présentes dans la souche portant le plasmide cultivée en présence de 3 uM de transferrine.Dans le cas de la souche sans plasmide, la protéine OM3 est la seule protéine induite à 2 pM de FeC13 (concentration minimale en fer permettant la croissance de cette souche) (comparer les pistes G, J et H). Donc les conditions de restriction en fer qui permettent une fixation très rapide du fer radio-actif par les souches portant un plasmide de Vibrio anguillarum induisent également la synthèse de deux protéines spécifiques de membrane extérieure OM2 et
OM3 respectivement de 86 000 et 79 000 daltons (ces valeurs étant mesurées avec des protéines de poids moléculaire standard (non représentées). La protéine OM2 est associée à la présence du plasmide pJMl.Analysis of the total cell envelopes of the strain containing the plasmid clearly shows that there is a threshold for the concentration of Fez13 (below 4 vM) for which OM2 and OM3 are inducible while these proteins are not not detectable at higher iron concentrations in strains carrying the plasmid (AF lanes). Lane A shows that, as expected, OM2 and OM3 are present in the strain carrying the plasmid cultured in the presence of 3 μM of transferrin. In the case of the strain without plasmid, the OM3 protein is the only protein induced at 2 pM FeC13 (minimum iron concentration allowing the growth of this strain) (compare lanes G, J and H). Therefore the iron restriction conditions which allow very rapid fixation of the radioactive iron by the strains carrying a Vibrio anguillarum plasmid also induce the synthesis of two proteins specific for the outer membrane OM2 and
OM3 of 86,000 and 79,000 daltons respectively (these values being measured with standard molecular weight proteins (not shown). The OM2 protein is associated with the presence of the plasmid pJM1.
Une synthèse élevée de la protéine OM2 dans les conditions de restriction en fer pourrait refléter l'accroissement du nombre des copies du plasmide de virulence dans ces mêmes conditions. Cependant ce n'est pas le cas. Le nombre des copies de plasmide déterminé en présence de transferrine et à diverses concentrations en fer (0,05-12 pm) indique qu'il n'y a pas de changement significatif du nombre des copies tandis que dans la même gamme des concentrations, on observe des modifications considérables de l'induction de la protéine OM2 (figure 2). A high synthesis of the OM2 protein under iron restriction conditions could reflect the increase in the number of copies of the virulence plasmid under these same conditions. However, this is not the case. The number of plasmid copies determined in the presence of transferrin and at various iron concentrations (0.05-12 μm) indicates that there is no significant change in the number of copies while in the same range of concentrations, considerable changes in the induction of the OM2 protein are observed (FIG. 2).
Les résultats précédents démontrent que la protéine de surface OM2 et éventuellement la protéine de surface OM3 sont des facteurs caractéristiques du caractère virulent de l'agent pathogène correspondant. Donc leur présence est importante pour la formation d'anticorps en réponse à ces protéines chez une espèce de poisson hâte infectée. Les vaccins de l'art entérieur ne tiennent pas compte de ce fait. Par conséquent, on peut préparer des vaccins à partir de souches bactériennes exprimant cette protéine en atténuant ou en tuant les souches selon des techniques classiques s'il est nécessaire. Sinon on peut préparer des vaccins par purification de la protéine de surface elle-même pour l'utiliser comme agent vaccinal. The above results demonstrate that the OM2 surface protein and possibly the OM3 surface protein are factors characteristic of the virulent nature of the corresponding pathogen. Therefore their presence is important for the formation of antibodies in response to these proteins in an infected species of hasty fish. Interior art vaccines ignore this fact. Therefore, vaccines can be prepared from bacterial strains expressing this protein by attenuating or killing the strains according to conventional techniques if necessary. Otherwise, vaccines can be prepared by purification of the surface protein itself for use as a vaccine agent.
On voit donc que des vaccins préparées selon l'invention confèrent une immunité plus précise contre les souches très virulentes de Vibrio anguillarum et d'autres vibrions très proches. It can therefore be seen that the vaccines prepared according to the invention confer more precise immunity against the very virulent strains of Vibrio anguillarum and other very close vibrios.
Diverses modifications de l'invention en plus de celles ici illustrées et décrites découlent de façon évidente pour l'homme de l'art de la description précédente et des illustrations annexées. Par exemple on peut utiliser les produits ici décrits avec des produits dérivant d'autres sérotypes de vibrions pour conférer une immunité plus étendue. Ces modifications entrent dans le cadre des revendications. Various modifications of the invention in addition to those illustrated and described here are obvious to those skilled in the art from the preceding description and the accompanying illustrations. For example, the products described here can be used with products derived from other vibrios serotypes to confer more extensive immunity. These modifications are within the scope of the claims.
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