DE69922261T2

DE69922261T2 - Monoklonale antikörper, antigene sowie diagnose und therapie von bösartigen krankheiten

Info

Publication number: DE69922261T2
Application number: DE69922261T
Authority: DE
Inventors: Britta Hardy; Abraham Novogrodsky
Original assignee: Mor Research Applications Ltd
Current assignee: Mor Research Applications Ltd
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 1999-09-30
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-10-01
Also published as: CA2367901A1; NZ513498A; BR9917218A; IL145535A0; CN1346371A; JP2003500015A; DE69922261D1; AU5996599A; US7695715B2; KR20020008140A; AU776464B2; RU2235131C2; ATE283289T1; EP1165616A1; CA2367901C; CN1267452C; ZA200106809B; HUP0200537A2; AU776464C; US20030026800A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Sequenzen monoklonaler Antikörper, Peptidsequenzen von Antigenen, an die die monoklonalen Antikörper binden, als auch diagnostische und therapeutische Assays unter Verwendung der monoklonalen Antikörper und Peptide.
Die gemeinsam eigene PCT-Anmeldung, WO 95/20605 offenbart immunstimulatorische monoklonale Antikörper. Die Antikörper, die Gegenstand dieser PCT-Anmeldung sind, wurden gegen lymphoblastoide B-Zellen gerichtet und zeigten, dass sie eine immunstimulatorische Wirkung besitzen. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass sie eine Antitumorwirkung hervorriefen, wenn sie in tumortragende Tiere injiziert wurden.
Die Krebsdiagnose ist unter den gegenwärtigen medizinischen Verfahren gewöhnlich ein mehrstufiger Prozess, der eine körperliche Untersuchung, Verwendung verschiedener bildgebender Verfahren, Anwendung verschiedener Krebsmarker, etc. erfordert. Im Stand der Technik gibt es einen lang gehegten Bedarf an Krebsdiagnoseverfahren, die den Nachweis von Krebs und ebenfalls die Bestimmung des Krebstyps, an dem das getestete Individuum leidet, gestatten.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von Sequenzen monoklonaler Antikörper, die gegen lymphoblastoide Zellen gerichtet sind. Die vorliegende Erfindung basiert weiterhin auf der Entdeckung, das der Grad der Bindung dieser Antikörper an T-Zellen von Patienten mit Krebs von dem Bindungsgrad dieser Antikörper an T-Zellen gesunder Individuen, verschieden (höher oder niedriger) ist.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird ein Assay bereitgestellt, in dem ein monoklonaler Antikörper angewendet wird, der eine variable Region aufweist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einem monoklonalen Antikörper, der eine variable Region der schweren Kette aufweist, die die Aminosäuresequenz von 1 umfasst;
(b) einem monoklonalen Antikörper, der eine variable Region der leichten Kappa-Kette aufweist, die die Aminosäuresequenz von 2 umfasst;
(c) einem monoklonalen Antikörper, der eine variable Region der schweren Kette aufweist, die die Aminosäuresequenz von 1 und eine variable Region der leichten Kappa-Kette aufweist, die die Aminosäuresequenz von 2 umfasst,
(d) einem monoklonalen Antikörper, der eine variable Region der schweren Kette aufweist, die mindestens 70% Identität zu der Sequenz von 1 aufweist;
(e) einem monoklonalen Antikörper, der eine variable Region der leichten Kette aufweist, die mindestens 70% Identität zu der Sequenz von 2 aufweist.

Der Begriff "Antikörper" bezieht sich erfindungsgemäß auf monoklonale Antikörper irgendeiner der Klassen IgG, IgM, IgD, IgA und IgE. Der Begriff bezieht sich auf vollständige Antikörper oder Fragmente der Antikörper, die die antigenbindende Domäne der Antikörper, bspw. Antikörper, denen der Fc-Abschnitt fehlt, Einzelketten-Antikörper, Fragmente von Abschnitten, die im Wesentlichen lediglich die variable antigenbindende Domäne des Antikörpers, etc., umfassen.
Außerdem können Antikörper verwendet werden, die an ein Antigen binden, an das irgendeiner der vorstehend erwähnten Antikörper spezifisch bindet, d.h. Antikörper, die eine Kreuzreaktivität mit den vorstehend erwähnten Antikörpern aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform ist der monoklonaler Antikörper ein chimärer Mensch-Maus Antikörper, namentlich ein mAb mit einer konstanten Region bzw. Bereich, die menschlichen Ursprungs ist und einer von der Maus abgeleiteten variablen Region. Zu diesem Zweck wurden die variablen Regionen der leichten Kappa und der schweren Kette mit PCR kloniert und ihre DNA sequenziert. Gemäß einer noch anderen Ausführungsform ist der Antikörper ein vollständig humanisierter Antikörper, d.h. sowohl seine variable als auch konstante Region sind menschlichen Ursprungs.
Der Ausdruck "weist mindestens X Prozent Identität auf" bezieht sich auf den prozentualen Anteil der Aminosäurereste, die in den zwei verglichenen Sequenzen identisch sind, wenn die Sequenzen optimal ausgerichtet sind. Daher bedeutet 70% Aminosäuresequenzidentität, das 70% der Aminosäuren in zwei oder mehr bestmöglichst ausgerichteten Polypeptidsequenzen identisch sind. Vorzugsweise beträgt die Identität mindestens 80%, am meisten bevorzugt mindestens 90%.
Erfindungsgemäß einer weiteren Ausführungsform werden Hybridomzelllinien von der Maus verwendet, die irgendeinen der mAbs herstellen. Die Hybridome können durch irgendein im Stand der Technik bekanntes Verfahren (beispielsweise, Kohler, G. und Milstein, C., Nature, 256:495–497, (1975)) hergestellt werden. Der Überstand der Hybridomzelllinien wird gewöhnlich durch irgendeines der im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise durch einen enzymgekoppelten Immunoassay (ELISA) oder Radioimmunoassay (RIA) auf eine Antikörperbindungsaktivität gescreent. Die Überstände werden auf die Produktion von mAbs hin gescreent, die an irgendeines der Peptide von Interesse (wie nachstehend erklärt) binden oder die an Zellen binden, an die sie binden, bspw. Daudi-Zellen oder T-Lymphozyten.
Wie jedem Fachmann ohne Zweifel klar sein wird, können aufgrund der degenerierenden Eigenschaft des genetischen Codes mehrere Nukleinsäuresequenzen den mAb von Interesse, jenseits der in den 1 oder 2 gezeigten, codieren.
Die Entdeckung auf der die Erfindung basiert, besteht darin, dass die mAbs von Interesse in unterschiedlichem Ausmaß an T-Zellen, die von Individuen mit einer malignen bzw. bösartigen Erkrankung erhalten wurden, verglichen mit dem Bindungsausmaß der gleichen mAbs an T-Zellen eines gesunden Individuums, binden können.
Daher wird erfindungsgemäß ein Assay bereitgestellt, der, um ein getestetes Individuum zu identifizieren, das mit einer hohen Wahrscheinlichkeit an einer malignen Erkrankung erkrankt ist und die Schritte (a) bis (c) von Anspruch 1 umfasst.
Erfindungsgemäß kann eine Probe, die von dem zu untersuchenden Individuum erhalten wird, jede Körperflüssigkeit sein, die eine feststellbare Anzahl von T-Zellen enthält. Gewöhnlich ist die Körperflüssigkeitsprobe eine Blut- oder Lymphflüssigkeitsprobe. Vorzugsweise werden die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) in der Probe vor einem Inkontaktbringen der mAbs der Erfindung mit der erhaltenen Probe durch irgendeines der im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise Ficoll Hypaque Dichtezentrifugation aufgetrennt, und die aufgetrennten Zellen werden anschließend mit den getesteten Antikörpern in Kontakt gebracht.
Der Begriff "bösartige Erkrankung" ist gemäß der Erfindung als irgendeine Art einer im Stand der Technik bekannten bösartigen Erkrankung, die sich an irgendeiner ihrer Stadien befindet, zu verstehen.
Dieser Begriff umfasst ebenfalls bösartige Erkrankungen, die sich in ihren Frühstadien befinden und noch keine klinischen Symptome hervorgerufen haben. Vorzugsweise bezieht sich dieser Begriff auf solide Tumoren.
Der Begriff "gesundes Individuum" bezieht sich auf ein Individuum, das an keiner bösartigen Erkrankung erkrankt ist und kann sich ebenfalls auf ein Durchschnittsniveau einiger Individuen oder auf ein Niveau beziehen, das durch Zusammenbringen von Körperflüssigkeiten einiger Individuen erhalten wird. Es sollte erwähnt werden, dass sobald ein Standardausmaß einer Bindung gesunder Individuen eingeführt ist, keine Notwendigkeit besteht diesen Standard erneut für jeden Assay erneut einzuführen und die eingeführte Abbildung fortdauernd verwendet werden kann. Gemäß der Erfindung stellte sich heraus, dass bei gesunden Individuen ungefähr 25% der CD3⁺ T-Zellen die Antikörper der Erfindung binden.
