ES3020839A1

ES3020839A1 - Method for identifying the developmental stage of a plant and method for selecting plants with a short juvenile period by using miRNAs

Info

Publication number: ES3020839A1
Application number: ES202330963A
Authority: ES
Inventors: Díez Concepción Muñoz; Bermúdez-Coronel Ana Gordon; Rodríguez Paola Gabriela Romero; Alvarez Esteban Meca; López Teresa García; Alcázar Carmen Tercero; Moral Juan Moral; Hristofor Miho; Navero Diego Barranco
Original assignee: Universidad de Cordoba
Current assignee: Universidad de Cordoba
Priority date: 2023-11-22
Filing date: 2023-11-22
Publication date: 2025-05-23

Abstract

Method for identifying the developmental stage of a plant and method for selecting plants with a short juvenile period through the use of miRNAs. The present invention describes both methods that involve the quantification of the expression levels of the biomarkers miR156 and miR172 in an isolated sample of a plant, where the expression of said biomarkers allows the developmental stage of a plant to be determined, as well as the selection of plants with a short juvenile stage. The ratio of the miR156/miR172 expression levels has values that vary depending on the developmental stage of the plant, where said ratio shows a progressive decrease throughout the development of the plant, from its juvenile stage to its adult stage. Furthermore, plants with a short juvenile period have decreased values of the miR156/miR172 ratio. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Description

DESCRIPCIÓN DESCRIPTION

Método para identificar el estado de desarrollo de una planta y método para seleccionar plantas con un periodo juvenil corto mediante el uso de miRNAs Method for identifying the developmental stage of a plant and method for selecting plants with a short juvenile period by using miRNAs

La presente se encuentra dentro del campo de la biotecnología, refiriéndose a métodos de identificación del estado de desarrollo de una planta y selección de plantas con un periodo juvenil corto, basados en la cuantificación de los niveles de expresión de biomarcadores, y usos de los mismo para estos fines. This paper is within the field of biotechnology, referring to methods for identifying the developmental stage of a plant and selecting plants with a short juvenile period, based on the quantification of biomarker expression levels, and their uses for these purposes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN BACKGROUND OF THE INVENTION

En los programas de mejora genética de plantas tales como los del olivo, se evalúan individuos genotípicamente únicos obtenidos a partir de semillas procedentes de cruzamientos. Para poder ser evaluados como nuevas variedades de interés estos individuos deben crecer, superar el periodo o fase juvenil y alcanzar el estado adulto para comenzar a producir frutos. El periodo juvenil en olivo (improductivo) puede durar entre 10 y 15 años en condiciones naturales y de 2-8 años en condiciones de forzado crecimiento en programas de mejora. Esto supone un tiempo largo de espera que ralentiza la obtención de nuevas variedades de interés y la capacidad de respuesta de los programas de mejora a posibles plagas y enfermedades, así como a cambios en las tendencias de mercado. In plant breeding programs such as those for the olive tree, genotypically unique individuals obtained from seeds derived from crosses are evaluated. To be evaluated as new varieties of interest, these individuals must grow, pass the juvenile stage, and reach adulthood to begin producing fruit. The juvenile (unproductive) period in olive trees can last between 10 and 15 years under natural conditions and 2-8 years under forced growth conditions in breeding programs. This represents a long lead time, which slows the development of new varieties of interest and the ability of breeding programs to respond to potential pests and diseases, as well as to changes in market trends.

La duración del periodo juvenil es un carácter segregante en el que tienen influencia los parentales (Moral, J et al., 2013.Scientia Horticulturae,156, 99-105). De hecho, la altura a la que florece el 50% de las plántulas de olivo depende principalmente del cultivar madre (Moral J et al. 2013). Por lo tanto, dentro de un mismo cruzamiento es posible encontrar plantas con periodo juvenil corto, largo o intermedio. Cabe destacar que la longitud del periodo juvenil de una nueva variedad de olivo se correlaciona con una característica agronómica crítica para las nuevas plantaciones, su precocidad de entrada en producción (León, L., et al., 2007.HortScience,42(3), 499-502), es decir, el tiempo entre la plantación y la primera cosecha significativa o periodo improductivo. Por lo tanto, al seleccionar plantas con periodo juvenil corto se seleccionan concomitantemente cultivares con un periodo improductivo corto. The length of the juvenile period is a segregating trait influenced by the parents (Moral, J et al., 2013. Scientia Horticulturae, 156, 99-105). In fact, the flowering height of 50% of olive seedlings depends mainly on the parent cultivar (Moral J et al. 2013). Therefore, within the same cross it is possible to find plants with a short, long or intermediate juvenile period. It is worth noting that the length of the juvenile period of a new olive variety correlates with a critical agronomic characteristic for new plantations, their precocity of entry into production (León, L., et al., 2007. HortScience, 42(3), 499-502), that is, the time between planting and the first significant harvest or unproductive period. Therefore, when selecting plants with a short juvenile period, cultivars with a short unproductive period are concomitantly selected.

Actualmente, el único biomarcador de periodo juvenil corto es la altura de la planta al final del periodo de crecimiento forzado en invernadero, ya que las plantas más altas presentan una mayor probabilidad de alcanzar la etapa adulta de forma temprana (De la Rosa, R., et al., 2006.Australian Journal of Agricultural Research57(4), 477-481; Rallo, P., et al., 2008.Australian Journal of Agricultural Research,59, 933-940). Sin embargo, la eficiencia de la altura como biomarcador es limitada, ya que el 50% de las plantas seleccionadas no muestran periodo juvenil reducido. Currently, the only biomarker of short juvenile period is plant height at the end of the forced growth period in a greenhouse, since taller plants have a greater probability of reaching the adult stage early (De la Rosa, R., et al., 2006. Australian Journal of Agricultural Research 57 (4), 477-481; Rallo, P., et al., 2008. Australian Journal of Agricultural Research, 59, 933-940). However, the efficiency of height as a biomarker is limited, since 50% of the selected plants do not show a reduced juvenile period.

En el estado de la técnica se describen métodos basados en la cuantificación de biomarcadores en muestras de plantas con el fin de identificar, de una manera sencilla y eficiente, plantas con características determinadas de producción (CN108537004A ), color (CN111961127A) o sexo (CN109554503A). Sin embargo, en el estado de la técnica no se describe ningún método basado de biomarcadores que permita la identificación del estado de desarrollo de una planta (juvenil o adulto) y la selección precoz de plantas con periodo juvenil corto. The prior art describes methods based on the quantification of biomarkers in plant samples in order to identify, in a simple and efficient manner, plants with specific production (CN108537004A), color (CN111961127A) or sex (CN109554503A) characteristics. However, the prior art does not describe any biomarker-based methods that allow the identification of the developmental stage of a plant (juvenile or adult) and the early selection of plants with a short juvenile period.

De manera que, a la vista del estado de la técnica, existe la necesidad de proporcionar nuevos métodos más rápidos y eficientes que permitan identificar el estado de desarrollo de una planta, así como la selección de plantas de cultivo con un periodo juvenil corto. Thus, given the state of the art, there is a need to provide new, faster and more efficient methods for identifying the developmental stage of a plant, as well as for selecting crop plants with a short juvenile period.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN DESCRIPTION OF THE INVENTION

Los inventores han observado que los niveles de los biomarcadores miR-156 y miR-172, de ahora en adelante "los biomarcadores de la invención”, presenta perfiles de expresión dependientes del estado de desarrollo (juvenil/adulto) de las plantas en los que fueron cuantificados (Fig. 1 y Fig. 2). The inventors have observed that the levels of the biomarkers miR-156 and miR-172, hereinafter "the biomarkers of the invention", present expression profiles dependent on the developmental stage (juvenile/adult) of the plants in which they were quantified (Fig. 1 and Fig. 2).

Primeramente, para identificar los miARNs implicados en la transición de estado juvenil a adulto, los inventores llevaron a cabo previamente estudios de perfiles de expresión a partir de librerías de ARN pequeño (smallRNA) utilizando tejido de hoja juvenil y adulta de varios olivos en transición entre las dos fases; es decir, individuos que poseían la parte basal en fase juvenil mientras que la zona área de la copa había alcanzado un estado adulto identificado por la presencia de flores. Tras el análisis bioinformático, los inventores seleccionaron los miARNs 156 y 172 ya que se mostraron diferencialmente expresados en hojas juveniles y adultas, y debido a su función en la transición de fase juvenil a adulta. La expresión de miR-156, de forma general, fue mayor en plantas juveniles disminuyendo durante el desarrollo. En cuanto a la expresión de miR-172, de forma general, ésta fue menor en plantas juveniles aumentando durante el desarrollo. First, to identify the miRNAs involved in the juvenile-to-adult transition, the inventors previously carried out expression profiling studies using small RNA (smallRNA) libraries using juvenile and adult leaf tissue from several olive trees in transition between the two phases; that is, individuals with the basal part in the juvenile phase while the canopy area had reached an adult state identified by the presence of flowers. After bioinformatic analysis, the inventors selected miRNAs 156 and 172 because they were differentially expressed in juvenile and adult leaves, and due to their role in the juvenile-to-adult transition. Expression of miR-156 was generally higher in juvenile plants, decreasing during development. Expression of miR-172 was generally lower in juvenile plants, increasing during development.

A continuación, llevaron a cabo la cuantificación de dichos biomarcadores en hojas procedentes de un grupo de olivos en diferentes estados de desarrollo. En este caso, observaron que el valor de la ratio de los niveles de expresión de miR-156/miR-172 fue significativamente mayor en olivos jóvenes con respecto a adultos, disminuyendo progresivamente a lo largo del desarrollo de la planta. They then quantified these biomarkers in leaves from a group of olive trees at different stages of development. In this case, they observed that the ratio of miR-156/miR-172 expression levels was significantly higher in young olive trees compared to adults, progressively decreasing throughout plant development.

Además, los presentes inventores observaron que el valor de la ratio de los niveles de expresión de miR-156/miR-172 fue menor en aquellas plantas que presentaron periodo juvenil corto o reducido (Fig. 3). Furthermore, the present inventors observed that the ratio value of miR-156/miR-172 expression levels was lower in those plants that had a short or reduced juvenile period (Fig. 3).

De manera que la presente invención solventa los problemas del estado de la técnica, ya que los niveles de expresión de miR-156 y miR-172 permiten identificar el estado de desarrollo de una planta, así como la selección de plantas con un periodo juvenil (no productivo) corto, lo cual supone un notable ahorro de tiempo y dinero para los programas de mejora genética de plantas de interés agronómico tales como el olivo. En base a la cuantificación de los biomarcadores de la invención, los inventores han desarrollado métodos para la identificación del estado de desarrollo de una planta y selección de plantas con un periodo juvenil corto, así como kits y usos para dichos fines, los cuales serán descritos en detalle a continuación. Thus, the present invention solves the problems of the state of the art, since the expression levels of miR-156 and miR-172 allow the identification of the developmental stage of a plant, as well as the selection of plants with a short juvenile (non-productive) period, which represents a significant saving of time and money for genetic improvement programs for plants of agronomic interest such as the olive tree. Based on the quantification of the biomarkers of the invention, the inventors have developed methods for the identification of the developmental stage of a plant and the selection of plants with a short juvenile period, as well as kits and uses for said purposes, which will be described in detail below.

