DE69535543T2

DE69535543T2 - Für enzyme, die die fähigkeit besitzen lineare alpha 1,4-glucane in pflanzen, pilzen und mikroorganismen zu synthesieren, kodierende dna sequenzen

Info

Publication number: DE69535543T2
Application number: DE69535543T
Authority: DE
Inventors: Jens Kossmann; Volker Büttcher; Thomas Welsh
Original assignee: Bayer Bioscience GmbH
Current assignee: Bayer Bioscience GmbH
Priority date: 1994-05-18
Filing date: 1995-05-18
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2015-05-19
Also published as: US6265635B1; EP0759993B1; AU2614195A; US7456003B2; HUT76087A; US20020092040A1; CA2190149C; WO1995031553A1; ATE368118T1; IL113776A; AU699552B2; US20050227319A1; HU226874B1; RU2201963C2; HU9603170D0; IL113776A0; KR100352532B1; US6818421B2; EP0759993A1; ES2287935T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft gentechnologische Verfahren zur Herstellung von Pflanzen und Mikroorganismen, die in der Lage sind, intra- und extrazellulär ein Protein zu exprimieren, das eine Amylosucraseaktivität aufweist und die Synthese linearer α-1,4-Glucane aus Saccharose katalysiert.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue DNA-Sequenzen und Plasmide, enthaltend diese DNA-Sequenzen, die nach Einführung in das Genom einer Pflanze oder nach Transformation in Mikroorganismen, insbesondere Bakterien oder Pilze, zur Expression eines Enzyms führen, das die Synthese von linearen α-1,4-Glucanen aus Saccharose katalysiert, sowie die transgenen Organismen (i.e. Pflanzen, Pilze und Mikroorganismen), die die obengenannten DNA-Sequenzen enthalten.
Lineare α-1,4-Glucane sind Polysaccharide, die aus Glucosemonomeren aufgebaut sind. Dabei sind die Glucosemonomere ausschließlich über α-1,4-glycosidische Bindungen miteinander verbunden. Das am häufigsten natürlich vorkommende α-1,4-Glucan ist die Amylose, ein Bestandteil der pflanzlichen Stärke. Der Verwendung linerarer α-1,4-Glucane im industriellen Bereich kommt in der letzten Zeit immer größere Bedeutung zu. Amylose kann aufgrund ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften für die Herstellung von Filmen verwendet werden, die farblos, geruch- und geschmacklos, nicht toxisch und biologisch abbaubar sind. Sie finden bereits heute eine ganze Reihe von Anwendungsmöglichkeiten, so z.B. in der Lebensmittelindustrie, der Textilindustrie, der Glasfaserindustrie und bei der Papierherstellung.
Weiterhin ist es gelungen, aus Amylose Fasern herzustellen, die in ihren Eigenschaften der natürlichen Cellulosefaser ähnlich sind und es erlauben, diese in der Papierherstellung teilweise oder sogar völlig zu ersetzen.
Amylose als wichtigster Vertreter der linearen α-1,4-Glucane findet Anwendung insbesondere als Bindemittel bei der Tablettenherstellung, als Dickungsmittel von Pudding und Cremes, als Gelatineersatz, als Bindemittel bei der Herstellung schalldämmender Wandplatten und zur Verbesserung der Fließeigenschaften von wachsartigen Ölen.
Eine weitere Eigenschaft der α-1,4-Glucane, die in jüngster Zeit immer mehr Interesse findet, ist die Fähigkeit dieser Moleküle, aufgrund ihrer helikalen Struktur Einschlussverbindungen mit organischen Komplexbildern einzugehen. Diese Eigenschaft ermöglicht eine Anwendung der α-1,4-Glucane auf den verschiedensten Gebieten. Diskutiert wird die Verwendung zur molekularen Verkapselung von Vitaminen, Arzneistoffen und Aromastoffen sowie die Verwendung zur chromatographischen Auftrennung von Substanzgemischen an immobilisierten linearen α-1,4-Glucanen.
Amylose dient ferner als Ausgangsstoff für die Herstellung von sogenannten Cyclodextrinen (auch Cycloamylosen, Cyclomaltosen), die ihrerseits breite Anwendung insbesondere in der Pharmaindustrie, Lebensmitteltechnologie, Kosmetik und analytischen Trenntechnik finden. Bei diesen Cyclodextrinen handelt es sich um cyclische Maltooligosaccharide aus 6-8 Monosaccharideinheiten, die gut wasserlöslich sind, aber eine hydrophoben Hohlraum besitzen, der für die Bildung von Einschlussverbindungen genutzt werden kann.
Die Gewinnung linearer α-1,4-Glucane erfolgt heutzutage in Form von Amylose aus Stärke. Stärke selbst ist jedoch aus zwei Komponenten aufgebaut. Eine Komponente bildet die Amylose als unverzweigte Kette aus α-1,4-verknüpften Glucoseinheiten. Die andere Komponente bildet das Amylopektin, ein hochverzweigtes Polymer aus Glucoseeinheiten, bei dem neben den α-1,4-Verbindungen auch Verzweigungen der Glycoseketten über α-1,6-Verbindungen auftreten können. Aufgrund der unterschiedlichen Struktur dieser beiden Komponenten und der daraus resultierenden physikalisch-chemischen Eigenschaften finden die beiden Komponenten auch weitgehend unterschiedliche Verwendungsmöglichkeiten. Um sich die Eigenschaften der einzelnen Komponenten direkt zu Nutze machen zu können, ist es erforderlich, diese in reiner Form zu gewinnen. Beide Komponenten können aus Stärke gewonnen werden, was jedoch eine Reihe von Reinigungsschritten erfordert und zeit- und kostenintensiv ist. Es besteht daher ein dringender Bedarf, Möglichkeiten zu finden, die beiden Komponenten der Stärke in einheitlicher Form gewinnen zu können. Um dies zu erreichen, ging man bisher den Weg, stärkeproduzierende Pflanzen durch Züchtung oder gentechnische Manipulation dahingehend zu verändern, dass sie Stärke mit verändertem Amylose/Amylopektin-Verhältnis produzieren. Während der normale Amylopektinanteil bei Maisstärke z.B. bei ca. 70% liegt, gelang es, durch Züchtung eine Maissorte (waxy maize) zu etablieren, deren Stärke zu nahezu 100% aus Amylopektin besteht (Akatsuka and Nelson, 1966, J. Biol. Chem. 241:2280-2285). Des Weiteren wurden verschiedene Maissorten mit einem erhöhten Amylosegehalt (60–70%) mittels züchterischer Maßnahmen hergestellt, z.B. die Sorten amylose extender und dull (Wolf et al. 1955, J. Am. Chem. Soc.77:1654–1659; Boyer et al. 1976, Die Stärke: 28: 405–410). Auch andere Pflanzenspezies wurden verwendet, um Sorten zu erhalten, die einheitliche Stärken in Form von Amylopektin synthetisieren, z.B. Reis (Sann, 1984, Theor. Appl. Genet. 68:467–473) und Gerste (Shannon and Garwood, 1984, in: Whistler, Bemiller, Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, Orlando, 2. Auflage: 25–86), oder die hochgradig amylosehaltige Stärke synthetisieren (z.B. Erbse).
Neben diesen auf klassisch-züchterischen Verfahren beruhenden Ansätzen wurde über Ansätze berichtet, die auf der genetischen Veränderung Stärke produzierender Pflanzen basieren.
Visser et al. (1991, Mol. Gen. Genet. 225:289–296) z.B. beschreiben, dass durch Antisense-Inhibition des Gens, das die stärkekorngebundene Stärkesynthetase codiert, Kartoffelsorten erhalten werden können, die im Wesentlichen reine Amylopektinstärke synthetisieren.
WO 92/14827 offenbart die Herstellung von Kartoffelpflanzen, die aufgrund der Antisense-Inhibition der Expression des Verzweigungsenzyms eine Stärke produzieren, die einen erhöhten Amylose/Amylopektin-Anteil aufweisen. Die in WO 92/14827 beschriebenen Pflanzen produzieren jedoch keine hochgradig amylosehaltige Stärke.
Trotz zahlreicher Bemühungen und verschiedenartiger Ansätze ist die Herstellung von Pflanzen, die reine Amylosestärke produzieren, bisher noch nicht gelungen. Auch ist bisher keine Möglichkeit beschrieben worden, hochgradig reine Amylose bzw. reine lineare α-1,4-Glucane unter Verwendung anderer Verfahren, z.B. Verwendung genetisch veränderter Mikroorganismen, herzustellen.
Des Weiteren wurden bislang keine DNA-Sequenzen gefunden, die Enzyme codieren, die fähig wären die Synthese von linearen α-1,4-Glucanen in Pflanzen, Pilzen, Mikrooganismen oder in vitro zu katalysieren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung von DNA-Sequenzen und Verfahren, die es ermöglichen, die Herstellung von Pflanzen, Pilzen und Mikrooganismen zu erlauben, die fähig sind, lineare α-1,4-Glucane zu synthetisieren.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung wird erzielt durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen definierten Ausführungsformen.
Die Erfindung betrifft daher DNA-Sequenzen, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosesucrase codieren, die die Synthese linearer α-1,4-Glucane aus Saccharose katalysiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

(a) DNA-Sequenzen, codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, codiert durch eine codierende Region, die eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea, wie enthalten in der DNA-Insertion des Plasmids pNB2 (DSM 9196), codiert;
(b) der DNA-Sequenz mit der Nucleotidsequenz der codierenden Region, die eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea, wie enthalten in der DNA-Insertion des Plasmids pNB2 (DSM 9196), codiert;
(c) DNA-Sequenzen, die mit einer Sequenz gemäß (a) oder (b) hybridisieren;
(d) DNA-Sequenzen, welche zumindest zu 40% identisch zu der DNA-Sequenz, wie definiert in (b), sind; und
(e) DNA-Sequenzen, welche im Vergleich zu den in (a), (b), (c) oder (d) erwähnten Sequenzen aufgrund des genetischen Codes degeneriert sind.