Der Begriff "hohe Wahrscheinlichkeit" bedeutet, dass der erfindungsgemäße Assay einen anfänglichen Screeningassay darstellt, der Individuen identifizieren kann, die vermutlich an einer bösartigen Erkrankung erkrankt sind. Die Tatsache, dass das durch das erfindungsgemäße Verfahren ermittelte Individuum, tatsächlich an einer bösartigen Erkrankung erkrankt ist, muss später unter Verwendung zusätzlicher im Stand der Technik bekannter Verfahren bestätigt werden.
Der Begriff "Bindungsausmaß" bezieht sich auf den Grad einer Bindung des Antikörpers an ein auf den T-Zellen des getesteten Individuums vorkommenden Antigens, dessen Ausmaß durch irgendein der im Stand der Technik bekannten Verfahren zur Bestimmung der Bindungsgrade von Antikörpern, wie beispielsweise ELISA oder Western-Blotting bestimmt werden kann. Das Bindungsausmaß kann unter Verwendung irgendeines Nachweissystems, wie beispielsweise Anti-Maus Immunglobulin oder Fragmente davon, die an einen nachweisbaren Marker gekoppelt sind, bestimmt werden. Beispiele derartiger nachweisbarer Marker umfassen eine radioaktive Gruppe, eine fluoreszierende Gruppe, ein Enzym, das eine Reaktion katalysieren kann, die ein nachweisbares Produkt liefert (wie beispielsweise eine Farbreaktion), eine Biotingruppe, die durch Avidin nachgewiesen werden kann, etc.. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Bindungsausmaß der mAbs an T-Zellen durch eine Doppelmarkierung ausgeführt, bei der der Anti-T-Zell Antikörper (bspw. Anti-CD3⁺ Antikörper) an eine Art eines Fluoreszenzmarkers gekoppelt und der mAb an einen zweiten Typ eines Fluoreszenzmarkers gekoppelt wird. Das Bindungsausmaß wird dann unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsorters (FACS) bestimmt. Die Quantifizierung des Bindungsausmaßes wird durch Bestimmen des prozentualen Anteils von CD3⁺ T-Zellen (bestimmt durch ihre Bindung von Anti-CD3⁺ Antikörpern) erreicht, die ebenfalls den mAb binden.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass die Gesamtzahl von CD3⁺ Zellen in Blutproben von Individuen mit einer bösartigen Erkrankung zu der Anzahl von CD3⁺ Zellen, die von gesunden Individuen erhalten werden, ähnlich ist, so dass die Normalisierung des Bindungsausmaßes, sowohl des mAb als auch CD3⁺ T-Zellen unter Verwendung der gesamten CD3⁺ bindenden T-Zellen, sowohl bei Patienten mit bösartiger Erkrankung als auch bei gesunden Individuen gültig ist. Der prozentuale Anteil der CD3⁺ bindenden T-Zellen jedoch, die ebenfalls den mAb (hiernach: "CD3⁺ mAb Zellen") in Individuen binden, die an einer bösartigen Erkrankung erkrankt sind, unterscheidet sich signifikant von dem Prozentsatz der CD3⁺ mAb⁺ Zellen im Blut gesunder Individuen. Der prozentuale Anteil der CD3⁺ mAb⁺ Zellen in Individuen mit einer bösartigen Erkrankung, kann abhängig vom Typ der bösartigen Erkrankung entweder signifikant höher oder signifikant niedriger liegen als der Prozentsatz von CD3⁺ mAb⁺ Zellen bei gesunden Individuen.
Das Bindungsausmaß eines mAb von Interesse an eine von einem getesteten Individuum erhaltenen T-Zelle wird als "signifikant verschieden" zu dem Bindungsausmaß an T-Zellen angesehen, die von einem gesunden Individuum erhalten wurden, wenn der Unterschied in der Bindung des mAb in einem signifikanten Grad statistisch verschieden ist, wie durch irgendeines der im Stand der Technik bekannten Verfahren (bspw. Students t-Assay), die in Verbindung mit Ergebnissen, die durch die hierin erwähnten experimentellen Verfahren erhalten werden, verwendet werden.
Mit der Erfindung können nicht nur Individuen identifiziert werden, die mit hoher Wahrscheinlichkeit an irgendeinem Typ bösartiger Erkrankungen erkrankt sind (wobei das erkrankte Individuum verglichen mit einem gesunden Individuum ein unterschiedliches Bindungsausmaß von T-Zellen an den mAb aufweist), sondern können ebenfalls eine Be stimmung, ob das Ausmaß höher oder niedriger als das entsprechende Ausmaß in dem gesunden Individuum liegt, helfen Individuen mit spezifischen Typen von Krebs zu identifiziert.
Gewöhnlich befindet sich der Prozentsatz einer Bindung der mAbs von Interesse an von gesunden Individuen erhaltenen T-Zellen in dem Bereich von ungefähr 25%, d.h. 25% der Zellen, die den CD3⁺ T-Zellmarker (bestimmt durch Bindung von Anti-CD3⁺ Antikörper an die Zellen) exprimieren, binden ebenfalls die mAbs.
Erfindungsgemäß ist gezeigt worden, das in Proben, die von Patienten mit Prostatakrebs erhalten wurden, der Prozentsatz CD3⁺ T-Zellen, an die die mAbs der Erfindung binden, in dem Bereich von ungefähr 50% liegt.
Weiterhin wurde gezeigt, dass bei den CD3⁺ T-Zellen, die von Proben stammen, die von Patienten mit Kolon oder Brustkarzinomen erhalten wurden, der Prozentsatz der Zellen die ebenfalls die erfindungsgemäßen mAbs binden, bei ungefähr 7% beziehungsweise 10% liegt.
Somit wurde es erfindungsgemäß möglich unter Verwendung eines einfachen und einzelnen Assays, der auf dem Bindungsausmaß der mAbs an die in der Körperflüssigkeitsprobe gegenwärtigen CD3⁺ Zellen basiert, zu bestimmen, dass es eine hohe Wahrscheinlichkeit gibt, dass ein spezifischer Krebstyp in einer von einem getesteten Individuum genommenen Körperflüssigkeitsprobe vorkommt. Die Einfachheit des Diagnoseassays der Erfindung, der die Verwendung von lediglich einer Art von mAb benötigt, um ein Individuum mit einem bestimmten Krebstyp zu identifizieren, ist für ein breites Screenen einer Population sehr nützlich.
Daher stellt die vorliegende Erfindung einen Assay zur Identifikation eines getesteten Individuums, das mit einer hohen Wahrscheinlichkeit an einer malignen Erkrankung erkrankt ist, bereit, der die Schritte (a) bis (c) von Anspruch 1 umfasst, wobei das Bindungsausmaß an die T-Zellen des Individuums einen spezifischen Typ bösartiger Erkrankung, den das getestete Individuum mit hoher Wahrscheinlichkeit aufweist, anzeigt, wenn es über oder unter dem Bindungsausmaß der mAbs an T-Zellen von gesunden Individuen liegt.
Insbesondere ist das getestete Individuum mit hoher Wahrscheinlichkeit an Prostatakrebs erkrankt, wenn das Bindungsausmaß an den mAb signifikant höher liegt als in gesunden Individuen.
Wenn das Bindungsausmaß signifikant niedriger liegt als das gesunder Individuen, dann ist das getestete Individuum mit hoher Wahrscheinlichkeit an Kolon- oder Brustkrebs erkrankt.
Gemäß einer diagnostischen Ausführungsform der Erfindung, können Zusammensetzungen, die die vorstehend erwähnten mAbs umfassen, zur Diagnose verwendet werden, um mit hoher Wahrscheinlichkeit Individuen mit einer bösartigen Erkrankung (allgemein) zu identifizieren oder eine spezifische bösartige Erkrankung zu identifizieren, an der das Individuum wahrscheinlich erkrankt ist.
Die Hauptausführungsformen der Erfindung werden jetzt mit gelegentlicher Bezugnahme auf die beigefügten Figuren beschrieben werden. In der folgenden Beschreibung und den Figuren wird der Begriff "BAT Antikörper" wechselweise mit dem Begriff offenbarte "mAbs" verwendet werden.