Métodos de la invención Methods of the invention

Método de identificación de la invenciónMethod of identifying the invention

En un aspecto, la invención se refiere a un método para identificar el estado de desarrollo de una planta, de ahora en adelante el "método de identificación de la invención”, que comprende las siguientes etapas: In one aspect, the invention relates to a method for identifying the developmental stage of a plant, hereinafter the "identification method of the invention", comprising the following steps:

a) cuantificar los niveles de expresión del biomarcador miR-156 y el biomarcador miR-172 en una muestra aislada de la planta; a) quantify the expression levels of the miR-156 biomarker and the miR-172 biomarker in an isolated sample of the plant;

b) calcular el valor de la ratio miR-156/miR-172 a partir de los niveles de expresión del paso a); y b) calculate the value of the miR-156/miR-172 ratio from the expression levels in step a); and

c) comparar el valor de la ratio calculado en b) con un valor de referencia; c) compare the ratio value calculated in b) with a reference value;

en donde un valor disminuido de la ratio calculada en b) con respecto al valor de referencia indica que la planta se encuentra en estado adulto. where a decreased value of the ratio calculated in b) with respect to the reference value indicates that the plant is in the adult state.

En la presente invención, el término "estado de desarrollo de una planta” se refiere al grado de desarrollo de una planta en un momento determinado. La planta se puede encontrar en estado juvenil o adulto según su grado de desarrollo, o como se ha indicado anteriormente en estado de transición. Por lo tanto, la expresión "identificar el estado de desarrollo de una planta” se refiere a la determinación del estado de desarrollo en el que se encuentra una planta en un momento determinado, pudiendo ser estado de desarrollo juvenil o estado de desarrollo adulto. In the present invention, the term "plant development stage" refers to the degree of development of a plant at a given time. The plant may be in a juvenile or adult state depending on its degree of development, or as indicated above, in a transition state. Therefore, the expression "identifying the development stage of a plant" refers to determining the development stage of a plant at a given time, which may be a juvenile development stage or an adult development stage.

En la presente invención el término "estado de desarrollo juvenil” o "estado juvenil”, se refiere al grado de desarrollo de una planta, en un momento determinado, en el que no es capaz de producir fruto, debido a que la planta aun no es capaz de florecer. El periodo de tiempo en el que la planta se encuentra en estado juvenil se denomina "etapa juvenil”, "periodo juvenil” o "fase juvenil”, términos usados de manera intercambiable en la presente invención. La etapa juvenil de una planta comprende el periodo de tiempo que va desde que la semilla germina hasta antes de la primera floración. Por lo tanto, durante la etapa juvenil la planta no es productiva (etapa no productiva). Típicamente, el periodo juvenil de una planta se expresa en el orden de meses o años, preferiblemente años. In the present invention, the term "juvenile development stage" or "juvenile state" refers to the degree of development of a plant, at a given time, at which it is not capable of producing fruit, because the plant is not yet capable of flowering. The period of time in which the plant is in a juvenile state is called "juvenile stage", "juvenile period" or "juvenile phase", terms used interchangeably in the present invention. The juvenile stage of a plant comprises the period of time from the germination of the seed until before the first flowering. Therefore, during the juvenile stage the plant is not productive (non-productive stage). Typically, the juvenile period of a plant is expressed in the order of months or years, preferably years.

En la presente invención, el término "estado de desarrollo adulto” o "estado adulto” , se refiere al grado de desarrollo de una planta, en un momento determinado, en el que es capaz de producir fruto, debido a que la planta es capaz de florecer. El periodo de tiempo en el que la planta se encuentra en estado adulto se denomina "etapa adulta”, "periodo adulto” o "o fase adulta”. El periodo de tiempo de la etapa adulta comienza cuando la planta florece por primera vez. Por lo tanto, durante la etapa adulta la planta es productiva (etapa productiva). In the present invention, the term "adult development stage" or "adult stage" refers to the degree of development of a plant, at a given time, at which it is capable of producing fruit, because the plant is capable of flowering. The period of time in which the plant is in the adult stage is called "adult stage", "adult period" or "adult phase". The time period of the adult stage begins when the plant flowers for the first time. Therefore, during the adult stage the plant is productive (productive stage).

De modo que la productividad de dicha planta (es decir, la capacidad de producción de fruto) se encuentra determinada por el estado de desarrollo en la que se encuentra esta. De modo que el método de identificación de la invención permite determinar si una planta se encuentra en su etapa productiva o no. Thus, the productivity of said plant (i.e., its ability to produce fruit) is determined by its stage of development. The identification method of the invention thus makes it possible to determine whether a plant is in its productive stage or not.

En la presente invención, el término "planta” se refiere a cualquier planta, preferiblemente una planta cultivada, donde dicha planta presenta una etapa juvenil o no productiva en su desarrollo, previa a una etapa adulta o productiva. En la presente invención, la planta comprende la información genética para la expresión de miR-156 y miR-172, donde dichos miR-156 y miR-172 son expresados en alguna etapa de desarrollo de la planta. En la presente invención el término "planta de cultivo” o "planta de cultivada” se refiere a cualquier planta que es cultivada por el ser humano preferiblemente para la obtención de un producto de interés (por ejemplo, para la obtención de frutos, tubérculos o una parte de la planta como la flor). Ejemplos de plantas de cultivo incluyen, sin limitación, olivo (géneroOlea),cítricos (géneroCitrus)almendro o melocotón (géneroPrunus).Los términos planta de cultivo o planta cultivada son equivalentes y pueden usarse de manera intercambiable a lo largo de la presente solicitud. In the present invention, the term "plant" refers to any plant, preferably a cultivated plant, where said plant has a juvenile or non-productive stage in its development, prior to an adult or productive stage. In the present invention, the plant comprises the genetic information for the expression of miR-156 and miR-172, where said miR-156 and miR-172 are expressed at some stage of development of the plant. In the present invention, the term "crop plant" or "cultivated plant" refers to any plant that is cultivated by humans, preferably for obtaining a product of interest (for example, for obtaining fruits, tubers or a part of the plant such as the flower). Examples of cultivated plants include, without limitation, olive tree (genus Olea), citrus trees (genus Citrus), almond tree or peach tree (genus Prunus). The terms crop plant or cultivated plant are equivalent and may be used interchangeably throughout this application.

Así, en una realización preferida del método de identificación de la invención, la planta es una planta cultivada. Thus, in a preferred embodiment of the identification method of the invention, the plant is a cultivated plant.

En otra realización preferida del método de identificación de la invención, la planta pertenece a un género seleccionado de la lista que consiste en:Olea, Citrus, Prunus, Pistacia, MagniferayPerseaIn another preferred embodiment of the identification method of the invention, the plant belongs to a genus selected from the list consisting of: Olea, Citrus, Prunus, Pistacia, Magnifera and Persea

En una realización más preferida del método de identificación de la invención, la planta pertenece a una especie seleccionada de la lista que consiste en:Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus máxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica y Persea americana.In a more preferred embodiment of the identification method of the invention, the plant belongs to a species selected from the list consisting of: Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica and Persea americana.

De acuerdo con el método de identificación de la invención, la etapa a) comprende la cuantificación del biomarcador miR-156 y el biomarcador miR-172 en una muestra aislada de la planta. According to the identification method of the invention, step a) comprises the quantification of the biomarker miR-156 and the biomarker miR-172 in an isolated sample of the plant.

En la presente invención "muestra aislada de la planta” se refiere a una parte o fragmento aislado de la planta que contiene ácidos nucleicos, como una muestra de hoja. En una realización preferida, la muestra aislada de la planta para la cuantificación de la etapa a) del método de identificación de la invención, es una muestra de hoja. In the present invention, "isolated plant sample" refers to an isolated part or fragment of the plant containing nucleic acids, such as a leaf sample. In a preferred embodiment, the isolated plant sample for quantification of step a) of the identification method of the invention is a leaf sample.

Previamente a la etapa de cuantificación de los métodos de la invención, es posible tratar la muestra para aislar el ácido ribonucleico. Técnicas para aislar ácidos ribonucleicos son práctica de rutina en un laboratorio y ampliamente conocidas por el experto en la materia. Prior to the quantification step of the methods of the invention, the sample can be treated to isolate the ribonucleic acid. Techniques for isolating ribonucleic acids are routine laboratory practice and are widely known to those skilled in the art.

Los biomarcadores de la invención, es decir aquellos cuya expresión se cuantifica en la etapa a) del método de identificación de la invención, corresponden a moléculas de microARNs. Tal y como se entiende en la presente invención, el término "microARN (miARN)” se refiere a una clase de ARN no codificante que desempeña un importante papel en la regulación de la expresión génica. La mayoría de los miARNs se transcriben a partir de secuencias de ADN en miARNs primarios y se procesan en miARNs precursores y, finalmente, en miARNs maduros. Los miARNs comprenden una longitud de 15 a 25 nucleótidos, preferiblemente de entre 18 a 23 nucleótidos, y son de cadena sencilla. Los miARNs están implicados en la regulación de procesos de desarrollo de plantas. En el presente documento, se utilizan indistintamente y de manera intercambiable los términos microARN, miARN o miR. The biomarkers of the invention, i.e. those whose expression is quantified in step a) of the identification method of the invention, correspond to microRNA molecules. As understood in the present invention, the term "microRNA (miRNA)" refers to a class of non-coding RNA that plays an important role in the regulation of gene expression. Most miRNAs are transcribed from DNA sequences into primary miRNAs and processed into precursor miRNAs and, finally, into mature miRNAs. miRNAs comprise a length of 15 to 25 nucleotides, preferably between 18 and 23 nucleotides, and are single-stranded. miRNAs are involved in the regulation of plant development processes. In this document, the terms microRNA, miRNA or miR are used indistinctly and interchangeably.

En la presente invención, el miR-156, es un miARN que comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100% con, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 1. In the present invention, miR-156 is a miRNA comprising a nucleotide sequence with a sequence identity of at least 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% with, preferably consisting of, the sequence SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1

UGACAGAAGAGAGUGAGCAU UGACAGAAGAGAGUGAGCAU

En la presente invención, el miR-172 es un miARN que comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 80, 85, 86, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100% con, preferiblemente consiste en, la secuencia SEQ ID NO: 2. In the present invention, miR-172 is a miRNA comprising a nucleotide sequence with a sequence identity of at least 80, 85, 86, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% with, preferably consisting of, the sequence SEQ ID NO: 2.

SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 2

UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA

En la presente invención se entiende por "identidad de secuencia” al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos obtenido mediante el alineamiento de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST [Altschul S.F.et al. Basic local alignment search tool.J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10]. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, TBLASTX, BLASTP y TBLASTN, son de dominio público en la página web deThe National Center for Biotechonology Information(NCBI). In the present invention, "sequence identity" is understood as the degree of similarity between two nucleotide sequences obtained by aligning the two sequences. Depending on the number of common residues between the aligned sequences, a degree of identity expressed as a percentage will be obtained. The degree of identity between two nucleotide sequences can be determined by conventional methods, for example, by standard sequence alignment algorithms known in the state of the art, such as BLAST [Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5; 215(3):403-10]. The BLAST programs, for example, BLASTN, BLASTX, TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, are in the public domain on the website of The National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Como entiende un experto en la materia, el nivel de un miARN en una muestra biológica, tal como una muestra de planta aislada, puede determinarse mediante metodologías convencionales bien conocidas en el estado de la técnica. Ejemplos de métodos para determinar los niveles de miARN incluyen, sin limitar a, inmunoensayos, por ejemplo, ELISA (por sus siglas,Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay),ensayos de biología molecular, por ejemplo, ensayos de reacción en cadena de la polimerasa tales como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), métodos de secuenciación (por ejemplo, secuenciación de ARN de pequeño tamaño, miARNseq(Next-Generation-Sequencing),matrices o microarrays de miARN, detección por NanoString nCounter, hibridaciónin situde miARN, o ensayos bioquímicos, por ejemplo, ensayos colorimétricos u otros. En una realización particular del método de identificación de la invención, los niveles de miARN se cuantifican mediante miARN-seq o RT-qPCR. As understood by one skilled in the art, the level of a miRNA in a biological sample, such as an isolated plant sample, can be determined by conventional methodologies well known in the state of the art. Examples of methods for determining miRNA levels include, but are not limited to, immunoassays, for example, ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), molecular biology assays, for example, polymerase chain reaction assays such as real-time quantitative PCR (RT-qPCR), sequencing methods (for example, small RNA sequencing, miRNAseq (Next-Generation-Sequencing), miRNA arrays or microarrays, NanoString nCounter detection, miRNA in situ hybridization, or biochemical assays, for example, colorimetric assays or others. In a particular embodiment of the identification method of the invention, miRNA levels are quantified by miRNA-seq or RT-qPCR.

Para la normalización de los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención, se puede usar como control interno un gen o biomarcador de referencia cuya expresión no varía en el tiempo y entre los diferentes estados de desarrollo de una planta. La elección de un gen o biomarcador de referencia es práctica de rutina para la persona experta en la materia. Por ejemplo, en los métodos de la invención, el biomarcador de referencia para la normalización de la expresión de los biomarcadores cuantificados es ARN ribosomal (rARN). To normalize the expression levels of the biomarkers of the invention, a reference gene or biomarker whose expression does not vary over time and between the different developmental stages of a plant can be used as an internal control. The selection of a reference gene or biomarker is routine practice for a person skilled in the art. For example, in the methods of the invention, the reference biomarker for normalizing the expression of the quantified biomarkers is ribosomal RNA (rRNA).

Así, en realizaciones preferidas de los métodos de la invención, en la etapa a) además se cuantifican los niveles de expresión de un gen o marcador de referencia, donde los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención se normalizan con respecto a los niveles de expresión del gen o marcador de referencia; preferiblemente, los niveles de expresión del gen o marcador de referencia se cuantifican mediante la misma técnica de cuantificación con la que se cuantifican los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención. Thus, in preferred embodiments of the methods of the invention, in step a) the expression levels of a reference gene or marker are also quantified, where the expression levels of the biomarkers of the invention are normalized with respect to the expression levels of the reference gene or marker; preferably, the expression levels of the reference gene or marker are quantified using the same quantification technique with which the expression levels of the biomarkers of the invention are quantified.

En una realización preferida de los métodos de la invención, el biomarcador de referencia es rARN 5S donde rARN 5S comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 80, 85, 86, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o un 100% con, preferiblemente consiste en, la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3: In a preferred embodiment of the methods of the invention, the reference biomarker is 5S rRNA where 5S rRNA comprises a nucleotide sequence with a sequence identity of at least 80, 85, 86, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% with, preferably consisting of, the nucleotide sequence SEQ ID NO: 3:

GAGCUGUGAUGAGAAAUUGUCAUGCACCACUCUGACUAUUAUCAGGUUGAUGA UAAUUUUAUGUACCCAUUCAAUUUCUGAGCUC GAGCUGUGAUGAGAAAUUGUCAUGCACCACUCUGACUAUUAUCAGGUUGAUGA UAAUUUUAUGUACCCAUUCAAUUUCUGAGCUC

La persona experta en la materia conoce los medios necesarios para llevar a cabo una cuantificación de los niveles de expresión de miARNs o genes de referencia mediante técnicas tales como RT-qPCR. En el mercado se encuentran disponibles sondas y cebadores para cuantificar mediante RT-qPCR los niveles de expresión de miR-156(Ref. 4398987, Custom TaqMan small RNA assay, ThermoFisher), miR-172 (Ref. The person skilled in the art knows the means necessary to quantify the expression levels of miRNAs or reference genes using techniques such as RT-qPCR. Probes and primers are commercially available for quantifying the expression levels of miR-156 (Ref. 4398987, Custom TaqMan small RNA assay, ThermoFisher), miR-172 (Ref.

4440886, TaqMan microRNA assay. TermoFisher) o el rARN 5S (Ref. Custom desalt assay SM each CCU001S, ID: GACD55456::839501. TermoFisher) en una muestra de una planta. 4440886, TaqMan microRNA assay. TermoFisher) or 5S rRNA (Ref. Custom desalt assay SM each CCU001S, ID: GACD55456::839501. TermoFisher) in a plant sample.

Tras la cuantificación de los biomarcadores de la invención en la etapa a) del método de identificación de la invención, se realiza una etapa b) de cálculo de la ratio miR-156/miR-172. After quantifying the biomarkers of the invention in step a) of the identification method of the invention, step b) of calculating the miR-156/miR-172 ratio is performed.

En la presente invención, el término "ratio miR-156/miR-172” se refiere a la ratio de los valores de expresión de miR-156 / valores de expresión de miR-172 medidos en una muestra aislada una planta. Es decir, el valor de la ratio miR-156/miR-172 se calcula a partir de la división de los valores de expresión de miR-156 por los valores de expresión de miR-172. In the present invention, the term "miR-156/miR-172 ratio" refers to the ratio of miR-156 expression values / miR-172 expression values measured in a sample isolated from a plant. That is, the miR-156/miR-172 ratio value is calculated by dividing the miR-156 expression values by the miR-172 expression values.

Los investigadores sorprendentemente encontraron que los valores de la ratio calculada en b) presenta una correlación con los estados de desarrollo de la planta de la cual procede la muestra aislada. El valor de la ratio miR-156/miR-172 disminuye progresivamente desde etapas tempranas del desarrollo de la planta (fase juvenil) hasta etapas más avanzadas (fase adulta). The researchers surprisingly found that the values of the ratio calculated in b) correlate with the developmental stages of the plant from which the isolated sample originated. The value of the miR-156/miR-172 ratio progressively decreases from early stages of plant development (juvenile phase) to more advanced stages (adult phase).

Tras el cálculo de la ratio miR-156/miR-172, ésta es comparada en una etapa c) con un valor de referencia, en donde un valor disminuido de la ratio calculada en b) respecto al valor de referencia indica que la planta se encuentra en estado adulto. After calculating the miR-156/miR-172 ratio, it is compared in step c) with a reference value, where a decreased value of the ratio calculated in b) with respect to the reference value indicates that the plant is in the adult stage.

En el contexto del método de identificación de la invención, el término "valor de referencia”, se refiere al valor de la ratio miR-156/miR-172 calculado a partir de los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención en una muestra de planta en estado juvenil, o al valor de la ratio miR-156/miR-172 calculado a partir de los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención en muestras de una población de plantas en estado juvenil. In the context of the identification method of the invention, the term "reference value" refers to the value of the miR-156/miR-172 ratio calculated from the expression levels of the biomarkers of the invention in a plant sample in its juvenile stage, or to the value of the miR-156/miR-172 ratio calculated from the expression levels of the biomarkers of the invention in samples from a population of plants in its juvenile stage.

Alternativamente, en una realización preferida del método de identificación de la invención, un valor de la ratio miR-156/miR-172 incrementado respecto a un valor de referencia es indicativo de un estado juvenil, donde el valor de referencia corresponde al valor de la ratio miR-156/miR-172 calculado a partir de los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención medidos en una planta en estado adulto, o al valor de la ratio miR-156/miR-172 calculado a partir de los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención en una población de plantas en estado adulto. Alternatively, in a preferred embodiment of the identification method of the invention, an increased miR-156/miR-172 ratio value relative to a reference value is indicative of a juvenile state, where the reference value corresponds to the miR-156/miR-172 ratio value calculated from the expression levels of the biomarkers of the invention measured in a plant in its adult state, or to the miR-156/miR-172 ratio value calculated from the expression levels of the biomarkers of the invention in a population of plants in its adult state.

En la presente invención los términos "disminución", "reducido", "reducción", "disminución", usados de manera intercambiable, se refieren a una disminución de una cantidad estadísticamente significativa del valor de la ratio de la invención con respecto a un valor de referencia, más preferiblemente "reducido", "reducción" o "disminución" o "inhibir" significa una disminución de al menos el 10% en comparación con un nivel de referencia, por ejemplo una disminución de al menos aproximadamente el 20%, o al menos aproximadamente el 30%, o al menos aproximadamente el 40%, o al menos aproximadamente el 50%, o al menos aproximadamente el 60%, o al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 90% o hasta e incluyendo una disminución del 100% (es decir, nivel ausente en comparación con una muestra de referencia), o cualquier disminución entre el 10-100% en comparación con un valor de referencia. In the present invention the terms "decrease", "reduced", "reduction", "diminution", used interchangeably, refer to a decrease of a statistically significant amount of the value of the ratio of the invention with respect to a reference value, more preferably "reduced", "reduction" or "decrease" or "inhibit" means a decrease of at least 10% compared to a reference level, for example a decrease of at least about 20%, or at least about 30%, or at least about 40%, or at least about 50%, or at least about 60%, or at least about 70%, or at least about 80%, or at least about 90% or up to and including a decrease of 100% (i.e., absent level compared to a reference sample), or any decrease between 10-100% compared to a reference value.

En la presente invención, los términos "aumentado" o "incrementado”, usados de manera intercambiable, se refieren a un aumento de una cantidad estadísticamente significativa del valor de la ratio de la invención con respecto a un valor de referencia; más preferiblemente los términos "aumentado" o "incrementado”, significan un aumento de al menos el 10% en comparación con un valor de referencia, por ejemplo un aumento de al menos aproximadamente el 20%, o al menos aproximadamente el 30%, o al menos aproximadamente el 40%, o al menos aproximadamente el 50%, o al menos aproximadamente el 60%, o al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos un 90% o hasta un aumento del 100% o cualquier aumento entre el 10-100% en comparación con un nivel de referencia, o al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 4 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces, o cualquier aumento entre 2 veces y 10 veces o mayor en comparación con un valor de referencia. In the present invention, the terms "increased" or "increased", used interchangeably, refer to an increase of a statistically significant amount in the value of the ratio of the invention relative to a reference value; more preferably the terms “increased” or “increased” mean an increase of at least 10% compared to a reference value, for example an increase of at least about 20%, or at least about 30%, or at least about 40%, or at least about 50%, or at least about 60%, or at least about 70%, or at least about 80%, or at least a 90% or up to a 100% increase or any increase between 10-100% compared to a reference level, or at least 2-fold, or at least 3-fold, or at least 4-fold, or at least 5-fold or at least 10-fold, or any increase between 2-fold and 10-fold or greater compared to a reference value.

Método de selección de la invenciónMethod of selecting the invention

Sorprendentemente, los presentes inventores encontraron que el valor de la ratio miR-156/ miR-172 presenta diferencias significativas en plantas con un periodo juvenil corto con respecto a plantas con un periodo juvenil mayor (Fig. 3). Surprisingly, the present inventors found that the value of the miR-156/miR-172 ratio shows significant differences in plants with a short juvenile period compared to plants with a longer juvenile period (Fig. 3).

Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para seleccionar plantas con un periodo juvenil corto, de ahora en adelante el “método de selección de la invención” caracterizado en que comprende los siguientes pasos: Thus, in another aspect, the invention relates to a method for selecting plants with a short juvenile period, hereinafter the “selection method of the invention” characterized in that it comprises the following steps:

a) cuantificar los niveles de expresión de los biomarcadores miR-156 y miR-172 en una muestra aislada de la planta; a) quantify the expression levels of the biomarkers miR-156 and miR-172 in an isolated sample of the plant;

b) calcular el valor de la ratio miR-156/miR-172 a partir de los niveles de expresión del paso a); b) calculate the value of the miR-156/miR-172 ratio from the expression levels of step a);

c) calcular la probabilidad de que la planta presente un periodo juvenil corto en función del valor de la ratio de miR-156/miR-172 del paso b); y c) calculate the probability that the plant has a short juvenile period based on the value of the miR-156/miR-172 ratio from step b); and

d) seleccionar la planta de acuerdo con el valor de probabilidad calculado en el paso c). d) select the plant according to the probability value calculated in step c).

Los términos empleados para definir el método de selección de la invención han sido explicados en el método de identificación de la invención, y tanto ellos como sus realizaciones preferidas, son aplicables al presente aspecto de la invención. The terms used to define the selection method of the invention have been explained in the identification method of the invention, and both they and their preferred embodiments are applicable to the present aspect of the invention.

En la presente invención, la expresión “seleccionar plantas con un periodo juvenil corto” se refiere a distinguir y/o elegir una planta(s) que en su proceso de desarrollo presentan o presentarán un periodo juvenil corto. In the present invention, the expression “selecting plants with a short juvenile period” refers to distinguishing and/or choosing a plant(s) that in their development process present or will present a short juvenile period.

En la presente invención las expresiones “periodo juvenil corto” o “periodo juvenil reducido”, usadas de manera intercambiable, se entienden como un periodo juvenil que presenta una reducción de tiempo de al menos entre un 20 y un 70 %, más preferiblemente de al menos el 20, 30, 40, 50, 60 o 70% con respecto a la duración media del periodo juvenil específico de la planta (donde periodo juvenil específico se refiere al periodo juvenil normal de la planta, el cual no presenta una reducción de su duración). Por ejemplo, el periodo juvenil medio (normal) de la especieOlea europaea,es de entre 10 y 15 años, de modo que el periodo en el que la planta deOlea europaea,que va desde que dicha planta germina hasta que florece por primera vez, presenta una media de entre 10 y 15 años. Por lo tanto, un periodo juvenil corto o reducido enOlea europaease refiere a un periodo juvenil con un periodo de tiempo menor a 10 años, preferiblemente un periodo juvenil corto o reducido enOlea europaeatiene una duración menor a 8 años, preferiblemente un periodo juvenil corto o reducido enOlea europaeatiene una duración menor a 6 años, más preferiblemente un periodo juvenil corto o reducido enOlea europaease refiere un periodo de tiempo comprendido entre 3 y 6 años; así un periodo juvenil corto o reducido enOlea europaeapresenta una reducción de al menos un valor entre el 60% y70 % en tiempo con respecto a un periodo de entre 10 y 15 años. In the present invention, the terms “short juvenile period” or “reduced juvenile period”, used interchangeably, are understood as a juvenile period having a reduction in time of at least 20 to 70%, more preferably at least 20, 30, 40, 50, 60 or 70% with respect to the average duration of the specific juvenile period of the plant (where “specific juvenile period” refers to the normal juvenile period of the plant, which does not have a reduction in its duration). For example, the average (normal) juvenile period of the species Olea europaea is between 10 and 15 years, such that the period in which the Olea europaea plant, from the time said plant germinates until it flowers for the first time, has an average of between 10 and 15 years. Therefore, a short or reduced juvenile period in Olea europaea refers to a juvenile period with a time period of less than 10 years, preferably a short or reduced juvenile period in Olea europaea has a duration of less than 8 years, preferably a short or reduced juvenile period in Olea europaea has a duration of less than 6 years, more preferably a short or reduced juvenile period in Olea europaea refers to a time period of between 3 and 6 years; thus a short or reduced juvenile period in Olea europaea presents a reduction of at least a value between 60% and 70 % in time with respect to a period of between 10 and 15 years.

En la presente invención, el periodo juvenil de la planta corresponde al periodo de tiempo, en condiciones no limitantes para el cultivo, donde las condiciones no limitantes para el cultivo se refieren a las condiciones óptimas de temperatura, suministro de agua y luz para el correcto desarrollo de la planta. La determinación de las condiciones no limitantes para el cultivo de una planta forma parte del conocimiento general de la persona experta en la materia, por ejemplo, las condiciones no limitantes de cultivo comprenden una iluminación adecuada, disposición de agua principalmente en primavera y otoño, y la no exposición a temperaturas extremas. In the present invention, the juvenile period of the plant corresponds to the period of time under non-limiting conditions for cultivation, where non-limiting conditions for cultivation refer to optimal temperature, water supply, and light conditions for the proper development of the plant. Determining the non-limiting conditions for the cultivation of a plant is within the general knowledge of a person skilled in the art. For example, non-limiting cultivation conditions include adequate lighting, water supply, primarily in spring and autumn, and avoidance of exposure to extreme temperatures.

En la presente invención, la expresión "calcular la probabilidad” se refiere a un cálculo matemático de las posibilidades que existen de que un suceso o resultado asociado a una variable ocurra, más preferiblemente en la presente invención, el suceso o resultado es que la planta presente un período juvenil corto o reducido. In the present invention, the expression "calculating the probability" refers to a mathematical calculation of the possibilities that exist for an event or result associated with a variable to occur, more preferably in the present invention, the event or result is that the plant presents a short or reduced juvenile period.

De acuerdo con el conocimiento de la persona experta en la materia, los cálculos de probabilidades se pueden llevar a cabo mediante un modelo de predicción, como los modelos regresión donde el periodo juvenil (variable dependiente) está influido significativamente por variables independientes como miR-156, miR-172, o la ratio entre ambos. According to the knowledge of the person skilled in the art, probability calculations can be carried out using a prediction model, such as regression models where the juvenile period (dependent variable) is significantly influenced by independent variables such as miR-156, miR-172, or the ratio between the two.

Así, en una realización preferida del método de selección de la invención, el cálculo de probabilidad el paso c) se realiza aplicando el valor de la ratio miR-156/miR-172 a un modelo de predicción de regresión logística. Thus, in a preferred embodiment of the selection method of the invention, the probability calculation in step c) is performed by applying the value of the miR-156/miR-172 ratio to a logistic regression prediction model.

En la presente invención, los términos "modelo de regresión logística”, "modelo predicción de regresión logística” o "modelo logit” usados de manera intercambiable, se refieren a un modelo de elección binaria, el cual se basa en una distribución acumulada logística estándar, preferiblemente mediante una función que consiste en calcular el logaritmo de la razón del cociente entre dos probabilidades y se basa en la probabilidad con la que sucede un evento. In the present invention, the terms "logistic regression model", "logistic regression prediction model" or "logit model" used interchangeably, refer to a binary choice model, which is based on a standard logistic cumulative distribution, preferably by means of a function that consists of calculating the logarithm of the ratio of the quotient between two probabilities and is based on the probability with which an event occurs.

En otra realización preferida del método de selección de la invención, el modelo de predicción de regresión logística corresponde a la fórmula (I): In another preferred embodiment of the selection method of the invention, the logistic regression prediction model corresponds to formula (I):

- donde "y” se calcula aplicando una regresión lineal de acuerdo con la fórmula (II): - where "y" is calculated by applying a linear regression according to formula (II):

- y donde "R” es el valor de la ratio miR-156/miR-172 obtenido de la muestra de estudio, calculado en el paso b). - where "R" is the miR-156/miR-172 ratio obtained from the study sample, calculated in step b).

El valor "P” de la fórmula (I) representa la probabilidad de un resultado particular, donde dicha probabilidad está en el rango que va de 0 a 1. En la presente invención el valor de "P” se refiere al valor de probabilidad de que una planta presente un periodo juvenil corto. Específicamente, cuanto más cercano sea el valor de P a 1 más probable será que esta planta presente dicho periodo juvenil corto. The "P" value in formula (I) represents the probability of a particular outcome, where said probability is in the range from 0 to 1. In the present invention the "P" value refers to the probability value of a plant exhibiting a short juvenile period. Specifically, the closer the P value is to 1 the more likely it is that this plant exhibits said short juvenile period.

Los valores de "m” y "b” en la fórmula (II) corresponden a la pendiente y la ordenada en el origen, respectivamente, y donde el modelo de predicción logística es obtenido en base a los valores de las ratios de miRNA 156/ miRNA 172 determinados en muestras de la planta tomadas en diferentes tiempos, y distribuidos binomialmente según el estado de floración, donde 0=planta no florecida (estado juvenil) y 1=planta florecida (estado adulto). La persona experta en la materia puede calcular de manera rutinaria los valores de "m” y "b”. The values of "m” and "b” in formula (II) correspond to the slope and the intercept, respectively, and where the logistic prediction model is obtained based on the values of the miRNA 156/miRNA 172 ratios determined in plant samples taken at different times, and binomially distributed according to the flowering state, where 0=non-flowering plant (juvenile state) and 1=flowering plant (adult state). The person skilled in the art can routinely calculate the values of "m” and "b”.

En otra realización preferida del método de selección de la invención, la planta es seleccionada como una planta con un periodo juvenil corto cuando el valor de la probabilidad calculada en el paso c) es mayor o igual que un límite de referencia, donde dicho límite de referencia es previamente establecido. En la presente invención, el término "límite de referencia” se refiere a un valor de referencia dePde acuerdo con la fórmula (I), donde dicho límite de referencia es estadísticamente predictivo del periodo juvenil de la planta. En una realización preferida del método de selección de la invención, el valor del límite de referencia es al menos 0,5, más preferiblemente el valor del límite de referencia es de 0,5. Por tanto, cuando el valor de P, calculado de acuerdo con el método de la invención, es mayor o igual que 0,5, la planta se selecciona o clasifica como una planta con un periodo juvenil corto. En la presente invención, los términos "límite de referencia” o "punto de corte de referencia”, son sinónimos y pueden ser usados de manera intercambiable. In another preferred embodiment of the selection method of the invention, the plant is selected as a plant with a short juvenile period when the value of the probability calculated in step c) is greater than or equal to a reference limit, where said reference limit is previously established. In the present invention, the term "reference limit" refers to a reference value of P according to formula (I), where said reference limit is statistically predictive of the juvenile period of the plant. In a preferred embodiment of the selection method of the invention, the value of the reference limit is at least 0.5, more preferably the value of the reference limit is 0.5. Therefore, when the value of P, calculated according to the method of the invention, is greater than or equal to 0.5, the plant is selected or classified as a plant with a short juvenile period. In the present invention, the terms "reference limit" or "reference cut-off point" are synonymous and may be used interchangeably.

Mediante el método de selección de la invención, la selección de la planta o plantas con un periodo juvenil corto se puede realizar dentro de una población de plantas con distintas duraciones de la etapa juvenil. De modo que el método de selección de la invención permite distinguir aquellas que presentan o presentarán un periodo juvenil corto con respecto al resto. Por lo que el método de selección de la invención se puede usar en programas de mejora de plantas, como por ejemplo el olivo, para seleccionar las plantas que alcancen su etapa adulta en un periodo de tiempo menor. Using the selection method of the invention, the plant or plants with a short juvenile period can be selected from a population of plants with different juvenile stage lengths. Thus, the selection method of the invention makes it possible to distinguish those that have or will have a short juvenile period from the rest. Therefore, the selection method of the invention can be used in plant improvement programs, such as the olive tree, to select plants that reach their adult stage in a shorter period of time.