Insbesondere betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, das codiert wird von der codierenden Region einer Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea, wie sie in der DNA-Insertion des Plasmids pNB2 (DSM 9196) enthalten ist, und die DNA-Sequenz mit der Nucleotidsequenz der codierenden Region, die eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea, wie enthalten in der DNA-Insertion des Plasmids pNB2 (DSM 9196), codiert. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus DNA-Sequenzen, die an die oben erwähnten erfindungsgemäßen Sequenzen hybridisieren und ein Protein codieren, das die enzymatische Aktivität einer Amylosucrase aufweist, sowie DNA-Sequenzen, die aufgrund des genetischen Codes im Vergleich zu den oben erwähnten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen degeneriert sind.
Der Begriff „Hybridisierung" bezieht sich in diesem Kontext auf die Hybridisierung unter Standardhybridisierungsbedingungen, bevorzugt unter strigenten Bedingungen, wie sie z.B. von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben werden.
Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, die ein Protein codieren, das die enzymatische Aktivität einer Amylosucrase aufweist, sind durch ein Verfahren, das die folgenden Schritte aufweist, erhältlich:

a) Herstellung einer genomischen oder einer cDNA-Bibliothek ausgehend von der genomischen DNA oder der mRNA von Zellen eines Organismus;
b) Transformation eines geeigneten Wirtes mit der in Schritt a) konstruierten Bibliothek;
c) Bedampfung der transformierten Zellen mit Ioddampf;
d) Identifizierung von Zellen, die eine Blaufärbung aufweisen;
e) Isolierung und Kultivierung der in Schritt d) identifizierten Zellen; und
f) Isolierung der genomischen DNA-Insertion oder der cDNA-Insertion aus den transfomierten Zellen.

Ein angemessener Wirt, wie in Schritt b) aufgeführt, ist z.B. E. coli.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die eine Amylosucrase aus Mikroorganismen, insbesondere aus Gram-negativen Mikroorganismen, vorzugsweise aus Bakterien der Spezies Neisseria und besonders bevorzugt aus Neisseria polysaccharea codieren.
Es ist auch möglich die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen durch Mutation oder durch eine Sequenzveränderung durch Insertion, Deletion, Substitution oder Rekombination zu verändern, um bestimmte Eigenschaften des zu exprimierenden Proteins zu ändern.
Eine dieser Modifikationen besteht unter anderem in der Deletion der Signalsequenz, die die Sekretion des Enzyms sicherstellt, und der Insertion anderer Signalsequenzen oder DNA-Sequenzen, die Transitpeptide codieren und dadurch die Lokalisierung des exprimierten Proteins beeinflussen.
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, insbesondere die in SEQ ID NO:1 dargestellte erfindungsgemäße DNA-Sequenz oder Teile davon, können verwendet werden, um zu bestimmen, ob homologe DNA-Sequenzen in bestimmten Organismen vorhanden sind oder von diesen exprimiert werden. Zu diesem Zweck werden DNA- oder mRNA-Sonden des einzelnen Organismus unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen nach Standardverfahren an eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz hybridisiert.
Es ist auch möglich, homologe Sequenzen, die gleichermaßen Amylosucrase oder Enzyme mit ähnlichen Eigenschaften codieren, unter Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz nach Standardtechniken vom Genom verschiedener Organismen zu isolieren. In diesem Zusammenhang bedeutet Homologie eine Sequenzidentität von mindestens 40% bis 60%, bevorzugt von mehr als 60%, insbesondere mehr als 80%, noch stärker bevorzugt eine Sequenzidentität von mehr als 95%. Homologie bedeutet darüber hinaus, dass die entsprechende DNA-Sequenzen oder codierten Aminosäuresequenzen funktionell oder strukturell äquivalent sind. Die Sequenzen, die zu den erfindungsgemäßen Sequenzen homolog sind und die von der DNA-Sequenz oder der codierten Aminosäuresequenz gemäß der Erfindung in einer oder mehreren Positionen abweichen, sind regelmäßig Variationen der Sequenz, die Modifikationen mit der gleichen Funktion darstellen. Diese können natürlich vorkommende Variationen wie Sequenzen anderer Organismen oder Mutationen sein. Diese Mutationen können natürlicherweise vorkommen oder können durch spezifische Mutagenese herbeigeführt sein. Darüber hinaus kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. All diese DNA-Sequenzen sind ebenfalls in der Erfindung umfasst.
Den Proteinen, die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codiert werden, sind bestimmte Eigenschaften wie enzymatische Aktivität, immunologische Reaktivität, Konformation etc. ebenso wie physikalische Eigenschaften wie elektrophoretische Mobilität, chromatographisches Verhalten, Sedimentationskoeffizient, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität, etc., gemeinsam.
Um verwandte DNA-Sequenzen zu bestimmen, ist es erforderlich, Genbibliotheken der zu untersuchenden Organismen zu erhalten, die für den Geninhalt des Organismus oder die Genexpression im Organismus oder für ein bestimmtes Gewebe des Organismus representativ sind. Beim zuerst erwähnten Typus handelt es sich um Genombibliotheken, beim letzteren um cDNA-Bibliotheken.
Die Identifikation und Isolierung von homologen DNA-Sequenzen aus solchen Bibliotheken erfolgt durch Hybridisierung nach Standardtechniken (siehe, z.B., Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laborstory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Als Hybridisierungssonde können DNA-Moleküle verwendet werden, die genau oder im Wesentlichen die unter SEQ ID NO:1 angegebene DNA-Sequenz oder einen Teil dieser Sequenz aufweisen. Die DNA-Fragmente, die als Hybridisierungssonden verwendet werden, können auch synthetische DNA-Fragmente sein, die nach Standard-DNA-Synthesemethoden hergestellt wurden und im Wesentlichen mit einer erfindungsgemäßen Sequenz identisch sind. Wenn die Gene, die an eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz hybridisieren, identifiziert und isoliert wurden, ist es erforderlich, die Sequenz zu bestimmen und die Eigenschaften der von dieser Sequenz codierten Proteine zu analysieren.
Die Amylosucrase (auch bezeichnet als Sacchrose:1,4-α-Glucan 4-α-Glucolsyltransferase, E.C. 2.4.1.4.) ist ein Enzym, für das der folgende Reaktionsmechanismus vorgeschlagen wird: Saccharose + (α-1,4-D-Glycosyl)_n → D-Fructose + (α-1,4-D-Glycosyl)_n+1
Bei dieser Reaktion handelt es sich um eine Transglucosylierung. Die Produkte dieser Reaktion sind lineare α-1,4-Glucane und Fructose. Cofaktoren werden nicht benötigt. Amylosucraseaktivität wurde bisher nur in wenigen Bakterienarten gefunden, darunter hauptsächlich Neisseria Spezies (MacKenzie et al., 1978, Can. J. Microbiol. 24:357–362) und das Enzym ist bisher lediglich in seiner enzymatischen Aktivität untersucht worden. Nach Okada et al. führt das partiell aufgereinigte Enzym aus Neisseria perflava nach Zugabe von Saccharose zur Synthese glykogenartiger Polysaccharide, die in einem geringen Maß Verzweigungen aufweisen (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem., 249:126–135). Ebenso zeigen auch die intra- bzw. extrazellulär synthetisierten Glucane von Neisseria perflava bzw. Neisseria polysaccharea einen gewissen Verzweigungsgrad (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32:909–911). Ob diese Verzweigungen durch die Amylosucrase eingeführt werden oder durch ein anderes Enzym, das in aufgereinigten Amylosucrase-Präparationen als Kontamination vorliegt, wurde bisher nicht geklärt. Da der Nachweis eines Enzyms, das Verzweigungen einführt, bisher nicht gelungen ist, wird vermutet, dass sowohl die Polymerisierungs- als auch die Verzweigungsreaktionen von Amylosucrase katalysiert werden (Okada et al., 1974, J. Biol. Chem., 249:126–135).
Das Enzym, das in Neisseria konstitutiv exprimiert wird, ist extrem stabil, bindet sehr fest an die Polymerisationsprodukte und wird kompetitiv durch das Produkt Fructose inhibiert (MacKenzie et al., 1977, Can. J. Microbiol. 23:1303–1307). Bei der Neisseria-Spezies Neisseria polysacchariea wird die Amylosucrase sekretiert (Riou et al., 1986, Can. J. Microbiol. 32:909–911), wohingegen sie in den anderen Neisseria-Arten in der Zelle verbleibt.
Enzyme mit einer Amylosucraseaktivität konnten bisher nur in Mikroorganismen nachgewiesen werden. Aus Pflanzen sind Amylosucrasen nicht bekannt.
Erfindungsgemäß konnte nachgewiesen werden, dass das durch Amylosucrase katalysierte Reaktionsprodukt lineare α-1,4-Glucane sind, die entgegen bisheriger Auffassung nicht verzweigt sind (siehe oben).
Der Nachweis der enzymatischen Aktivität der Amylossucrase kann durch Nachweis der synthetisierten Glucane, wie in Beispiel 3 unten beschrieben, erbracht werden. Der Nachweis wird normalerweise mithilfe einer Iodfärbung durchgeführt. Es ist möglich Amylosucrase exprimierende Bakterienkolonien z.B. durch Behandlung mit Ioddampf zu identifizieren. Kolonien, die lineare α-1,4-Glucane synthetisieren, sind blau gefärbt.
Die Enzymaktivität des gereinigten Enzyms kann z.B. auf Saccharose enthaltenden Agaroseplatten nachgewiesen werden. Wird das Protein auf eine solche Platte aufgebracht und für etwa 1 Stunde oder länger bei 37°C inkubiert, durchdringt es die Agarose und katalysiert die Synthese linearer Glucane. Letztere können mittels Iodbedampfung nachgewiesen werden. Ferner können die Proteine in nativen Polyacrylamidgelen nachgewiesen werden. Nach einer Elektrophorese mit nativem Polyarylamidgel wird das Gel in Natriumcitratpuffer (50 mM, pH 6,5) äquilibriert und über Nacht in einer Saccharoselösung (5% in Natriumcitratpuffer) inkubiert. Wenn das Gel anschließend mit Lugolscher Lösung gefärbt wird, sind die Bereiche, in denen Proteine mit Amylosucraseaktivität lokalisiert sind, aufgrund der Synthese linearer α-1,4-Glucane blau gefärbt.
Mithilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ist es möglich, Pflanzen herzustellen, die in der Lage sind, reine Amylosestärke, d.h. lineare α-1,4-Glucane, zu produzieren, und Stärke produzierende Pflanzen so zu modifizieren, dass sie höhere Stärkeerträge und gleichzeitig ein erhöhtes Amylose/Amylopektin-Verhältnis erbringen. Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können verwendet werden, um Mikroorganismen und Pilze, insbesondere Hefen, herzustellen, die in der Lage sind, ein Enzym zu produzieren, das die Synthese von linearen α-1,4-Glucanen aus Saccharose katalysiert.
Des Weiteren ist es möglich, mithilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder der von ihnen codierten Proteine reinen Fructosesirup zu niedrigen Kosten herzustellen.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung rekombinante DNA-Moleküle wie Vektoren, insbesondere Plasmide, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teile davon enthalten, z.B. pNB2, das unter der DSM-Nr. 9196 hinterlegt wurde. Die Erfindung betrifft insbesondere rekombinante DNA-Moleküle, in denen eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz mit Sequenzen verbunden ist, die die Expression eines Proteins mit Amylosucraseaktivität, das die Synthese linearer α-1,4-Glucane aus Saccharose katalysiert in Mikroorganismen, Pilzen oder Pflanzen gewährleistet, z.B. Plasmide, die die folgenden DNA-Sequenzen enthalten:

(a) einen geeigneten, in Mikroorganismen aktiven Promotor, der gewährleistet, dass die nachgeschaltete codierende Sequenz in Mikroorganismen transkribiert wird, und
(b) eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit Amylosucraseaktivität codiert, das die Synthese linearer α-1,4-Glucane aus Saccharose katalysiert, und die mit dem Promotor so verbunden ist, dass die Bildung einer in ein Polypeptid translatierbarer RNA ermöglicht wird,

(a) einen geeigneten in Pflanzen aktiven Promotor, der gewährleistet, dass die nachgeschaltete codierende Sequenz zur geeigneten Zeit oder in einem geeigneten Entwicklungsstadium einer transgenen Pflanze oder in bestimmten Geweben einer transgenen Pflanze transkribiert wird, und
(b) eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid mit Amylosucraseaktivität codiert, das die Synthese linearer α-1,4-Glukane aus Saccharose katalysiert, und die mit dem Promotor so verbunden ist, dass die Bildung einer in ein Polypeptid translatierbaren RNA ermöglicht wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mikroorganismen, Pilze und Pflanzen, die die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle enthalten.
Ein noch weiterer Gegenstand der Erfindung sind Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase, die die Synthese linearer α-1,4-Glukane aus Saccharose katalysieren und die von einer der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen codiert werden, insbesondere diejenigen aus Mikroorganismen abgeleiteten DNA-Sequenzen, vorzugsweise aus Gram-negativen Mikroorganismen, insbesondere aus Mikroorganismen der Gattung Neisseria und besonders bevorzugt aus Neisseria polysaccharea. Ein Gegenstand der Erfindung sind des Weiteren Amylosucrasen mit einem Molekulargewicht von 63 ± 20 kDa in Gelelektrophorese, vorzugsweise 63 ± 15 kDa und am meisten bevorzugt 63 ± 10 kDa.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Protein mit der enzymatischen Aktivität von Amylosucrase, die die Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweisen, das von der codierenden Region, die eine Amylosucrase von Neisseria polysaccharea, wie enthalten in der DNA-Insertion des Plasmids pNB2 (DSN 9196), codiert. Die Erfindung betrifft des Weiteren Proteine, die Aminosäuresequenzen aufweisen, die im Wesentlichen identisch zu der Aminosäuresequenz sind oder von der Sequenz in einer oder mehreren Positionen abweichen. Die Abweichungen sind vorzugsweise konservative Aminosäureaustausche und das Protein hat die enzymatische Aktivität einer Amylosucrase. Daher betrifft die Erfindung ferner Amylosucrasen, deren Aminosäuresequenz eine hohe Homologie zu der Aminosäuresequenz des Polypeptids aufweist, die von der codierenden Region, die eine Amylosucrase von Neisseria polysaccharea, wie enthalten in der DNA-Insertion des Plasmids pNB2 (DSN 9196), codiert wird, insbesondere eine Homologie von mindestens 70%, vorzugsweise von mehr als 80%, stärker bevorzugt von mehr als 90% und besonders bevorzugt eine Homologie von mindestens 99%.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und von DNA-Molekülen, insbesondere von Plasmiden, die die DNA-Sequenzen enthalten, zur Transformation von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen sowie zur Expression einer Amylosucrase in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen, und auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Proteine durch Züchten eines Mikroorganismus, der ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül enthält, in einem geeigneten Nährmedium.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist spezifisch ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die in der Lage sind, lineare α-1,4-Glucane zu synthetisieren, dadurch gekennzeichnet, dass in Pflanzenzellen eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz eingeführt wird, die eine Region umfasst, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase codiert, und die mit DNA-Sequenzen verbunden ist, die die Expression in Pflanzenzellen gewährleisten, und vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzenzellen und Pflanzen, die fähig sind, lineare α-1,4-Glucane zu synthetisieren, das die folgenden Verfahrensschritte umfasst:

(a) Herstellen einer Expressionskassette mit den folgenden Teilsequenzen: (i) einem Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA in dem entsprechenden Zielgewebe oder in den entsprechenden Zielzellen gewährleistet; (ii) zumindest einer erfindungsgemäße DNA-Sequenz, welche ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase codiert und welche mit dem Promotor in Sense-Ausrichtung fusioniert ist; (iii) einem Signal, das in Pflanzen zur Transkriptionstermination und Polyadenylierung eines RNA-Moleküls funktionell ist;
(b) Transferieren der Expressionskassette in Pflanzenzellen; und
(c) Regenerieren intakter vollständiger Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