1 zeigt die DNA- und Peptidsequenzen der variablen Region der schweren Kette des offenbarten mAb;
2 zeigt die DNA- und Peptidsequenzen der variablen Region der leichten Kappa-Kette des offenbarten mAb;
3 zeigt eine Analyse der Aminosäuresequenz der variablen Region der schweren Kette des offenbarten Antikörpers (als "BAT" bezeichnet, wobei "BAT" die Aminosäuresequenz der V_H Region des BAT Antikörpers definiert, während "VMS2" die Aminosäuresequenz des Keimbahn VMS2/VGK4 Keimbahngens definiert). Stellen der BAT Sequenz und der Keimbahnsequenz, die identisch sind, werden durch einen Punkt (.) dargestellt; Stellen an denen Fehlpaarungen auftreten, wird der unterschiedliche Keimbahnrest gezeigt. Die folgenden Tabellen und die Sequenz auf den folgenden Seiten beschreiben die Häufigkeit mit der bestimmte Aminosäuren an einer bestimmten Resteposition, sowohl innerhalb der Kabat et al., Sequenzces of proteins of immunolgical interest, (1991) verschiedenartigen Subgruppe der schweren Kette der Maus (Maus V_H Misc.) als auch über eine größere Datenbank aller bekannter V_H Sequenzen der Maus (Alle Maus V_H) auftreten;
4 zeigt eine Analyse der Aminosäuresequenz der variablen Region der leichten Kappa-Kette des offenbarten Antikörpers (in der Fig. als "BAT" bezeichnet). "Maus" definiert die K_K Region Aminosäuresequenz des BAT Antikörpers, während „Keim" die Aminosäuresequenz des Keimbahn H4 Keimbahngens definiert. An Stellen, an denen die BAT Sequenz und die Keimbahnsequenz identisch sind, wird die Keimbahnsequenz durch Punkte (.) dargestellt; an Stellen an denen sich Fehlpaarungen ereignen wird der unterschiedliche Keimbahnrest gezeigt. Die nachstehenden Tabellen und die auf den folgenden Seiten zeigen die Häufigkeit mit der bestimmte Aminosäuren an besonderen Restpositionen sowohl innerhalb der Kabat Maus Subgruppe VI der schweren Kette (Maus V_K VI) als auch über eine größere Datenbank von allen bekannten Maus V_κ Sequenzen (alle Maus V_κ) beobachtet wurden;
5 zeigt die DNA und Peptidsequenzen der variablen Regionen der leichten Kappa-Kette des offenbarten chimären Antikörpers;
6 zeigt die DNA und Peptidsequenzen der variablen Region der schweren Kette des offenbarten chimären Antikörpers;
7 zeigt eine schematische Darstellung des Säugerexpressionsvektors pKN 110, der für die Expression der leichten Kappa-Kette des offenbarten chimären Antikörpers verwendet wurde;
8 zeigt eine schematische Darstellung des Säugerexpressionsvektors pG1D 110, der für die Expression der schweren Kette des offenbarten chimären Antikörpers verwendet wurde;
9 zeigt eine graphische Darstellung, die ein Beispiel von Ergebnissen eines ELISAs' bietet, der die Bindungseigenschaften des Maus und des offenbarten γ1/Kappa chimären Antikörpers an Daudi-Zellen erfasst;
10 zeigt die Aminosäuresequenz von Peptid 1;
11 zeigt die Aminosäuresequenz von Peptid 2
12 zeigt die Aminosäuresequenz von Peptid 3;
13 ist eine schematische Darstellung, die den durch eine FACS-Analyse bestimmten prozentualen Anteil von CD3⁺ Zellen zeigt, die ebenfalls den mAb (bezeichnet als "BAT") verglichen mit der Gesamtzahl von CD3⁺ Zellen in Blutproben gesunder Individuen binden;
14 zeigt den prozentualen Anteil von CD3⁺ Zellen, die ebenfalls den mAb (bezeichnet als BAT) verglichen mit der Gesamtzahl von CD3⁺ Zellen in Blutproben, die von Patienten mit Kolonkarzinom entnommen wurden, binden wie mittels FACS-Analyse bestimmt wurde;
15 zeigt den prozentualen Anteil von CD3⁺ Zellen, die ebenfalls den mAb (bezeichnet als BAT) verglichen mit der Gesamtzahl von CD3⁺ Zellen in Blutproben, die von Patienten mit Brustkarzinom erhalten wurden, binden;
16 zeigt den prozentualen Anteil von CD3⁺ Zellen die ebenfalls den mAb (bezeichnet als BAT) verglichen mit der Gesamtzahl von CD3⁺ Zellen in Blutproben, die von Patienten mit Prostatakarzinom erhalten wurden, binden;
17 ist eine schematische Darstellung, die den durchschnittlichen Prozentsatz von CD3⁺ Zellen zeigt, die verglichen mit Patienten mit Brustkarzinom, Kolonkarzinom oder Prostatakarzinom den mAb (bezeichnet als BAT) in gesunden Individuen binden;
18 ist eine Photographie eines Western-Blots von Peptiden, die von T-Zellen von Individuen mit Prostatakrebs, Ohr-, Nasen- und Rachen (ENT) -karzinom, Brustkarzinom oder von Membranen von Daudi-Zellen erhalten wurden. Der Blot wurde mit dem offenbarten mAb inkubiert und zeigt verglichen mit einem nicht nachweisbaren Grad von Antigen in T-Zellen, die von Patienten mit Brustkarzinom erhalten wurden, eine erhöhte Menge von Antigen in T-Zellen, die von Patienten mit Prostatakarzinom erhalten wurden.
I. Sequenzierung der MAB
(A) Abkürzungen
Fetales Kälberserum (FCS), Ribonukleinsäure (RNA), Messenger-RNA (mRNA), Desoxyribonukleinsäure (DNA), Kopie-DNA (cDNA), Polymerase Ketten Reaktion (PCR), Minute (Min.), Sekunde (Sek.), Tris-Borat Puffer (TBE).
(B) Materialien
Medienbestandteile und alle anderen Gewebekulturmaterialien wurden von Life Technologies (UK) bezogen. Der RNA Isolation Kit wurde von Stratagene (USA) erhalten, während der Erststrang cDNA Synthese Kit von Pharmacia (UK) gekauft wurde. Alle, die Bestandteile und die Gerätschaft für die PCR-Reaktionen, einschließlich der AmpliTaq^® DNA Polymerase, wurden von Perkin Elmer (USA) erworben. Der TA Cloning^® Kit wurde von Invitrogen (USA) erhalten. Agarose (UltraPur^TM) wurde von Life Technologies (UK) erhalten. Der Thermo Sequences^TM pre-mixed cycle Sequenzierungs-Kit und die Vistra 725 DNA Sequenziermaschine wurden beide von Amersham (UK) erworben. Alle anderen molekularbiologischen Produkte wurden von New England Biolabs (USA) erhalten.
(C) Experimentelle Verfahren: PCR Klonierung und Sequenzierung der Gene der variablen Region des Maus BAT Antikörpers
Die BAT Hybridomzellinie der Maus und die Daudi-Zelllinie wurden erfolgreich auf die MRC-CC übertragen und beide Zelllinien wurden in Suspension unter Verwendung von RPMI (ohne Glutamin) ergänzt mit 10% (v/v) FCS, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 12,5 Einheiten/ml Nystatin gezüchtet.
Ungefähr 10⁸ lebende Zellen der BAT Hybridomzellinie wurden geerntet und von den 10⁸ Zellen wurde unter Verwendung eines RNA Isolations-Kits Gesamt-RNA gemäß den Vorschriften des Herstellers isoliert. Bei dem Kit wurde, wie durch Chromczynski und Sacchi, Anal Biochem., 162:156, 1987 beschrieben ein Einzelschrittextraktionsverfahren mit Guanidinium Thiocyant Phenol-Chloroform verwendet. Ebenfalls wurde den Vorschriften des Herstellers folgend ein Erststrang cDNA Synthese Kit verwendet, um eine einzelsträngige DNA-Kopie der mRNA des BAT Hybridoms unter Verwendung des NotI-(dT)₁₈ Primers, der in dem Kit mitgeliefert wurde, herzustellen. Ungefähr 5 μg einer Gesamt RNA wurden jeweils in einem 33 μl Reaktionsendvolumen verwendet. Das vervollständigte Reaktionsgemisch wurde dann auf 90°C für 5 Min. erhitzt, um den RNA-cDNA Duplex zu denaturieren und die Reverse Transkriptase zu inaktivieren, bevor auf Eis gekühlt wurde.
Um das variable Regiongen der schweren Kette der Maus (V_H Gen) und das variable Regiongen der leichten Kappa-Kete der Maus (Vκ Gen) aus der Hybridomzelllinie mit PCR zu amplifizieren, wurde dem durch Jones und Bendig, Bio/Technology, 9:8, 1987 beschriebenen Verfahren gefolgt. Im Wesentlichen wurden zwei Reihen degenerierter Primer, eine die dazu gestaltet ist an die Leadersequenzen der schweren Kettengene der Maus (d.h. MHV1-12; Tabelle 1) anzulagern und einem der dazu gestaltet ist an die Leadersequenzen der leichten Kappa-Kettengene (d.h. MKV1-11; Tabelle 2) anzulagern, in Verbindung mit dazu gestalteten Primern verwendet, die an das 5' Ende des geeigneten Konstanregiongens anlagern, um die Gene der variablen Regionen der Maus zu klonieren.
