DK147525B - 24,24-difluor-25-hydroxy-6-alkoxy-3,5-cyclovitamin d3 forbindelser - Google Patents

Description

147525 i

Opfindelsen angår hidtil ukendte 24,24-difluor-25-hydroxy- 6-alkoxy-3,5-cyclovitamin Dj forbindelse med formlen

RO J

^OH

hvori R betegner en carbonhydridgruppe med 1-4 carbon-atomer, der er mellemprodukter ved fremstillingen af det 5 hidtil ukendte 24,24-difluor-ΐα,25-dihydroxy-vitamin Dj.

Vitamin Dj er et velkendt middel til at kontrollere kalcium- og phosphorhomeostase. Hos normale dyr eller mennesker vides denne forbindelse også at stimulere tarmkal-ciumtransporten og knoglekalci ummobiliseringen, og den 10 er i stand til at forebygge rakitis.

Det er også velkendt, at vitamin Dj for at være virksomt må omdannes in vivo til dets hydroxylerede former. F.eks. hydroxyleres vitaminet først i leveren til dannelse af 25-hydroxy-vitamin Dj og hydroxyleres yderligere i nyrerne, 15 hvorved der dannes la,25-dihydroxy-vitamin Dj eller 24,- 147525 2 25-dihydroxy-vitamin D^· Den Ια-hydroxylerede form af vitaminet antages sædvanligvis at være den fysiologisk aktive eller hormonale form af vitaminet og at være ansvarlig for, hvad der betegnes som den vitamin D-lignende 5 virkning, som f.eks. forøget tarmabsorption af kalcium og phosphat, mobilisering af knoglemineral og tilbageholdelse af kalcium i nyrerne.

Siden opdagelsen af biologisk aktive metabolitter (meta-boliseringsprodukter) af vitamin D har der været megen 10 interesse for fremstilling af strukturanaloge af disse metabolitter, fordi sådanne forbindelser kan udgøre værdifulde terapeutiske midler til behandling af sygdomme, der skyldes uregelmæssigheder ved kalciummetabolismen.

En hel række vitamin D-lignende forbindelser er blevet 15 syntetiseret. Jfr. US patentskrifterne 3 741 996, der omhandler lce-hydroxycholecalciferol; 3 907 843, der omhandler Ια-hydroxyergocalciferol; 3 786 062, der omhandler 22-dehydro-25-hydroxycholecalciferol; 3 906 014, der omhandler 3-deoxy-la-hydroxycholecalciferol og 4 069 321, 20 der omhandler fremstillingen af forskellige sidekædefluo- rerede vitamin D^-derivater og sidekædefluorerede dihy-drotachysterolanaloge. Mange af disse forbindelser har faktisk vist sig at være i besiddelse af kraftig vitamin D-lignende virkning, og nogle af disse frembyder andre 25 praktiske fordele, som f.eks. at de er forholdsvis lette at fremstille, eller at de har delvis selektiv virkningsmåde, men ingen har endnu vist sig så aktiv in vivo som la, 25-dihydroxycholecalciferol (la,25-dihydroxy-vitamin D^), der nu sædvanligvis antages at være den targetcelle-30 aktive hormonale form af vitamin D.

Man har nu fremstillet et nyt derivat af vitamin D, der er i det mindste så kraftigt som la,25-dihydroxy-vitamin D^, når man måler dets evne til at stimulere tarmkalcium-transporten eller dets evne til at mobilisere kalcium fra 3 147525 knogler Dette derivat er blevet identificeret som 24,- 24- difluor-la,25-dihydroxycholecalciferol (24,24-difluor-la, 25-dihydroxy-vitamin Dj eller 24-F2~l, 25 (OH) 2^·^) ·

Det omhandlede derivat kan udgøre et foretrukkent middel 5 til mange terapeutiske formål, fordi det er blokeret for yderligere metabolisme ved carbonatomet 24. Det er velkendt, at la,25-dihydroxy-vitamin Dj kan undergå yderligere nedbrydning in vivo, hvorved der opstår la,24R,- 25- trihydroxy-vitamin Dj. Denne 24-hydroxylerede form er 10 imidlertid mindre aktiv end selve la,25-dihydroxy-vitamin

Dj, og 24-hydroxyleringen kan faktisk repræsentere et første trin mod nedbrydning og fjernelse af denne forbindelse fra organismen. I det omhandlede derivat forhindrer tilstedeværelsen af 2 fluoratomer ved carbon-24 15 naturligvis hydroxyleringen af dette carbonatom, og for bindelsen er derfor ikke følsom for den aktivitetsformindskende nedbrydning, der påvirker 1,25-dihydroxychole-calciferol. Forhindring af denne sidekædemetabolisme bevirker, at det er muligt at opretholde højere cellenive-20 auer af den analoge gennem et længere tidsrum, en faktor, der har selvfølgelige fordele til mange terapeutiske formål .