Nützliche Promotoren sind die Promotoren, die eine konstitutive Expression des Gens in allen Geweben der Pflanzen gewährleisten, wie der 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV), wie auch Promotoren, die die Expression nur in bestimmten Organen oder zu bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung der Pflanze gewährleisten. Bekannt sind Promotoren, die eine spezifische Expression in den Knollen von Kartoffelpflanzen gewährleisten, wie der B33-Promotor (Liu et al. 1990, Mol. Gen. Genet. 223:401–406), oder Promotoren, die eine spezifische Expression in den Wurzeln der Zuckerrübe erlauben. Darüber hinaus werden DNA-Sequenzen beschrieben, die eine lichtabhängige und gewebespezifische Expression von nachgeschalteten DNA-Sequenzen in Blättern erlauben (Orozco and Ogren, 1993, Plant Mol. Biol. 23:1129–1138).
Die in Verfahrensschritt (a) (ii) beschriebene DNA-Sequenz kann grundsätzlich eine beliebige erfindungsgemäße DNA-Sequenz sein, die eine codierende Region umfasst, die ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase codiert. Nützliche DNA-Sequenzen sind insbesondere aus Mikroorganismen abgeleitete DNA-Sequenzen, bevorzugt aus Gram-negativen Mikroorganismen, insbesondere der Gattung Neisseria und insbesondere aus Neisseria polysaccharea.
Erfindungsgemäß ist die DNA-Sequenz, die eine Amylosucrase codiert, in Sense-Ausrichtung an den Promotor gebunden (3'-Ende des Promotors an das 5'-Ende der codierenden Sequenz). Diese Sequenz kann vor oder nach der Bindung an die Transkriptionskontrollelemente (Promotor und Terminationssignal) modifiziert werden, um ggf. die Eigenschaften des Polypeptids oder seine Lokalisierung, wie unten ausführlicher beschrieben, zu variieren.
Um die Enzyme im Cytosol der Pflanzenzellen zu exprimieren, muss die Signalsequenz, die die Sekretion bewirkt, entfernt werden. Wenn das zu exprimierende Enzym auf bestimmte subzelluläre Kompartimente wie Chloroplasten, Amyloplasten, Mitochondrien oder die Vacuole gerichtet sein soll, muss die Sekretion auslösende Signalsequenz durch eine Signalsequenz oder eine Sequenz ersetzt werden, die ein Transitpeptid codiert, das den Transport des exprimierten Proteins zu dem entsprechenden Kompartiment gewährleistet. Solche Sequenzen sind bekannt. Für den Transport in die Plastiden sind z.B. die Transitpeptide der Vorläuferproteine der kleinen Untereinheit der Ribulose-Biphoshatcarboxylase (RUBISCO) von Kartoffeln (Wolter et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:846–850) oder das Acylträgerprotein (ACP) nützlich. Für den Transport in die Vacuole kann z.B. die Signalsequenz von Patatin verwendet werden (Sonnewald et al., 1991, Plant J. 1:95–106). Die verwendeten Sequenzen müssen jeweils in demselben Leserahmen wie die das Enzym codierende DNA-Sequenz fusioniert sein.
Der Transfer von der in Verfahrensschritt (a) konstruierten Expressionskassette in Pflanzenzellen wird vorzugsweise unter Verwendung von Plasmiden, z.B. binären Plasmiden, durchgeführt.
Bevorzugt wird die Verwendung von Techniken, die gewährleisten, dass die Expressionskassette stabil in das Genom der transformierten Pflanzenzelle integriert wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann prinzipiell auf jede beliebige Pflanzenart angewendet werden. Sowohl monokotyle als auch dikotyle Pflanzen sind von Interesse. Transformationstechniken wurden bereits für verschiedene monokotyle und dikotyle Pflanzenarten beschrieben.
Mithilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ist es möglich, Pflanzen so zu verändern, dass sie Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase exprimieren, und so die Synthese linearer α-1,4-Glukane in Pflanzen erlauben. Da lineare α-1,4-Glucane hinsichtlich ihrer chemischen Struktur identisch zu der in Pflanzen synthetisierten Amylose ist, ist es möglich, Pflanzen zu produzieren, die reine Amylose synthetisieren, und Stärke produzierende Pflanzen so zu verändern, dass sie eine Stärke synthetisieren, die einen erhöhten Amyloseanteil aufweist.
In den meisten Pflanzen werden die im Verlauf der Photosynthese gebildeten Photoassimilate innerhalb einer Pflanze in Form von Zuckern, und zwar vorwiegend in Form der Saccharose, zu den jeweiligen Zielorganen transportiert. Da das Substrat für die Polymerisationsreaktion der Amylosucrase Saccharose ist, können daher mithilfe des oben beschriebenen Verfahrens im Prinzip alle Pflanzen, sowohl dikotyle als auch monokotyle, im Hinblick auf eine Amylosucrase-Expression verändert werden. Bevorzugt sind Nutzpflanzen wie Mais, Reis, Weizen, Gerste, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Tabak, Kartoffel oder Maniok, aber auch Obst- und Gemüsearten wie Apfel, Pflaume, Karotte oder Tomate.
Die Expression einer Amylosucraseaktivität in Pflanzen kann unter anderem dazu verwendet werden, die Viskosität von aus Pflanzen durch Synthese linearer α-1,4-Glucane erhaltenen Extrakten zu verändern. Hier ist beispielsweise die Tomate von Interesse. Durch die Expression einer Amylosucrase in der Tomatenfrucht kommt es zur Synthese linearer α-1,4-Glucane und folglich zu einer Erhöhung der Viskosität der aus diesen Früchten erhaltenen Extrakte.
Die Expression von Amylosucrase ist ferner insbesondere in solchen Organen der Pflanzen von Vorteil, die große Mengen an Saccharose speichern. Solche Organe sind z.B. die Wurzel der Zuckerrübe oder der Stamm des Zuckerrohrs. Da diese Pflanzen normalerweise keinen nennenswerten Mengen an Stärke synthetisieren, ließen sich aus diesen Pflanzen die durch die Amylosucrase synthetisierten linearen α-1,4-Glucane in reiner Form isolieren.
Der Ort der Biosynthese der Saccharose in pflanzlichen Zellen ist das Cytosol. Der Ort der Speicherung ist hingegen die Vacuole. Beim Transport in das Speichergewebe der Zuckerrübe bzw. der Kartoffel oder beim Transport in das Endosperm von Samen muss die Saccharose den Apoplasten durchqueren. Für die Expression der Amylosucrase zur Synthese linearer Glucane kommen daher alle drei Kompartimente, d.h. Cytosol, Vacuole und Apoplast, in Betracht.
Bei Stärke produzierenden Pflanzen wie der Kartoffel oder Mais, bei denen die Stärkesynthese und Stärkespeicherung normalerweise in den Amyloplasten erfolgt, würde eine Expression der Amylosucrase im Apoplasten, im Cytosol oder in der Vacuole zu einer zusätzlichen Synthese von Glucanen in diesen Kompartimenten führen, was eine beträchtliche Steigerung des Ertrags bedeutet.
Da es bei der Kartoffel möglich ist, bei der Stärkegewinnung die in den Amyloplasten synthetisierte Stärke von den im Apoplasten, im Cytosol oder in der Vacuole mithilfe der Amylosucrase synthetisierten linearen α-1,4-Glucane zu trennen, ließe sich ein und dieselbe Pflanze zur Gewinnung von Stärke und von linearen α-1,4-Glucanen verwenden.
Weiterhin sind transgene Kartoffelpflanzen sowie Maispflanzen bekannt, bei denen es infolge der Inhibierung der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase durch ein Antisense-Konstrukt zur völligen Inhibierung der Stärkesynthese in den Knollen bzw. in den Körnern kommt. Stattdessen tritt z.B. bei den Kartoffeln eine Akkumulation von löslichen Zuckern, insbesondere Saccharose und Glucose, in den Knollen auf (Müller-Röber et al., 1992, EMBO J. 11:1229–1238; EP-A-0 455 316 ). Durch die Expression einer Amylosucrase im Cytosol, in der Vacuole oder dem Apoplasten dieser Pflanzen, also in Kompartimenten, in denen keine Verzweigungsenzyme vorhanden sind, kann somit die Synthese hochgradig amylosehaltiger Stärke, d.h. Stärke, die überwiegend aus linearen α-1,4-Glucanen besteht, erreicht werden.
Der Reaktionsmechanismus, den die Amylosucrase katalysiert, zeichnet sich dadurch aus, dass ein Glucoserest direkt von Saccharose auf ein lineares Glucan übertragen wird. Dagegen wird bei der Biosynthese von linearen Glucanen aus Saccharose in Pflanzen die Saccharose erst in Glucose und Fructose gespalten, die dann jeweils in die aktivierte Zwischenstufe ADP-Glucose umgewandelt werden. Von der ADP-Glucose wird der Glucoserest durch das Enzym Stärkesynthase auf ein bereits vorhandenes Glucan übertragen, wobei ADP freigesetzt wird. Die Umwandlung der Saccharose in zwei Moleküle ADP-Glucose erfordert mehrere Energie verbrauchende Reaktionen.
Daher ist die Energiebilanz der durch die Amylosucrase katalysierten Reaktion im Vergleich zu der Energiebilanz der Synthese von Amylose aus Saccharose in pflanzlichen Zellen wesentlich günstiger, was zu einer erhöhten Ausbeute an synthetisierten Glucanen in Pflanzen, die eine Amylosucraseaktivität exprimieren, führt.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird gewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im Allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen, Sequenzierungsreaktionen und weitere bekannte Verfahren der Biochemie und Molekularbiologie eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in das gleiche oder andere Plasmide cloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Je nach Einführungsmethode der gewünschten Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z.B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Randsequenz, häufig jedoch die rechte und linke Randsequenz der Ti- und Ri-Plasmid-T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobacteria verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen binären Vektor. Aufgrund der Sequenzen, die zu Sequenzen in der T-DNA homolog sind, können die intermediären Vektoren durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses Plasmid enthält die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Randregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., 1978, Mol. Gen. Genet. 163:181–187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120516 ; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V.; Alblasserdam, 1985, Kapitel V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1–46 und An et al., 1985, EMBO J. 4:277–287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzenexplantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stängelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können auf die Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden an sich keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z.B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transfomierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markers notwendig.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Glufosinat u.a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen erlauben, denen die eingeführte DNA fehlt. Die transformierten Zellen wachsen in der üblichen Weise innerhalb der Zelle (vgl. z.B. McCormick et al., 1986, Plant Cell Reports 5:81–84). Diese Pflanzen können normal angezogen werden und können mit Pflanzen, die das gleiche transformierte genetische Material oder anderes genetisches Material aufweisen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil erhalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, das der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.
Ein weiteres Ziel der Erfindung sind die modifizierten Pflanzenzellen und Pflanzen, die aus dem oben genannten erfindungsgemäßen Verfahren resultieren, insbesondere Pflanzenzellen und Pflanzen, die eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz in Verbindung mit DNA-Sequenzen enthält, die die Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz in Pflanzenzellen erlaubt. Diese Pflanzenzellen sind charakterisiert durch die Expression eines Proteins mit einer enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase, wodurch es zur Synthese von linearen α-1,4-Glucanen in den Zellen oder den Pflanzen kommt. Die transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen sind weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass sie ein rekombinantes DNA-Molekül enthalten, das in ihr Genom, das eine Expressionskassette umfasst, stabil integriert ist, wobei die Expressionskassette eine DNA-Sequenz enthält, die eine Amylosucrase codiert.
Die mit Hilfe der Amylosucrase in den transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen gebildeten linearen α-1,4-Glucane können aus transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen in der gleichen Weise isoliert werden wie normalerweise gebildete Stärke.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder Teilen davon für die Expression eines Polypeptids mit Amylosesucrase-Aktivität, bevorzugt in Microorganismen, die selber keine Amylosesucrase-Aktivität haben.
In dieser Verwendung versteht man unter Microorganismen Bakterien als auch Protisten wie z. B. von Schlegel „Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag, 1985, Seiten 1–2, definiert.
Heutzutage werden in der biotechnologischen Forschung weitgehend Mikroorganismen verwendet, um die verschiedenartigsten Substanzen zu synthetisieren und zu verarbeiten. Dies wurde durch die Bereitstellung einer Vielzahl verschiedener Systeme für eine effiziente Expression von prokaryontischen und eukaryontischen Genen in Mikroorganismen möglich (für einen Überblick siehe z. B. Methods in Enzymology 153:385–516). Häufig verwendet werden z. B. die Stämme der Bakterienspezies Escherichia coli und Bacillus subtilis. Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ist es nun möglich, ein Protein, das Amylosucraseaktivität hat, in Mikroorganismen zu exprimieren, für die geeignete Expressionssysteme zur Verfügung stehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft besonders ein Verfahren für die Herstellung von Mikroorganismen, die in der Lage sind, entweder intrazellulär oder extrazellulär lineare α-1,4-Glucane zu synthetisieren, in die eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz eingeführt und die in dem Mikroorganismus exprimiert wird. Solch ein Verfahren kann exemplarisch die folgenden Schritte umfassen:

(a) Herstellung einer Expressionskassette mit folgenden Teilsequenzen: (i) einem Promotor, der in den ausgewählten Mikroorganismen aktiv ist und die Transkription der nachgeschalteten DNA-Sequenz gewährleistet; (ii) einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz, die eine Amylosesucrase codiert und in Sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist, (iii) einem Transkription-Terminationssignal, das in Mikroorganismen funktionell ist;
(b) Transformation eines geeigneten Mikroorganismus mit der in Schritt (a) konstruierten Expressionskassette.