In einem speziellen PCR-Raum wurden getrennte PCR-Reaktionen für jeden der degenerierten Primer mit ihrem entsprechenden Primer für die konstante Region, unter Verwendung speziell entwickelter Protokolle vorbereitet, die ausgestaltet sind, um die Möglichkeit einer Kreuzkontamination zu minimieren. Die AmpliTaq^® DNA Polymerase verwendet, um in allen Fällen die Matrizen bzw. Template cDNA zu amplifizieren. Die PCR-Reaktionsröhrchen wurden dann in einen Perkin Elmer 480 DNA Thermal Cycler geladen und (nach einem anfänglichen Schmelzen bei 94°C für 15 Min.) bei 94°C für 1 Min. und 72°C für 1 Min. über 25 Zyklen durchgeführt. Bei Beendigung des letzten Zyklus wurde ein letzter Extensionsschritt bei 72°C für 10 Min. ausgeführt, bevor die Reaktionen auf 4°C abgekühlt wurden. Abgesehen für die zwischen den Anlagerungs- (50°C) und Extensions-(72°C) Schritten bei denen eine gedehnte Rampenzeit von 2,5 Min. verwendet wurde, wurde zwischen jedem Schritt des Zyklus eine Rampenzeit von 30 Sek. angewendet.
10 μl Aliquots jeder PCR-Reaktion wurden auf einem 1% Agarose/TBE (pH 8.8) Gel aufgetrennt, um festzustellen welche ein PCR-Produkt der richtigen Größe erzeugt hat. Solche PCR-Reaktionen, die Volllängengene der variablen Region amplifiziert zu haben schienen, wurden wiederholt, um unabhängige PCR-Klone zu erzeugen und dadurch die Wirkung von RCP-Fehlern zu minimieren. 1–6 μl Aliquots dieser PCR-Produkte der richtigen Größe wurden direkt in den pCRII^TM Vektor kloniert, der durch den TA Cloning^® Kit bereitgestellt wurde und wurden gemäß den Herstellerangaben in INA αF' kompetente Zellen transformiert. Kolonien, die das Plasmid mit dem Insert richtiger Größe enthielten, wurden durch PCR-Screening der Kolonien unter Verwendung der pCRII vorwärts und pCRII reversen bzw. rückwärts Oligonukleotidprimer, die nachfolgend in Tabelle 3 beschrieben werden, entsprechend dem Verfahren von Güssow und Clackson, Nucleic Acids Res., 17:4000, 1989 identifiziert.
Diese identifizierten mutmaßlichen positiven Klone enthielten doppelsträngige Plasmid DNA, die unter Verwendung der Vistra DNA Sequenziermaschine und dem Thermo Sequenase^TM pre-mixed cycle Sequenzierkit, wie in den Vorschriften des Herstellers beschrieben, sequenziert wurde.
Beispiel 1: Klonieren und Sequenzieren der variablen Region der schweren Kette des BAT Antikörpers
Wie bei allen Humanisierungsprojekten wurde einem strengen PCR-Klonierungs- und Sequenzierungsprotokoll gefolgt. Dies wurde umgesetzt, um die Möglichkeit zu minimieren, Fehler in die Wildtyp Sequenzen der variablen Region der Maus V_H Gene von der BAT Hybridomzellinie einzuführen. Lediglich wenn alle DNA Sequenzdaten von mindestens zwei verschiedenen V_H Genklonen von der Hybridomzelllinie, die den Maus BAT Antikörper exprimiert, genau passten, wurden die Gensequenzen als richtig akzeptiert.
Drei einzelne PCR-Produkte, die jeweils aus einer unterschiedlichen Gesamt-RNA Präparation und einer anschließenden Erststrang cDNA Synthesereaktion stammten, wurden PCR kloniert und die DNA wurde auf beiden Strängen vollständig sequenziert. Obwohl alle zwölf schwere Kettenprimer getestet wurden (Tabelle 1), amplifizierte lediglich der MHV9 Primer (in Verbindung mit MHCG3 – gestaltet, um an die CH₁ Domäne des Maus γ3 schwere Kettengens anzulagern) ein PCR-Produkt von ungefähr 460 bp, das dann in den pCRII^TM Klonierungsvektor (Daten nicht gezeigt) TA-kloniert wurde.
Die DNA Sequenzanalyse einiger individueller Klone von jedem der drei PCR-Produkte (jeweils von verschiedenen Erststrangsynthesereaktionen und anschließenden PCR Reaktionen) führte, wie in 1 beschrieben, zu der Bestimmung der Sequenz der variablen Region der schweren Kette des BAT Antikörpers. Diese Sequenz wurde auf beiden Strängen für alle drei untersuchten PCR Klone bestätigt.
Beispiel 2: Klonieren und Sequenzieren der variablen Region der leichten Kappa-Kette des BAT Antikörpers
Die einzelsträngige cDNA Matrize, die durch eine Erststrangsynthese erzeugt wurde, wurde unter Verwendung einer Reihe degenerierter Primer von leichten Kappa-Ketten (Tabelle 2 unten) mit PCR amplifiziert. Dies führte jedoch zu der Amplifikation einer Anzahl von PCR Produkten von mehr als einem degenerierten Primer, was nahe legte, dass zumindest durch die BAT Hybridomzellinie mehr als ein Gen für eine variable Region transkribiert wurde.
Erstens, wurde ein PCR Produkt beobachtet, wenn der MKV2 Primer (der ähnlich allen Primern der MKV Reihe an das 5'-Ende der DNA Sequenz des Signalpeptids der leichten Kappa-Kette anlagert) und MKC (der gestaltet ist, um an das 5'-Ende des konstanten Kappa Regiongens der Maus anzulagern) gemeinsam verwendet wurden. Vorherige unternehmensinterne Erfahrungen zeigten uns, dass der MKV2 Primer ein abweichendes mRNA Transkript durch PCR amplifizieren würde. Dieses abweichende Pseudogen war in allen Standardfusionspartnern, die von der ursprünglichen MOPC-21 Plasmazytomzelllinie abgeleitet waren, vorhanden und als MOPC-21n, Deyev, S.M. et al., Genetica, 85:45, 1991, bekannt. NO-0 war eine Zelllinie, die von der MOPC-21 Linie abgeleitet war, und es war diese Linie, die als Fusionspartner verwendet wurde, um das BAT Hybridom zu erzeugen. Folglich war es nicht überraschend, dass ein PCR Produkt beobachtet wurde, wenn der MKV2 Primer verwendet wurde. Dieses Produkt wurde analysiert und als das nicht funktionelles Pseudogen (Daten nicht gezeigt) gezeigt.
Ungewöhnlicherweise wurde ein anderes Pseudogen, das vorhergehend als durch die verwandte Zelllinie NS-1, Hamlyn, P.H., et al., Nucl. Acids Res., 9:4485, 1981 sekretiert erkannt wurde und normalerweise unter Verwendung des MKV7 Primers in Verbindung mit dem MKC Primer durch PCR kloniert wird, wurde in keinem der bisher analysierten PCR Produkte beobachtet. Da die NS-1 und NS-0 Zelllinien sehr eng verwandt sind, war dies ein wenig überraschend. Jedoch hob es ebenfalls die verwirrende Beschaffenheit der Transkription der leichten Kappa-Kette hervor, die in der BAT Hybridomzellinie vorkommt.
Ein anderer PCR-Klon von dem es sich schließlich herausstellte das Vκ Gen des BAT Antikörpers zu sein, wurde ebenfalls aus der BAT Hybridomzellinie mit den Primern MKV5 und MKC durch PCR erfolgreich amplifiziert. Folgend einer Transformation des ungefähr 450 bp Produkts in INVαF' kompetente Zellen, wurden mutmaßliche positive Transformanten unter Verwendung des PCR Screeningassays identifiziert und anschließend wurde die DNA sequenziert.
Aus der Sequenzanalyse zweier einzelner Klone des MKV5 Produkts (jeweils von verschiedenen Erststrangsynthesereaktionen und anschließenden PCR Reaktionen) wurde die DNA Sequenz des variablen Regiongens der leichten Kappa-Ketten des BAT Antikörpers bestimmt (2). Diese Sequenz wurde wieder für jeden Klon auf beiden DNA Strängen bestätigt.
