ES2660969T5 - Método basado en euglobulina para determinar la actividad biológica de defibrotida - Google Patents

Método basado en euglobulina para determinar la actividad biológica de defibrotida Download PDF

Info

Publication number
ES2660969T5
ES2660969T5 ES12756826T ES12756826T ES2660969T5 ES 2660969 T5 ES2660969 T5 ES 2660969T5 ES 12756826 T ES12756826 T ES 12756826T ES 12756826 T ES12756826 T ES 12756826T ES 2660969 T5 ES2660969 T5 ES 2660969T5
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
defibrotide
euglobulin
plasmin
biological activity
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES12756826T
Other languages
English (en)
Other versions
ES2660969T3 (es
Inventor
Terenzio Ignoni
Vijay Kumar
Khalid Islam
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gentium SRL
Original Assignee
Gentium SRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46829846&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2660969(T5) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gentium SRL filed Critical Gentium SRL
Application granted granted Critical
Publication of ES2660969T3 publication Critical patent/ES2660969T3/es
Publication of ES2660969T5 publication Critical patent/ES2660969T5/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
    • C12N2310/127—DNAzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

DESCRIPCIÓN
Método basado en euglobulina para determinar la actividad biológica de defibrotida
La presente invención se refiere a un método para determinar la actividad biológica de defibrotida y, en particular, se refiere a un método enzimático indirecto para determinar la actividad biológica de defibrotida.
Campo técnico de la invención
La defibrotida (Merck Index, 1996, n.° 2915) es una sustancia de origen natural que se obtiene por extracción a partir de órganos animales y que está constituida por la sal de sodio de polidesoxirribonucleótidos que tienen un bajo peso molecular. La defibrotida ha sido objeto de numerosas investigaciones farmacológicas que han sugerido que se aplique en terapia como un agente antitrombótico (patente de Estados Unidos N.° 3.829.567).
Además, también se ha usado defibrotida con éxito en el tratamiento de arteriopatías periféricas, en insuficiencia renal aguda (patente de Estados Unidos N.° 4.694.134) o en isquemia miocárdica aguda (patente de Estados Unidos N.° 4.693.995).
La defibrotida está actualmente en proceso de ensayos clínicos para usarse para el tratamiento y prevención de la enfermedad venooclusiva (VOD).
Al igual que otras sustancias biológicas que se obtienen por extracción, la defibrotida también está sujeta a una variabilidad de composición limitada que es típica de biopolímeros naturales. Un ejemplo clásico de esta situación lo proporciona la heparina, cuya variabilidad de lote a lote en términos de longitud de cadena, peso molecular, composición, grado de sulfatación, etc., se conoce bien. La consecuencia de esto es que las mismas cantidades en peso de defibrotida pueden, de hecho, ser no equivalentes desde el punto de vista de una actividad biológica específica.
El proceso de extracción, aislamiento y purificación no pueden garantizar per se una reproducibilidad absoluta del producto, precisamente debido a su naturaleza biopolimérica intrínseca.
Sin embargo, si se controla bien, es posible reducir esta variabilidad: para ese propósito, se han realizado estudios de procesos industriales estandarizados para aislar defibrotida por extracción a partir de órganos, tal como, por ejemplo, los descritos en la patente de Estados Unidos N.° 4.985.552.
El producto obtenido de acuerdo con el proceso anteriormente mencionado se caracteriza por la determinación de algunos parámetros fisicoquímicos específicos, tal como, por ejemplo, movilidad electroforética, el coeficiente de extinción, potencia rotatoria óptica y promedio en masa de masa molecular relativa. Sin embargo, esos parámetros dependen básicamente de la estructura de la defibrotida y no son capaces de proporcionar información de la actividad biológica de la misma.
Hasta donde alcanza el conocimiento de los presentes inventores, los únicos métodos que se ha informado para usarse, hasta ahora, para evaluar la actividad biológica de la defibrotida son la prueba de placa de fibrina y el registro tromboelastográfico del tiempo de lisis de euglobulina [Prino G., Mantovani M., Niada R., Coccheri S., Butti A., Indagini preliminari sull'attivita fibrinolitica, nell'animale e nell'uomo, di una nuova sostanza presente in diversi organi animali, Simposio Internazionale: La ricerca scientifica nell'industria farmaceutica in Italia, Rome, 2-4 Oct.
1975-Il Farmaco, Ed. Prat.) (1969), 24,552-561] y el método basado en plasmina divulgado en la patente de Estados Unidos N.° 7.338.777.
Sin embargo, el método anteriormente mencionado de registro tromboelastográfico del tiempo de lisis de euglobulina se caracteriza por una considerable complejidad experimental, por reproducibilidad y precisión poco satisfactorias y en el caso específico del registro tromboelastrográfico, por una linealidad de respuesta limitada para unos intervalos de concentración muy restrictivos.
En cuanto al método basado en plasmina, la actividad enzimática de la plasmina normalmente se determina por varias pruebas estándar in vitro. Uno de los métodos más comúnmente utilizados es la determinación por espectrofotometría o fluorimetría de los compuestos cromogénicos o fluorogénicos que se liberan por la acción de plasmina en sustratos adecuados [Haemostasis, (1978), 7, 138-145]. Generalmente, se utilizan sustratos peptídicos que tienen la fórmula A1-A2-A3-X, en los que A1 y A2 son aminoácidos que son predominantemente no polares, A3 es lisina o arginina y X representa el compuesto medible liberado, por ejemplo para-nitroanilina (pNa) o 2-naftilamina (NA) [Haemostasis, (1978), 7, 146-149]. Además de los sustratos peptídicos anteriormente mencionados, el éxito se logra usando otros compuestos más simples, tal como, por ejemplo, p-nitrobencil-p-toluenosulfonil-L-arginina [Haemostasis, (1978), 7, 105-108].
La tasa a la que se libera el compuesto X en el medio de incubación es proporcional a la actividad (unidades/mg) de plasmina presente en la muestra. El método que se divulga en la patente de Estados Unidos N.° 7.338.777 se basa, por tanto, en el hallazgo de que, en las pruebas de evaluación de plasmina descritas anteriormente, la defibrotida aumenta la tasa de liberación del compuesto X proporcionalmente a su concentración.
Sin embargo, dicho método se realiza en tampón TRIS sin ningún otro activador/inhibidor de plasma/suero. Por lo tanto, el procedimiento no refleja la condición fisiológica ni simula con precisión el mecanismo de acción de defibrotida in vivo.
Hasta el momento, por lo tanto, se han descrito y validado métodos no verdaderamente válidos, precisos y reproducibles para determinar la actividad biológica de defibrotida que reflejan de una manera precisa el mecanismo de acción del producto en un sistema biológico complejo (in vivo).
Se ha desarrollado un método simple y fiable para determinar la actividad biológica de defibrotida, que permite controlar las muestras obtenidas por extracción y por lo tanto, permite estandarizar las preparaciones medicinales basadas en defibrotida.
El método al que se refiere la presente invención permite determinar la actividad biológica específica de la defibrotida en comparación con un patrón de referencia con un alto grado de precisión y exactitud.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un gráfico que muestra la cinética de liberación de pNA del sustrato S-2251, por medio de una fracción de euglobulina de mamífero que está activada y no activada con defibrotida (concentración 0-50 pg/ml, 0-100 min).
La FIG. 2 es un gráfico que ilustra el sigmoide que surge en relación con un patrón y una muestra de prueba de defibrotida.
La FIG. 3 es un gráfico que muestra la “absorbancia frente al tiempo” de preparaciones patrón (por ejemplo: S1_Ca, S1_Cb, S1_Cc) e identifica un intervalo lineal adecuado (por ejemplo: de 30 a 35 min).
Descripción de la invención
La presente invención, por lo tanto, se refiere a un método para determinar la actividad biológica específica de muestras de defibrotida, método que comprende las etapas de:
a) poner en contacto defibrotida, euglobulina y un sustrato específico para la plasmina que, por reacción con la plasmina, proporciona un producto medible y