Expressionsvektoren sind in großem Umfang in der Literatur beschrieben. Sie enthalten neben einem Selektionsmarker-Gen und einem die Replikation in dem gewählten Wirt sicherstellenden Replikationsursprung in der Regel einen bakteriellen oder viralen Promotor sowie ein Terminationssignal für die Transkription. Zwischen Promotor und Terminationssignal befindet sich mindestens eine Restriktionsschnittstelle oder ein Polylinker, die/der die Insertion einer codierenden DNA-Sequenz ermöglicht. Als Promotorsequenz kann, sofern sie in dem gewählten Organismus aktiv ist, die natürlicherweise die Transkription des entsprechenden Gens steuernde DNA-Sequenz verwendet werden. Diese Sequenz kann gegen andere Promotor-Sequenzen ausgetauscht werden. Es können sowohl Promotoren verwendet werden, die eine konstitutive Expression des Gens bewirken, als auch induzierbare Promotoren, die eine gezielte Regulation der Expression des nachgeschalteten Gens erlauben. Bakterielle und virale Promotorsequenzen mit diesen Eigenschaften sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Promotoren, die eine besonders starke Expression des nachgeschalteten Gens erlauben, sind z.B. der T7-Promotor (Studier et al., 1990, in Methods in Enzymology 185:60–89), lacuv5, trp-, trp-lacUV5- (DeBoer et al, in Rodriguez, R.L. and Chamberlin, M.J., (Eds.), Promotors, Structure and Function; Praeger, New York, 1982, S.462–481; DeBoer et al, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21–25), Ip₁-, rac- (Boros et al., 1986, Gen 42:97–100) oder ompF-Promotor.
Bei der im Verfahrensschritt a) aufgeführten DNA-Sequenz kann es sich um jede beliebige DNA-Sequenz handeln, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase codiert. Vorzugsweise werden DNA-Sequenzen aus Mikroorganismen, insbesondere Gram-negativen Bakterien, bevorzugt der Gattung Neisseria und insbesondere aus Neisseria polysaccharea verwendet.
Die verwendete Sequenz kann entweder vor oder nach der Integration in den Expressionsvektor modifiziert werden, um gegebenenfalls die Eigenschaften des Polypeptids oder seine Lokalisation zu variieren, wie oben genauer beschrieben. Anstatt der eine Amylosesucrase für Neisseria polysaccharea, wie in Plasmid pNB2 (DSN 9196) enthalten, codierenden Sequenz können DNA-Sequenzen verwendet werden, die sich von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion ableiten lassen, sofern die enzymatische Aktivität des codierten Proteins dadurch nicht beeinträchtigt wird.
Die Transformation der Mikroorganismen in Schritt b) kann in der Regel nach Standardmethoden durchgeführt werden, wie beschrieben in Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 1982, New York: Cold Spring Harbour Laboratory Press).
Die Kultivierung des transformierten Mikroorganismus erfolgt in Medien, die den Bedürfnissen des jeweils verwendeten Wirts entsprechen müssen, insbesondere unter spezifischer Berücksichtigung von pH-Wert, Temperatur, Belüftung etc.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls die aus dem beschriebenen Verfahren resultierenden Mikroorganismen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine DNA-Sequenz, die für eine Amylosucrase codiert, enthalten, wobei diese Bestandteil eines rekombinanten DNA-Moleküls ist. Dieses rekombinante DNA-Molekül kann je nach der verwendeten Transformationsmethode entweder außerhalb des Genoms in den Zellen vorliegen oder stabil in das Genom der Zellen des verwendeten Mikroorganismus integriert sein.
Die von Neisseria polysaccharea exprimierte Amylosucrase ist ein extrazelluläres Enzym, das außerhalb der Zellen lineare α-1,4-Glucane ausgehend von Saccharose synthetisiert. Dazu werden weder aktivierte Glucosederivate noch Kofaktoren benötigt, wie bei den meisten Synthesewegen für Polysaccharide, die innerhalb der Zellen ablaufen. Die Energie, die für die Bildung der α-1,4-glucosidischen Bindung zwischen den kondensierten Glucoseresten benötigt wird, wird direkt aus der Hydrolyse der Bindung zwischen der Glucose- und der Fructoseeinheit in dem Saccharosemolekül gewonnen.
Es besteht daher die Möglichkeit, Amylosucrase sekretierende Mikroorganismen, die mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahrensschritte hergestellt wurden, in saccharosehaltigem Medium zu kultivieren, wobei die sekretierte Amylosucrase in dem Medium zu einer Synthese linearer α-1,4-Glukane aus Saccharose führt. Diese können aus dem Kulturmedium isoliert werden.
Ferner besteht die Möglichkeit, α-1,4-Glucane in vitro mit Hilfe einer zellfreien Enzympräparation zu synthetisieren.
In diesem Fall werden Amylosucrase sekretierende Mikroorganismen in einem saccharosefreiem Medium, das die Expression der Amylosucrase erlaubt, bis zum Erreichen der stationären Wachstumsphase kultiviert. Nach Abzentrifugieren der Zellen aus dem Wachstumsmedium kann das sekretierte Enzym aus dem Überstand gewonnen werden. Das Enzym kann dann saccharosehaltigen Lösungen zur Synthese linearer α-1,4-Glucane zugesetzt werden. Im Vergleich zu der Synthese linearer α-1,4-Glucane direkt in einem saccharosehaltigen Wachstumsmedium bietet dieses Verfahren den Vorteil, dass sich die Reaktionsbedingungen besser kontrollieren lassen und die Reaktionsprodukte wesentlich reiner sind und sich einfacher weiter aufreinigen lassen.
Die Reinigung des Enzyms aus dem Kulturmedium kann nach herkömmlichen Reinigungsmethoden wie Fällung, Zonenaustausch-Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie, Gelfiltration, HPLC-Umkehrphasenchromatographie etc. erfolgen. Weiterhin ist es aber auch möglich, durch Modifikation der in den Expressionsvektor inserierten DNA-Sequenz ein Polypeptid zu exprimieren, das sich aufgrund bestimmter Eigenschaften leichter aus dem Kulturmedium isolieren läßt. So besteht die Möglichkeit, das Enzym als Fusionsprotein mit einer weiteren Polypeptidsequenz zu exprimieren, deren spezifische Bindungseigenschaften die Isolierung des Fusionsproteins über Affinitätschromatographie ermöglichen.
Bekannte Techniken sind z.B. die Expression als Fusionprotein mit Glutathion-S-Transferase und die anschließende Reinigung über Affinitätschromatographie über Glutathion-Säulen. Dabei wird die Affinität der Gluthation-S-Transferase für Glutathion ausgenutzt (Smith and Johnson, 1988, Gene 67:31–40). Eine weiterhin bekannte Technik ist die Expression als Fusionprotein mit dem Maltose Binding Protein (MBP) und anschließende Reinigung über eine Amylosesäule (Guan et al., 1988, Gene 67:21–30; Maina et al., 1988, Gene 74:365–373).
Neben der Möglichkeit, das gereinigte Enzym einer saccharosehaltigen Lösung zur Synthese linearer α-1,4-Glucane direkt zuzusetzen, besteht auch die Alternative, das Enzym an einem Trägermaterial zu immobilisieren. Eine derartige Immobilisierung bietet den Vorteil, dass das Enzym als Katalysator der Syntheseraktion auf einfache Weise wiedergewonnen und mehrfach verwendet werden kann. Da die Aufreinigung von Enzymen in der Regel zeit- und kostenintensiv ist, ermöglichen eine Immobilisierung und Wiederverwendung des Enzyms eine erhebliche Kosteneinsparung. Ein weiterer Vorteil ist der hohe Reinheitsgrad der Reaktionsprodukte, der unter anderem darauf beruht, dass sich bei der Verwendung immobilisierter Enzyme die Reaktionsbedingungen besser kontrollieren lassen. Die als Reaktionsprodukte auftretenden unlöslichen linearen Glucane lassen sich dann auf einfache Weise weiter aufreinigen.
Für die Immobilisierung von Proteinen steht eine Vielzahl von Trägermaterialien zur Verfügung, wobei die Kopplung an das Trägermaterial über kovalente oder nicht-kovalente Bindung erfolgen kann (für eine Übersicht siehe: Methods in Enzymology Bd. 135, 136 und 137). Weite Verbreitung als Trägermaterialien haben z.B. Agarose, Cellulose, Polyacrylamid, Silica oder Nylon.
Ebenso wie das gereinigte Enzym lassen sich auch Mikroorganismen, die das gewünschtes Polypeptid exprimieren oder ein bestimmtes Stoffwechselprodukt ausscheiden, immobilisieren. Die Immobilisierung erfolgt hierbei in der Regel durch Einschluss der Zellen in ein geeignetes Material wie z.B. Alginat, Polyacrylamid, Gelatine, Celulose oder Chitosan. Möglich ist aber auch die Adsorption oder die kovalente Bindung der Zellen an ein Trägermaterial (Brodelius and Mosbach, in Methods in Enzymology, Bd. 135: 173–175). Ein Vorteil der Immobilisierung von Zellen ist, dass dadurch wesentlich höhere Zelldichten erreicht werden können als bei einer Kultivierung in Flüssigkultur. Daraus resultiert eine höhere Produktivität. Weiterhin verringern sich die Kosten für Agitation und Belüftung der Kultur sowie für Maßnahmen zur Aufrechterhaltung der Sterilität. Ein wichtiger Gesichtspunkt ist, dass bei der Immobilisierung eine kontinuierliche Produktion möglich ist, so dass lange unproduktive Phasen, die regelmäßig bei Fermentationsprozessen auftreten, vermieden oder zumindest stark reduziert werden können.
Ebenso wie in Mikroorganismen lassen sich die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch für die Expression einer Amylosucraseaktivität in Pilzen, insbesondere Hefen, z.B. Saccharomyces cerevisiae, verwenden. Vektoren für die Expression heterologer Gene in Hefen sind beschrieben (z.B. Bitter et al., 1987, Methods in Enzymology 153:516–544). Diese Vektoren enthalten neben einem Selektionsmarker-Gen und einem Replikationsursprung für die Vermehrung in Bakterien mindestens ein weiteres Selektionsmarker-Gen, das die Identifizierung transformierter Hefezellen erlaubt, eine die Replikation in Hefen gewährleistende DNA-Sequenz und einen Polylinker für die Insertion der gewünschten Expressionskassette. Die Expressionskassette wird konstruiert aus Promotor, zu exprimierender DNA-Sequenz und einer DNA-Sequenz, die die Transkriptionstermination und die Polyadenylierung des Transkriptes gewährleistet. Promotoren und Transkriptionsterminationssignale aus Saccharomyces sind ebenfalls beschrieben und verfügbar. Ein Expressionsvektor kann in Hefezellen nach Standardmethoden durch Transformation eingeführt werden (Methods in Yeast Genetics, A Laborstory Course Manual, Cold Spring Harbour Laborstory Press, 1990). Zellen, die den Vektor enthalten, werden auf geeignetem Selektionsmedien selektiert und propagiert. In Hefen besteht darüber hinaus die Möglichkeit, die Expressionskassette unter Verwendung eines geeigneten Vektors über homologe Rekombination in das Genom einer Zelle zu integrieren. Das führt zu einer stabilen Vererbung des Merkmals.
Amylosucrase exprimierende Hefe-Stämme lassen sich analog zu Mikroorganismen für die Gewinnung einer sekretierten Amylosucrase verwenden. Kultivierungsmethoden für Hefen sind ausreichend beschrieben (Methods in Yeast Genetics, A Laborstory Course Manual, Cold Spring Harbour Laborstory Press, 1990). Auch die Immobilisierung von Hefezellen ist möglich und wird bereits bei der industriellen Ethanolherstellung angewendet (Nagashima et al., in Methods in Enzymology, Bd. 136:394–405; Nojima and Yamada, in Methods in Enzymology Bd. 136: 380–394).
Die Verwendung von Amylosucrase-sekretierenden Hefen für die Synthese linearer α-1,4-Glucane in saccharosehaltigem Medium ist dagegen nicht ohne weiteres möglich, da Hefen eine Invertase sezernieren, die extrazelluläre Saccharose spaltet. Die Hefen nehmen die entstehenden Hexosen über einen Hexosetransporter auf. In Gozalbo und Hohmann (1990, Current Genetics 17, 77–791) wird jedoch ein Hefestamm beschrieben, der ein defektes suc2-Gen trägt und daher keine Invertase sezernieren kann. Darüber hinaus enthalten diese Hefezellen kein Transportsystem, das Saccharose in die Zellen importieren kann. Wird ein derartiger Stamm mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz dahingehend verändert, dass er eine Amylosucrase in das Kulturmedium sezerniert, so erfolgt in einem saccharosehaltigem Kulturmedium die Synthese linearer α-1,4-Glucane durch die Amylosucrase. Die dabei als Reaktionsprodukt entstehende Fructose kann anschließend von den Hefen aufgenommen werden.
Somit betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Pilzzellen, die in der Lage sind, entweder intrazellulär oder extrazellulär lineare α-1,4-Glucane zu synthetisieren, wobei eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz in Pilzzellen eingeführt und exprimiert wird. Solch ein Verfahren kann exemplarisch die folgenden Schritte umfassen:

(a) Herstellen einer Expressionskassette mit folgenden Teilsequenzen: (i) einem Promotor, der in den Zellen des ausgewählten Pilzes aktiv ist und die Transkription der nachgeschalteten DNA-Sequenz gewährleistet; (ii) einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz, die eine Amylosucrase codiert und in Sense-Orientierung an den Promotor fusioniert ist, (iii) einem Transkription-Terminationssignal, das in den Pilzzellen funktionell ist;
(b) Transformation von Pilzzellen mit der in Schritt (a) konstruierten Expressionskassette.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Möglichkeit, mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auf kostengünstige Art und Weise reinen Fructosesirup herzustellen. Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Fructose sehen entweder die enzymatische Spaltung von Saccharose mit Hilfe der Invertase oder die Spaltung von Stärke in Glucoseeinheiten, meist durch Säurehydrolyse, und anschließende enzymatische Umwandlung der Glucose in Fructose durch Glucoseisomerase vor. Beide Verfahren führen zu Gemischen aus Glucose und Fructose. Die beiden Komponenten müssen durch chromatographische Verfahren voneinander getrennt werden.
Die Herstellung reiner Fructose bzw. von reinem Fructosesirup mit Hilfe eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase erfolgt vorzugsweise im zellfreien System unter Verwendung des gereinigten Enzyms. Dieses kann dabei an einem geeigneten Trägermaterial immobilisiert sein oder frei in Lösung vorliegen. In Anwesenheit von Saccharose kommt es zur Synthese linearer Glucane und zur Freisetzung von Fructose. Die Trennung des Substrates von den Reaktionsprodukten bzw. die Trennung der beiden Reaktionsprodukte kann beispielsweise durch Verwendung von Membranen erreicht werden, die den Durchtritt von Fructose, aber nicht von Saccharose oder von Glucanen erlauben. Wird die Fructose kontinuierlich über eine derartige Membran entfernt, kommt es zu einer mehr oder weniger vollständigen Umwandlung der Saccharose in Fructose und lineare Glucane.
Ferner kann die Amylosucrase vorzugsweise an einem Trägermaterial das zwischen zwei Membranen lokalisiert ist, immobilisiert sein, von denen die eine den Durchtritt von Fructose, aber nicht von Saccharose oder Glucanen erlaubt, und die andere den Durchtritt von Saccharose, aber nicht von Glucanen erlaubt. Die Versorgung mit Substrat erfolgt durch die Membran, die den Durchtritt von Saccharose erlaubt. Die synthetisierten Glucane verbleiben in dem Raum zwischen den beiden Membranen, und die freigesetzte Fructose kann durch die Membran, die lediglich den Durchtritt von Fructose erlaubt, kontinuierlich aus dem Reaktionsgleichgewicht abgezogen werden. Durch eine derartige Anordnung ist eine effiziente Trennung der Reaktionsprodukte und somit u.a. die Herstellung reiner Fructose möglich.
Die Verwendung von Amylosucrasen zur Herstellung von reiner Fructose besitzt daher den Vorteil, dass das vergleichsweise preisgünstige Substrat Saccharose als Ausgangssubstanz verwendet werden kann, und darüber hinaus kann die Fructose auf einfache Art und Weise ohne chromatographische Verfahren aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung von Proteinen mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase zur Herstellung von Fructose.
Eine weitere Möglichkeit der Verwendung von Proteinen mit Amylosucraseaktivität besteht in der Verwendung zur Herstellung von Cyclodextrinen. Cyclodextrine werden hergestellt durch den Abbau von Stärke mittels des Enzyms Cyclodextrin-Transglycosylase (EC 2.4.1.19), das aus dem Bakterium Bacillus macerans gewonnen wird. Durch die Verzweigung von Stärke können unter Verwendung dieses Systems nur etwa 40% der Glucoseeinheiten in Cyclodextrine umgewandelt werden. Durch die Bereitstellung von weitgehend reinen Proteinen mit Amylosucraseaktivität ist es möglich, Cyclodextrine ausgehend von Saccharose durch gleichzeitige Einwirkung von Amylosucrase und Cyclodextrin-Transglycosylase zu synthetisieren, wobei die Amylosucrase die Synthese linearer Glucane aus Saccharose katalysiert und die Cyclodextrin-Transglycosylase die Umwandlung dieser Glucane in Cyclodextrine.
Das erfindungsgemäße Plasmid pNB2 wurde am 06. Mai 1994 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Braunschweig, Deutschland, entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages unter der Hinterlegungsnummer DSM 9196 hinterlegt. Verwendete Abkürzungen