Beispiel 3: Sequenzanalyse der variablen Regionen des BAT Antikörpers der Maus
Die Aminosäuresequenz der BAT V_κ und V_H Regionen wurden mit den Konsensussequenzen variabler Subgruppenregionen der Maus verglichen, die in der Kabat (supra) Datenbank definiert sind. Bei dieser Analyse wurde festgestellt, dass die BAT V_H Region am meisten mit der Konsensussequenz der Maus Kappa-Subgruppe VI übereinstimmt. Ähnliche Vergleiche der BAT V_H Region mit der Kabat Datenbank ergaben, dass sie die engste Übereinstimmung mit der Konsensussequenz schweren Kette Subgruppe "Verschiedenes" ("Miscellaneous") der Maus zeigte.
Ein Vergleich der vorstehend erwähnten Sequenzen der variablen Regionen des BAT Antikörpers mit einer Datenbank von Mauskeimbahnen, ergab, dass das nächste Keimbahngen zu dem BAT V_H Gen VMS/VGK4 (3) war, während das nächste Keimbahngen zu dem BAT V_κ Gen H4 (4) war. Wie in der 3 gesehen werden kann, waren diejenigen sich zwischen dem BAT V_H Gen und seinem engsten Keimbahngen ergebenden Fehlpaarungen wenig überraschend hauptsächlich in der CDR2 und CDR3 angeordnet. Es gab lediglich drei Gerüständerungen und diese waren alle in der FR3 angeordnet. Hinsichtlich des BAT Vκ Gens (4) war es wieder nicht allgemein überraschend, dass die Mehrheit der Fehlpaarungen in den CDRs positioniert war. Die vier in den FRs angeordneten Unterschiede waren alle hoch konservierte Änderungen, ausgenommen für das Cystein an Position 72 (Kabatnummerierung) in FR3. Seine Anordnung unmittelbar angrenzend an den kanonischen Rest (Position 71) legte nahe, dass das Cystein ein Schlüsselrolle bei der Antigenbindung spiel könnte. Jedoch könnte eine derartige Vermutung lediglich durch Modellieren der Fv Domäne geklärt werden.
Trotzdem bestätigten diese Analysen, das die beiden V_H Regionen und die Vκ Regionen der Maus BAT variablen Regionen für variable Regionen der Maus normal zu sein schienen.
Tabelle 1 Bei der Klonierung der variablen Region des BAT schwere Kettengens verwendete PCR Primer
Tabelle 2 Bei der Klonierung der variablen Region des BAT leichten Kappa-Kettengens verwendete Primer
Tabelle 3 Primer für das PCR Screening transformierter Kolonien
II: Konstruktion und Expression eines chimären BAT Antikörpers
(A) Abkürzungen
Die folgenden nicht SI Einheiten und andere Abkürzungen wurden verwendet:
Polymerase Ketten Reaktion (PCR), Desoxyribonukleinsäure (DNA), Kopie-DNA (cDNA), variable Region der leichten Kappa-Kette (V_k), variable Region der schweren Kette (V_H), Minute (Min.), Tris-Borat Puffer (TBE), Phosphat gepuffertes Salz (PBS), Raumtemperatur (RT), Rinderserumalbumin (BSA), Salzsäure (HCl), Meerrettich-Peroxidase (HRP), fettarme Milch (LFM), Stunde (St.), Prozent (%), O-Phenylendiamnin-dihydrochlorid (OPD), Mehrfachklonierungsstelle (MCS).
(B) Materialien
Medienbestandteile und alle anderen Gewebekulturmaterialien wurden von Life Technologies (UK) erhalten. Die Bestandteile für die PCR-Reaktionen, einschließlich der AmpliTaq^® DNA Polymerase wurden von Perkin Elmer (USA) erworben. Der TA Cloing^® Kit und die INVαF' kompetenten Zellen wurden jedoch von Invitrogen (USA) erhalten. DH5α kompetente Zellen und Agarose (UltraPure^TM) wurden von Life Technologies erhalten. Der Thermo Sequenase^TM pre-mixed cycle Sequenzierung Kit und die Vistra 725 DNA Sequenziermaschine wurden beide von Amersham (UK) erworben. Der Big Dye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, der mit dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer verwendet wurde, wurden von PE Applied Biosystems (UK) erworben. Alle anderen beschriebenen molekularbiologischen Produkte wurden entweder von New England Biolabs (USA) oder von Promega (USA) erhalten. Nunc-Immuno Plate MaxiSorp^TM Immunplatten wurden von Life Technologies (UK) erworben, während die Corning easy wash ELISA Platten von Corning Laboratory Company (UK) erhalten wurden. Der Ziege Anti-Mensch IgG (Fc_γ Fragment spezifisch) Antikörper, das Ziege Anti-Mensch leichte Kappa-Ketten/HRP Konjugat und das AffinPure Ziege Anti-Mensch IgG (Fc_γ Fragment spezifisch)/HRP Konjugat wurden von Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (USA) erhalten. K-Blue TMB Substrat und Red Stop Lösung wurden von Neogen Inc. (USA) erworben. Alle anderen Produkte für den ELISA wurden von Sigma (UK) erhalten. Das Microplate Manager^® Datenanalyse Software Paket wurde von Bio-Rad (UK) erworben. Die Mikrovolumen gerührte Ultrafiltrationszelle und die PM30 Filtermembran wurden von Amicon PLC (UK) erworben, während der Immunopure^® (G) IgG Reinigungs-Kit von Pierce PLC (UK) erworben wurde.
(C) Experimentelle Verfahren
C1 Konstruktion eines chimären γ1/κ BAT Antikörpers
Das vorherig isolierte variable Regiongen der leichten Kappa-Kette (V_κ) der Maus (1) und das variable Regiongen der schweren Kette (V_H) (2) wurden an den 5'- und 3'-Enden unter Verwendung spezifisch gestalteter PCR-Primer (Tabelle 1) modifiziert, um eine Expression der BAT variablen Regiongene in Säugerzellen als Teil eines chimären Maus-Mensch Antikörpers zu ermöglichen. Um dies zu erreichen wurden, in einem speziellen PCR-Raum unter Verwendung spezieller Protokolle, die entwickelt wurden, um die mögliche Kreuzkontamination zu minimieren, für jedes variable Regiongen einzelne PCR Reaktionen vorbereitet. Die Plasmide BATV_H-pCR2.1 und BATV_κ-pCR2.1 wurden als Matrizen verwendet und AmpliTaq^® DNA Polymerase wurde verwendet, um diese Matrizen zu amplifizieren. Die Primer B8814 und B8815 (Tabelle 4) wurden verwendet, um das BAT V_H Gen durch PCR zu modifizieren, während die Primer C0224 und C0225 (Tabelle 4) verwendet wurden, um das BAT V_κ Gen durch PCR zu mutieren.
Die PCR Reaktionsröhrchen wurden (nach einem anfänglichen Schmelzen bei 94°C für 3 Min.) bei 94°C für 50 Sek., 72°C für 1 Min. 30 Sek. über 30 Zyklen einem Kreisprozess unterzogen. Bei der Beendigung des letzten Zyklus wurde ein letzter Erweiterungsschritt bei 72°C für 10 Min. ausgeführt bevor die Reaktionen auf Eis gekühlt wurden. Von jeder PCR Reaktion wurden dann 5 μl Aliquots auf einem 1,2% Agarose/TBE (pH 8.8) Gel aufgetrennt, um festzustellen, welche ein PCR Produkt der richtigen Größe erzeugt hat.
Von diesen PCR Produkten der richtigen Größe wurden 1–2 μl Aliquots direkt in den durch den TA Cloning^® Kit bereitgestellten pCR2.1^TM Vektor kloniert und in INVαF' kompetente Zellen, wie in den Vorschriften des Herstellers beschrieben, transformiert. Die Kolonien, die das Plasmid mit einem Insert von richtiger Größe enthielten, wurden durch PCR Screening der Kolonien unter Verwendung der Oligonukleotidprimer 1212 und 1233 (Tabelle 5) entsprechend dem Verfahren von Güssow und Clackson (supra) identifiziert. Diese identifizierten mutmaßlichen positiven Klone, die doppelsträngige Plasmid DNA enthielten wurden sowohl unter Verwendung der Vistra DNA Sequenziermaschine als auch dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer sequenziert. Der Thermo Sequenase^TM pre-mixed Cycle Sequenzier Kit und der Big Dye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaktions Kit wurden, wie in den Vorschriften des Herstellers beschrieben, mit den Primern 1212 und 1233 (Tabelle 5) verwendet.
Diejenigen Klone, die die korrekt angepassten BAT V_κ und V_H Gene enthielten (5 beziehungsweise 6) wurden als HindIII-BamHI Fragmente in die Expressionsvektoren pKN110 (7) beziehungsweise pG1D110 (8) subkloniert, um in Säugerzellen chimäre leichte und schwere Ketten zu exprimieren. Die ligierten Expressionsvektoren (d.h. pKN110-BATV_κ und pG1D110-BATV_H) wurden dann in DH5α kompetente Zellen transformiert. Positive Klone, die die richtig konstruierten Expressionsvektoren enthielten, wurden schließlich durch eine Restriktionsverdauanalyse identifiziert.
