DE69431835T2

DE69431835T2 - Impfstoffe gegen hiv-1, damit zusammenhängende antikörperzusammensetzungen, und therapeutische und prophylaktische verwendungen davon

Info

Publication number: DE69431835T2
Application number: DE69431835T
Authority: DE
Inventors: Karl W. Hasel; Paul J. Maddon
Original assignee: Progenics Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Progenics Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-03-26
Filing date: 1994-03-25
Publication date: 2003-08-14
Anticipated expiration: 2014-03-26
Also published as: US5869624A; EP0693937A4; US5886163A; CA2158171A1; ATE228852T1; EP0693937B1; EP0693937A1; AU672693B2; DE69431835D1; WO1994022477A1; AU6525194A

Description

Hintergrund der Erfindung

In dieser Patentanmeldung wird mit arabischen Ziffern auf verschiedene Publikationen verwiesen. Die vollständigen Quellenangaben für diese Verweise finden sich am Ende dieser Beschreibung, unmittelbar vor den Patentansprüchen.
Der Lebenszyklus tierischer Viren ist durch eine Reihe von Ereignissen gekennzeichnet, die für eine produktive Infektion der Wirtszelle erforderlich sind. Der erste Schritt im Replikationszyklus ist die Anheftung des Virus an die Zelloberfläche, die mittels der spezifischen Wechselwirkung zwischen dem viralen Anheftungsprotein (VAP) und den Rezeptoren an der Oberfläche der Zielzelle zustandekommt. Die unterschiedlichen Expressionsmuster dieser Rezeptoren sind die Hauptverantwortlichen für das Wirtsspektrum und die tropischen Eigenschaften der Viren. Weiterhin kommt eine wirkungsvolle Immunantwort auf viele Viren durch gegen das VAP gerichtete, neutralisierende Antikörper zustande. Die Wechselwirkung des VAP mit zellulären Rezeptoren und dem Immunsystem spielt deshalb eine entscheidende Rolle bei der Infektion und der Pathogenese von Viruskrankheiten.
Das menschliche Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) befällt in erster Linie T-Helfer- Lymphocyten, Dendritenzellen und Monocyten/Makrophagen - Zellen, die Oberflächen-CD4 exprimieren - und führt zu allmählichem Verlust der Immunfunktion. Dieser Funktionsverlust führt zur Entwicklung des erworbenen menschlichen Immunschwächesyndroms (AIDS) (1). Die Anfangsphase des Replikationszyklus von HIV-1 beinhaltet die Wechselwirkung mit hoher Affinität zwischen dem äußeren Hüllglykoprotein gp120 des HIV-1 und dem CD4 der Zelloberfläche (Kd etwa 4 · 10&supmin;&sup9; M) (2). Es gibt mehrere Beweise dafür, daß diese Wechselwirkung für die Infektiosität des Virus erforderlich ist. Führt man in menschliche CD4&supmin;- Zellen CD4 codierende cDNA ein, genügt dies, um ansonsten resistente Zellen infektionsanfällig gegen HIV-1 werden zu lassen (3). In vivo scheint die Virusinfektion auf CD4 exprimierende Zellen beschränkt zu sein, was darauf hindeutet, daß der zelluläre Tropismus von HIV-1 großteils vom CD4-Expressionsmuster der Zelle bestimmt wird. Im Anschluß an die Bindung des gp120 des HIV-1 an das CD4 der Zelloberfläche verschmelzen die Membranen von Virus und Zielzelle durch einen Mechanismus, der wenig verstanden ist, und schließlich kommt es zur Einführung des Viruskapsids in das Cytoplasma der Zielzelle (4).
Reifes CD4 hat eine relative Molekularmasse (Mr) von 55 kDa und besteht aus einer Nterminalen extrazellulären Domäne von 372 Aminosäuren, die vier immunglobulinartige Tandem-Regionen (V1-V4) enthält, auf die eine transmembrane Domäne von 23 Aminosäuren und ein cytoplasmatisches Segment von 38 Aminosäuren (5, 6) folgt. In Versuchen mit verkürzten sCD4-Proteinen wurde gezeigt, daß die Determinanten für die Bindung mit hoher Affinität an das HIV-1-gp120 ausschließlich innerhalb der N-terminalen immunglobulinartigen Domäne (V1) liegen (7-9). Mutationsanalyse von V1 hat eine diskrete Bindungsstelle (Reste 38-52) bestimmt, die eine der zweiten komplementaritätsbestimmenden Region (CDR2) von Immunglobulingenen strukturell homologe Region umfaßt (9).
Die Herstellung großer Mengen von sCD4 hat die Strukturanalyse der beiden N-terminalen immunglobulinartigen Domänen (VIV2) erlaubt. Die bei einer Auflösung von 2,3 Angström ermittelte Struktur zeigt, daß das Molekül zwei fest assoziierte Domänen hat, von denen jede die mit einem durchgehenden Betastrang verbundene Immunglobulin-Faltung enthält. Die mutmaßlichen Bindungsstellen der monoclonalen Antikörper, der Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Moleküle Klasse II und des HIV-1-gp120 liegen, wie durch Mutationsanalyse bestimmt, auf der Moleküloberfläche (10, 11).
Das Hüllgen von HIV-1, env, codiert einen Hüllglycoproteinvorläufer, gp160, der vor seinem Transport zur Plasmamembran durch Proteasen der Zelle gespaltet wird und damit gp120 und gp41 ergibt. Das membrandurchspannende Glycoprotein gp41 ist mit gp120, einem rein extrazellulären Glycoprotein, nichtkovalent assoziiert. Das reife gp120-Molekül ist stark glycosyliert (etwa 24 N-gebundene Oligosaccharide), enthält etwa 480 Aminosäurereste mit 9 Disulfidbindungen innerhalb der Kette (12) und verbreitet sich von der Virusmembran als dimeres oder multimeres Molekül (13).
Mutationsuntersuchungen des HIV-1-gp120 haben wichtige funktionale Regionen des Moleküls aufgezeigt. Die Regionen des gp120, die mit dem gp41 interagieren, liegen in erster Linie an den N- und C-Enden (14). Das vorherrschende stammspezifische, neutralisierende Epitop auf gp120 liegt in der nachstehend als V3-Schleife bzw. V3-Loop bezeichneten dritten variablen Schleife der Aminosäurenreste 32-34, die sich in der Nähe des Zentrums der gp120-Sequenz befindet (15). Die CD4-Bindungsstelle liegt auf unzusammenhängenden Regionen des gp120, die auch hochgradig konservierte oder invariante Aminosäurereste in der zweiten, dritten und vierten konservierten Domäne (den C2-, C3- und C4-Domänen) des gp120 beinhalten (16). Es wurde postuliert, daß eine von diesen konservierten Resten gebildete kleine Einstülpung im gp120 die CDR2-Schleife von CD4 aufnehmen könnte, eine Region, die aufgrund von Mutationsanalysen als wichtig für die Wechselwirkung mit gp120 definiert wurde (17).
Das HIV-1-gp120 vermittelt nicht nur die Anheftung des Virus an die CD4-Moleküle der Oberfläche, sondern dient auch als Hauptziel für die Antikörper, die nicht zellassoziierte Viren neutralisieren und Virusübertragungen von Zelle zu Zelle hemmen.
Es gibt zwei Hauptkategorien HIV-1-neutralisierender Antikörper: typspezifische und gruppengemeinsame (15). Typspezifische neutralisierende Antikörper erkennen in erster Linie lineare Determinanten in der hochgradig variablen V3-Schleife des gp120. Diese Antikörper wirken, indem sie die Verschmelzung von HIV-1 und der Membran der Zielzelle hemmen, und sie neutralisieren im allgemeinen nur ein bestimmtes HIV-1-Isolat oder diesem nahe verwandte Stämme. Die Sequenzvariation innerhalb der V3-Schleife wie auch außerhalb dieser Region erlaubt es Viren, der Neutralisation durch anti-V3-Schleife-Antikörper zu entkommen. (m Gegensatz dazu erkennen die gruppengemeinsamen neutralisierenden Antikörper in erster Linie unzusammenhängende oder Konformationsepitope des gp120, und haben die Fähigkeit, ein vielfältiges Spektrum von HIV-1-Isolaten zu neutralisieren. Oft erkennen diese breitbandig neutralisierenden Antikörper eine Stelle auf dem gp120, die die hochkonservierte CD4-Bindungsstelle überlappt und somit gp120-CD4-Bindungen hemmt.
Es wurde gezeigt, daß zwischen der V3-Schleife und der C4-Region des gp120, welche sowohl einen Teil der CD4-Bindungsstelle als auch einen Teil der konservierten Neutralisierungsepitope darstellt, eine strukturelle Verwandtschaft besteht. Es wurde beobachtet, daß die Deletion der V3-Schleife zu signifikant gesteigerter Bindung einer Reihe breitbandig neutralisierender hMoAbs (neutralisierende menschliche monoclonale Antikörper) an die CD4- Bindungsstelle führte (18).
Ein Hauptziel bei der Entwicklung von AIDS-Impfstoffen ist es, einen Impfstoff zu entwickeln, der in der Lage ist, eine Person gegen die vielen genetischen Varianten des HIV-1 zu schützen, die den Menschen infizieren. Obwohl die zellvermittelten Immunantworten die Infektion bei HIV-1 infizierten Individuen unter Kontrolle halten könnte, zeigen mehrere Beweise, daß der Schutz gegen Infektionen hauptsächlich durch die gegen gp120 gerichteten neutralisierenden Antikörper erfolgt. Frühe Versuche zeigten, daß die Immunisierung von Schimpansen mit rekombinantem gp120 eine schützende Immunantwort gegen die Nachimmunisierung ("challenge") durch den homologen HIV-1-Stamm auslöste (17). Dieser Schutz ging mit dem Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern von hohem Titer gegen die V3-Schleife von gp120 einher. Zusätzlich führte die passive Immunisierung von Schimpansen mit einem neutralisierenden monoclonalen Antikörper gegen die V3-Schleife auch zum Schutz vor einer Nachimmunisierung durch den homologen HIV-1-Stamm (19). Obwohl mit diesen beiden Versuchen der Schutz gegen eine Nachimmunisierung demonstriert wurde, haben neuere Studien die klinische Relevanz dieser Befunde bezweifelt. Zum Beispiel erkennen diese neutralisierenden Antikörper die V3-Schleifen-Determinanten eines einzelnen Stammes und nicht konservierte oder unzusammenhängende Epitope. Somit fehlt diesen Antikörpern die Fähigkeit, das in einer HIV-1-Population vorkommende breite Spektrum von HIV-1-Stämmen zu neutralisieren. Außerdem gehörte das zur Nachimmunisierung verwendete Virus zu dem im Labor bearbeiteten HIV-1-homologen Stamm LAI (HTLV-IIIB) und nicht zu einem jener primären Isolate, die beträchtliche gp120-Sequenzheterogenität aufweisen. Da diese Versuche gezeigt haben, daß eine Impfung mit gp120-Untereinheiten eine Immunantwort auslöst, die nur gegen den als Antigen verwendeten, homogenen HIV-1- Stamm wirksam ist, ist es unwahrscheinlich, daß die in diesen Versuchen angewandten Impfschemata beim Menschen wirksam sind.