El método de selección de la invención se puede aplicar a una planta o población de plantas que se encuentran en periodo juvenil (por ejemplo, la planta se encuentra en estadío de plántula), de modo que se puede seleccionar la planta o plantas que alcanzarán su fase adulta en un periodo de tiempo menor. Esta selección temprana en la etapa juvenil de la planta permite seleccionar plantas que serán productivas en un menor tiempo, por lo que las plantas que no son seleccionadas como plantas con una etapa juvenil corta son descartadas. De esta manera, los recursos aplicados en el cultivo de plantas, en especial plantas productoras de frutos de interés humano o animal, pueden ser optimizados. En la presente invención, las expresiones “seleccionar una planta” y “clasificar una planta”, tienen significados equivalentes y pueden ser usados de manera intercambiable. The selection method of the invention can be applied to a plant or population of plants in the juvenile stage (e.g., the plant is in the seedling stage), such that the plant or plants that will reach their adult phase in a shorter period of time can be selected. This early selection in the juvenile stage of the plant allows for the selection of plants that will be productive in a shorter time, so that plants that are not selected, such as plants with a short juvenile stage, are discarded. In this way, the resources applied to the cultivation of plants, especially plants that produce fruits of human or animal interest, can be optimized. In the present invention, the expressions "selecting a plant" and "classifying a plant" have equivalent meanings and can be used interchangeably.

Así, en otra realización preferida del método de selección de la invención, la planta se encuentra en estado juvenil. Alternativamente, en la presente realización preferida se puede decir que la planta se encuentra en un estado previo al estado adulto. Thus, in another preferred embodiment of the selection method of the invention, the plant is in a juvenile state. Alternatively, in the present preferred embodiment, the plant can be said to be in a pre-adult state.

En una realización más preferida la planta del método de selección en la invención se encuentra en forma plántula. In a more preferred embodiment, the plant of the selection method in the invention is in seedling form.

El término “plántula” se refiere a una planta en sus primeras etapas de desarrollo, a partir de la germinación de la semilla, preferiblemente se refiere a aquellas plantas nacidas de semilla que aún no han alcanzado el año de edad. The term “seedling” refers to a plant in its early stages of development, beginning with seed germination, preferably referring to those plants grown from seed that have not yet reached one year of age.

En una realización preferida, la muestra aislada de la planta para la cuantificación de la etapa a) del método de selección de la invención, consiste en muestras de hoja. In a preferred embodiment, the sample isolated from the plant for the quantification of step a) of the selection method of the invention consists of leaf samples.

Los métodos por los cuales se pueden cuantificar los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención han sido explicados en el método de identificación de la invención, siendo aplicables al método de selección de la invención. The methods by which the expression levels of the biomarkers of the invention can be quantified have been explained in the identification method of the invention, being applicable to the selection method of the invention.

En una realización preferida del método de selección de la invención, la planta es una planta cultivada. In a preferred embodiment of the selection method of the invention, the plant is a cultivated plant.

En una realización más preferida del método de selección de la invención, la planta que pertenece a un género seleccionado de la lista que consiste en:Olea, Citrus, Prunus Pistacia, MagniferayPersea.In a more preferred embodiment of the selection method of the invention, the plant belonging to a genus selected from the list consisting of: Olea, Citrus, Prunus Pistacia, Magnifera and Persea.

En una realización aún más preferida del método de selección de la invención, la planta pertenece a una especie seleccionada de la lista que consiste en:Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica y Persea americana.In an even more preferred embodiment of the selection method of the invention, the plant belongs to a species selected from the list consisting of: Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica and Persea americana.

En una realización más preferida del método de selección de la invención, la planta esOlea europaea.In a more preferred embodiment of the selection method of the invention, the plant is Olea europaea.

En otra realización preferida del método de selección de la invención, cuando la planta esOlea europaea,la fórmula (II) es: In another preferred embodiment of the selection method of the invention, when the plant is Olea europaea, formula (II) is:

y =3 ,379 - 0 ,184 XRy = 3 .379 - 0 .184 XR

- donde “R” es el valor de la ratio miR-156/miR-172 calculado en el paso b); - Preferiblemente donde la planta se selecciona como una planta con un periodo juvenil corto cuando el valor de “P” en la formula (I) es mayor o igual que el límite de referencia; y - where “R” is the value of the miR-156/miR-172 ratio calculated in step b); - Preferably where the plant is selected as a plant with a short juvenile period when the value of “P” in formula (I) is greater than or equal to the reference limit; and

- Preferiblemente donde el periodo juvenil es menor de 6 años, más preferiblemente un periodo de entre 3 y 6 años. - Preferably where the juvenile period is less than 6 years, more preferably a period between 3 and 6 years.

El modelo establecido por los inventores sorprendentemente muestra una probabilidad de acierto de un 84,90% (ejemplo 3 de la presente invención). El porcentaje de acierto del marcador de selección más empleado actualmente (altura) tiene un porcentaje aproximado de acierto del 50%. Por tanto, todo valor que supere este porcentaje (50%) se considerará una optimización del método empleado actualmente. The model established by the inventors surprisingly shows a success rate of 84.90% (Example 3 of the present invention). The success rate of the most commonly used selection marker (height) is approximately 50%. Therefore, any value exceeding this percentage (50%) will be considered an optimization of the currently used method.

Usos de la invención Uses of the invention

Los términos empleados para definir los usos de la invención han sido explicados en el apartado de métodos de la invención, y tanto ellos como sus realizaciones preferidas, son aplicables a los aspectos relacionados con los usos de la invención que se explican a continuación. The terms used to define the uses of the invention have been explained in the section on methods of the invention, and both they and their preferred embodiments are applicable to the aspects related to the uses of the invention that are explained below.

Uso de identificación de la invenciónUse of identification of the invention

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de los niveles de expresión de los biomarcadores miR-156 y miR-172, para identificar el estado de desarrollo de una planta, de ahora en adelante "uso de identificación de la invención”. In another aspect, the invention relates to the use of the expression levels of the biomarkers miR-156 and miR-172, to identify the developmental status of a plant, hereinafter "identification use of the invention."

De acuerdo con los hallazgos de los inventores, los niveles de expresión de los biomarcadores miR-156 y miR-172 presentaron diferencias en sus niveles de expresión entre los estados de desarrollo en las plantas que se cuantificaron, concretamente la ratio de los niveles de expresión miR-156/ miR-172 presentó diferencias significativas entre los estados juvenil y adulto en una planta. According to the inventors' findings, the expression levels of the biomarkers miR-156 and miR-172 showed differences in their expression levels between the developmental stages in the plants that were quantified, specifically the ratio of the miR-156/miR-172 expression levels showed significant differences between the juvenile and adult stages in a plant.

Por lo que, en una realización preferida, el uso de identificación de la invención se refiere al uso de la ratio de los niveles de expresión de los biomarcadores miR-156 y miR-172 para identificar el estado de desarrollo de una planta, donde dicha ratio es miR-156/miR-172. Therefore, in a preferred embodiment, the identification use of the invention relates to the use of the ratio of the expression levels of the biomarkers miR-156 and miR-172 to identify the developmental state of a plant, where said ratio is miR-156/miR-172.

En una realización preferida del uso de identificación de la invención, un valor de la ratio miR-156/miR-172 menor a un valor de referencia es indicativo de un estado adulto. In a preferred embodiment of the identification use of the invention, a value of the miR-156/miR-172 ratio less than a reference value is indicative of an adult state.

Uso de selección de la invenciónSelection use of the invention

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los niveles de expresión de los biomarcadores miR-156 y miR-172, para la selección de plantas con un periodo juvenil corto de ahora en adelante "uso de selección de la invención”. Another aspect of the present invention relates to the use of the expression levels of the biomarkers miR-156 and miR-172, for the selection of plants with a short juvenile period, hereinafter "selection use of the invention."

De acuerdo con los hallazgos de los inventores, los niveles de expresión de los biomarcadores miR-156 y miR-172 presentaron diferencias en sus niveles de expresión entre plantas con un periodo juvenil corto, concretamente la ratio miR-156/miR-172 obtenida a partir de los niveles de expresión, presentó diferencias significativas en aquellas plantas con un periodo juvenil corto con respecto a aquellas plantas que presentaron un periodo juvenil normal. According to the inventors' findings, the expression levels of the biomarkers miR-156 and miR-172 showed differences in their expression levels between plants with a short juvenile period, specifically the miR-156/miR-172 ratio obtained from the expression levels showed significant differences in those plants with a short juvenile period compared to those plants that had a normal juvenile period.

Por lo que, en una realización preferida, el uso de selección de la invención se refiere al uso de la ratio de los de los niveles de expresión de los biomarcadores miR-156 y miR-172, donde dicha ratio es miR-156/miR-172. Therefore, in a preferred embodiment, the selection use of the invention refers to the use of the ratio of the expression levels of the biomarkers miR-156 and miR-172, where said ratio is miR-156/miR-172.

En otra realización preferida el uso de selección de la invención, la planta se encuentra en estado juvenil. Alternativamente, en la presente realización preferida se puede decir que la planta se encuentra en un estado previo al estado adulto. In another preferred embodiment of the selection method of the invention, the plant is in a juvenile state. Alternatively, in the present preferred embodiment, the plant can be said to be in a pre-adult state.

En una realización más preferida la planta del uso de selección en la invención, la planta se encuentra en forma plántula. In a more preferred embodiment of the plant selection method of the invention, the plant is in seedling form.

En realizaciones preferidas de los usos de la invención, la planta es una planta de cultivo. In preferred embodiments of the uses of the invention, the plant is a crop plant.

En realizaciones más preferidas de los usos de la invención, la planta pertenece a un género seleccionado de la lista que consiste en:Olea, Citrus, Prunus, Pistacia, MagniferayPerseaIn more preferred embodiments of the uses of the invention, the plant belongs to a genus selected from the list consisting of: Olea, Citrus, Prunus, Pistacia, Magnifera and Persea

En realizaciones aún más preferidas de los usos de la invención, la planta pertenece a una especie seleccionada de la lista que consiste en:Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica y Persea americana.In even more preferred embodiments of the uses of the invention, the plant belongs to a species selected from the list consisting of: Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica and Persea americana.

En realizaciones preferidas de los usos de la invención, los niveles de expresión de los biomarcadores miR-156 y miR-172, son cuantificados en una muestra aislada de la planta; donde dicha muestra es preferiblemente hoja. In preferred embodiments of the invention, the expression levels of the biomarkers miR-156 and miR-172 are quantified in an isolated sample of the plant; said sample is preferably a leaf.

Kits y usos del kit de la invención Kits and uses of the kit of the invention

La puesta en práctica de los usos y los métodos de la invención se basan en la cuantificación de los niveles de los biomarcadores de la invención en una muestra aislada de una planta. Los medios empleados para la cuantificación de los biomarcadores miR-156 y miR-172 pueden estar formando parte de un kit. The implementation of the uses and methods of the invention is based on the quantification of the levels of the biomarkers of the invention in an isolated sample of a plant. The means used for quantifying the miR-156 and miR-172 biomarkers may be part of a kit.

Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit, de ahora en adelante el "kit de la invención”, comprende medios para cuantificarin vitrolos niveles de expresión de miR-156, y los niveles de expresión de miR-172, en una muestra aislada de una planta. Thus, another aspect of the present invention relates to a kit, hereinafter the "kit of the invention", comprising means for quantifying in vitro the expression levels of miR-156, and the expression levels of miR-172, in an isolated sample of a plant.

En una realización preferida, el kit de la invención además comprende los reactivos necesarios para llevar a cabo la técnica RT-qPCR. Preferiblemente los medios del kit comprenden cebadores y sondas que permiten la detección y cuantificación de forma específica de los niveles de expresión de miR-156 y miR-172. In a preferred embodiment, the kit of the invention also comprises the reagents necessary to carry out the RT-qPCR technique. Preferably, the kit's media comprise primers and probes that allow for the specific detection and quantification of miR-156 and miR-172 expression levels.

En una realización preferida, el kit de la invención además comprende medios, preferiblemente cebadores y una sonda, para detectar y cuantificar de forma específica los niveles de expresión del biomarcador de referencia rARN 5S de la planta, donde el biomarcador rARN 5S de la planta comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:3. In a preferred embodiment, the kit of the invention further comprises means, preferably primers and a probe, to specifically detect and quantify the expression levels of the plant 5S rRNA reference biomarker, where the plant 5S rRNA biomarker comprises the nucleotide sequence SEQ ID NO:3.

Como sabe un experto en la materia, los niveles de miARNs pueden determinarse mediante técnicas y métodos conocidos en el estado de la técnica, tal y como se ha explicado en aspectos inventivos anteriores, y tanto ellas como sus realizaciones preferidas, son aplicables al kit de la invención. As one skilled in the art knows, miRNA levels can be determined by techniques and methods known in the state of the art, as explained in previous inventive aspects, and both they and their preferred embodiments are applicable to the kit of the invention.

Además, como entiende un experto en la materia, el kit puede comprender otros componentes útiles en la puesta en práctica de la presente invención, tales como, soluciones tamponadoras, vehículos de entrega, soportes del material, componentes de controles positivos y/o negativos, etc. Además de los componentes mencionados, los kits podrán incluir también instrucciones para practicar el objeto de la invención. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits mencionados en una variedad de formas, uno o más de los cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p. ej., una hoja o hojas de papel en las que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un inserto de paquete, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un CD, un USB, etc., en el que se haya registrado la información. Otro medio que puede estar presente es una dirección de sitio web que puede utilizarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio remoto. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits. Furthermore, as understood by one of ordinary skill in the art, the kit may comprise other components useful in practicing the present invention, such as buffer solutions, delivery vehicles, material supports, positive and/or negative control components, etc. In addition to the aforementioned components, the kits may also include instructions for practicing the subject matter of the invention. These instructions may be present in the aforementioned kits in a variety of forms, one or more of which may be present in the kit. One form in which these instructions may be present is as printed information on a suitable medium or substrate, e.g., a sheet or sheets of paper on which the information is printed, on the kit packaging, on a package insert, etc. Another medium would be a computer-readable medium, for example, a CD, a USB, etc., on which the information is recorded. Another medium that may be present is a website address that can be used over the Internet to access the information at a remote site. Any convenient medium may be present in the kits.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención en cualquiera de los métodos y/o usos de la invención. Thus, in another aspect, the invention relates to the use of the kit of the invention in any of the methods and/or uses of the invention.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención para identificar el estado de desarrollo de una planta. In another aspect, the invention relates to the use of the kit of the invention to identify the development stage of a plant.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención para la selección de plantas con un periodo juvenil corto. In another aspect, the invention relates to the use of the kit of the invention for the selection of plants with a short juvenile period.

Los términos empleados para definir el kit de la invención y los usos del kit de la invención han sido explicados para los métodos de la invención, y tanto ellos como sus realizaciones preferidas son aplicables a los diferentes usos del kit de la invención. The terms used to define the kit of the invention and the uses of the kit of the invention have been explained for the methods of the invention, and both they and their preferred embodiments are applicable to the different uses of the kit of the invention.

En realizaciones preferidas del kit de la invención y sus usos, la planta es una planta de cultivo. In preferred embodiments of the kit of the invention and its uses, the plant is a crop plant.

En realizaciones preferidas del kit de la invención y su uso, la planta pertenece a un género seleccionado de la lista que consiste en:Olea, Citrus, Prunus, Pistacia, MagniferayPerseaIn preferred embodiments of the kit of the invention and its use, the plant belongs to a genus selected from the list consisting of: Olea, Citrus, Prunus, Pistacia, Magnifera and Persea

En realizaciones preferidas del kit de la invención y uso del kit de la invención, la muestra aislada de la planta es una muestra de hoja. In preferred embodiments of the kit of the invention and use of the kit of the invention, the sample isolated from the plant is a leaf sample.

En realizaciones preferidas del kit de la invención como su uso, la planta pertenece a una especie seleccionada de la lista que consiste en:Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica y Persea americana.In preferred embodiments of the kit of the invention as its use, the plant belongs to a species selected from the list consisting of: Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica and Persea americana.

En realizaciones del uso del kit de la invención para la selección de plantas con un periodo juvenil corto, la planta se encuentra en estado juvenil, preferiblemente en forma de plántula. In embodiments of the use of the kit of the invention for the selection of plants with a short juvenile period, the plant is in a juvenile state, preferably in the form of a seedling.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DESCRIPTION OF THE FIGURES

Fig. 1. Análisis mediante RT-qPCR de la expresión relativa de (A) miARN 156, (B) miARN 172 y (C) la ratio de miR-156/miR-172 medida en dos grupos de plantas de olivo de la misma edad, pero en distintos estados de desarrollo: juvenil y adulto. Los resultados permiten diferenciar ambos grupos de desarrollo a partir de los niveles de expresión. * p < 0.05, *** p < 0,001. Fig. 1. RT-qPCR analysis of the relative expression of (A) miRNA 156, (B) miRNA 172 and (C) the miR-156/miR-172 ratio measured in two groups of olive plants of the same age but at different developmental stages: juvenile and adult. The results allow differentiating both developmental groups based on their expression levels. * p < 0.05, *** p < 0.001.

Fig. 2. Análisis mediante RT-qPCR de la expresión relativa de (A) miARN 156, (B) miARN 172 y (C) la ratio miR-156/miR-172 en plantas de olivo en cinco estados de desarrollo distinto. La ratio miR-156/miR-172 (C) permite establecer un gradiente de desarrollo en función de los niveles de expresión de los miARN156 (A) y miARN172 (B), donde, a menor grado de desarrollo de la planta, mayor es el valor obtenido para la ratio. Los grupos estadísticamente distintos se indican con las letras A, B y C, o la combinación de estas en el caso de los grupos intermedios, P < 0,05. Plántula: planta en estadio del desarrollo que comienza cuando la semilla germina. Planta juvenil: Planta que no ha alcanzado la plena madurez, fundamentalmente la sexual, por lo cual no tiene capacidad de floración. Planta adulta: La planta es adulta cuando está preparada para la reproducción sexual, es decir, cuando adquiere la capacidad de florecer. Cono de juvenilidad: Árbol procedente de semilla que se encuentra en fase de transición de la etapa juvenil a la adulta. En este árbol podemos encontrar una parte adulta (cono adulto), cuyos tejidos presentan características adultas y por tanto pueden presentar floración, y una parte juvenil (cono juvenil), cuyos tejidos presentan características juveniles y por tanto no tienen capacidad de producir floración. En el cono de juvenilidad la parte adulta se encuentra en la parte más apical del árbol, mientras que la parte juvenil se encuentra en la parte basal. Fig. 2. RT-qPCR analysis of the relative expression of (A) miRNA 156, (B) miRNA 172 and (C) the miR-156/miR-172 ratio in olive plants at five different developmental stages. The miR-156/miR-172 ratio (C) allows establishing a developmental gradient based on the expression levels of miRNA 156 (A) and miRNA 172 (B), where the lower the stage of plant development, the higher the value obtained for the ratio. Statistically distinct groups are indicated by the letters A, B and C, or a combination of these in the case of intermediate groups, P < 0.05. Seedling: plant at the stage of development that begins when the seed germinates. Juvenile plant: Plant that has not reached full maturity, mainly sexual maturity, and therefore is not capable of flowering. Adult plant: A plant is considered adult when it is ready for sexual reproduction, that is, when it acquires the capacity to flower. Juvenile cone: A tree grown from seed that is in the transition phase from the juvenile to the adult stage. In this tree, we can find an adult part (adult cone), whose tissues have adult characteristics and are therefore capable of flowering, and a juvenile part (juvenile cone), whose tissues have juvenile characteristics and are therefore not capable of flowering. In the juvenile cone, the adult part is located at the apical part of the tree, while the juvenile part is located at the base.

Fig. 3. Análisis mediante RT-qPCR de la variación temporal del (A) miARN156, (B) miARN 172 y (C) la ratio miR-156/miR-172 en hojas de olivo. Análisis mediante RT-qPCR de la variación temporal del (D) miARN156, (E) miARN 172 y (F) la ratio miR-156/miR-172 diferenciando variedades con periodo juvenil corto y periodo juvenil largo en hojas de olivo. * p<0.05 vs Periodo Juvenil Largo, ** p<0.01 vs Periodo Juvenil Largo; *** p<0.001 vs Periodo Juvenil Largo. Fig. 3. RT-qPCR analysis of the temporal variation of (A) miRNA156, (B) miRNA 172 and (C) the miR-156/miR-172 ratio in olive leaves. RT-qPCR analysis of the temporal variation of (D) miRNA156, (E) miRNA 172 and (F) the miR-156/miR-172 ratio differentiating varieties with short and long juvenile period in olive leaves. * p<0.05 vs Long Juvenile Period, ** p<0.01 vs Long Juvenile Period; *** p<0.001 vs Long Juvenile Period.

EJEMPLOS EXAMPLES

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención. The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which demonstrate the effectiveness of the product of the invention.

Ejemplo 1. Determinación de los niveles de expresión de miR-156, y miR-172 en plantas de olivo como indicadores de su estado de desarrollo (juvenil/adulto). Example 1. Determination of the expression levels of miR-156 and miR-172 in olive plants as indicators of their developmental status (juvenile/adult).

Para conocer la expresión de los miARNs involucrados en el cambio de fase juveniladulto, se tomaron los dos pares de hojas del tercer y cuarto nudo a partir del ápice de los brotes de un año de cada planta. Las muestras se almacenaron inmediatamente a -80°C hasta su procesamiento. To determine the expression of miRNAs involved in the juvenile-to-adult phase transition, two pairs of leaves were taken from the third and fourth nodes of the apex of one-year-old shoots from each plant. The samples were immediately stored at -80°C until processing.