C2 Cotransfektion chimärer γ1/κ BAT Antikörpervektor DNA in COS Zellen
Um die Säugerexpressionsvektoren in COS Zellen zu transfizieren wurde dem Verfahren von Kettleborough et al. gefolgt. In Kürze wurde die DNA (jeweils 10 μg des leichten Kappa-Ketten Expressionsvektors pKN110-BATV_κ und des schwere Ketten Expressionsvektors pG1D110-BATV_H) zu einem 0,70 ml Aliquot von 1 × 10⁷ Zellen/ml in PBS zugegeben und bei 1900 V, 25 μF Kapazität unter Verwendung eines Bio-Rad Gene Pulser Geräts gepulst. Gefolgt von einer Erholungsphase von 10 Min. bei RT wurden die elektroporierten Zellen zu 8 ml DMEM, das 5% FCS enthält, zugegeben und für 72 St. in 5% CO₂ bei 37°C inkubiert. Nach 72 St. Inkubation wurde das Medium gesammelt, zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und durch einen ELISA für eine chimäre BAT Antikörperproduktion analysiert.
C3 Quantifizierung von chimärem γ1/κ Antikörper durch ELISA
Zuerst wurde in jedes Loch bzw. Vertiefung einer 96-Loch Nunc-Immuno Platte MaxiSorp^TM Immunoplatte mit 100 μl Aliquots eines in PBS verdünnten 0,4 ng/μl Zeige Anti-Mensch IgG (Fc_γ Fragment spezifischen) Antikörpers beschichtet und über Nacht bei 4°C inkubiert und vor der Verwendung entfernt. Aliquots von 100 μl/Loch der experimentellen Proben (d.h. geernteter COS Zellüberstand, die zentrifugiert wurden, um Zelltrümmer tu entfernen) und in Probenenzymkonjugatpuffer (0,1 M Tris-HCl (pH 7.0), 0,1 M NaCl, 0,02% (v/v) TWEEN-20 und 0,2% (w/v) BSA) 1:2 verdünnte Probenverdünnungen wurden dann auf die Immunoplatte aufgetragen. Außerdem wurde ein gereinigter γ1/κ Antikörper (1000 ng/μl) als Standard verwendet und in serieller 1:2 Verdünnung ebenfalls auf die Immunoplatte aufgebracht. Die Immunoplatte wurde bei 37°C für 1 St. inkubiert, bevor sie mit 200 μl/Loch eines Waschpuffers (PBS/0,1% (v/v) TWEEN-20) dreimal gewaschen wurde. 100 μl eines Ziege Anti-Mensch leichte Kappa-Kette/Meerrettich-Peroxidasekonjugats, das 5000-fach in Probenenzymkonjugatpuffer verdünnt wird, wurde jedem Loch zugegeben, woraufhin die Immunoplatte bei 37°C für 1 St. inkubiert wurde, bevor sie wie vorher gewaschen wurde. 150 μl Aliquots des K-Blue Substrats wurden dann jedem Loch zugegeben, gefolgt von 10 Min. Inkubation der Immunoplatte bei RT im Dunkeln. Die Reaktion wurde schließlich durch Verteilen von 50 μl eines Red Stop in jedes Loch abgestoppt. Die optische Dichte wurde dann bei 655 nm unter Verwendung eines Bio-Rad 3550 Mikroplatten Readers in Verbindung mit dem Microplate Manager^® Software Paket festgestellt.
C4 Reinigung des chimären BAT Antikörpers
Der chimäre BAT γ1/κ Antikörper wurde aus COS Zellüberständen in zwei Schritten gereinigt. Zuerst wurde entsprechend den Herstellerangaben eine Mikrovolumen gerührte Ultrafiltrationszelle mit einer PM30 Filtermembran verwendet, um das Volumen des rohen, nicht gereinigten Überstands zu verringern. Dann wurde ein Immunopure^® (G) IgG Reinigungs Kit ebenfalls entsprechend den Vorschriften des Herstellers verwendet, um den chimären BAT Antikörper von dem konzentrierten Überstand Äffinitäts-aufzureinigen.
C5 Daudi-Zellen ELISA
Der Zell ELISA Assay wurde unter Verwendung der Daudi-Zellen, die von einem Orginalstamm bzw. Originalbestand, ebenfalls von Dr. Hardy (Felsenstein Medical Research Center, Rabin Medical Center, Beilinson Campus, Petach Tikva, 49100, Israel), kultiviert wurden, ausgeführt. Abhängig davon, ob der Maus oder Maus-Mensch chimäre BAT Antikörper analysiert wurde, wurden geringe Modifikationen an dem Assay vorgenommen. Wurde die Bindungsaffinität des Maus BAT Antikörpers getestet, dann wurde ein Ziege Anti-Maus IgG (Fab spezifisch)/HRP Konjugat (1:15000 verdünnt) als sekundärer Antikörper verwendet. Im Gegenteil dazu wurde ein AffiniPure Ziege Anti-Mensch IgG (Fc_γ fragmentspezifisch)/HRP Konjugat (1000-fach verdünnt) verwendet, wenn die Affinität des chimären BAT Antikörper erfasst wurde.
Die Daudi-Zellen (2 Tage nach einer Passage) wurden zuerst mit 10⁵ Zellen/Loch in einer 96-Loch Corning easy wash ELISA Platte ausplattiert und anschließend über Nacht bei 37°C in einem Trockeninkubator inkubiert. Am nächsten Tag wurden 200 μl eines Rehydrationspuffers (PBS, das 10% FCS und 0,05% Azid enthält) zu jedem Loch gegeben, die dann für mindestens 1 St. stehen gelassen wurden. Der Rehydrationspuffer wurde dann abgegossen, bevor 50 μl Aliquots verschiedener serieller 1:2 Verdünnungen des gereinigten BAT Antikörpers zu den Löchern der Platte zugegeben wurden. Die Platte wurde erneut über Nacht (bei 4°C) inkubiert, zweimal mit 200 μl/Loch PBS, mit 5% LFM enthält, gewaschen und trocknen gelassen. 50 μl/Loch des HRP konjugierten sekundären Antikörpers wurden dann zugegeben, bevor eine Reihe von sechs unterschiedlichen Waschgängen (d.h. ein Waschgang mit PBS enthaltend 5% LFM, drei Waschgänge mit dem gleichen Puffer ergänzt mit 0,05% TWEEN-20, gefolgt von weiteren zwei Waschgängen mit PBS/LFM Puffer) durchgeführt wurde. 200 μl/Loch eines 0,4 mg/ml OPD Substrats in 0,05 M Citratpuffer (pH 5.0) und 60 mg/ml Wasserstoffperoxyd wurden dann zugegeben, bevor die ELISA Platte im Dunkeln und bei RT inkubiert wurde bis sich die Farbe entwickelt hatte (normalerweise ungefähr 30 Min.). Schließlich wurde die Reaktion durch die Zugabe von 50 μl/Loch 2,5 M Schwefelsäure gestoppt und die optische Dichte wurde dann unter Verwendung eines Bio-Rad 3550 Mikroplatten Readers in Verbindung mit dem Mikroplatten Manager^® Software Paket bei 490 nm erfasst.
Ergebnisse
Beispiel 4 Konstruktion des chimären γ1/κ BAT Antikörpers
Wie bei allen Projekten wurde ein strenges PCR Klonierungs- und Sequenzierungsprotokoll befolgt. Dies wurde durchgeführt, um die Möglichkeit eines Einführens von Fehlern in die Wildtypsequenzen der variablen Regiongene der Maus während des PCR Modifikationsschritts zu minimieren. Unter Verwendung der Primer C0224 und C0225 (Tabelle 1) wurde das BAT V_κ Gen (2) durch PCR modifiziert, um eine 418 bp Bande (Daten nicht gezeigt) zu erzeugen. Dieses PCR Produkt wurde in das pCR2.1 Plasmid ligiert und in INVαF' kompetente Zellen transformiert. In ähnlicher Weise wurde das Maus BAT V_H Gen (1) unter Verwendung der Primer B8814 und B8815 (Tabelle 1) durch PCR mutiert, um eine 436 bp Bande (Daten nicht gezeigt) zu erzeugen. Dieses PCR Produkt wurde ebenfalls in das pCR2.1 Plasmid ligiert und in INVαF' kompetente Zellen transformiert.