Mit HIV-1 infizierte Individuen entwickeln typischerweise Antikörper, die das Virus in vitro neutralisieren, und die Neutralisierungstiter nehmen mit fortschreitender Krankheit ab (19). Die Analyse der Seren von HIV-1 infizierten Menschen zeigt, daß im frühen Infektionsstadium typspezifische neutralisierende Antikörper auftreten. Im weiteren Verlauf der Infektion entwickelt sich eine eher breitbandig neutralisierende Antikörperantwort. Jedoch ist diese Antikörperantwort von signifikant niedrigerem Titer und/oder niedrigerer Affinität. Fraktionierungsstudien von HIV-1-Antikörper-positiven menschlichen Seren zeigen, daß die typspezifische neutralisierende Aktivität in erster Linie gegen lineare Determinanten in der V3-Schleife von gp120 gerichtet ist (20). Es wurde keine Korrelation bei den Antikörpern zwischen der Fähigkeit, abweichende HIV-1-Isolate zu neutralisieren, und der Reaktivität zur V3-Schleife dieser Isolate gefunden. Im Gegensatz dazu erkennen die breitbandig neutralisierenden Antikörper in HIV-1-Antikörper-positiven menschlichen Seren in erster Linie unzusammenhängende Epitope im gp120, die die CD4-Bindungsstelle überlappen und die gp120- CD4-Bindung blockieren. Mit anderen Worten: die breitbandig neutralisierende Aktivität der neutralisierenden Antikörper ist nicht nur das Ergebnis additiver anti-V3-Schleife-Reaktivitäten gegen diverse HIV-1-Isolate, die während einer Infektion auftreten.
In neuerer Zeit haben mehrere Arbeitsgruppen aus HIV-1-Infizierten abgeleitete menschliche monoclonale Antikörper (hMoAbs) erzeugt, die typspezifische oder gruppengemeinsame neutralisierende Aktivität aufweisen (17). Es zeigte sich, daß die typspezifischen neutralisierenden hMoAbs lineare Determinanten in der V3-Schleife von gp120 erkennen. Im Gegensatz dazu erkennen die gruppengemeinsamen neutralisierenden hMoAbs im allgemeinen unzusammenhängende Epitope, die die CD4-Bindungsstelle überlappen und die gp120-CD4- Bindung blockieren.
Die V3-Schleife ist eine hochgradig immundominante Region des gp120, die teilweise mit der CD4-Bindungsregion in Wechselwirkung tritt. Die Anwesenheit der V3-Schleifen-Region im gp120 kann die humorale Immunantwort von der Produktion von Antikörpern abbringen, die spezifisch an die CD4-Bindungsregion des gp120 binden. Außerdem würden die Vorteile, die eine Entfernung der V3-Schleife brächte, um die CD4-Bindungsdomäne des gp120 freizulegen und dem Immunsystem auszusetzen, durch die Tatsache aufgewogen werden, daß die ausgesetzte CD4-Bindungsstelle immer noch eine hohe Affinität zum CD4 der Zelloberfläche aufwiese. Mit anderen Worten: ein mutiertes gp120-Protein, dem nur die V3-Schleife fehlt, würde schnell an CD4+-Zellen binden und damit an der Erzeugung einer Immunantwort gegen die ausgesetzte CD4-Bindungsstelle gehindert werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ein mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein, das sowohl das Problem der Immundominanz der V3-Schleife als auch das der hohen Affinität zu CD4 überwindet. Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin Impfstoffe, die das mutierte HIV-1- gp120-Hüllglykoprotein enthalten, Antikörper, die spezifisch an die CD4-Bindungsstelle des HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins binden, Arzneimittel, die diese Antikörper enthalten, und Verfahren zur Anwendung dieser Impfstoffe und Arzneimittel, um HIV-1-Infektionen zu behandeln oder ihnen vorzubeugen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C4-Domänen(W→X)-Funktmutation aufweist, wobei X ein anderer Aminosäurerest als Tryptophan ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist X ein Valinrest.
In einer Ausführungsform ist das Nucleinsäuremolekül ein DNA-Molekül. Das DNA-, Molekül kann ein Plasmid sein. In einer Ausführungsform enthält das Plasmid die Sequenz des als PPI4-tPA bezeichneten Plasmids.
In einer Ausführungsform ist die C4-Domäne die C4-Domäne eines HIV-1LAI-gp120- Hüllglykoproteins. Das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein kann ein mutiertes HIV-1LAI-gp120-Hüllglykoprotein sein.
In einer anderen Ausführungsform ist die C4-Domäne die C4-Domäne eines HIV-1JR-FL- gp120-Hülglykoproteins. Das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein kann ein mutiertes HIV-1JR-FL-gp120-Hüllglykoprotein sein.
Die vorliegende Erfindung liefert auch das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein, das von dem rekombinanten Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung codiert wird.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Impfstoff, der eine therapeutisch wirksame Menge des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins der vorliegenden Erfindung und ein Adjuvans enthält.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines HIV-1 infizierten Individuums, das die Immunisierung des HIV-1 infizierten Individuums mit dem Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt und somit die Behandlung des HIV-1 infizierten Individuums bewirkt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Impfstoff, der eine prophylaktisch wirksame Menge des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins gemäß der vorliegenden Erfindung und ein Adjuvans enthält.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines HIV-1 ausgesetzten Individuums mit HIV-1 infiziert zu werden; das Verfahren umfaßt die Immunisierung des HIV-1 ausgesetzten Individuums mit dem Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung, und somit die Verringerung der Wahrscheinlichkeit des HIV-1 ausgesetzten Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines nicht-HIV-1-ausgesetzten Individuums mit HIV-1 infiziert zu werden; das Verfahren umfaßt die Immunisierung des nicht-HIV-1-ausgesetzten Individuums mit dem Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung und somit die Verringerung der Wahrscheinlichkeit des nicht-HIV-1-ausgesetzten Individuums mit HIV-1 infiziert zu werden.
Die vorlegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zu Gewinnung teilweise gereinigter Antikörper, die spezifisch an die CD4-Bindungsdomäne von HIV-1-gp120- Hüllglykoprotein binden; dieses Verfahren umfaßt (a) die Immunisierung eines nicht-HIV-1- ausgesetzten Individuums mit dem Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung, (b) Gewinnung von Serum aus dem immunisierten Individuum, das die Antikörper enthält, und (c) teilweise Reinigung dieser Antikörper, womit man teilweise gereinigte Antikörper erhält, die spezifisch an die CD4-Bindungsdomäne von HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein binden. In der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein menschliches Individuum.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin die teilweise gereinigten Antikörper, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Arzneimittel, das eine therapeutisch wirksame Menge teilweise gereinigter Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines HIV-1 infizierten Individuums, das die Verabreichung einer Dosis des Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung an das Individuum umfaßt, die eine Abnahme der Population von HIV-1 infizierten Zellen in dem HIV-1 infizierten Individuum und somit eine Behandlung des HIV-1 infizierten Individuums bewirkt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines HIV-1 infizierten Individuums, das die Verabreichung einer Dosis des Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung an das Individuum umfaßt, die eine Abnahme der Population von HIV-1 in dem HIV-1 infizierten Individuum und somit eine Behandlung des HIV-1 infizierten Individuums bewirkt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Arzneimittel, das eine prophylaktisch wirksame Menge teilweise gereinigter Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines HIV-1 ausgesetzten Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden; das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer Dosis des Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung an das HIV-1 ausgesetzte Individuum, die eine Abnahme der Population von HIV-1 in dem HIV-1 ausgesetzten Individuum bewirkt, und somit wird die Wahrscheinlichkeit des Individuums verringert, mit HIV-1 infiziert zu werden. In einer Ausführungsform ist das Individuum ein praktischer Arzt. In einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein Neugeborenes.
Schließlich liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit einer nicht-HIV-1-ausgesetzten Person, mit HIV-1 infiziert zu werden als Folge einer Exposition während eines Ereignisses, bei dem ein erhöhtes Expositionsrisiko gegen HIV-1 besteht; das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer Dosis des Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung an das Individuum unmittelbar vor dem Ereignis, die eine Abnahme der Population von HIV-1 bewirkt, der die Person während des Ereignisses ausgesetzt ist, und somit eine Verringerung der Wahrscheinlichkeit des Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden. In einer Ausführungsform ist die Person ein praktischer Arzt.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1: Struktur von gp120