b) medir la cantidad de producto formado en sucesivas ocasiones.
El método de la invención es un método indirecto in vitro para determinar la actividad de defibrotida, que se basa en las interacciones funcionales entre la defibrotida y la euglobulina.
La euglobulina es la fracción de globulina sérica que es insoluble en agua destilada pero soluble en soluciones salinas.
La euglobulina contiene fibrinógeno, PAI-1, activador del plasminógeno tisular (tPA), plasminógeno y, en menor medida, alfa 2-antiplasmina y también factor VIII.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que la defibrotida cataliza la hidrólisis del plasminógeno en plasmina. Por consiguiente, cuando la defibrotida se incuba con euglobulina y un sustrato específico para plasmina, tal como un péptido de fórmula A1-A2-A3-X como se divulga por Haemostasis, (1978), 7, 138-149, la tasa a la que se libera el compuesto X en el medio de incubación aumenta proporcionalmente a la concentración de defibrotida en el mismo.
En otros términos, la defibrotida cataliza la hidrólisis del plasminógeno contenido en euglobulina en plasmina; plasmina que reacciona enzimáticamente con el sustrato específico para plasmina, preferentemente un sustrato cromogénico, para proporcionar un producto medible.
El método de la presente invención comprende adicionalmente las etapas de: c) determinar la tasa de liberación del producto medible durante el transcurso de la reacción enzimática de una muestra patrón y una muestra de prueba de defibrotida; d) correlacionar, matemáticamente y/o gráficamente, la tasa de liberación con la concentración de defibrotida correspondiente para obtener la actividad biológica de la muestra de prueba de defibrotida.
La muestra de defibrotida utilizada para la determinación de acuerdo con la presente invención se prepara generalmente por extracción a partir de órganos de acuerdo con procedimientos conocidos, tal y como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 4.985.552 que ya se ha mencionado.
Se eligió un lote de defibrotida normal fabricado industrialmente como muestra de referencia (patrón) y se usó para preparar las curvas de calibración de acuerdo con el método de la presente invención.
En general, el presente método proporciona medidas precisas y exactas de defibrotida incluso en presencia de contaminantes, tal como, por ejemplo, ARN, heparina, defibrotida degradada (defibrotida de la que se ha eliminado purina o pirimidina) o etanol, siempre que estén en concentraciones, generalmente menores del 10% en peso, para no perjudicar el sistema.
Además de permitir la determinación de defibrotida, el método también permite la determinación de otras sustancias biológicamente equivalentes derivadas de defibrotida, tal como, por ejemplo, defibrotida desaminada o, más simple, defibrotida desnaturalizada/degradada por combinación de condiciones fisicoquímicas.
El presente método es suficientemente sensible para detectar concentraciones de defibrotida inferiores o iguales a 2,5 pg/ml (concentración final en el sistema de determinación) y, en general, expresa buena correlación hasta valores de concentración máxima superiores o iguales a 1000 pg/ml.
La euglobulina utilizada es generalmente cualquier fracción de euglobulina de mamífero, tal como, por ejemplo, euglobulina bovina, porcina, de conejo y humana, con preferencia por euglobulina humana o bovina.
Sin embargo, aunque la fracción de euglobulina es el sistema enzimático de elección, el uso de otros sistemas ezimáticos equivalentes, tal como, por ejemplo, plasma y suero diluidos (hasta 1:10 con tampones), combinaciones de plasminógeno artificialmente creadas o aisladas, tPA, uPA, PAI-1&2 alfa 2 antiplasmina y los sistemas enzimáticos similares que están químicamente y biológicamente relacionados y tienen una funcionalidad similar, están dentro del alcance de la presente invención.
En el método de la presente invención, el sustrato para la plasmina puede entenderse como cualquier sustrato específico para plasmina que, en las condiciones del método, libera un producto de hidrólisis detectable X.
Dependiendo de la naturaleza del grupo detectable X, se pueden adoptar, igualmente bien, sistemas de detección alternativos comúnmente conocidos por el experto en la materia. Los sistemas de detección espectrofotométrica y fluorimétrica son particularmente ventajosos, especialmente los sistemas espectrofotométricos.
Los sustratos utilizados generalmente son aquellos que son específicos para ensayos de plasminógeno plasmina. Es preferible usar péptidos de la fórmula A1A2-A3-X, en los que A1 y A2 son aminoácidos que son predominantemente no polares, A3 es lisina o arginina y X es el grupo detectable. Son ejemplos de esos sustratos Val-Leu-Lys-pNa, Val-Phe-Lys-pNa o piroGlu-Phe-Lys-pNa en los que el grupo X detectable por espectrofotometría es para-nitroanilina (pNA). Otros sustratos adecuados, por ejemplo Val-Gly-Arg-2NA, contiene 2-naftilamina, que es medible por fluorimetría. Un sustrato particularmente preferido es el compuesto H-D-Valil-L-Leucil-L-Lisina-p35 nitroanilina (H-D-Val-Leu-Lys-pNA).
Los sustratos específicos utilizados para determinar la actividad de defibrotida en la fracción de euglobulina están disponibles comercialmente.
El método de determinación de la presente invención se lleva a cabo colocando una muestra de defibrotida en una solución de euglobulina, en un pH y molaridad específicos.
En particular, las fracciones de euglobulina obtenidas del plasma de mamífero se reconstituyen disolviendo y diluyendo la euglobulina al volumen original del plasma generador con tampón salino (por ejemplo: la cantidad de fracción de euglobulina obtenida de 10 ml de plasma se disuelve y reconstituye a 10 ml con tampón salino a Ph entre 7 y 8).
Sin embargo, con respecto a las concentraciones de sustratos, generalmente se usan de 0,3 a 4 mM, preferentemente de 2,5 a 3,5 mM y ventajosamente de 3 mM en el caso de un sustrato cromogénico, mientras que se usan concentraciones de 0,05 a 0,15 mM en el caso de un sustrato fluorogénico.
El método de determinación de la invención, como otros métodos enzimáticos, es sensible al pH del medio. De hecho, no se puede aplicar generalmente en valores de pH extremos donde el sistema enzimático se inactivaría.
También es preferible que el pH del medio no experimente variación en ningún momento durante el período en que se toman las medidas, y por lo tanto, la fracción de euglobulina se reconstituye con sistemas tampón seleccionados de los que normalmente de usan para las pruebas biológicas. Sistemas de tampón adecuados pueden ser, por ejemplo, tampón fosfato, tampón citrato o tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato y tampón cloruro de sodio (TRISNaCl). La reconstitución de la fracción de euglobulina se lleva a cabo preferentemente con TRIS NaCl.
En el presente método, se prefiere mantener habitualmente el pH del medio en un intervalo de aproximadamente de 7 a 8, más preferentemente aproximadamente 7,4-7,6.
Además, se prefiere mantener la concentración del sistema tampón en un intervalo de 10 a 200 mM, preferentemente aproximadamente 50 mM. Más específicamente, para TRIS-NaCl las concentraciones deben ser 50 mM para TRIS y 150 mM para cloruro de sodio
El método de la invención para determinar la actividad biológica de defibrotida, las soluciones de muestra de defibrotida se diluyen directamente en fracción de euglobulina, y luego se añade el sustrato cromogénico y fluorogénico. En particular, para permitir las mediciones, es preferible diluir/disolver defibrotida previamente en tampón TRIS-NaCl para obtener una solución madre de ambos, muestra y patrón. A partir de las soluciones madre se diluyen la muestra y el patrón, por diluciones en serie, en un volumen definido de fracción de euglobulina hasta el intervalo de concentración analítica que es de 1 a 1000 pg/ml de defibrotida
Un parámetro importante en el presente método de determinación es la temperatura. Es preferible mantener la misma temperatura durante toda la duración de las mediciones y para todas las muestras determinadas, tanto en lo que respecta a la construcción de las curvas de referencia como durante la etapa de medición. Con ese fin, es preferible usar un aparato de temperatura controlada y también, cuando sea necesario, es posible continuar con varios conjuntos de mediciones, cambiando la posición de las muestras adecuadamente para asegurar que el sistema tiene una máxima homogeneidad térmica.