Mutmaßlich positive Transformanten wurden dann unter Verwendung des PCR Screening Assays (Daten nicht gezeigt) festgestellt, bevor schließlich die ds-DNA auf dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer sequenziert wurde. Die 3 und 4 zeigen die Ergebnisse dieser DNA Sequenzanalyse des chimären BAT V_κ Gens beziehungsweise des BAT V_H Gens. Die Analyse wurde dazu ausgeführt, um sowohl ihre erfolgreiche Mutagenese zu bestätigen als auch ebenfalls zu zeigen, dass keine PCR-Fehler vorliegen, die in die Gene hätten eingeführt werden können. Tatsächlich wurde lediglich eine PCR Reaktion für jedes variable Regiongen ausgeführt und von lediglich zwei Klonen von jeder dieser PCR Reaktionen wurden schließlich die DNA Sequenzen vervollständigt.
Trotzdem erwies sich dies als ausreichend, um mindestens einen Klon für jedes modifizierte variable Regiongen, das die richtige modifizierte DNA Sequenz enthielt, zu isolieren.
Die mutierten V_H und Vκ Gene wurden dann als HindIII/BamHI Fragmente in die geeigneten Expressionsvektoren subkloniert, um pKN110-BATVκ (7,88 Kb) beziehungsweise pG1D110-BATV_H (7,55 Kb) zu erzeugen. Die Genauigkeit der konstruierten Expressionsvektoren wurde dann durch eine Restriktionsenzymanalyse (Daten nicht gezeigt) bestätigt. Sobald diese Vektoren in COS Zellen Kotransfiziert sind, würden sie die vorübergehende Expression einer γ1/κ Version des chimären BAT Antikörpers gestatten.
Außerdem wurde als ein Zusatzbestandteil für das BAT Antikörperhumanisierungsprojekt das BAT V_H Gen ebenfalls als ein HindIII/BamHI Fragment sowohl in die pG3D110 als auch den pG4D1100 schwere Ketten Expressionsvektoren subkloniert. Diese Vektoren waren mit dem pG1D110 identisch, wodurch sie sicher für die Ersetzung der cDNA Kopie der menschlichen γ1 Gene der konstanten Region mit sowohl einer cDNA Kopie der 3γ Gene der konstanten Region (in dem Fall von pG3D110) oder der cDNA der γ3 Gene der konstanten Region (in dem Fall von pG3D110) oder der cDNA der γ4 Gene der konstanten Region (in dem Fall von pG3D110) sind. Die Konstruktion dieser Vektoren (d.h. pG3D110-BATV_κ von sowohl γ3/κ beziehungsweise γ4/κ Versionen des chimären BAT Antikörpers in COS Zellen.
Beispiel 5 Vorübergehende Expression des chimären γ1/κ BAT Antikörpers
Die zwei Vektoren pKN110-BATVk und pG1D110-BATV_H wurden in einer Serie von Übergangs-Expressionsexperimenten wiederholt in COS Zellen kotransfiziert. Nach 72 St. Expression wurden die chimären Maus-Mensch γ1/κ BAT Antikörper in dem Überstand der cotransfizierten COS Zellen durch den γ1/κ ELISA nachgewiesen. Die durchschnittliche Konzentration des chimären γ1/κ BAT Antikörpers, der in den Medien festgestellt wurde, wurde von diesen Assays auf 509 ± 272 ng/ml berechnet.
Interessanterweise schienen die γ3/κ und γ4/κ Versionen des chimären BAT Antikörpers nach ihrer Expression von COS Zellen in signifikant höheren Mengen des Antikörpers produziert zu werden. Insbesondere, wenn pG3D110-BATV_H und pKN110BATV_κ in COS Zellen cotransfiziert wurden, wurde die anfängliche Analyse des Überstands (unter Verwendung des in Abschnitt 4.3 beschrieben ELISA Verfahrens und des menschlichen IgG3/Kappa Antikörpers als Standard) der Expressionsgrade des chimären γ3/κ BAT Antikörpers auf 6,7 μg/ml gemessen. Desweiteren, wenn pG4D110-BATV_H pKN110-BATV_κ in COS Zellen exprimiert wurden, maß der gleiche ELISA (unter Verwendung von menschlichem IgG4/Kappa Antikörper als Standard) die Expressionsgrade des γ4/κ BAT Antikörpers auf 8,2 μg/ml.
Beispiel 6 Reinigung des chimären γ1/κ BAT Antikörpers
Ungefähr 8 ml werden pro Kotransfektion geerntet, weshalb ein Reihe von Transfektionen ausgeführt wurde bis 200 ml von COS Überstand gesammelt war. Das Volumen dieses Überstands wurde dann durch Durchführen des Überstands durch eine Mikrovolumen gerührte Ultrafiltrationszelle mit einer PM30 Filtermembran – die einen Molekulargewichtsausschluss von 30 kDa aufweist – auf 15 ml verringert.
Der Immunopure^® (G) IgG Reinigungskit umfasst im Wesentlichen eine 2 ml Säule einer immobilisierten Protein G Säule. Der Antikörper wurde von der Säule mit 6 ml eines Elutionspuffers eluiert, wobei das Eluat davon in 1 ml Fraktionen gesammelt wurde. Die Konzentration des chimären γ1/κ BAT Antikörpers in jeder Fraktion wurde dann unter Verwendung des in Sektion C3 beschriebenen ELISA Verfahrens getestet. Diese Analyse ergab, dass der chimäre Antikörper in Fraktion 3 (42,05 μg/ml) und Fraktion 4 (20,05 μg/ml) vorhanden war, was einer Gesamtausbeute von 62,1 μg/ml des chimären γ1/κ BAT Antikörpers entspricht. Dieser wurde bis zu seiner anschließenden Übermittlung zur weiteren Analyse bei Curetech bei –20°C gelagert.
Beispiel 7 Analyse einer Daudi-Zellbindung durch den chimären γ1/κ BAT Antikörper
Unter Verwendung des Daudi-Zell-ELISAs' wurde deutlich gezeigt, dass der gereinigte chimäre γ1/κ BAT Antikörper an Daudi-Zellen bindet. Die 9 zeigt ein typisches Beispiel eines Experiments. Was jedoch weniger schlüssig war, war das Binden ähnlicher Konzentrationen des Maus BAT Antikörpers in dem gleichen ELISA, das niedriger als der chimäre Antikörper zu sein schien. Da der zum Nachweis einer Antikörperbindung an Daudi-Zellen verwendete konjugierte sekundäre Antikörper für jedes Antikörperkonstrukt unterschiedlich war, kann dennoch kein direkter Vergleich der Bindung der zwei Versionen berechtigterweise durchgeführt werden.
Tabelle 4 Primer, die verwendet werden, um die variablen Regiongene der leichten Kappa-Kette und der schweren Kette des Maus BAT Antikörpers mit PCR zu modifizieren, um ihre Expression als Teil eines chimären γ1/κ BAT Antikörpers in Säugerzellen zu gestatten
Tabelle 5 Primer, die verwendet werden, um die transformierten Kolonien mittels PCR zu screenen und die DNA der PCR modifizierten variable Regiongene des BAT Antikörpers zu sequenzieren
IV Aminosäuresequenz von 3 Peptiden, die von dem Daudi B-Zell lymphoblastoiden Zelllinienantigen stammen, an die die offenbarten mAbs binden
Drei Peptide wurden sequenziert, die von dem antigenen Epitop der Daudi B-lymphoblastoiden Zellen, an die die mAbs binden, umfasst werden. Ihre Sequenzen sind in den 10, 11 und 12 dargestellt.
Suchen, die gegenüber der nicht redundanten Genbank Datenbank und der EST Division ausgeführt wurden, ergaben keine Treffer, wenn die drei Peptide als Abfragen unter Verwen dung des TBLASTN Algorithmus (Version 2) mit einem ERWARTUNGswert von 10 und der Matrix BLOSUM 62 durchgeführt wurden.
Da jedoch die Peptide kleine Peptide darstellen, wurden sie erneut mit einem höheren ERWARTUNGswert eingereicht, um die Suche weniger stringent durchzuführen. Der Filter wurde ebenfalls für niedrige Komplexität entmaskiert, das die potentiell verwirrenden Übereinstimmungen (bspw. Treffer gegen Prolin reiche Regionen oder Proly-A bzw. Poly-A Schwänze) von den Blastberichten beseitigen kann, wodurch Regionen übrig bleiben, deren Blaststatistik die Spezifität ihrer paarweisen Anordnung widerspiegeln. Die drei Peptide erhielten sogar bei einer sehr geringen Stringenz keinen Treffer bei der Genbank und der EST Divisionsdatenbank.
Daher scheinen, in Übereinstimmung mit den vorstehenden Ergebnissen, die drei vorstehend erwähnten Peptide neue Peptide zu sein.