Dargestellt ist ein Kastenbild des HIV-1-gp120, das die Grenzen der fünf konstanten Domänen (C1-C5) und der fünf variablen Domänen (V -V5) zeigt. Die Numerierung der Aminosäurereste oberhalb des Kastens beginnt beim Initiator-Methionin am Beginn der Signalsequenz (S); sie ist einer Consensusequenz aller bekannter HIV-1-gp120-Aminosäuresequenzen angepaßt. Es werden auch die Aminosäuresequenzen der C4-Domänen der HIV-1- Stämme LAI und JR-FL gezeigt. Oberhalb der Sequenzen der C4-Domänen sind zwei Mutationen angegeben, die die Bindung des gp120 zum CD4 der Zelloberfläche verringern, und zwar Tryptophan zu Valin und Aspartat zu Alanin.

Fig. 2: PPI4-tPA-gp120LAI

Expressionsvektor mit an den CMV-MIE-Promoter gebundenem HIV-1LAI-gp120-Gen und mit tPA-Signalsequenz anstatt der HIV-1-gp120-Signalsequenz. Abkürzungen: CMV-MIE = sehr früher Cytomegalievirus-Haupt, E = Enhancer, P = Promoter, EXA = Exon A, INA = Intron A, EXB = Exon B, tPA ss = Signalsequenz des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators, gp120 = Glykoprotein 120, BGH = Rinder-Wachstumshormon, AMP = Ampicillinresistenzgen, DHFR = Dihydrofolatreduktasegen.