Primero se realizó la disrupción y homogeneización de la muestra mediante el uso de TissueLyser (disrupción mecánica) y fue de la siguiente manera: de las hojas muestreadas se cortaron de dos a tres discos de hojas de olivo de aproximadamente 1 cm de diámetro cada uno. A continuación, los discos se colocaron en un tubo de 2 ml libre de nucleasas con dos bolas de acero inoxidable de 5 mm. Utilizando un Retsch TissueLyser Mixer Mill Grinder Homogenizer Cell Disrupter Retsch MM200 las muestras se molieron con tres ciclos consecutivos de un minuto a 30 Hz. Entre cada ciclo, las muestras se volvieron a sumergir en nitrógeno líquido para evitar la descongelación y la degradación. First, the sample was disrupted and homogenized using a TissueLyser (mechanical disruption) as follows: two to three olive leaf discs of approximately 1 cm diameter each were cut from the sampled leaves. The discs were then placed in a 2 ml nuclease-free tube with two 5 mm stainless steel balls. Using a Retsch TissueLyser Mixer Mill Grinder Homogenizer Cell Disrupter Retsch MM200, the samples were ground with three consecutive one-minute cycles at 30 Hz. Between each cycle, the samples were re-immersed in liquid nitrogen to prevent thawing and degradation.

El ARN total se aisló de las muestras recolectadas utilizando el kit comercial RNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante, incluyendo un paso adicional en el que las muestras en búfer RLT se incuban a 56°C durante 2 minutos. El ARN se almacenó a -80°C hasta su procesamiento y se analizó su concentración y calidad mediante el uso de un espectrofotómetro (Nanodrop). Total RNA was isolated from collected samples using the commercial RNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) following the protocol provided by the manufacturer, including an additional step in which samples were incubated at 56°C for 2 minutes in RLT buffer. RNA was stored at -80°C until processing and its concentration and quality were analyzed using a spectrophotometer (Nanodrop).

Para identificar los miARNs implicados en la transición de fase juvenil-adulto, los inventores llevaron a cabo previamente estudios de perfiles de expresión génica, a partir de la generación de librerías de ARNs pequeños (smallRNA) utilizando tejido de hoja en estado juvenil y adulto de varios olivos en transición de fase (juvenil-adulto) que mostraban un cono de juvenilidad evidente. Después del análisis bioinformático, un número reducido de miARNs se expresaron significativamente de manera diferencial entre las etapas juvenil y adulta. To identify miRNAs involved in the juvenile-to-adult phase transition, the inventors previously performed gene expression profiling studies, generating small RNA libraries using juvenile and adult leaf tissue from several olive trees in phase transition (juvenile-to-adult) that displayed a clear juvenile cone. After bioinformatics analysis, a small number of miRNAs were significantly differentially expressed between the juvenile and adult stages.

Teniendo en cuenta estos resultados, los inventores seleccionaron los siguientes miARNs debido a su posible función crucial en la transición de fase juvenil a adulta: miARN-156 (SEQ ID NO: 1) y miARN-172 (SEQ ID NO: 2). Paralelamente, de las mismas librerías de smallRNA, se seleccionó el rRNA 5S (SEQ ID NO: 3) como el gen de referencia más fiable debido a su estabilidad de expresión evaluada mediante análisis bioinformáticos y posteriormente con el software RefFinder (https://www.heartcure.com.au/reffinder/) a partir de los resultados de la PCR. Considering these results, the inventors selected the following miRNAs due to their potential crucial roles in the juvenile-to-adult phase transition: miRNA-156 (SEQ ID NO: 1) and miRNA-172 (SEQ ID NO: 2). In parallel, from the same smallRNA libraries, 5S rRNA (SEQ ID NO: 3) was selected as the most reliable reference gene due to its expression stability assessed by bioinformatics analysis and subsequently with the RefFinder software (https://www.heartcure.com.au/reffinder/) based on the PCR results.

El diseño de los cebadores y sondas de miARNs se realizó a través de la interfaz de ThermoFisher. Para determinar y monitorizar la expresión de los miARNs se utilizó un proceso que incluye dos pasos. En el primer paso, se realizó una retrotranscripción (RT) múltiple de todos los miARNs maduros de interés mediante el uso del kit de transcripción TaqMan MicroRNA (ThermoFisher Scientific) para obtener el ADN complementario (cDNA). Para ello, se preparó una mezcla personalizada de cebadores "horquilla” de RT mediante la combinación de todos los cebadores y sondas específicas de los miARNs diana (miR156 y miR172) y del gen de referencia (5S): miR156 (Ref. 4398987, Custom TaqMan small RNA assay, ThermoFisher); miR172 (Ref. 4440886, TaqMan microRNA assay. TermoFisher); rARN 5S (Ref. Custom desalt assay SM each CCU001S, ID: GACD55456::839501. TermoFisher). Esta mezcla se realizó agregando 2 j l de cada uno de los cebadores y diluyendo la mezcla en un volumen final de 200 j l de tampón 1xTris-EDTA para obtener una dilución final de 0,05x. Posteriormente, para cada reacción de RT multiplex, se agregaron 6 j l de la mezcla de cebadores a la mezcla de reacción, que contenía 0,3 |jl de dNTP 100 mM, 3 |jl de transcriptasa inversa MultiScribe (50 U/jl), 1,5 j l de tampón de RT 10x, 0,19 j l de inhibidor de RNasa (20 U/ l) y 1,01 j l de agua libre de nucleasas. A continuación, se añadió un volumen de 3 j l de ARN total (33,3 ng/jl) a la mezcla descrita anteriormente. Todo el proceso se llevó a cabo en condiciones de frío. Por último, la mezcla final (15 jl) se sometió a transcripción inversa utilizando un termociclador T100TM de 96 pocillos (Bio-Rad) con las siguientes condiciones: 30 min a 16°C para la fase de anillamiento de los cebadores, 30 min a 42°C para la fase de extensión, y 5 min a 85°C para detener la reacción. Finalmente, se fijó una temperatura de 4°C para garantizar la integridad del cDNA resultante, hasta su almacenamiento a -20°C. The design of miRNA primers and probes was performed through the ThermoFisher interface. A two-step process was used to determine and monitor miRNA expression. In the first step, multiplex reverse transcription (RT) of all mature miRNAs of interest was performed using the TaqMan MicroRNA Transcription Kit (ThermoFisher Scientific) to obtain complementary DNA (cDNA). To do this, a custom RT hairpin primer mix was prepared by combining all primers and probes specific for the target miRNAs (miR156 and miR172) and the reference gene (5S): miR156 (Ref. 4398987, Custom TaqMan small RNA assay, ThermoFisher); miR172 (Ref. 4440886, TaqMan microRNA assay, ThermoFisher); 5S rRNA (Ref. Custom desalt assay SM each CCU001S, ID: GACD55456::839501. TermoFisher). This mixture was made by adding 2 j l of each of the primers and diluting the mixture in a final volume of 200 j l of 1xTris-EDTA buffer to obtain a final dilution of 0.05x. Subsequently, for each multiplex RT reaction, 6 j l of the primer mix was added to the reaction mixture, which contained 0.3 |jl of 100 mM dNTPs, 3 |jl of MultiScribe reverse transcriptase (50 U/jl), 1.5 j l of 10x RT buffer, 0.19 j l of RNase inhibitor (20 U/ l) and 1.01 j l of nuclease-free water. Next, a volume of 3 μl of total RNA (33.3 ng/μl) was added to the mixture described above. The entire process was carried out under cold conditions. Finally, the final mixture (15 μl) was subjected to reverse transcription using a 96-well T100™ thermal cycler (Bio-Rad) under the following conditions: 30 min at 16°C for the primer annealing step, 30 min at 42°C for the extension step, and 5 min at 85°C to stop the reaction. Finally, a temperature of 4°C was set to ensure the integrity of the resulting cDNA, until its storage at -20°C.

En el segundo paso, se realizó una PCR en tiempo real (qPCR) para determinar los niveles de expresión de los miARNs aplicando un ensayo de sonda TaqMan qPCR. Las reacciones de qPCR se llevaron a cabo en volúmenes finales de 20 j l utilizando el sistema de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX96™. La mezcla de reacción constaba de 10 j l de TaqMan® Fast Advanced Master Mix (2X), 1 j l de TaqMan® Advanced miARN Assay (20X) que contiene los cebadores y las sondas marcadas con un fluoróforo denominado colorante FAM™, 7,67 ^l de agua libre de nucleasas y 1,33 ^l de una dilución 1:5 del stock de cDNA. Las reacciones se incubaron en una placa de 96 pocillos a 95°C durante 20 segundos, seguidas de 40 ciclos de 95°C durante 3 segundos y 60°C durante 30 segundos. Además, en cada placa de 96 pocillos se incorporó un control negativo (esta muestra incluía todos los reactivos de PCR, pero el volumen correspondiente al cDNA molde se sustituyó por agua libre de nucleasas). Junto con el gen de referencia (5S), utilizado en el proceso de normalización de los datos, se calcularon las curvas de eficiencia de cada PCR a tiempo real para determinar la expresión relativa de miRNA156 y miRNA172 siguiendo el modelo descrito por (Pfaffl, M. W. (2007). Relative quantification. Real-Time PCR, 64-82). Las curvas de eficiencia se generaron para los 2 miARNs (miR-156 y miR-172) y el gen de referencia (5S). In the second step, real-time PCR (qPCR) was performed to determine the expression levels of miRNAs using a TaqMan qPCR probe assay. qPCR reactions were carried out in final volumes of 20 µl using the Bio-Rad CFX96™ Real-Time PCR System. The reaction mixture consisted of 10 µl of TaqMan® Fast Advanced Master Mix (2X), 1 µl of TaqMan® Advanced miRNA Assay (20X) containing primers and probes labeled with a fluorophore called FAM™ dye, 7.67 µl of nuclease-free water, and 1.33 µl of a 1:5 dilution of the cDNA stock. The reactions were incubated in a 96-well plate at 95°C for 20 seconds, followed by 40 cycles of 95°C for 3 seconds and 60°C for 30 seconds. In addition, a negative control was incorporated into each 96-well plate (this sample included all PCR reagents, but the volume corresponding to the template cDNA was replaced with nuclease-free water). Together with the reference gene (5S), used in the data normalization process, the efficiency curves of each real-time PCR were calculated to determine the relative expression of miRNA156 and miRNA172 following the model described by (Pfaffl, M. W. (2007). Relative quantification. Real-Time PCR, 64-82). The efficiency curves were generated for the 2 miRNAs (miR-156 and miR-172) and the reference gene (5S).

La ratio miR156/miR172 fue indicativa del estado de desarrollo (juvenil/adulto) de las plantas analizadas, siendo alto en plantas juveniles y decreciendo progresivamente hasta ser cercanos a cero en plantas adultas (Fig.1 donde la planta se identificó como potencialmente juvenil cuando el valor de la ratio fue mayor que 1; y Fig.2). The miR156/miR172 ratio was indicative of the developmental state (juvenile/adult) of the plants analyzed, being high in juvenile plants and progressively decreasing until being close to zero in adult plants (Fig. 1 where the plant was identified as potentially juvenile when the ratio value was greater than 1; and Fig. 2).

Ejemplo 2. Aplicación de los niveles de expresión de miR156 y miR172 en plantas de olivo como indicadores de su estado de desarrollo (juvenil/adulto) Example 2. Application of miR156 and miR172 expression levels in olive plants as indicators of their developmental status (juvenile/adult)

Para probar la eficiencia de estos miARNs como biomarcadores del estado juvenil o adulto, seleccionamos un conjunto de plantas de olivo compuesto por 44 árboles, que: a) tenían 5 años, pero presentaban diferentes estados de desarrollo, juvenil o adulto; b) derivaban de 5 variedades de madre en polinización abierta; y c) estaban en la misma plantación y bajo el mismo manejo agronómico. To test the efficacy of these miRNAs as biomarkers of juvenile or adult stages, we selected a set of 44 olive trees that: a) were 5 years old but presented different stages of development, either juvenile or adult; b) were derived from 5 open-pollinated maternal varieties; and c) were in the same plantation and under the same agronomic management.