En general, este método de determinación se aplica en un intervalo de temperatura de, por ejemplo, desde 25 a 40 °C, preferentemente de 35 a 39 °C, y aún más preferentemente a 37 °C.
Según la presente invención, la medición de la concentración de compuesto X liberado en el medio por la acción de defibrotida comienza cuando se han añadido todos los reactivos y continúa durante un tiempo predeterminado y a una frecuencia predeterminada en función de la naturaleza química de X y del sistema de detección.
De manera similar a otros métodos de determinación biológica, el método de la invención también proporciona una etapa de calibración y una etapa de medición que se llevan a cabo preferentemente en la misma microplaca para reducir lo más posible la incidencia de la variabilidad experimental.
La etapa de calibración comprende la adquisición de los datos de absorbancia relativos a las muestras a concentraciones crecientes conocidas de defibrotida (patrón), el reprocesamiento estadístico de esos datos y la extrapolación de las curvas de calibración, que expresan la correlación entre el incremento en la velocidad de la reacción enzimática de la invención y la concentración de defibrotida presente en la fracción de euglobulina. En la etapa de medición, debido a la correlación obtenida en la etapa de calibración, es posible determinar las actividades biológicas desconocidas de las muestras de defibrotida basándose en los valores de absorbancia medidos y procesados en las mismas condiciones.
Con más detalle, el protocolo experimental generalmente proporciona la preparación de varias muestras, tanto patrón como desconocida, a varias concentraciones conocidas de defibrotida. Las muestras de defibrotida se preparan por dilución progresiva de las soluciones madre de acuerdo con un factor de dilución predeterminado.
En el presente método, se prefiere preparar, al menos, 5 concentraciones de patrón y 5 concentraciones de la muestra a analizar, preparando, al menos, 4 réplicas para cada concentración del patrón y de manera similar, para cada concentración de la muestra de prueba, generalmente para diluciones sucesivas 1:2 de soluciones madre.
Tanto las concentraciones del patrón como de la muestra de prueba de defibrotida son generalmente de 0,1 a 1000 pg/ml.
Las concentraciones de la muestra de prueba son preferentemente del mismo orden de magnitud que las concentraciones del patrón.
De acuerdo con la ilustración anterior, las mediciones de cada concentración se llevan a cabo preferentemente en 1 microplaca donde preferentemente se alterna la posición de cada muestra, el patrón y la muestra de prueba, respectivamente, en la concentración correspondiente. De acuerdo con este esquema para la disposición de las muestras, que se explica con más detalle en la parte experimental, para cada concentración de defibrotida tanto del patrón como de la muestra de prueba, se miden, al menos, 4 valores de absorbancia para cada tiempo.
El conjunto de mediciones descritas anteriormente se toman en tiempos predeterminados, es decir, en primer lugar a tiempo 0, es decir, cuando se hayan añadido todos los componentes, antes de que haya comenzado la reacción enzimática de la invención y, posteriormente, a intervalos precisos y durante un periodo de tiempo suficiente para adquirir los datos necesarios.
Preferentemente, las mediciones de la absorbancia se continúan hasta un máximo de 90 minutos, con lecturas tomadas cada 1-10 minutos. Más ventajosamente, las lecturas se toman cada minuto. Las lecturas de absorbancia fotométrica se realizan a una longitud de onda que depende de la naturaleza del grupo X detectable liberado en el curso de la reacción hidrolítica enzimática. En el caso específico en el que X es p-NA, la absorbancia se mide a 405 nm.
Las lecturas de absorbancia de las muestras de defibrotida del patrón y desconocida, conocidas como datos sin procesar, generalmente se originan directamente del mismo aparato que proporciona la operación de lectura; se tabulan de tal manera que se expresa un valor de absorbancia para cada tiempo y pocillo.
Los datos sin procesar se procesan luego, utilizando, por ejemplo, la hoja de cálculo-Microsoft Excel®. Esta primera operación de procesamiento conduce al cálculo de la absorbancia promedio y de la desviación típica asociada, en cada momento y para cada conjunto de lecturas, cada conjunto comprende, al menos, 4 réplicas para cada concentración de defibrotida, tanto del patrón como de la muestra de prueba.
El procesamiento estadístico adicional de los datos se lleva a cabo con software disponible comercialmente para determinación de ensayos biológicos como se describe por Finney D J, Statistical Method in Biological Assay, 2nd ed. Ch. Griffin, London and relevant Pharmacopoeias.
Para ser más precisos, de acuerdo con la presente invención, la determinación de ensayo biológico de defibrotida se puede realizar usando un modelo de línea paralela, modelo de relación de pendiente y modelos de curva logística de cuatro parámetros como se define, por ejemplo, por el texto general relevante de la Farmacopea Europea 5.3, Análisis Estadístico"
Como se ilustra en la FIG. 1, al colocar el tiempo en las abscisas y la absorbancia en las ordenadas, se obtendrán líneas rectas cuya pendiente “b” será proporcional a la velocidad de reacción enzimática: al incrementar la concentración de defibrotida, aumentarán la velocidad de hidrólisis y, proporcionalmente, el valor de “b”. Finalmente, los valores de pendiente, calculados como se describe anteriormente para cada conjunto de réplicas de defibrotida de patrón y defibrotida de muestra de prueba, se correlacionan con la concentración de defibrotida a la que se refieren. Se puede utilizar la transformación matemática adecuada de las abscisas (es decir, logaritmo de concentración de defibrotida) en lugar del valor real.
Gráficamente, esa correlación da lugar a un sigmoide para el patrón y un sigmoide para la muestra de prueba (FIG. 2); las porciones centrales del sigmoide tienen dos líneas rectas que son generalmente paralelas y la distancia entre ellas es una función de la diferencia en la actividad biológica entre la muestra de prueba y el patrón. Este intervalo se utiliza para la determinación de la potencia usando el modelo de líneas paralelas como se describe por Finney D J, Statistical Method in Biological Assay, 2nd ed. Ch. Griffin, London.
Para una determinación más específica, se utilizan los modelos de curva logística de cuatro parámetros y en este caso se usa toda la curva sigmoidea de ambas, muestra y patrón, para el cálculo de la potencia biológica relativa de la muestra.
En una realización preferida de la presente invención, las soluciones de patrón y las soluciones de las muestras de defibrotida a determinar se introducen en los pocillos respectivos de la microplaca. Las fracciones de euglobulina se preparan en el momento de usarse y es el medio de dilución de la solución madre de defibrotida. Finalmente, se añade la solución que contiene el sustrato cromogénico. La microplaca se coloca luego en un lector termostático y, después de agitación rápida, se toman las lecturas de absorbancia del sistema en intervalos predeterminados y durante el periodo de tiempo predeterminado. Los datos sin procesar obtenidos se procesan luego, determinando así las actividades desconocidas de las muestras de defibrotida.
Como se apreciará en los siguientes ejemplos, el método de acuerdo con la presente invención permite obtener formulaciones líquidas de defibrotida, preferentemente soluciones de agua, que tienen una actividad biológica definida y, en particular, que tienen una actividad de 25 a 35 UI/mg de defibrotida, preferentemente de 27,5 a 32,5 UI/mg y, más preferentemente, de 28 a 32 UI/mg.
Las formulaciones líquidas de defibrotida se comercializan preferentemente en forma de recipientes, más preferentemente en viales, que contienen 200 mg de defibrotida en 2,5 ml solución de agua tamponada (preferentemente a un pH de 6,5 a 8,5, más preferentemente de 7 a 8) para diluirla antes de usar; en consecuencia, cuando se evalúa la actividad biológica con el método de la presente invención, cada recipiente presenta una actividad de defibrotida de 5000 a 7000 UI, preferentemente de 5500 a 6500 IU, más preferentemente de 5600 a 6400.