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

Verwendete Medien und Lösungen

YT-Medium 8 g Bacto-Trypton 5 g Hefeextrakt 5 g NaCl ad 1000 ml mit ddH₂O

YT-Platten YT-Medium mit 15 g Bacto-Agar/1.000 ml

Lugolsche Lösung 12 g KI 6g I₂ ad 1,8 l mit ddH₂O
Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt das Plasmid pNB2 (DSM 9196)
Die fein gezogene Linie entspricht der Sequenz des Clonierungsvektors pBluescript SK(–). Die starke Linie repräsentiert die ca. 4.2 kb lange Insertion von genomischer DNA aus Neisseria polysaccharea. Die codierende Region für Amylosucrase ist als Pfeil unterhalb der Insertion dargestellt.
Oberhalb der Insertion ist der sequenzierte Bereich dargestellt. Alle Zahlenangaben beziehen sich auf diesen 2883 bp langen Bereich.
2 zeigt die Expression einer Amylosucraseaktivität in transformierten E.coli-Zellen durch Jodbedampfung.
E.coli-Zellen, die mit dem pBluescript II SK-Plasmid transformiert worden waren (A), und E.coli-Zellen, die mit dem Plasmid pNB2 transformiert worden waren (B), wurden auf YT-Platten (1.5 % Agar; 100 μg/ml Ampicillin; 5% Saccharose; 0.2 mM IPTG) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit Jod bedampft. Kolonien der Zellen, die mit dem Plasmid pNB2 transformiert waren, wiesen einen deutlichen blauen Hof auf.
Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
Isolierung einer genomischen DNA-Sequenz, die für eine Amylosucraseaktivität codiert, aus Neisseria polysaccharea
Für die Isolierung einer DNA-Sequenz, die für eine Amylosucraseaktivität codiert, aus Neisseria polysaccharea wurde zunächst eine genomische DNA-Bibliothek angelegt. Hierzu wurden Neisseria polysaccharea-Zellen auf "Columbia blond agar" (Difco) für 2 Tage bei 37°C angezogen. Die entstandenen Kolonien wurden von den Platten geerntet. Genomische DNA wurde nach der Methode von Ausubel et al. (in: Current Protocols in Molecular Biology (1987); J. Wiley & Sons, NY) isoliert und aufgearbeitet. Die so gewonnene DNA wurde mit der Restriktionsendonuklease Sau3A partiell verdaut. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden in den mit BamHI geschnittenen Vektor pBluescriptSK(–) ligiert. Die Ligierungsprodukte wurden in E. coli XL1-Blue-Zellen transformiert. Die Zellen wurden zur Selektion auf YT-Platten mit Ampicillin als Selektionsmarker ausplattiert. Das Selektionsmedium enthielt zusätzlich 5% Saccharose und 1 mM IPTG. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die gewachsenen Bakterienkolonien einer Jodfärbung unterzogen. Dies erfolgte, indem kristallines Jod in den Deckel einer Petrischale gegeben wurde und die Kulturschalen mit den Bakterienkolonien jeweils 10 min kopfüber auf die Petrischale gelegt wurden. Durch das bei Raumtemperatur verdampfende Jod wurden einige Bereiche auf den Kulturschalen, die amyloseartige Glukane enthielten blau angefärbt. Aus Bakterienkolonien, die von einem blauen Hof umgeben waren, wurde nach der Methode von Birnboim & Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7:1513–1523) Plasmid-DNA isoliert. Diese wurde retransformiert in E.coli SURF-Zellen. Die transformierten Zellen wurden auf YT-Platten mit Ampicillin als Selektionsmarker ausplattiert. Positive Clone wurden isoliert.
Beispiel 2
Sequenzanalyse der genomischen DNA-Insertion des Plasmids pNB2
Aus einem entsprechend Arbeitsbeispiel 1 erhaltenen E.coli-Clon wurde ein rekombinantes Plasmid isoliert. Restriktionsanalysen ergaben, dass dieses Plasmid ein Ligierungsprodukt aus zwei Vektormolekülen und einem ca. 4.2 kb großen genomischen Fragment war. Das Plasmid wurde mit der Restriktionsendonuklease PstI geschnitten, und das genomische Fragment wurde isoliert (GeneClean, Bio101). Das so erhaltene Fragment wurde in einen mit PstI linearisierten pBluescript II SK-Vektor ligiert. Dadurch erfolgte eine Verdoppelung der PstI- und SmaI-Schnittstellen. Das Ligierungsprodukt wurde in E.coli-Zellen transformiert, und diese wurden zur Selektion auf Ampicillin-Platten ausgestrichen. Positive Clone wurden isoliert. Aus einem dieser Clone wurde das Plasmid pNB2 (1) isoliert und ein Teil der Sequenz seiner genomischen DNA-Insertion durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463–5467) bestimmt. Die gesamte Insertion ist ca. 4.2 kbp lang.
Beispiel 3
Expression einer extrazellulären Amylosucraseaktivität in transformierten E.coli-Zellen
a) Nachweis einer Amylosucraseaktivität bei Wachstum auf YT-Platten
Für die Expression einer extrazellulären Amylosucraseaktivität wurden E. coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. Eine Kolonie des transformierten Stammes wurde auf YT-Platten (1.5% Agar; 100 μg/ml Ampicillin; 5% Saccharose; 0.2 mM IPTG) über Nacht bei 37°C inkubiert. Der Nachweis der Amylosucraseaktivität erfolgte durch Bedampfung mit Jod (2). Amylosucrase-exprimierende Kolonien weisen einen blauen Hof auf. Amylosucraseaktivität ist auch bei Abwesenheit von IPTG wahrscheinlich aufgrund der Aktivität des endogenen Amylosucrase-Promotors zu beobachten.
b) Nachweis einer Amylosucraseaktivität bei Wachstum in YT-Medium
Für die Expression einer extrazellulären Amylosucraseaktivität wurden E. coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. YT-Medium (100 μg/ml Ampicillin; 5% Saccharose) wurde mit einer Kolonie des transformierten Stammes angeimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C unter ständiger Bewegung (Rotationsschüttler; 150–200 VpM) inkubiert. Der Nachweis der Produkte der durch Amylosucrase katalysierten Reaktion erfolgte durch Zugabe von Lugolscher Lösung zum Kulturüberstand, was zur Blaufärbung führte.
c) Nachweis der Amylosucraseaktivität in den Kulturüberständen von transformierten E. coli-Zellen, die in Abwesenheit von Saccharose kultiviert wurden
Für die Expression einer extrazellulären Amylosucraseaktivität wurden E. coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. YT-Medium (100 μg/ml Ampicillin) wurde mit einer Kolonie des transformierten Stammes angeimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C unter ständiger Bewegung (Rotationsschüttler; 150–200 VpM) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert (30 min, 4°C, 5500 VpM, JA10 Beckmann-Rotor). Der Überstand wurde durch einen 0.2 μm-Filter (Schleicher & Schuell) sterilfiltriert.
Der Nachweis einer Amylosucraseaktivität erfolgte

i) durch Inkubation des Überstandes auf einer saccharosehaltigen Agarplatte. Hierzu wurden 40 μl Überstand aus einer Agarplatte ausgestanztes Loch (5% Saccharose in 50 mM Natriumcitrat-Puffer, pH 6.5) gegeben und für mindestens eine Stunde bei 37°C inkubiert. Der Nachweis der Produkte der durch Amylosucrase katalysierten Reaktion erfolgte durch Anfärben mittels Iodbedampfung. Vorhandensein von Reaktionsprodukten ruft eine Blaufärbung hervor.
ii) oder durch gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine des Überstandes in einem nativen Gel und Nachweis der Reaktionsprodukte in dem Gel nach Inkubation mit Saccharose. Hierzu wurden 40–80 μl des Überstandes auf einem 8%igen nativen Polyacrylamidgel (0.375 M Tris, pH 8.8) bei einer Spannung von 100 V gelelektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend zweimal 15 min mit ca. 100 ml 50 mM Natriumcitrat-Puffer (pH 6.5) äquilibriert und über Nacht bei 37°C in Natriumcitrat-Puffer pH 6.5/5% Saccharose inkubiert. Zur Sichtbar-machung der Reaktionsprodukte der durch Amylosucrase katalysierten Reaktion wurde das Gel mit Lugolscher Lösung gespült. Banden mit Amylosucraseaktivität wiesen eine Blaufärbung auf.