Fig. 3: CMV-MIE-Promoter, gebunden an tPA-gp120LAI

Die Nucleotidsequenz der CMV-MIE-Promoter/Enhancerregion wird als an das HIV-1LAI- gp120-Gen, das die tPA-Signalsequenz enthält, gebunden gezeigt. Die Numerierung der Nucleotidsequenz beginnt mit der HincII-Stelle, und die Numerierung der Aminosäuresequenz beginnt beim ersten Methionin der tPA-Signalsequenz. Die tPA-Signalsequenz ist im Leserahmen an das Thr&sub3;&sub1; des gp120 gebunden, die erste Aminosäure im reifen gp120. Die Signalsequenz und verschiedene Hauptrestriktionsstellen, die, wie im Text erörtert, zum Clonieren verwendet werden, sind mit fetten Buchstaben gezeigt. Die Lage von Exon A, Intron A, Exon B und die Stelle des Transkriptionsstartes und die Spaltstelle der Signalsequenz sind angegeben.

Fig. 4: Vorübergehende Expression von gp120

Autoradiographie von ³&sup5;S-markierten Überständen von COS-Zelltransfektanten, immungefällt mit einem CD4-Immunglobulin-Protein A-Sepharose-Komplex und auf einem reduzierenden 10% SDS-PAGE-Gel gelaufen. Folgende Plasmide wurden für die Transfektion verwendet: Spur 1: Scheintransfizierte Zellen; Spur 2: Vektor, der ein chimäres CD4-Immunglobulin- Molekül codiert, als positive Transfektionskontrolle; Spur 3: PPI4-tPA-gp120LAI; Spur 4: PPI4-tPA-gP120JR-FL. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind angegeben.

Fig. 5: Bestimmung der gp120-Konzentration durch ELISA

Tafel A: Durch ELISA bestimmte Konzentrationen von gp120 in Medien von mit PPI4-tPA- gp120LAI stabil transfizierten CHO-Zellinien. Tafel B: Standardkurve, aufgestellt unter Verwendung bekannter gp120-Mengen.

Fig. 6: Expression von gp120 in stabil transfizierten CHO-Zellen

Autoradiographie von ³&sup5;S-markierten Überständen von stabilen CHO-Zellinien, immungefällt mit einem CD4-Immunglobulin-Protein A-Sepharose-Komplex und auf einem reduzierenden 10% SDS-PAGE-Gel gelaufen. Spur 1: Clon 9; Spur 2: Clon 13; Spur 3: Clon 6; Spur 4: Clon 5. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind angegeben.

Fig. 7: tPA-gp120-JR-FL

Es werden clie Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz der an HIV-1JR-FL- gp120 gebundenen tPA-Signalsequenz gezeigt. Die Stellen der Restriktionsendonucleasen NarI und NotI, die zum Clonieren verwendet wurden, sind mit fetten Buchstaben gezeigt. Die vorhergesagte Spaltungsstelle der Signalpeptidase zwischen Arg&sub3;&sub5; und Val3&sub6; ist angegeben.

Fig. 8: tPA-gp120LAI-V3(-)

Es werden die Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz der tPA-Signalsequenz gezeigt, die an HIV-1LAI-gp120 gebunden ist, dessen V3-Schleife deletiert und durch das Pentapeptid TGAGH ersetzt ist. Der Ersatz für die V3-Schleife und die Stellen der Restriktionsendonucleasen NarI und NotI, die zum Clonieren verwendet wurden, sind mit fetten Buchstaben gezeigt. Die vorhergesagte Spaltungsstelle der Signalpeptidase zwischen Arg&sub3;&sub5; und Thr&sub3;&sub6; ist angegeben.

Fig. 9: tPA-gp120JR-FL-V3(-)

Es werden die Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz der tPA-Signalsequenz gezeigt, die an HIV-1JLFL-gp120 gebunden ist, dessen V3-Schleife deletiert und durch das Pentapeptid TGAGH ersetzt ist. Der Ersatz für die V3-Schleife und die Stellen der Restriktionsendonucleasen NarI und NotI, die zum Clonieren verwendet wurden, sind mit fetten Buchstaben gezeigt. Die vorhergesagte Spaltungsstelle der Signalpeptidase zwischen Arg&sub3;&sub5; und Val&sub3;&sub6; ist angegeben.

Fig. 10: tPA-gp120LAI-V3(-)-CD4(-)

Es werden die Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz der tPA-Signalsequenz gezeigt, die an HIV-1LAI-gp120 gebunden ist, dessen V3-Schleife deletiert und durch das Pentapeptid TGAGH ersetzt und dessen Trp&sub4;&sub0;&sub8; zu Val mutiert ist. Die Mutationen und die Stellen dei Restriktionsendonucleasen NarI und NotI, die zum Clonieren verwendet wurden, sind mit fetten Buchstaben gezeigt. Die vorhergesagte Spaltungsstelle der Signalpeptidase zwischen Arg&sub3;&sub5; und Thr&sub3;&sub6; ist angegeben.

Fig. 11: rPA-gp120JR-FL-V3(-)-CD4(-)

Es werden die Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz der tPA-Signalsequenz gezeigt, die an HIV-1JR-FL-gp120 gebunden ist, dessen V3-Schleife deletiert und durch das Pentapeptid TGAGH ersetzt und dessen Trp&sub3;&sub9;&sub6; zu Val mutiert ist. Die Mutationen und die Stellen der Restriktionsendonucleasen NarI und NotI, die zum Clonieren verwendet wurden, sind mit fetten Buchstaben gezeigt. Die vorhergesagte Spaltungsstelle der Signalpeptidase zwischen Arg&sub3;&sub5; und Val&sub3;&sub6; ist angegeben.

Fig. 12: tPA-gp120LAI-CD4(-)

Es werden die Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz der an HIV-1LAI- gp120 gebundenen tPA-Signalsequenz gezeigt. Die Mutation von Trp&sub4;&sub3;&sub7; zu Val, betreffend die CD4-Bindung, die Stellen der Restriktionsendonucleasen NarI und NotI, die zum Clonieren verwendet wurden, und die vorhergesagte Spaltungsstelle der Signalpeptidase zwischen Arg&sub3;&sub5; und Thr&sub3;&sub6; sind mit fetten Buchstaben gezeigt.

Fig. 13: tPA-gp120JR-FL-CD4(-)

Es werden die Nucleotid- und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz der an HIV-1JR-FL- gp120 gebundenen tPA-Signalsequenz gezeigt. Die Mutation von Trp&sub4;&sub2;&sub4; zu Val, betreffend die CD4-Bindung, die Stellen der Restriktionsendonucleasen NarI und NotI, die zum Clonieren verwendet wurden, und die vorhergesagte Spaltungsstelle der Signalpeptidase zwischen Arg&sub3;&sub5; und Val&sub3;&sub6; sind mit fetten Buchstaben gezeigt.

Fig. 14: Expression von gp120 in stabil transfizierten CHO-Zellen

Autoradiographie von super-³&sup5;S-markierten Überständen von stabilen CHO-Zellinien, immungefällt mit einem MoAb F105-Protein A-Sepharose-Komplex und auf einem reduzierenden 10% SDS-PAGE-Gel gelaufen.
Tafel A: Spur 1: tPA-gp120LAI-CHO-Zellen;
Spur 2: tPA-gp120LAI-V3(-)-CHO-Zellen;
Spur 3: tPA-gp120LAI-V3(-)-CD4(-)-CHO-Zellen.
Tafel B: Spur 1: tPA-gp120JR-FL-CHO-Zellen;
Spur 2: tPA-gp120JR-FL-V3(-)-CHO-Zellen;
Spur 3: tPA-gp120JR-FL-V3(-)-CD4(-)-CHO-Zellen.
Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind angegeben.