IV Diagnose bösartiger Erkrankungen bei Patienten unter Verwendung des offenbarten mAb
Periphere Blutlymphozyten von getesteten Individuen wurden unter Verwendung des Anti-CD3 Antikörpers und eines der mAbs doppelmarkiert. Der Prozentsatz von CD3⁺ Zellen, die die mAbs binden wurden bestimmt. Erfindungsgemäß wurde gezeigt, dass die Anzahl der CD3⁺ mAb⁺ Zellen in Individuen mit einer bösartigen Erkrankung von dem prozentualen Anteil dieser Zellen in Blutproben, die von gesunden Individuen erhalten wurden, verschieden sind. Die Tatsache, dass es einen signifikanten Unterschied des prozentualen Anteils der CD3⁺ Zellen in Individuen mit einer bösartigen Erkrankung gibt und wenn der Unterschied oberhalb oder unterhalb des prozentualen Anteils von CD3⁺ mAb⁺ Zellen liegt, die von gesunden Individuen erhalten wurden, dann kann mit hoher Wahrscheinlichkeit bestimmt werden, ob das Individuum eine bösartige Erkrankung hat, als auch die spezifische Art einer bösartigen Erkrankung, an der das getestete Individuum erkrankt sein kann.
Gewöhnlich wurden menschliche periphere Blutlymphozyten aus 20 ml Blut entweder eines gesunden Individuums oder von Krebspatienten durch Ficoll Hypaque Dichtezentrifugation erhalten. Die Zellen wurden gewaschen und in PBS mit 0,5% BSA und 0,05% Azid (as acid) suspendiert. Die Proben, die 0,5 × 10⁶ Zellen enthielten, wurden für eine FACS-Analyse verwendet. Zuerst, wurden die Zellen mit einer gesättigten Menge des erfindungsgemäßen mAb für 45 Min. bei 0°C inkubiert, gefolgt von ihrer Inkubation mit einem FITC konjugierten Anti-Maus mAb für 30 Min. auf Eis. Nach zwei Waschgängen und Zentrifugation bei 1200 Upm, wurden die Zellen mit PE konjugierten Anti-Mensch CD3 Antikörpern für 30 Min. auf Eis inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen zweimal gewaschen und die Probe wurde durch einen FACS Scan (Bectan Dickinson) analysiert. Die Ergebnisse werden in den 13 bis 17 gezeigt.
Wie in der 13 als auch in 17 gesehen werden kann, liegt der prozentuale Anteil von CD3⁺ BAT⁺ Zellen (verglichen mit den gesamten CD3⁺ Zellen) in Blutproben, die von gesunden Individuen erhalten wurden, in dem Bereich von ungefähr 25%. Wie in 14 zu sehen ist, liegt der prozentuale Anteil der CD3⁺ BAT⁺ Zellen in Blutproben, die von Patienten mit Kolonkarzinom erhalten wurden, verglichen mit gesunden Individuen beträchtlich niedriger, in einem Bereich von ungefähr 7%. In ähnlicher Weise liegt der prozentuale Anteil von CD3⁺ BAT⁺ Zellen in Blutproben, die von Patienten mit Brustkarzinom erhalten wurden in einem Bereich von ungefähr 10% (15). Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass durch die Tatsache, dass der prozentuale Anteil von CD3⁺ BAT⁺ Zellen verglichen mit gesunden Individuen niedriger ist, ein Kolon- und Brustkarzinom identifiziert werden kann.
Der prozentuale Anteil von CD3⁺ BAT⁺ Zellen in Blutproben, die von Patienten mit Prostatakarzinom erhalten wurden, liegt, wie in 16 zu sehen ist, signifikant höher als der Prozentsatz in Blutproben von gesunden Individuen und liegt in dem Bereich von ungefähr 50%. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass ein Prostatakarzinom durch die Tatsache, dass der prozentuale Anteil von CD3⁺ BAT⁺ Zellen, wie in 16 zu sehen ist, verglichen mit gesunden Individuen höher liegt, identifiziert werden kann. Wie in der 18 zu sehen ist, ist die Menge des Antigens, das der erfindungsgemäße mAb bindet, das auf T-Zellen gefunden wird, die von Patienten mit Prostatakarzinom erhalten wurden, sehr hoch ist, während das Antigen auf T-Zellen, die von Patienten mit Brustkarzinom erhalten wurden, nicht nachweisbar ist.
Die vorstehend erwähnten Ergebnisse zeigen, dass die offenbarten mAbs verwendet werden können, um ein Individuum zu identifizieren, das an einer bestimmten Art einer bösartigen Erkrankung leidet. Daher liegt, wenn in einer Blutprobe, die von einem getesteten Individuum erhalten wird und das Bindungsausmaß der erfindungsgemäßen mAbs an CD3⁺ Zellen in der Probe signifikant hoch ist (in dem Bereich von ungefähr 50%) eine hohe Wahrscheinlichkeit vor, dass das getestete Individuum an einem Prostatakrebs leidet. Im Gegenteil liegt, wenn der prozentuale Anteil der CD3⁺ Zellen in der Probe verglichen mit gesunden Individuen (in dem Bereich von ungefähr 7% oder 10%) signifikant niedrig ist, eine hohe Wahrscheinlichkeit vor, dass das getestete Individuum an einem Brust oder Kolonkarzinom leidet. Offensichtlich ist, dass wenn das getestete Individuum ein männliches Individuum ist, eine hohe Wahrscheinlichkeit vorliegt, dass es an einem Kolonkarzinom leidet.
Die vorstehend ausgeführten Beispiele sollten nicht einschränkend ausgelegt werden und zusätzliche Korrelationen zwischen dem prozentualen Anteil CD3⁺ Zellen, die die mAbs binden und anderen bösartigen Erkrankungen liegen ebenfalls innerhalb des Bereichs der Erfindung.
Sequenzliste

Claims

Assay zur Identifizierung eines getesteten Individuums, das mit hoher Wahrscheinlichkeit an einer malignen Erkrankung erkrankt ist, umfassend: a) Inkontaktbringen einer Probe einer Körperflüssigkeit, die von einem Individuum erhalten wurde, mit mindestens einem der monoklonalen Antikörper (mAbs), die eine variable Region aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: i) einem monoklonalen Antikörper, der eine variable Region der schweren Kette aufweist, die die Aminosäuresequenz von 1 umfasst; ii) einem monoklonalen Antikörper, der eine variable Region der leichten Kappa-Kette aufweist, die die Aminosäuresequenz von 2 umfasst; iii) einem monoklonalen Antikörper, der die variable Region der schweren Kette aufweist, die die Aminosäuresequenz von 1 umfasst und die variable Region der leichten Kappa-Kette aufweist, die die Aminosäuresequenz von 2 umfasst; iv) einem monoklonalen Antikörper, der eine variable Region der schweren Kette aufweist, die mindestens 70% mit der Aminosäuresequenz von 1 identisch ist; und v) einem monoklonalen Antikörper, der eine variable Region der leichten Kappa-Kette aufweist, die mindestens 70% mit der Aminosäuresequenz von 2 identisch ist. b) Bestimmen des Bindungsausmaßes der mAbs an T-Zellen in der Probe; und c) Vergleichen des Ausmaßes von b) mit dem Bindungsausmaß der mAbs an T-Zellen in einer von einem Gesunden erhaltenen Probe, wobei ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden vorstehend aufgeführten Bindungsausmaßen anzeigt, dass das getestete Individuum eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweist, an einer malignen Erkrankung erkrankt zu sein.
Assay nach Anspruch 1, wobei ein an T-Zellen des Individuums oberhalb oder unterhalb des Bindungsniveaus der mAbs an T-Zellen von gesunden Individuen vorliegendes Bindungsausmaß anzeigt, dass ein spezifischer Typ einer malignen Erkrankung vorliegt, an dem das getestete Individuum mit einer hohen Wahrscheinlichkeit erkrankt ist.
Assay nach Anspruch 1 oder 2, wobei der monoklonale Antikörper ein chimärer Human-Maus-Antikörper ist.
Assay nach Ansprüchen 1 bis 3, wobei die Körperflüssigkeit Blut ist.
Assay nach Ansprüchen 1 bis 4, wobei vor Schritt a) PBMCs aus der Probe abgetrennt werden, wobei die PBMCs dann in Schritt a) mit dem mindestens einen der mAbs in Kontakt gebracht werden.
Assay nach Ansprüchen 2 oder 5, wobei das von dem getesteten Individuum erhaltene Bindungsausmaß der mAbs an T-Zellen höher ist, als das Bindungsausmaß der gleichen mAbs an T-Zellen von gesunden Individuen.
Assay nach Anspruch 6, wobei die spezifische maligne Erkrankung ein Prostatakarzinom ist.
Assay nach den Ansprüchen 2 oder 5, wobei das von dem getesteten Individuum erhaltene Bindungsausmaß der mAbs an T-Zellen niedriger ist, als das Bindungsausmaß der gleichen mAbs an T-Zellen von gesunden Individuen.
Assay Nach Anspruch 8, worin die spezifische maligne Erkrankung ein Mammakarzinom oder ein Kolonkarzinom ist.