Esos y otros aspectos de la invención se ilustrarán mejor en los siguientes ejemplos que, sin embargo, no deben considerarse como limitantes de la invención.
Ejemplos
Los siguientes materiales se usaron en los ejemplos dados aquí:
Aparato
Figure imgf000007_0001
Programas y Software
o Microsoft Excel® (Microsoft Corporation, Redmond, Wash., USA)
Sustancias
o Defibrotida (Gentium)
o Sustrato cromogénico S-2251 (Chromogenix Instrumentation Laboratory S.p.A., Milan, Italy)
o Tris(hidroximetil)aminometano (TRIS)-NaCl, (Sigma-Aldrich, Milan, Italy)
o HCl 1 N (Carlo Erba reagenti, Milan, Italy)
o NaOH 1 N (Carlo Erba reagenti, Milan, Italy)
o Plasma bobino (Tebu Bio Italia, Magenta (MI), Italy)
o Ácido Acético Glacial (Carlo Erba reagenti, Milan, Italy)
Soluciones
o TRIS-NaCl (Preparación de 1 l): Transferir cuantitativamente en un vaso de precipitados de 1 l 6,06 g de TRIS NaCl-HCl y 2,2 g de NaCl. Disolver en 500 ml de agua purificada y ajustar el pH a 7,4 con aproximadamente 40 ml de HCl 1 N. Transferir cuantitativamente la solución a un matraz volumétrico de 1 l y enrasar la solución con agua purificada. Almacenar la solución en el refrigerador (2-8 °C)
o Sustrato cromogénico S2251 (CAS 63589-93-5) 3 mM Preparación de (15,2 ml): Disolver aproximadamente 25 mg de sustrato cromogénico con 15,2 ml de agua purificada. Almacenar la solución en el refrigerador (2-8 °C)
o Euglobulinas Bovinas (Preparación de 10 ml). Introducir 240 ml de agua purificada enfriada con hielo en un envase con una capacidad mínima de 300 ml y agregar 10 ml de plasma bovino bajo agitación. Ajustar el pH a 5,3 ± 0,1 con ácido acético 1 %. Dejar reposar a 2-8 °C durante 1 a 16 horas. Eliminar la solución sobrenadante transparente mediante sifón y recoger el precipitado mediante centrifugación a 2.800 rpm durante 5 minutos y a 4 °C. Suspender el precipitado dispersándolo mecánicamente (por ejemplo,: por medio de una varilla de vidrio de laboratorio) en 5 ml de agua purificada enfriada con hielo, agitar durante aproximadamente 5 min y recoger el precipitado por centrifugación a 2.800 rpm durante 5 minutos y a 4 °C. Dispersar el precipitado mecánicamente en aproximadamente 10 ml de TRIS-NaCl; para facilitar la disolución del precipitado, aplastar las partículas del precipitado con un instrumento adecuado (por ejemplo: una varilla de vidrio de laboratorio). Almacenar la suspensión obtenida a 2-8 °C durante no menos de 1 hora y no más de 6 horas antes de su uso.
Soluciones de Defibrotida de Patrón y Muestra
Solución Madre de Referencia
Transferir cuantitativamente, en un matraz volumétrico de 20 ml, aproximadamente 100 mg de patrón de referencia de defibrotida pesado con precisión. Disolver el polvo con aproximadamente 10 ml de TRIS-NaCl y enrasar con el mismo disolvente. Diluir la solución obtenida a 1:4 con TRIS-NaCl para obtener una solución RS de defibrotida de aproximadamente 1,25 mg/ml.
Solución Madre de Muestra
Transferir cuantitativamente, en un matraz volumétrico de 20 ml, aproximadamente 100 mg de muestra de defibrotida pesados con precisión. Disolver el polvo con aproximadamente 10 ml de TRIS-NaCl y enrasar con el mismo disolvente. Diluir la solución obtenida 1:4 con TRIS-NaCl para obtener una solución de muestra de defibrotida de aproximadamente 1,25 mg/ml.
Preparación de las soluciones de referencia y muestra
a) Defibrotida 125 ug/ml: Diluir la solución madre de defibrotida 1:10 (Referencia y Muestra) con TRIS NaCl (que corresponde a 50 ug/ml en el pocillo de la placa). Transferir cuantitativamente 500 ul de la solución preparada a un tubo eppendorf y mezclar con 500 ul de euglobulina. Cerrar el tubo y almacenar en agua enfriada con hielo.
b) Defibrotida 62,5 ug/ml: diluir la solución 1:2 (a) con TRIS NaCl (correspondiente a 25 ug/ml en un pocillo de la placa). T ransferir cuantitativamente 500 ul de la solución preparada a un tubo eppendorf y mezclar con 500 ul de euglobulina. Cerrar el tubo y almacenar en agua enfriada con hielo.
c) Defibrotida 31,25 ug/ml: diluir la solución (b) 1:2 con TRIS NaCl (que corresponde a 12,5 ug/ml en el pocillo de la placa). Transferir cuantitativamente 500 ul de la solución preparada a un tubo eppendorf y mezclar con 500 ul de euglobulina. Cerrar el tubo y almacenar en agua enfriada con hielo.
d) Defibrotida 12,5 ug/ml: diluir la solución 1:2,5 (d) con TRIS NaCl (que corresponde a 5 ug/ml en el pocillo de la placa). Transferir cuantitativamente 500 ul de la solución preparada a un tubo eppendorf y mezclar con 500 ul de euglobulina. Cerrar el tubo y almacenar en agua enfriada con hielo.
Solución blanco
Mezclar 1 volumen de euglobulinas con 1 volumen de solución de TRIS NaCl (por ejemplo: 500 ul 500 ul) Deposición en Placa
De acuerdo con el esquema de deposición propuesto (véase la Tabla 1 presentada a continuación), añadir 200 ul de solución patrón o muestra o blanco en cada pocillo de la placa. Debe tenerse en cuenta que se puede usar un esquema deposición según la disponibilidad y configuración de las pipetas automáticas. Sin embargo se deben usar no menos de 4 deposiciones por cada solución referencia y muestra para el ensayo.
Añadir en cada pocillo 50 ul de sustrato Cromogénico inmediatamente antes de la incubación de la placa en el lector de microplacas.
Tabla 1
Figure imgf000008_0001
BLK solución Blanco
Cálculos y resultados
A partir de la gráfica cinética “absorbancia frente al tiempo” de las preparaciones patrón (por ejemplo: S1_Ca, S1_Cb, S1_Cc) e identifica un intervalo lineal adecuado (por ejemplo: de 30 a 35 min, véase la figura 3). Identificación del intervalo cinético lineal (A a 405 nm frente al tiempo).
Calcular para cada preparación del patrón y de la muestra, la respuesta del ensayo (Pendiente) en el intervalo de tiempo predefinido como sigue.
Respuesta de la Muestra y del
Figure imgf000009_0001
Donde:
Aa es el valor de Absorbancia en el tiempo Ta (30 min de la gráfica anterior)
Ab es el valor de Absorbancia en el tiempo Tb (35 min de la gráfica anterior)
Presentar el valor obtenido en un formato de tabla como se presenta en la tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000009_0002
Representar las respuestas para la sustancia a examinar y para el patrón frente al logaritmo de la concentración y calcular la actividad de la sustancia a examinar usando el modelo de líneas paralelas como se define en el capítulo pertinente 5.3.2 de la edición actual de la Ph. Eur.
Se deben usar no menos de 3 diluciones en serie consecutivas de la referencia y de la muestra (por ejemplo, concentración de defibrotida 5 ug/ml, 12,5 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml o 5 pg/ml, 12,5 pg/ml, 25 pg/ml o 12,5 pg/ml, 25 pg/ml, 50 mg/ml).
Análisis de la varianza
El análisis de la varianza se lleva a cabo de acuerdo con la sección 5.3.2.3 de la edición actual de la Ph. Eur. Y Finney DJ (1964) Statistical Method in Biological Assay 2nd ed.
Prueba de Validez
1) Los términos de regresión lineal son significativos, es decir, la probabilidad calculada es menor que 0,05. Si no se cumple este criterio, no es posible calcular el I.C. del 95 %.
2) La expresión de no paralelismo no es significativa, es decir, la probabilidad calculada es menor que 0,05.
3) La expresión de no linealidad no es significativa, es decir, la probabilidad calculada es menor que 0,05. Criterios de aceptación
4) La potencia estimada no es inferior al 90 % ni superior al 111 % de la potencia establecida.
5) Los límites de confianza (P=0,95) de la potencia estimada no son inferiores al 80 % ni superiores al 125 % de la potencia establecida
Cálculos
Rx Potencia Std (UI/mg) x ConcStd (mg/ml)
Conc. Muestra (mg/ml)
Potencia de la muestra ( UI/mg)=
donde:
- R: Resultado de la muestra obtenida por análisis de modelo de líneas paralelas
- Potencia Std: Potencia establecida del Patrón (UI/mg en sustancia seca)
- Conc. Std: Concentración del Patrón (mg/ml en sustancia seca)
- Conc. Muestra: Concentración de la Muestra (mg/ml en sustancia seca)
Ensayo aplicado a formulaciones de defibrotida
El ensayo divulgado anteriormente se ha usado para determinar la actividad biológica de formulaciones líquidas que contienen 200 mg de defibrotida en 2,5 ml (80 mg por ml) y que tienen la composición cuali-cuantitativa presentada en la tabla 3.
Tabla 3
Figure imgf000010_0001
Los resultados se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000010_0002