Identiteten af forbindelsen som 24,24-difluor-ΐα,25-dihydroxy-vitamin Dj kan bekræftes ud fra de spektroskopi-25 ske egenskaber. Forbindelsen udviser den typiske vitamin D-lignende ultraviolette absorption med et maksimum ved 264 nm. Massespektret af forbindelsen indeholder en mo-lekylarion ved m/e 452, således som der kræves for et 24,25-difluorderivat af la,25-dihydroxy-vitamin Dj. Frag-30 mentionerne m/e 434 og 416 repræsenterer fjernelsen af 1 og 2 molekyler ^0. Tabet af hele steroidsidekæden bevirker fragmentering af m/e 287, der ved fjernelse af 1 og 2 molekyler 1^0 forårsager to toppe ved m/e 269 og 251. Herudover viser spektret udtalte toppe ved m/e 152 og m/e 4 14752-6 134 (152-^0)» der repræsenterer ring A fragmenter og som er typiske for la, 3[3-dihydroxy-vitamin D^-forbindel-ser.

Fremstilling af 24,24-difluor-ΐα,25-dihydroxy-vitamin 5 kan udføres ved direkte C-l-hydroxylering via 3,5-cyclo- vitamin D-mellemprodukterne ifølge opfindelsen ved hjælp af almene metoder beskrevet af Paaren et al., (Proc. Nat.

Acad. Sci., U.S.A. 75, 2080 - 2081 (1978)). Syntesen er vist på det skematiske processkema nedenfor V f f ' χΧχ'® »-Q ‘h i “ ^ “ F F P P P p vX^ .T r^H^L pv oh

iT AcO HO HO

ΗΟ·*'νν>^ΟΗ 1 12 - 13 15 5 147525

Behandling af en pyridinopløsning af 24,24-difluor-25-hydroxy-vitamin (9) med 1-1,5 ækvivalenter p-toluen-sulfonylchlorid i 24 timer ved 3°C, giver efter tilsætning en mættet opløsning af NaHCO^, ekstraktion med. ether, 5 og efterfølgende afdampning af etheren, det tilsvarende 3-monotosylerede derivat. Dette materiale opløses i vandfrit methanol og behandles herefter med 5-10 ækvivalenter NaOAc. Efter opvarmning til 55°C i 20 timer afkøles blandingen, der fortyndes med HgO og ekstraheres med ether.

10 Den ønskede forbindelse 24,24-difluor-25-hydroxy-6-metho- xy-3,5-cyclovitamin D^ (10) (R = methyl) fås efter afdampning af etheren med et 50% totaludbytte. Anvendelsen af andre alkoholiske opløsningsmidler, såsom ethanol og pro-panol, i den ovenfor nævnte reaktion giver analoge cyclo-15 vitamin D-forbindelser med den almene formel (10), hvor R = ethyl, propyl. Disse analoge er lige så anvendelige til de efterfølgende syntetiske trin, som beskrives nedenfor. Dersom det ønskes, kan cyclovitamin D-forbindelsen renses ved hjælp af silicagel-tyndtlagschromatografi, i-20 det man anvender hexan/ethylacetat (8:2) som opløsnings middelsystem, men den kan også anvendes direkte i det næste trin, der indebærer behandling af cyclovitamin-mellemproduktet, opløst i et halogen-carbonhydridopløsnings- middel (f.eks. Ct^Cl^) med SeC^ (0,5 ækvivalenter og 25 t-butylhydroperoxid (2 ækvivalenter), såeldes som beskre vet af Paaren et al. (ovenfor). Efter 15 minutters omsætning ved stuetemperatur tilsættes en 10% NaOH-opløs-ning, og produktet ekstraheres med ether. Etherfasen vaskes med vandig alkali og herefter med vand, der ind-50 dampes og efter tyndtlagschromatografi af remanensen (idet man anvender silicagel og hexan/ethylacetat (6:4) som opløsningsmiddel) fås det rene 24,24-difluor-la,25-dihydroxy-6-methoxy-3,5-cyclovitamin (11) (R = methyl) (udbytte 55%). Behandling af denne forbindelse med is-55 eddikesyre ved 60°C i 15 minutter efterfulgt af neutrali sering af eddikesyren med vandig alkali og ekstraktion 147525 6 med ether giver efter afdampning af opløsningsmidlet en blanding af 24,24-difluor-la, 25-dihydroxy-vitamin Dj-3-ace-tat (12) og den tilsvarende 5,6-transisomere (13) (forhold ca. 3:1). Disse forbindelser kan bekvemt adskilles 5 enten ved søjlechromatografi eller tyndtlagschromato- grafi (f.eks. silicagel, hexan:ethylacetatopløsningsmid-del) eller højtryksvæskechromatografi, og det således opnåede rene 24,24-difluor-la,25-dihydroxy-vitamin Dj-3-acetat hydrolyseres ved behandling med base (f.eks. 5% 10 NaOH/MeOH, 2 timer ved stuetemperatur), hvorefter man ved ekstraktion med ether og afdampning af etheren får den ønskede analoge 24,24-difluor-la,25-dihydroxy-vitamin Dj (14) i ren form, der udviser samme spektrale egenskaber som en tilsvarende forbindelse, der er fremstillet 15 enzymatisk ved hydroxylering af 24,24-difluor-25-hydroxy- vitamin Dj.