Fig. 15: Gereinigte gp120-Proteine

Silbergefärbtes 10% SDS-PAGE-Gel mit einer Probe gereinigter gp120-Proteine.
Tafel A: Spur 1: tPA-gp120LAI-CHO-Zellen;
Spur 2: tPA-gp120LAI-V3(-)-CHO-Zellen,
Spur 3: tPA-gp120LAI-V3(-)-CD4(-)-CHO-Zellen.
Tafel B: Spur 1: tPA-gp120JR-FL-CHO-Zellen;
Spur 2: tPA-gp120JR-FL-V3(-)-CHO-Zellen;
Spur 3: tPA-gp120JR-FL-V3(-)-CD4(-)-CHO-Zellen.

Fig. 16: FACS-Analyse der Bindung von rekombinantem mutiertem gp120 an menschliches Zelloberflächen-CD4.

Tafel 1: DG44-Zellen, ein Subclon von CHO-Zellen, denen die Expression menschlichen CD4-Proteins fehlt, wurden als Kontrolle verwendet. Zunehmende Konzentrationen von HIV-1-gp120LAI zeigten keine Zunahme der spezifischen Fluoreszenz im Vergleich zum Hintergrund. Tafel 2: DG44 #3-Zellen sind eine CHO-Zellinie, die mit dem cDNA-Clon, der das menschliche CD4-Protein codiert, transfiziert ist. Zunehmende Konzentrationen von HIV-1- gp120LAI zeigten eine dramatische Zunahme (oder Verschiebung) der Fluoreszenz. Tafel 3: Ähnlich Tafel 2, doch wurde das HIV-1-gp120LAI-V3(-)-Protein hinzugefügt. Wieder zeigte sich eine starke Verschiebung, die auf Bindung an die DG44 #3-Zellen hinwies. Tafel 4: DG44 #3-2 eilen wurden entweder mit HIV-1-gp120LAI-V3(-)-CD4(-)-Protein oder mit Mo- Ab OKT4A, einem Antikörper mit hoher Affinität zu menschlichem CD4, inkubiert. Nur OKT4A band an die Zellen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die PPI4-tPA-gp120LAI und PPI4-tPA-gp120JR-FL benannten Plasmide wurden gemäß dem und in Erfüllung der Bestimmungen des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikoorganismen zu Patentierungszwecken bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter den ATCC-Hinterlegungsnummern 75431 bzw. 75432 hinterlegt. Die Plasmide PPI4-tPA- gp120LAI uni PPI4-tPA-gp120JR-FL wurden am 12. März 1993 bei der ATCC hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung liefert ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C4- Domänen(W→X)-Punktmutation enthält, wobei X ein anderer Aminosäurerest als Tryptophan ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist X ein Valinrest.
In einer Ausführungsform ist das Nucleinsäuremolekül ein DNA-Molekül. Das DNA- Molekül kann ein Plasmid sein. In einer Ausführungsform enthält das Plasmid die Sequenz des als PPI4-tPA bezeichneten Plasmids.
Die V3-Schleife des HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins ist in Fig. 1 dargestellt. Die V3- Schleife wird sowohl an ihrem N- als auch an ihrem C-Ende von Cysteinresten begrenzt. Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet V3-Loop-Deletion bzw. V3-Schleifen-Deletion eine Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten zwischen den terminalen Cysteinresten, mit der Maßgabe, daß zwischen den zwei terminalen Cysteinresten drei oder mehr Aminosäurereste in einer V3-Schleifen-Deletion verbleiben. Diese drei oder mehr Aminosäurereste können entweder Reste sein, die ursprünglich in der V3-Schleife vorhanden waren, oder exogene Reste. Wie zum Beispiel im nachstehenden Abschnitt Versuchsdetails gezeigt, liegt das Pentapeptid TGAGH zwischen den beiden terminalen Cysteinresten. Variationen in der Größe der V3-Schleifen-Deletion, die in dieser Arbeit gezeigt werden, können toleriert werden, ohne daß die Gesamtstruktur des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins beeinträchtigt wird, wie den Fachleuten bekannt ist.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet "C4-Domäne" die C4-Domäne des HIV-1- gp120-Hüllglykoproteins mit folgender Consensus-Sequenz:
X&sub1; X&sub2; X&sub3; CX&sub4; IX&sub5; X&sub6; X&sub7; X&sub8; X&sub9; X&sub1;&sub0; WX&sub1;&sub1; X&sub1;&sub2; X&sub1;&sub3; X&sub1;&sub4; X&sub1;&sub5; AX&sub1;&sub6; YX&sub1;&sub7; X&sub1;&sub8; PX&sub1;&sub9; X&sub2;&sub0; X&sub2;&sub1; X&sub2;&sub2; X&sub2;&sub3; X&sub2;&sub4; X&sub2;&sub5; X&sub2;&sub6; SX&sub2;&sub7; X&sub2;&sub8; TGX&sub2;&sub9; X&sub3;&sub0; X&sub3;&sub1; X&sub3;&sub2; RX&sub3;&sub3; GX&sub3;&sub4;,
wobei X&sub1; = T, I, V, K oder R; X&sub2; = L, I oder H; X&sub3; = P, Q, L oder T; X&sub4; = R, K oder G; X&sub5; = K oder E; X&sub6; = Q oder E; X&sub7; = F, I oder V; X&sub8; = I, V oder M; X&sub9; = N, R oder K; X&sub1;&sub0; = M, R, L oder T; X&sub1;&sub1; = Q, R oder V; X&sub1;&sub2; = E, K, G, R, V oder A; X&sub1;&sub3; = V, T, A oder G; X&sub1;&sub4; = G oder E; X&sub1;&sub5; = K, R, E oder Q; X&sub1;&sub6; = M, V, I oder L; X&sub1;&sub7; = A, T oder D; X&sub1;&sub8; = P oder L; X&sub1;&sub9; = I oder F; X&sub2;&sub0; = S, R, G, K, N, A, E oder Q; X&sub2;&sub1; = G oder R; X&sub2;&sub2; = Q, L, P, N, K, V, T, E oder I; X&sub2;&sub3; = I, V oder L; X&sub2;&sub4; = R, K, S, N, G, I, T, E oder I; X&sub2;&sub5; = C oder R; X&sub2;&sub6; = S, L, I, T, P, E, V, K, D oder N; X&sub2;&sub7; = N, K oder L; X&sub2;&sub8; = I oder V; X&sub2;&sub9; = L, P oder I; X&sub3;&sub0; = L oder I; X&sub3;&sub1; = L oder I; X&sub3;&sub2; = T, A, I, V oder E; X&sub3;&sub3; D oder E; X&sub3;&sub4; = G oder V.
Die Consensus-Sequenz der C4-Domäne beruht auf vorhandenen Sequenzinformationen von den C4-Domänen verschiedener HIV-1-Stämme und ist somit nicht notwendigerweise eine erschöpfende Consensus-Sequenz. Der fettgedruckt dargestellte konservierte Tryptophanrest nach dem Rest X&sub1;&sub0; ist der einzige konservierte Tryptophanrest in der C4-Domäne. Im Zusammenhang dieser Arbeit wird unter einer C4-Domänen(W→X)-Punktmutation eine Mutation des vorstehend identifizierten, konservierten C4-Domänen-Tryptophanrestes zu einem anderen Aminosäurerest als Tryptophan verstanden. Eine C4-Domänen(W→V)- Punktmutation zum Beispiel ist eine Mutation des konservierten C4-Domänen- Tryptophanrestes zu einem Valinrest.
In einer Ausführungsform ist die C4-Domäne die C4-Domäne des HIV-1LAI-gp120-Hüllglykoproteins. Die Sequenz der C4-Domäne des HIV-1LAI-gp120 ist: TLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGG. Das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein kann ein mutiertes HIV-1LAI-gp120-Hüllglykoprotein sein.
In einer anderen Ausführungsform ist die C4-Domäne die C4-Domäne des HIV-1JR-FL- gp120-Hüllglykoproteins. Die Sequenz der C4-Domäne des HIV-JR-FL-gp120 ist: TLPCRIKQIINMWQEVGKAMYAPPIRGQIRCSSNITGLLLTRDGG. Das mutierte HIV-1-gp120- Hüllglykoprotein kann ein mutiertes HIV-1JRFL-gp120-Hüllglykoprotein sein.
HIV-1LAI ist ein im Labor bearbeiteter Stamm, der auf Phytohämagglutinin (PHA) stimulierte Lymphocyten aus peripherem Blut (PBLs) und auf immortalisierte menschliche T-Zelllinien tropisch ist. Im Gegensatz dazu wurde HIV-1JR-FL aus Hirngewebe isoliert, das im Zug einer Autopsie entnommen wurde, und gemeinsam mit Lectin aktivierten, normalen menschlichen PBLs gezüchtet. HIV-1JR-FL ist auf PHA stimulierte PBLs und auf aus dem Blut abgeleitete Makrophagen tropisch, repliziert sich aber nicht in transformierten T-Zellinien. Mutierte, HIV-1-gp120-Hüllglykoproteine, die von einem klinischen Isolat von HIV-1 wie etwa JR-FL abgeleitet sind, können im Vergleich zu den laborbearbeiteten HIV-1-Stämmen neue oder andere Epitope besitzen, die vorteilhaft für eine erfolgreiche Impfung sind. Obwohl im Rahmen dieser Arbeit nur HIV-1LAI- und HIV-1JR-FL-Stämme zur Erzeugung des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, könnten, wie dem Fachmann wohlbekannt ist, an ihrer Stelle auch andere HIV-1-Stämme verwendet werden.