Beispiel 4
In-vitro-Produktion von Glucanen mit partiell gereinigter Amylosucrase
Für die Expression einer extrazellulären Amylosucraseaktivität wurden E. coli-Zellen nach Standardmethoden mit dem Vektor pNB2 transformiert. YT-Medium (100 μg/ml Ampicillin) wurde mit einer Kolonie des transformierten Stammes angeimpft. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C unter ständiger Bewegung (Rotationsschüttler; 150–200 VpM) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert (30 min, 4°C, 5500 VpM, JA10 Beckmann-Rotor). Der Überstand wurde durch einen 0.2 μm-Filter (Schleicher & Schuell) sterilfiltriert.
Anschließend wurde der Überstand unter Verwendung einer Amicon-Kammer (YM30-Membran mit einer Ausschlussgröße von 30 kDa, Fa. Amicon) unter Druck (p = 3 bar) 200-fach aufkonzentriert. Der konzentrierte Überstand wurde zu 50 ml Saccharoselösung (5% Saccharose in 50 mM Natrium-Citrat-Puffer, pH 6.5) hinzugegeben. Der vollständige Ansatz wurde bei 37°C inkubiert. Es kommt zur Bildung weißlicher, unlöslicher Polysaccharide.
Beispiel 5
Charakterisierung der durch Amylosucrase synthetisierten Reaktionsprodukte aus Beispiel 4
Die in Beispiel 4 beschriebenen unlöslichen Reaktionsprodukte sind in 1 M NaOH löslich. Die Charakterisierung der Reaktionsprodukte erfolgte durch Messung des Absorptionsmaximums. Hierzu wurden ca. 100 mg der isolierten Reaktionsprodukte (Nassgewicht) in 200 μl 1 M NaOH gelöst und 1:10 mit H₂O verdünnt. Zu 100 μl dieser Verdünnung wurden 900 μl 0,1 M NaOH und 1 ml Lugolsche Lösung gegeben. Es wurde das Absorptionsspektrum zwischen 400 und 700 nm gemessen. Das Maximum liegt bei 605 nm (Absorptionsmaximum von Amylose: ca. 614 nm). Eine HPLC-Analyse des Reaktionsgemisches von Beispiel 4 auf einer CARBOPAC PA1-Säule (DIONEX) zeigte, dass neben den unlöslichen Produkten auch lösliche Produkte entstanden waren. Es handelt sich hierbei um kurzkettige Polysaccharide. Die Kettenlänge lag in diesem Fall zwischen ca. 5 und ca. 50 Glucoseeinheiten. In geringem Maße waren jedoch auch kürzere und längere Moleküle nachweisbar. Mit den zur Verfügung stehenden Analysemethoden war es nicht möglich, Verzweigungen in den Syntheseprodukten nachzuweisen.
Beispiel 6
Expression einer intrazellulären Amylosucraseaktivität in transformierten E. coli-Zellen
Mit Hilfe einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde aus dem Plasmid pNB2 ein Fragment amplifiziert, das die Nucleotide 981 bis 2871 der unter SEQ ID NO:1 dargestellten Sequenz umfasst. Als Primer wurden folgende Oligonucleotide verwendet:
TPN2 5'-CTC ACC ATG GGC ATC TTG GAC ATC-3' (SEQ ID NO:3)
TPC1 5'-CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G-3' (SEQ ID NO:4)
Das resultierende Fragment enthält die codierende Region für Amylosucrase mit Ausnahme der Nucleotide, die für die 16 N-terminalen Aminosäuren codieren. Diese Aminosäuren umfassen die Sequenzen, die für eine Sekretion des Enzyms aus der Zelle notwendig sind. Darüber hinaus enthält dieses PCR-Fragment 88 bp des nicht-translatierten 3'-Bereiches. Durch die verwendeten Primer wurden in beide Enden des Fragmentes NcoI-Schnittstellen eingeführt.
Nach Verdau mit der Restriktionsendonuklease NcoI wurde das resultierende Fragment in den mit NcoI geschnittenen Expressionsvektor pMex7 ligiert. Die Ligierungsprodukte wurden in E.coli-Zellen transformiert und transformierte Clone selektiert. Positive Clone wurden auf YT-Platten (1.5% Agar; 100 μg/ml Ampicillin; 5% Saccharose; 0.2 mM IPTG) über Nacht bei 37°C inkubiert. Nach Jodbedampfung wurde keine Blaufärbung im Bereich um die Bakterienkolonien herum beobachtet, aber die intrazelluläre Produktion von Glycogen konnte nachgewiesen werden (Braunfärbung der transformierten Zellen im Gegensatz zu keiner Färbung in nicht transformierten XL1-Blue-Zellen. Um die Funktionalität des Proteins zu überprüfen, wurden in YT-Medium kultivierte transformierte Zellen mittels Ultraschall aufgeschlossen und der erhaltene Rohextrakt wurde auf saccharosehaltige Agarplatten pipettiert. Nach Jodbedampfung der Platten war eine Blaufärbung zu beobachten. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Sequenz codierend für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase, welche die Synthese linearer α-1,4 Glucane aus Saccharose katalysiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) DNA-Sequenzen codierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids codiert durch die codierende Region, die eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea wie enthalten in der DNA-Insertion des Plasmids pNB2 (DSM 9196) codiert; (b) die DNA-Sequenz mit der Nucleotidsequenz der codierenden Region, die eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea wie enthalten in der DNA-Insertion des Plasmids pNB2 (DSM 9196) codiert; (c) DNA-Sequenzen, die mit einer der Sequenzen gemäß (a) oder (b) hybridisieren; (d) DNA-Sequenzen, welche zumindest zu 40% identisch zu der DNA-Sequenz wie definiert in (b) sind; und (e) DNA-Sequenzen, welche im Vergleich zu den in (a), (b), (c) oder (d) erwähnten Sequenzen aufgrund des genetischen Codes degeneriert sind.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1(d), wobei die Sequenzidentität zumindest 60% ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1(d), wobei die Sequenzidentität zumindest 80% ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1(d), wobei die Sequenzidentität zumindest 95% ist.
DNA-Sequenz nach Anspruch 1(c), wobei die Hybridisierungsbedingungen stringente Hybridisierungsbedingungen sind.
Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend eine DNA-Sequenz nach einem der
Rekombinates DNA-Molekül nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz codierend für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase, welche die Synthese linearer α-1,4 Glucane aus Saccharose katalysiert, verbunden ist mit DNA-Sequenzen, welche die Transkription in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen erlauben.
Plasmid pNB2, hinterlegt als DSM 9196.
Mikroorganismus, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 6 bis 8.
Fungus, umfassend ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 6 bis 8.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Amylosucraseaktivität, welches die Synthese linearer α-1,4 Glucane aus Saccharose katalysiert, umfassend das Züchten eines Mikroorganismus nach Anspruch 9 oder eines Fungus nach Anspruch 10 in einem geeigneten Kulturmedium.
Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase, welches die Synthese linearer α-1,4 Glucane aus Saccharose katalysiert und welches durch eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 codiert ist.
Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die in der Lage sind, lineare α-1,4 Glucane zu synthetisieren, dadurch gekennzeichnet, dass eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die mit DNA-Sequenzen verbunden ist, welche die Expression der DNA-Sequenz gewährleistet, in Pflanzenzellen eingeführt wird und vollständige Pflanzen aus diesen Pflanzenzellen regeneriert werden.
Verfahren nach Anspruch 13, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: (a) Herstellung einer Expressionkassette mit den folgenden Teilsequenzen: (i) ein Promotor, der in Pflanzen aktiv ist und die Bildung einer RNA in dem entsprechenden Zielgewebe oder den entsprechenden Zielzellen gewährleistet; (ii) zumindest eine DNA-Sequenz wie in Anspruch 13 angegeben, welche ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase codiert, welche die Synthese linearer α-1,4 Glucane aus Saccharose synthetisiert, und welche mit dem Promotor in sense-Ausrichtung fusioniert ist; (iii) ein Signal, das in Pflanzen zur Transkriptionstermination und Polyadenylierung eines RNA-Moleküls funktionell ist; (b) Transferieren der Expressionskassette in Pflanzenzellen; und (c) Regenerieren intakter vollständiger Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.
Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, lineare α-1,4 Glucane zu synthetisieren, wobei eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einen Mikroorganismus eingeführt und exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 15, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: (a) Herstellen einer Expressionskassette mit den folgenden Teilsequenzen: (i) ein Promotor, der in dem ausgewählten Mikroorganismus aktiv ist und der die Expression der DNA-Sequenz stromabwärts davon gewährleistet; (ii) eine DNA-Sequenz, die eine Amylosucrase codiert, welche die Synthese linearer α-1,4 Glucane aus Saccharose synthetisiert, und die mit dem Promotor in sense-Ausrichtung fusioniert ist; (iii) ein Transkriptionsterminationssignal, das in Mikroorganismen funktionell ist; und (b) Transformieren eines geeigneten Mikroorganismus mit der Expressionskassette wie hergestellt in Schritt (a).
Verfahren zur Herstellung von Pilzzellen, die in der Lage sind, lineare α-1,4 Glucane zu synthetisieren, wobei eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Pilzzellen eingeführt und exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, umfassend die folgenden Schritte: (a) Herstellen einer Expressionskassette mit den folgenden Teilsequenzen: (i) ein Promotor, der in den Zellen des ausgewählten Pilzes aktiv ist und der die Expression der DNA-Sequenz stromabwärts davon gewährleistet; (ii) eine DNA-Sequenz, die eine Amylosucrase codiert, welche die Synthese linearer α-1,4 Glucane aus Saccharose synthetisiert, und die mit dem Promotor in sense-Ausrichtung fusioniert ist; (iii) ein Transkriptionsterminationssignal, das in den Pilzzellen funktionell ist; und (b) Transformieren von Pilzzellen mit der Expressionskassette wie hergestellt in Schritt (a).
Pflanzenzellen, enthaltend eine DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kombination mit DNA-Sequenzen, welche die Expression der DNA-Sequenz in Pflanzenzellen erlauben.
Pflanze, umfassend Pflanzenzellen nach Anspruch 19.
Pflanze nach Anspruch 20, welche eine Nutzpflanze ist.
Pflanze nach einem der Ansprüche 20 oder 21, welche eine Mais-, Reis-, Weizen-, Gersten-, Zuckerrüben-, Zuckerrohr-, Tabak-, Tomaten- oder Kartoffelpflanze ist.
Verfahren zur Herstellung linearer α-1,4 Glucane, umfassend die Schritte des Züchtens des Mikroorganismus nach Anspruch 9 oder eines Fungus nach Anspruch 10 in einem Kulturmedium, das Saccharose umfasst, und das Gewinnen der hergestellen Glucane aus der Kultur.
Verfahren zur in-vitro-Herstellung linearer α-1,4 Glucane, umfassend die Schritte des Kontaktierens des Proteins nach Anspruch 12 mit einer Saccharose-enthaltenden Lösung und das Gewinnen der hergestellten α-1,4 Glucane aus der Lösung.
Verfahren zur Herstellung von Fructose, umfassend die Schritte des Kontaktierens des Proteins nach Anspruch 12 mit einer Saccharose-enthaltenden Lösung und das Gewinnen der hergestellten Fructose aus der Lösung.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Protein immobilisiert ist.
Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrin, umfassend die Schritte des Kontaktierens einer Saccharose-enthaltenden Lösung mit dem Protein nach Anspruch 12 und einer Cyclodextrintransglycosylase.
Verwendung einer DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines davon abgeleiteten Sondenmoleküls zur Isolierung homologer DNA- oder RNA-Sequenzen.
Verwendung der Proteine nach Anspruch 12 zur Herstellung linearer α-1,4 Glucane.
Verwendung der Proteine nach Anspruch 12 zur Herstellung von Fructose.
Verfahren zur Herstellung linearer α-1,4 Glucane, umfassend die Schritte des Verfahrens nach Anspruch 13 oder 14 und ferner umfassend den Schritt des Isolierens der in den Pflanzen synthetisierten α-1,4 Glucane aus den Pflanzen.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Expressionskassette eine Sequenz umfasst, die ein Transitpeptid codiert, welches den Transport des Amylosucraseproteins in die Vakuole oder in den Apoplasten gewährleistet.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die in (ii) genannte DNA-Sequenz, welche ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase codiert, die die Synthese linearer α-1,4 Glucane aus Saccharose katalysiert, die Signalsequenz nicht umfasst, welche die Sekretion in den Apoplasten zur Folge hat.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei der in (i) definierte Promotor die Expression von Amylosucrase in Pflanzenorganen gewährleistet, die Saccharose speichern.