5.6- Trans-24,24-difluor-la,25-dihydroxy-vitamin Dj-3-ace-tat (13) isomeren, der fås i ren form efter chromatogra-fien beskrevet ovenfor, hydrolyseres i fortyndet base 20 (5¾ NaOH/MeOH, 2 timer ved stuetemperatur), hvorved man efter etherekstraktion og afdampning af etheren får det rene 5,6-trans-24,24-difluor-la,25-dihydroxy-vitamin Dj (15). Denne forbindelse viser et massespektrum, der er meget lig med den tilsvarende 5,6-cis-isomere, men den 25 udviser et ultraviolet spektrum med et maksimum ved 270 nm, hvilket er karakteristisk for den 5,6-trans-vitamin D-chromofore.

5.6- Trans-24,24-difluor-la,25-dihydroxy-vitamin Dj-forbindelsen kan naturligvis omdannes til 24,24-difluor-la,- 30 25-dihydroxy-vitamin Dj ved den velkendte fotokemiske isomerisering af 5,6-dobbeltbindingen, idet man anvender fremgangsmåden, f.eks. beskrevet af Inhoffen et al., (Chem. ber. 9£, 2544 (1957)). Alternativt kan 5,6-trans- 3-acetat-mellemproduktet (13) opnået ved solvolysen af 7 147525 cyclovitaminforbindelsen, således som beskrevet ovenfor, isomeriseres ved bestråling med ultraviolet lys, hvorved man får 5,6-cis-3-acetatet (12), og omdannelsen af dette materiale til den ønskede 24,24-difluor-la,25-5 dihydroxy-vitamin D^-analoge kan herefter opnås ved hy drolyse i mild base, således som allerede beskrevet.

Biologisk aktivitet

Den biologiske effektivitet af den omhandlede analoge er bekræftet ved forsøg in vivo over for rotter.

10 Fravænnede hanrotter fodres med lav-kalcium, vitamin D- fri diæt, beskrevet af Suda et al. (J. Nutr.100, 1049-1052 (1970)) i 3,5 uger. De opdeltes i tre grupper med 5-6 dyr i hver. Dyrene fra denene gruppe (kontrolgruppen) fik 0,05 ml ethanol intrajugulært. Den anden og tredje gruppe 15 fik en kendt mængde af henholdsvis 24,24-difluor-la,25- dihydroxy-viatmin D^ (24,24-F2~l,25-(Oh^D^) og la,25-di-hydroxy-vitamin D^ (la,25-(OH)^3) som opløsninger i 0,05 ml ethanol intrajugulært. Med passende mellemrum undersøgtes virkningen af forsøgsforbindelserne på tarmkalci-20 umtransporten pg på serumkalciumniveauerne ( et mål for knoglekalciummobilisering) ved standardmetoder (Martin and DeLuca, Am. 0. Phys. 216, 1351 - 1359 (1969) og Tana-ka et al., Biochemistry 14, 3293 - 3296 (1975) med følgende resultater: 8 1Λ7525

Biologisk aktivitet af 24,24-F2~l,25-(0H)2D3 T arm-Ca-

Timer transport Serum

Indgiven Dosis efter .45r ς , Calcium forbindelse (pmol) dosis 4503 mucos) m9/100 ml

EtOh 1,9| 0,4® 3,2ίθ,1® 24,24-F 65 6 4,6± 0,8° 4,3±0,2b 1.25- (00) D 24 4,7± 0,9° 4,l±0,3b 1.25- (0H)^d£ 65 6 4,8± 0,7d 4,2±0,3b 2 3 24 5;7io,7e 4;ι±0;4°

Signifikans b,c,dre fra a b fra a af forskel P<0,001; P <0,001; c fra e c fra a ikke signi- P< 0,005; fikant

De ovenstående data viser, at 24,24-F2-l,25-(0H)2D3 er virksom både i tarmen og i knoglerne, og at forbindelsen er mindst lige så virksom som 1,25-(0H)2D3, det mest aktive, hidtil kendte vitamin D-derivat.