Die variablen Regionen des gp120, V1 und V2, sind für die CD4-Bindung nicht nötig (21). Deshalb kann das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein gemäß der vorliegenden Erfindung die variablen Regionen V1 und V2 entweder beinhalten oder nicht beinhalten.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C4-Domänen(Asp→X)-Punktmutation aufweist, wobei der Aspartatrest zwischen den Aminosäureresten X&sub1;&sub5; und X&sub1;&sub6; in der C4-Consensussequenz liegt und X ein anderer Aminosäurerest als Aspartat oder Glutamat ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist X ein Alaninrest.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C4-Domänen(Glu→X)-Punktmutation aufweist, wobei der Glutamatrest zwischen den Aminosäureresten X&sub1;&sub5; und X&sub1;&sub6; in der C4-Consensussequenz liegt und X ein anderer Aminosäurerest als Aspartat oder Glutamat ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist X ein Alaninrest.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1LAI-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C3-Domänen(asp375→X)-Punktmutation aufweist, wobei X ein anderer Aminosäurerest als Aspartat oder Glutamat ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist X ein Lysinrest.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-JR-FL-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C3-Domänen(asp369→X)-Punktmutation aufweist, wobei X ein anderer Aminosäurerest als Aspartat oder Glutamat ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist X ein Lysinrest.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1LAI-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C3-Domänen(glu380→X)-Punktmutation aufweist, wobei X ein anderer Aminosäurerest als Glutamat ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist X ein Glutaminrest.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1JR-FL-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C3-Domänen(glu371→X)-Punktmutation aufweist, wobei X ein anderer Aminosäurerest als Glutamat ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist X ein Glutaminrest.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1LAI-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C2-Domänen(thr267→X)-Punktmutation aufweist, wobei X ein anderer Aminosäurerest als Threonin ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist X ein Argininrest.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1JR-FL-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das eine V3-Schleifen-Deletion und eine C2-Domänen(thr267→X)-Punktmutation aufweist, wobei X ein anderer Aminosäurerest als Threonin ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist X ein Argininrest.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein rekombinantes Nucleinsäuremolekül, das ein mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein codiert, das (a) eine V3-Schleifen-Deletion oder (b) eine der C2, C3- oder C4-Domänen, Punktmutationen, die, vorstehend besprochen wurden, aufweist.
Die vorstehend beschriebenen Punktmutationen in den rekombinanten Nucleinsäuremolekülen werden nach ihrer Fähigkeit ausgewählt, die Affinität des von ihnen codierten mutierten gp120-Glykoproteins zu CD4 zu verringern. "Die Affinität verringern" bedeutet im Zusammenhang dieser Arbeit die Affinität wenigstens zweifach zu verringern.
Ein Fachmann dürfte in der Lage sein, rekombinante Nucleinsäuremoleküle herzustellen, die mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein codieren, das eine V3-Schleifen-Deletion und die spezifischen C2-, C3- oder C4-Domänen-Punktmutationen umfaßt, die den in den vorstehenden Beispielen anhand der Stämme HIV-1JR-FL und HIV-1LAI dargestellten Mutationen entsprechen. Weiterhin dürfte ein Fachmann wissen, wie diese rekombinanten Nucleinsäuremoleküle einzusetzen sind, um die von ihnen codierten Proteine zu erhalten, und diese in therapeutischen und prophylaktischen Verfahren anzuwenden, wie in dieser Arbeit für das rekombinante Nucleinsäuremolekül beschrieben, das mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein mit einer V3-Schleifen-Deletion und einer C4-Domänen(W→X)-Punktmutation codiert.
Die vorliegende Erfindung liefert auch das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein, das vom rekombinanten Nucleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung codiert wird.
Gemäß der Erfindung können zahlreiche Vektorsysteme für die Expression des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins verwendet werden. Eine Vektorklasse zum Beispiel verwendet DNA-Elemente, die aus tierischen Viren wie Rinderpapillomvirus, Polyomavirus, Adenovirus, Vacciniavirus, Baculovirus, Retroviren (RSV, MMTV oder MoMLV), Semliki-Forest- Virus oder SV40-Virus abgeleitet sind.
Weiterhin können Zellen, die die DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, selektiert werden, indem ein oder mehrere Marker zur Selektion transfizierter Wirtszellen eingeschleust werden. Der Marker kann zum Beispiel einem auxotrophen Wirt Prototropie, Biozid (z. B. Antibiotika)-resistenz oder Resistenz gegen Schwermetalle wie Kupfer u. ä. verleihen. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt an die zu exprimierenden DNA- Sequenzen angehängt oder durch Co-Transformation in dieselbe Zelle eingeschleust werden. Weitere Elemente können für eine optimale mRNA-Synthese erforderlich sein. Solche Elemente können Spleißsignale, Transkriptionspromoter, Enhancer und Terminationssignale sein. Zu den cDNA-Expressionsvektoren, die solche Elemente beinhalten, zählen auch die von Okayama (22) beschriebenen.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Vektoren sind so ausgelegt, daß sie hohe Spiegel mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins in gezüchteten Eukaryontenzellen exprimieren und diese Proteine auch wirkungsvoll in das Kulturmedium sekretieren können. Die Lenkung des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins in das Kulturmedium wird erreicht, indem die Präprosignalsequenz des Gewebeplasminogenaktivators (tPA) im Leserahmen an das reife N-Ende des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins gebunden wird.
Das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein kann in folgenden Schritten erzeugt werden: a) Transfektion einer Säugerzelle mit einem Expressionsvektor zur Herstellung mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins; b) Züchtung der so erhaltenen transfizierten Säugerzelle unter Bedingungen, die eine Produktion von mutiertem HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein ermöglichen; und c) Gewinnung des so erzeugten mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins.