Se tomaron muestras de hojas de estos árboles y medimos la expresión relativa de los miARNs 156 y 172, tal y como se ha detallado en la sección anterior. Leaf samples were taken from these trees and we measured the relative expression of miRNAs 156 and 172, as detailed in the previous section.

Se observaron diferencias significativas (Wilcoxon rank sum test;P< 0.05) en el nivel de expresión de los miARNs analizados entre árboles dependiendo de su estado de desarrollo, especialmente para las ratios miR156/miR172 (P = 0.0007) En los individuos juveniles las ratios fueron significativamente mayores que en los adultos. Significant differences (Wilcoxon rank sum test; P < 0.05) were observed in the expression level of the analyzed miRNAs between trees depending on their developmental stage, especially for the miR156/miR172 ratios (P = 0.0007). In juvenile individuals the ratios were significantly higher than in adults.

Para caracterizar la expresión de estos miARNs durante todas las etapas del desarrollo de la planta, desde su germinación hasta la transición a estado adulto, se analizaron: plántulas (< 1 año de edad), plantas juveniles, plantas en transición o en cono de juvenilidad (cono juvenil-cono adulto) y plantas adultas. Para ello, tomamos muestras de hojas de estas plantas y medimos la expresión relativa de los miARNs: miR156 y miR172, tal y como se ha detallado en la sección anterior. To characterize the expression of these miRNAs during all stages of plant development, from germination to the transition to adulthood, the following were analyzed: seedlings (<1 year old), juvenile plants, plants in transition or in the juvenile cone (juvenile cone-adult cone), and adult plants. To do this, we sampled leaves from these plants and measured the relative expression of the miRNAs miR156 and miR172, as detailed in the previous section.

Los resultados corroboraron que los valores de la ratio miR156/miR172, fueron significativamente más altos en las etapas de desarrollo más tempranas para disminuir progresivamente hasta la etapa adulta (Fig. 3). The results confirmed that the values of the miR156/miR172 ratio were significantly higher in the earliest stages of development and progressively decreased until the adult stage (Fig. 3).

Ejemplo 3. Validación de la ratio miR156/miR172 como método de selección de plantas con periodo juvenil corto Example 3. Validation of the miR156/miR172 ratio as a method for selecting plants with a short juvenile period

Para validar el uso de la ratio miR156/miR172 y diseñar el modelo predictivo, se realizó el seguimiento de un grupo de plantas de olivo desde su germinación hasta su floración. Estas plantas se muestrearon de forma periódica cada 4 meses durante los años que duró el experimento. Los valores de expresión de los miR156/miR172 se cuantificaron como en el Ejemplo 1. To validate the use of the miR156/miR172 ratio and design the predictive model, a group of olive plants was monitored from germination to flowering. These plants were sampled periodically every 4 months throughout the duration of the experiment. The miR156/miR172 expression levels were quantified as in Example 1.

Una vez floreció un número considerable de las plantas, establecimos dos grupos, dividiendo las plantas entre: plantas con periodo juvenil corto y plantas con periodo juvenil largo. Once a considerable number of the plants flowered, we established two groups, dividing the plants into: plants with a short juvenile period and plants with a long juvenile period.

A partir de los valores obtenidos para estos dos grupos pudimos determinar la edad idónea de las plantas para la medida de la ratio miR156/miR172 (< un año). Así mismo, con estos datos realizamos el modelo de predictivo anteriormente descrito: modelo de predicción de regresión logística (fórmula I y fórmula II de la presente invención, donde en la fórmula (II) es y=3,37884-0,18393*R, y donde R es el valor de la ratio de los valores de expresión de miR-156/miR-172; se estableció como límite de referencia un valor de 0,5). From the values obtained for these two groups, we were able to determine the ideal age of the plants for measuring the miR156/miR172 ratio (< one year). Likewise, with these data, we carried out the predictive model described above: logistic regression prediction model (formula I and formula II of the present invention, where in formula (II) y = 3.37884 - 0.18393 * R, and where R is the value of the ratio of the miR-156/miR-172 expression values; a value of 0.5 was established as the reference limit).

Finalmente, para evaluar la capacidad predictiva realizamos una tabla de clasificación, con la que evaluamos si el modelo era capaz de clasificar correctamente a las plantas en función de la duración de su periodo juvenil: corto o largo. Finally, to assess the predictive capacity, we created a classification table to evaluate whether the model was able to correctly classify plants based on the length of their juvenile period: short or long.

Evaluamos 53 plantas, cuya duración del periodo juvenil ya nos era conocida, introduciendo el valor de la ratio miR156/miR172 de cuando estas plantas tenían menos de un año de edad, obteniendo una probabilidad de acierto del modelo del 84,90% (Tabla 1). We evaluated 53 plants, whose juvenile period duration was already known, introducing the value of the miR156/miR172 ratio when these plants were less than one year old, obtaining a model success probability of 84.90% (Table 1).

Las plantas evaluadas se germinaron en diciembre de 2019. Se consideraron como plantas con periodo juvenil corto (PJ corto) aquellas que florecieron antes de mayo del año 2023, mientras que las que aún no habían llegado a florecer a fecha de junio de 2023 se consideraron como plantas con periodo juvenil largo (PJ largo). The plants evaluated were germinated in December 2019. Plants with a short juvenile period (SFP) were considered those that flowered before May 2023, while those that had not yet flowered by June 2023 were considered plants with a long juvenile period (LFP).

Tabla 1. Tabla de clasificación realizada para evaluar la capacidad predictiva del modelo de predicción de regresión logística (fórmula I y fórmula II de la presente invención). Para la evaluación, se clasificaron 53 plantas cuya duración del periodo juvenil (PJ) nos era previamente conocida: 25 con PJ largo y 28 con PJ corto. Para la evaluación se consideró como 0 el suceso PJ largo y como 1 el suceso PJ corto. Las predicciones de la duración del PJ se realizaron usando el modelo previamente descrito. De las 25 plantas con PJ largo el modelo fue capaz de predecir correctamente 19, en el caso de las 28 plantas con PJ corto el modelo fue capaz de predecir 26. El modelo clasificó correctamente el 76,0% de las plantas que presentaron PJ largo y el 92,9% de las plantas que presentaron PJ corto, lo que da un valor final de plantas correctamente clasificadas del 84,9%. Table 1. Classification table created to evaluate the predictive capacity of the logistic regression prediction model (formula I and formula II of the present invention). For the evaluation, 53 plants whose juvenile period (JP) duration was previously known were classified: 25 with long JP and 28 with short JP. For the evaluation, a long JP event was considered 0 and a short JP event was considered 1. JP duration predictions were made using the previously described model. Of the 25 plants with long JP, the model was able to correctly predict 19; in the case of the 28 plants with short JP, the model was able to predict 26. The model correctly classified 76.0% of the plants with long JP and 92.9% of the plants with short JP, giving a final value of correctly classified plants of 84.9%.

** Proporción perteneciente a la categoría 0 (PJ largo) correctamente clasificada: 0,760; Proporción perteneciente a la categoría 1 (PJ corto) correctamente clasificada: 0,929; Proporción total correctamente clasificada: 0,849. ** Proportion of correctly classified individuals in category 0 (long PJ): 0.760; Proportion of correctly classified individuals in category 1 (short PJ): 0.929; Total proportion of correctly classified individuals: 0.849.

Claims

CLAIMS 1. Method for identifying the developmental stage of a plant, comprising the following steps: a) quantifying the expression levels of the miR156 and miR172 biomarkers in an isolated sample of the plant; b) calculating the miR156/miR172 ratio from the expression levels in step a); and c) comparing the ratio value calculated in b) with a reference value; wherein a decreased value of the ratio calculated in b) relative to the reference value indicates that the plant is in the adult stage.

2. Method for selecting plants with a short juvenile period, comprising the following steps: a) quantifying the expression levels of the miR156 and miR172 biomarkers in an isolated plant sample; b) calculating the miR156/miR172 ratio from the expression levels in step a); c) calculating the probability that the plant has a short juvenile period based on the miR156/miR172 ratio in step b); and d) selecting the plant according to the probability value calculated in step d).

3. Method according to claim 2, wherein the probability calculation in step b) is performed by applying the value of the miR156/miR172 ratio to a logistic regression prediction model.

4. Method according to claim 3, wherein the logistic prediction model corresponds to formula (I):

where “y” is calculated by applying a linear regression according to formula (II):

- and where “R” is the value of the miR156/miR172 ratio calculated in step b).

5. The method according to any one of claims 2 to 4, wherein the plant is selected as a plant with a short juvenile period when the value of the probability calculated in c) is greater than or equal to a reference limit.

6. Method according to any one of claims 2 to 5, wherein the plant is in a juvenile state, preferably in the form of a seedling.

7. Method according to any one of claims 1 to 6, wherein the plant is a crop plant.

8. The method of any one of claims 1 to 7, wherein the plant belongs to a genus selected from the list consisting of: Olea, Citrus, Prunus, Pistacia, Magnifera, and Persea.

9. The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the plant belongs to a species selected from the list consisting of: Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica, and Persea americana.

10. Method according to any one of claims 1 to 9, wherein the sample isolated from the plant is a leaf sample.

11. Method according to any one of claims 1 to 10, wherein the quantification of step a) is carried out by miRNA-seq or RT-qPCR.

12. Using the expression levels of the miR156 and miR172 biomarkers to identify the developmental stage of a plant.

13. Use according to claim 12, wherein the ratio of miR156/miR172 expression levels is used to identify the developmental stage of a plant.

14. Use of miR156 and miR172 biomarker expression levels to select plants with a short juvenile period.

15. Use according to claim 14, wherein the ratio of miR156/miR172 expression levels is used for the selection of plants with a short juvenile period.

16. Use according to any one of claims 12 to 15, wherein the plant is a crop plant.

17. Use according to any one of claims 12 to 16, wherein the plant belongs to a genus selected from the list consisting of: Olea, Citrus, Prunus, Pistacia, Magnifera, and Persea.

18. Use according to any one of claims 12 to 17, wherein the plant belongs to a species selected from the list consisting of: Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica, and Persea americana.

19. Kit comprising means for quantifying in vitro miR156 expression levels and miR172 expression levels in an isolated plant sample.

20. Kit according to claim 19, wherein the media comprise primers and probes that specifically detect miR156 and miR172.

21. Kit according to claim 19 or 20, wherein said kit further comprises primers and a probe that specifically detect 5S rRNA.

22. Use of the kit according to any one of claims 19 to 21, to identify the developmental stage of a plant.

23. Use of the kit according to any one of claims 19 to 21, for the selection of plants with a short juvenile period.

24. Use of the kit according to claim 22 or 23, wherein the plant is a crop plant.

25. Use of the kit according to any one of claims 22 to 24, wherein the plant belongs to a genus selected from the list consisting of: Olea, Citrus, Prunus, Pistacia, Magnifera and Persea.

26. Use of the kit according to any one of claims 22 to 25, wherein the plant belongs to a species selected from the list consisting of: Olea europaea, Citrus limon, Citrus jambhiri, Citrus maxima, Citrus aurantifolia, Citrus aurantium, Citrus reticulada, Prunus avium, Prunus dulcis, Prunus domestica, Prunus persica, Pistacia vera, Magnifera indica and Persea americana.