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la actividad biológica de defibrotida, que comprende las etapas de:
a) poner en contacto defibrotida, euglobulina de mamífero y un sustrato específico para la plasmina que, por reacción con la plasmina, proporciona un producto medible; y
b) medir la cantidad de producto formado en sucesivas ocasiones, para, así, determinar la actividad biológica de defibrotida.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la euglobulina es una euglobulina de mamífero.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la euglobulina es euglobulina humana, de conejo o bovina.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la plasmina que reacciona con el sustrato específico para la plasmina se libera mediante el plasminógeno contenido en la euglobulina.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato específico para la plasmina es un sustrato cromogénico.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato específico para la plasmina es un compuesto de fórmula A1-A2-A3-X en el que A1 y A2 son aminoácidos no polares, A3 es lisina o arginina y X es el grupo medible.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el producto medible X se selecciona del grupo que consiste en paranitroanilina y 2-naftilamina.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el sustrato específico para plasmina es H-D-Valil-L-Leucil-L-Lisina-p-nitroanilina.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 6, donde el producto medible X se mide por espectrofotometría o espectrofluorimetría.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la euglobulina de mamífero se reconstituye en el mismo volumen del plasma de origen o se diluye hasta 1:10 con tampón adecuado y el sustrato cromogénico/fluorogénico tiene una concentración de 2,5 a 3,5 mM, preferentemente 3 mM.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho método se lleva a cabo en un medio de reacción que es una solución acuosa tamponada a un pH de 7 a 8, preferentemente a un pH de 7,4.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se mantiene la temperatura entre 35 y 39 °C, preferentemente a 37 °C.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la concentración del sustrato específico para la plasmina es de 0,3 a 4 mM, preferentemente de 2,5 a 3,5 mM, más preferentemente 3 mM.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, método que comprende las etapas de: c) determinar la tasa de liberación del producto medible durante el curso de la reacción enzimática tanto para una muestra patrón como para una muestra de prueba; d) correlacionar, matemáticamente y/o gráficamente, la tasa de liberación con la concentración de defibrotida correspondiente para obtener la actividad biológica de la muestra de prueba de defibrotida.
ES12756826T 2012-06-22 2012-06-22 Método basado en euglobulina para determinar la actividad biológica de defibrotida Active ES2660969T5 (es)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IT2012/000193 WO2013190582A1 (en) 2012-06-22 2012-06-22 Euglobulin-based method for determining the biological activity of defibrotide