Sobald cer Expressionsvektor oder die DNA-Sequenz, die die Konstrukte enthält, für die Expression vorbereitet wurde, können die Expressionsvektoren transfiziert oder in geeignete Säugerwirtszellen eingeschleust werden. Hierzu können verschiedene Techniken angewandt werden, wie z. B. Protoplastenfusion, Calciumphosphatpräzipitation, Elektroporation oder andere herkömmliche Techniken. Im Fall der Protoplastenfusion werden die Zellen in Medium gezüchtet und nach der geeigneten Aktivität abgesucht. Die Expression des Gens, das mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein codiert, führt zur Produktion des mutierten Glykoproteins.
Die Verfahren und Bedingungen zur Züchtung der erhaltenen transfizierten Zellen und zur Gewinnung des so hergestellten mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins sind den Fachleuten wohlbekannt und können je nach spezifischem/r verwendetem/r Expressionsvektor bzw. Säugerwirtszelle variiert oder optimiert werden.
Gemäß der beanspruchten Erfindung sind die bevorzugten Wirtszellen zur Expression des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins gemäß dieser Erfindung Säugerzellinien. Dazu zählen zum Beispiel die Affennierenlinie CV-1, transformiert mit SV40 (COS-7); die Linie 293 aus embryonalen menschlichen Nieren; Babyhamster-Nierenzellen (BHK); DHFR- Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO); DHFR-Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (DXB11); Affennierenzellen (CV1); Nierenzellen von afrikanischen Grünen Meerkatzen (VERO-76); menschliche Cervixcarcinomzellen (HELA); Hundenierenzellen (MDCK); menschliche Lungenzellen (W138); menschliche Leberzellen (Hep G2); Maus- Brusttumor (MMT060562); die Maus-Zellinie C127 und Myelomzellinien.
Es können auch andere eukaryontische Expressionsysteme, die Vektor/Zellinienkombinationen von Nichtsäugerherkunft verwenden, zur Produktion des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins eingesetzt werden. Dazu zählen unter anderem Baculovirusvektor/Insektenzellen-Expressionsysteme und Hefeshuttlevektor/Hefezellexpressionsysteme.
Im Rahmen der Erfindung werden Verfahren und Bedingungen zur Reinigung des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins aus dem Kulturmedium geliefert, doch dürfte den Fachleuten wohlbekannt sein, daß diese Verfahren noch variiert oder optimiert werden können.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Impfstoff, der eine therapeutisch wirksame Menge des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins gemäß der vorliegenden Erfindung und ein Adjuvans umfaßt.
Eine therapeutisch wirksame Menge des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins kann nach den Verfahren bestimmt werden, die den Fachleuten wohlbekannt sind.
Im Zusammenhang dieser Arbeit sind die Adjuvantien unter anderem: Alaun, unvollständiges Freundsches Adjuvans (FIA), Saponin, Quil A, Monophosphoryllipid A (MPL) und nichtionische Block-Copolymere (SAF) wie z. B. L-121 (Pluronic; Syntex SAF). In der bevorzugten Ausführungsform ist das Adjuvans Alaun, besonders in Form eines thixotropen, viskosen und homogenen Aluminiumhydroxidgels. Der Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann als Öl-in-Wasser-Emulsion verabreicht werden. Verfahren, um Adjuvantien mit Antigenen zu kombinieren, sind Fachleuten wohlbekannt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines HIV-1 infizierten Individuums, das die Immunisierung des HIV-1 infizierten Individuums mit dem Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt, und somit die Behandlung des HIV-1 infizierten Individuums bewirkt.
Ein HIV-1-infiziertes Individuum mit dem Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung behandeln, bedeutet im Zusammenhang dieser Arbeit entweder die Population von HIV-1 oder die von HIV-1 infizierten Zellen in diesem Individuum zu verringern oder den Fortschritt einer HIV-1-bedingten Krankheit des Individuums zu verlangsamen.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet "HIV-1-infiziertes Individuum" ein Individuum, bei dem mindestens eine Körperzelle von HIV-1 befallen ist.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet "immunisieren" die Verabreichung einer ersten Dosis des Impfstoffes an ein Individuum, der nach einem geeigneten Zeitraum eine oder mehrere weitere Verabreichungen des Impfstoffes folgen, so daß in dem Individuum eine Immunantwort gegen, die CD4-Bindungsregion des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins in dem Impfstoff hervorgerufen wird. Ein geeigneter Zeitraum zwischen den Verabreichungen des Impfstoffs kann von einem Fachmann leicht bestimmt werden und liegt gewöhnlich in der Größenordnung von einigen Wochen bis Monaten.
In der bevorzugten Ausführungsform ist die verabreichte Dosis des Impfstoffs ausreichend, um dem Individuum zwischen 10 ug und 1 mg des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins zuzuführen.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Impfstoff, der eine prophylaktisch wirksame Menge des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins gemäß der vorliegenden Erfindung und ein Adjuvans umfaßt.
Die prophylaktisch wirksame Menge des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins kann mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines HIV-1 ausgesetzten Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden; das Verfahren umfaßt die Immunisierung dieses HIV-1 ausgesetzten Individuums mit dem Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung, und somit die Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines HIV-1 ausgesetzten Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet mit HIV-1 infiziert zu werden, daß HIV-1 in die Körperzellen des Individuum eindringt.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden, eine Verringerung der Wahrscheinlichkeit des Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden um wenigstens das Zweifache. Wenn das Individuum zum Beispiel eine 1%-ige Chance einer HIV-1-Infektion hatte, würde eine Verringerung der Wahrscheinlichkeit des Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden, um das Zweifache bedeuten, daß das Individuum nunmehr eine 0,5%-ige Chance einer HIV-1-Infektion hat. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bedeutet Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden, daß sich die Wahrscheinlichkeit eines Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden, um wenigstens das Zehnfache verringert.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet HIV-1 ausgesetztes bzw. HIV-1 exponiertes Individuum ein Individuum, in dessen Körper sich HIV-1 befindet, das jedoch noch nicht von HIV-1 infiziert wurde.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines nicht HIV-1-ausgesetzten Individuums, mit HIV-1 infiziert, zu werden; das Verfahren umfaßt die Immunisierung dieses nicht HIV-1-ausgesetzten Individuums mit dem Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung und somit die Verringerung der Wahrscheinlichkeit dieses nicht HIV-1-ausgesetzten Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet nicht-HIV-1-ausgesetztes bzw. nicht-HIV-1- exponiertes Individuum ein Individuum, in dessen Körper sich kein HIV-1 befindet.