Publications (2)

Publication Number Publication Date
ES2660969T3 ES2660969T3 (es) 2018-03-26
ES2660969T5 true ES2660969T5 (es) 2021-09-03

Family

ID=46829846

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES12756826T Active ES2660969T5 (es) 2012-06-22 2012-06-22 Método basado en euglobulina para determinar la actividad biológica de defibrotida

Country Status (16)

Country Link
US (9) US9902952B2 (es)
EP (1) EP2864496B2 (es)
JP (1) JP6198821B2 (es)
KR (4) KR20150044877A (es)
CN (2) CN110079580B (es)
AU (1) AU2012383169B2 (es)
BR (1) BR112014031934B1 (es)
CA (1) CA2874960C (es)
DK (1) DK2864496T4 (es)
ES (1) ES2660969T5 (es)
IL (1) IL236132B (es)
IN (1) IN2014DN10584A (es)
MX (1) MX352085B (es)
RU (1) RU2627177C2 (es)
SG (1) SG11201408481UA (es)
WO (1) WO2013190582A1 (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2010363814B2 (en) 2010-11-12 2016-05-19 Gentium S.R.L. Defibrotide for use in prophylaxis and/or treatment of Graft versus Host Disease (GVHD).
CN110079580B (zh) 2012-06-22 2022-12-06 真蒂奥姆责任有限公司 用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法
EP3026122A1 (en) 2014-11-27 2016-06-01 Gentium S.p.A. Cellular-based method for determining the potency of defibrotide
CN110249399B (zh) * 2017-01-25 2022-05-03 凯米特电子公司 自衰减mlcc阵列
JP2020530004A (ja) * 2017-08-03 2020-10-15 ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド 核酸を高濃度で含む製剤
CN112236149A (zh) 2018-04-12 2021-01-15 贾兹制药公司 用于预防和治疗细胞因子释放综合征和与免疫耗竭相关的神经毒性的去纤苷
WO2020118165A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited Subcutaneous delivery of high concentration formulations
EP4110287A1 (en) 2020-02-28 2023-01-04 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited Delivery of low viscosity formulations
TW202308659A (zh) 2021-05-06 2023-03-01 愛爾蘭商爵士製藥愛爾蘭有限責任公司 用於急性呼吸窘迫症候群之治療及預防的去纖維蛋白多核苷酸

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1043823B (it) 1970-11-03 1980-02-29 Prephar Procedimento per l estrazione di acidi nucleici da organi animali
US3899481A (en) 1970-11-03 1975-08-12 Crinos Industria Farmaco Process for the controlled partial degradation of deoxyribonucleic acid extracted from animal organs
DE2154279A1 (de) 1970-11-03 1972-05-25 Crinos Industria Farmaco Medikamente für das fibrinolytische System
DE2812943C3 (de) 1978-03-23 1981-05-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren und Reagens zur Bestimmung der biologischen Aktivität von Heparin im Plasma
US4853221A (en) 1980-11-13 1989-08-01 Warner-Lambert Company Method for treating non-small cell lung cancer, head and neck cancers and breast cancer
IT1170215B (it) 1983-09-12 1987-06-03 Crinos Industria Farmaco Composizione farmaceutica per il trattamento di stati di insufficienza renale acuta
IT1170214B (it) 1983-09-12 1987-06-03 Crinos Industria Farmaco Composizione farmaceutica per la cura delle arteriopatie periferiche
IT1206341B (it) 1984-02-16 1989-04-14 Crinos Industria Farmaco Composizione farmaceutica per il trattamento dell'ischemia acuta del miocardio.
US4694134A (en) 1985-05-28 1987-09-15 Ajax Magnethermic Corporation Apparatus for overheating edges of skelp for the production of compression welded pipe
US5223609A (en) 1986-04-17 1993-06-29 Crinos Industria Farmacobiologica S.P.A. Process for obtaining chemically defined and reproducible polydeoxyribonucleotides
IT1190313B (it) 1986-04-17 1988-02-16 Crinos Industria Farmaco Procedimento per l'ottenimento di polidesossiribonucleotidi chimicamente definiti e riproducibili e prodotto farmacologicamente attivo risultante
US5231006A (en) 1986-10-16 1993-07-27 Behringwerke Aktiengesellschaft Method for the determination of plasminogen
US4753221A (en) 1986-10-22 1988-06-28 Intravascular Surgical Instruments, Inc. Blood pumping catheter and method of use
JP2907447B2 (ja) 1988-08-24 1999-06-21 中外製薬株式会社 抗血栓剤
IT1231509B (it) 1989-09-07 1991-12-07 Crinos Industria Farmaco Composizione farmceutica ad uso topico per la terapia della fragilita' capillare.
JPH0539280A (ja) * 1990-07-20 1993-02-19 Takeda Chem Ind Ltd サツカロアスコルビン酸誘導体および血栓症予防治療剤
US5199942A (en) 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US5977083A (en) 1991-08-21 1999-11-02 Burcoglu; Arsinur Method for using polynucleotides, oligonucleotides and derivatives thereof to treat various disease states
US5624912A (en) 1991-08-21 1997-04-29 Burcoglu; Arsinur Method of treating HIV infection and related secondary infections with defibrotide
US6699985B2 (en) 1991-08-21 2004-03-02 Arsinur Burcoglu Method of treating HIV infection and related secondary infections thereof
IT1252174B (it) 1991-12-09 1995-06-05 Crinos Industria Farmaco Oligodesossimibonucleotidi ad attivita' antiischemica e procedimenti per il loro ottenimento
US5578716A (en) 1993-12-01 1996-11-26 Mcgill University DNA methyltransferase antisense oligonucleotides
US6335356B1 (en) 1994-01-07 2002-01-01 Sugen, Inc. Method of treating a patient by parenteral administration of a lipophilic compound
JPH08127539A (ja) 1994-10-31 1996-05-21 Ajinomoto Co Inc ヒトｉｌ−１１を含有する末梢血幹細胞増加剤
US5856444A (en) 1994-11-30 1999-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Thrombocytopoiesis stimulating factor
ATE299030T1 (de) 1996-07-10 2005-07-15 Meiji Dairies Corp Verwendung von proteinen aus der mk familie als hämatopoietischer faktor
HK1044896A1 (zh) 1997-04-28 2002-11-08 Burcoglu Arsinur 治疗hiv感染和与之有关的继发感染的方法
AU8125098A (en) 1997-05-30 1998-12-30 Mcgill University Dna methyltransferase genomic sequences and antisense oligonucleotides
US6177545B1 (en) 1997-09-02 2001-01-23 Insight Strategy & Marketing Ltd. Heparanase specific molecular probes and their use in research and medical applications
DE19740384A1 (de) 1997-09-08 1999-03-11 Max Delbrueck Centrum Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN) gegen Proteinkinase C (PKC)-Isoformen, ihre Verwendung und pharmazeutische Zubereitungen dieser ODN
GB9719161D0 (en) 1997-09-09 1997-11-12 Glaxo Group Ltd New therapeutic method
US6573372B2 (en) 1999-01-07 2003-06-03 Heska Corporation Feline immunoglobulin E molecules and compositions there of
JP2003503313A (ja) 1999-06-03 2003-01-28 ジェシー エル エス オウ 細胞増殖及び細胞死を変調する方法及び組成物
ATE311907T1 (de) 1999-06-08 2005-12-15 Gentium Spa Anwendung von komplexen von kationischen liposomen und polydeoxyribonukleotiden wie arzneimitteln
EP1147777A1 (en) 2000-04-18 2001-10-24 Crinos Industria Farmacobiologica S.p.A. Combination of defibrotide and G-CSF and its use to activate haematopoietic progenitors
US8771663B2 (en) 2000-04-18 2014-07-08 Gentium Spa Formulation having mobilising activity
CA2426540A1 (en) 2000-10-20 2002-07-25 Biocardia, Inc. Leukocyte expression profiling
EP1356071B1 (en) 2000-11-28 2007-11-21 The University of Chicago Genetically engineered herpes virus for the treatment of cardiovascular disease
CA2433225A1 (en) 2000-12-29 2002-07-11 Bio-Technology General, Inc. Isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US6770753B2 (en) 2001-07-05 2004-08-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Phosphorothioate antisense heparanase oligonucleotides
US7514414B2 (en) 2001-09-24 2009-04-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Suppressors of CpG oligonucleotides and methods of use
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
EP1325962A1 (en) 2001-12-17 2003-07-09 Gentium S.p.A. A method for determining the biological activity of defibrotide
UA83628C2 (ru) 2002-05-31 2008-08-11 Клиникум Дер Универзитет Регенсбург Способ защиты эндотелиальных и эпителиальных клеток во время трансплантации алогенных стволовых клеток
US20050215498A1 (en) 2002-05-31 2005-09-29 Guenther Eissner Method for the protection of endothelial and epithclial cells during chemotherapy
RU2005101621A (ru) 2002-07-01 2005-11-20 Савиент Фармасьютикалс, Инк. (Us) Антитела и их применения
US20060293256A1 (en) 2002-08-06 2006-12-28 Masateru Yamada Remedy or preventive for kidney disease and method of diagnosing kidney disease
US20050196382A1 (en) 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
DE10244453A1 (de) 2002-09-24 2004-04-01 Phenomiques Gmbh Hemmung der Proteinkinase C-alpha zur Behandlung von Krankheiten
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
ITMI20031714A1 (it) 2003-09-05 2005-03-06 Gentium Spa Formazioni ad azione antitumorale.
WO2005089503A2 (en) 2004-03-19 2005-09-29 Progenics Pharmaceuticals, Inc. Cd4-igg2 formulations
CA2623142C (en) * 2004-09-22 2016-01-19 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods for a global assay of coagulation and fibrinolysis
US7723127B2 (en) 2005-03-03 2010-05-25 Novx Systems Inc. Immunoassay with extended dynamic range
WO2006094916A1 (en) 2005-03-03 2006-09-14 Gentium Spa Defibrotide and/or oligodeoxyribonucleotides for treating angiogenesis-dependent tumors
WO2006119619A1 (en) 2005-05-06 2006-11-16 Replicor Inc. Oligonucleotides inhibiting cell proliferation
EP1872787A1 (en) 2006-06-27 2008-01-02 Gentium S.p.A. Use of defibrotide for the inhibition of heparanase
EP1982722A1 (en) 2007-04-16 2008-10-22 Gentium S.p.A. Use of oligotide for the treatment of renal diseases
FR2917172B1 (fr) * 2007-06-07 2014-01-03 Inst Nat Sante Rech Med Methode de mesure de l'activite plasmine des microparticules presentes dans un echantillon de fluide biologique et utilisation
EP2183598A1 (en) 2007-07-13 2010-05-12 Elan Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for identifying substrate specificity of inhibitors of gamma secretase
EP2103689A1 (en) 2008-03-19 2009-09-23 Gentium S.p.A. Synthetic phosphodiester oligonucleotides and therapeutical uses thereof
EP2274617A4 (en) 2008-04-10 2011-11-09 Massachusetts Inst Technology METHOD OF DETECTING AND USING MEDIUM-TREATMENT AID ON CANCER STEM CELLS
CN101301306A (zh) 2008-06-30 2008-11-12 广东天普生化医药股份有限公司 Dft在制备治疗和预防休克药物中的应用
HUE025670T2 (en) 2009-03-03 2016-04-28 Grifols Therapeutics Inc A method for producing plasminogen
NZ624963A (en) 2009-04-29 2016-07-29 Amarin Pharmaceuticals Ie Ltd Pharmaceutical compositions comprising epa and a cardiovascular agent and methods of using the same
WO2011057143A1 (en) * 2009-11-06 2011-05-12 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions, methods and uses for simultaneous assay of thrombin and plasmin generation
AU2010363814B2 (en) 2010-11-12 2016-05-19 Gentium S.R.L. Defibrotide for use in prophylaxis and/or treatment of Graft versus Host Disease (GVHD).
CN110079580B (zh) 2012-06-22 2022-12-06 真蒂奥姆责任有限公司 用于测定去纤维蛋白多核苷酸的生物活性的基于优球蛋白的方法
EP3026122A1 (en) 2014-11-27 2016-06-01 Gentium S.p.A. Cellular-based method for determining the potency of defibrotide
JP2020530004A (ja) 2017-08-03 2020-10-15 ジャズ ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド 核酸を高濃度で含む製剤
WO2020118165A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited Subcutaneous delivery of high concentration formulations
EP4110287A1 (en) 2020-02-28 2023-01-04 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited Delivery of low viscosity formulations

Also Published As

Publication number Publication date
EP2864496B1 (en) 2017-11-29
US11085043B2 (en) 2021-08-10
US12534722B2 (en) 2026-01-27
KR20190016148A (ko) 2019-02-15
US9902952B2 (en) 2018-02-27
US20230357762A1 (en) 2023-11-09
US20210388350A1 (en) 2021-12-16
SG11201408481UA (en) 2015-01-29
KR102038357B1 (ko) 2019-10-31
RU2014149089A (ru) 2016-08-10
BR112014031934B1 (pt) 2021-05-04
US20180334672A1 (en) 2018-11-22
CN110079580B (zh) 2022-12-06
IL236132B (en) 2018-07-31
US12529052B2 (en) 2026-01-20
MX2014016114A (es) 2015-09-23
DK2864496T3 (en) 2018-01-15
KR20190112197A (ko) 2019-10-02
DK2864496T4 (da) 2021-01-04
ES2660969T3 (es) 2018-03-26
AU2012383169A1 (en) 2015-01-15
KR20180098420A (ko) 2018-09-03
US11236328B2 (en) 2022-02-01
EP2864496B2 (en) 2020-11-25
CN110079580A (zh) 2019-08-02
US20250075206A1 (en) 2025-03-06
WO2013190582A1 (en) 2013-12-27
AU2012383169B2 (en) 2017-12-21
MX352085B (es) 2017-11-08
US11746348B2 (en) 2023-09-05
JP2015521477A (ja) 2015-07-30
CA2874960A1 (en) 2013-12-27
US20250236866A1 (en) 2025-07-24
RU2627177C2 (ru) 2017-08-03
US20210363519A1 (en) 2021-11-25
IL236132A0 (en) 2015-01-29
EP2864496A1 (en) 2015-04-29
US20150176003A1 (en) 2015-06-25
US20250236867A1 (en) 2025-07-24
KR101948243B1 (ko) 2019-05-21
JP6198821B2 (ja) 2017-09-20
HK1208503A1 (en) 2016-03-04
CN104619857A (zh) 2015-05-13
CA2874960C (en) 2021-05-18
US20200208148A1 (en) 2020-07-02
BR112014031934A8 (pt) 2018-01-02
KR20150044877A (ko) 2015-04-27
IN2014DN10584A (es) 2015-08-28
BR112014031934A2 (pt) 2017-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2660969T5 (es) Método basado en euglobulina para determinar la actividad biológica de defibrotida
ES2349509T3 (es) Un método para determinar la actividad biológica de la defibrotida.
RU2766143C2 (ru) Жидкая композиция дефибротида для лечения и профилактики веноокклюзионной болезни
TWI615473B (zh) 用於測定去纖維蛋白多核苷酸的生物活性之基於優球蛋白的方法
HK1208503B (en) Euglobulin-based method for determining the biological activity of defibrotide
JP6880627B2 (ja) α−アミラーゼ活性測定用試薬に用いるキャリブレーションまたは精度管理用物質、およびキャリブレーションまたは精度管理方法
SA113350049B1 (ar) طريقة تعتمد على جلوبولين حقيقي لتحديد النشاط الحيوي لديفيبروتيد