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung teilweise gereinigter Antikörper, die spezifisch an die CD4-Bindungsdomäne von HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein binden; das Verfahren umfaßt (a) die Immunisierung eines nicht-HIV-1-ausgesetzten Individuums mit dem Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung, (b) Gewinnung von Serum des immunisierten Individuums, das die Antikörper enthält, und (c) teilweise Reinigung dieser Antikörper, womit man teilweise gereinigte Antikörper erhält, die spezifisch an die CD4-Bindungsdomäne von HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein binden. In der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein menschliches Individuum.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet teilweise gereinigte Antikörper eine Zusammensetzung, die spezifisch an die CD4-Bindungsdomäne von HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein bindende Antikörper enthält und aus weniger Proteinunreinheiten besteht als das Serum, von dem die anti-CD4-Bindungsdomänen-Antikörper abgeleitet sind. Eine Proteinunreinheit bedeutet hierbei jedes andere Protein als der anti-CD4-Bindungsdomänen-Antikörper. Die teilweise gereinigten Antikörper können zum Beispiel eine IgG-Zubereitung sein.
Verfahren zur Serumgewinnung aus einem Individuum sind den Fachleuten wohlbekannt. Verfahren zur teilweisen Reinigung von Antikörpern sind den Fachleuten ebenfalls wohlbekannt; sie umfassen unter anderem zum Beispiel Filtrierung, Ionenaustauschchromatographie und Fällung.
In einer Ausführungsform umfassen die teilweise gereinigten Antikörper eine Immunglobulin (IG)-Zubereitung. IG kann in einem zweistufigen Prozeß aus dem Serum gereinigt werden. Zuerst wird das Serum mit dem Kaltethanolverfahren von Cohn et al. (29) fraktioniert. Hauptproteinbestandteil der Cohn-Fraktion II ist das IgG-Immunglobulin, das in Form von Mononieren, Dimeren und Aggregaten vorliegt. Die Fraktion II wird anschließend gereinigt und ergibt IVIG (intravenöses Immunglobulin); hierzu werden verschiedene Reinigungsverfahren angewandt, darunter zum Beispiel Ionenaustausch, DEAE-Chromatographie, Diafiltrierung bei saurem pH-Wert von 4,25, PEG-Fällung oder Pepsinbehandlung. Das Endprodukt wird stabilisiert (z. B. Glucose + NaCl), und die Endkonzentration des IgG wird im Bereich zwischen etwa 3% und etwa 6% festgelegt.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten, teilweise gereinigten Antikörper.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Arzneimittel, das eine therapeutisch wirksame Menge der teilweise gereinigten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Eine therapeutisch wirksame Menge der teilweise gereinigten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren bestimmt werden.
Pharmazeutisch verträgliche Träger sind den Fachleuten wohlbekannt; sie umfassen unter anderem 0,01-0,1 M und vorzugsweise 0,05 M Phosphatpuffer oder 0,8% Kochsalzlösung. Weiterhin können solche pharmazeutisch verträglichen Träger wässrige oder nichtwässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen sein. Beispiele nichtwässriger Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger sind unter anderem Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösungen und gepufferter Medien. Parenterale Vehikel sind unter anderem Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, lactathaltige Ringer-Lösung oder fette Öle. Intravenöse Vehikel sind unter anderem Flüssigkeits- und Nahrungsergänzungsstoffe, Elektrolytergänzungsstoffe wie die auf Basis von Ringer-Dextrose und ähnliche. Konservierungsstoffe und andere Zusätze wie zum Beispiel antimikrobielle Substanzen, Antioxidantien, chelierende Agentien, Inertgase usw. können auch enthalten sein.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines HIV-1 infizierten Individuums, das die Verabreichung einer Dosis des Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung an das Individuum umfaßt, die eine Abnahme der Population von HIV-1 infizierten Zellen in dem HIV-1 infizierten Individuum und somit eine Behandlung des HIV-1 infizierten Individuums bewirkt.
Im Zusammenhang dieser Arbeit kann die Verabreichung mittels eines beliebigen der verschiedenen Verfahren erfolgen, die den Fachleuten hierzu bekannt sind. Die Verabreichung kann intravenöse Verabreichung umfassen. Die Verabreichung kann auch intramuskuläre Verabreichung umfassen. Die Verabreichung kann weiterhin subcutane Verabreichung umfassen.
Die Dosis des Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Abnahme der Population von HIV-1 infizierten Zellen in dem HIV-1 infizierten Individuum bewirkt, kann mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren leicht bestimmt werden. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Dosis ausreichend, um dem Individuum bei intramuskulärer Verabreichung zwischen etwa 10 mg/kg und 150 mg/kg Protein zuzuführen. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Dosis ausreichend, um dem Individuum bei intravenöser Verabreichung zwischen etwa 100 mg/kg und 2 g/kg Protein zuzuführen.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Behandlung eines HIV-1 infizierten Individuums, das die Verabreichung einer Dosis des Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung an das Individuum umfaßt, die eine Abnahme der Population von HIV-1 in dem HIV-1 infizierten Individuum und somit eine Behandlung des HIV-1 infizierten Individuums bewirkt.
Die Dosis des Arzneimittels gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Abnahme der Population von HIV-1 in dem HIV-1 infizierten Individuum bewirkt, kann mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren leicht bestimmt werden. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Dosis ausreichend, um dem Individuum bei intramuskulärer Verabreichung zwischen etwa 10 mg/kg und 150 mg/kg Protein zuzuführen. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Dosis ausreichend, um dem Individuum bei intravenöser Verabreichung zwischen etwa 100 mg/kg md 2 g/kg Protein zuzuführen.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin eine Zusammensetzung, die eine prophylaktisch wirksame Menge der teilweise gereinigten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
Eine prophylaktisch wirksame Menge der teilweise gereinigten Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines HIV-1 ausgesetzten Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden; das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer Dosis der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung an das HIV-1 ausgesetzte Individuum, die eine Abnahme der Population von HIV-1 in dem HIV-1 ausgesetzten Individuum bewirkt, und verringert somit die Wahrscheinlichkeit einer HIV-1-Infektion dieses Individuums.
In einer Ausführungsform ist das Individuum ein medizinischer Praktiker. Es kann sich um einen medizinischen Praktiker handeln, der einer HIV-1-haltigen Körperflüssigkeit ausgesetzt ist. Im Zusammenhang dieser Arbeit bezeichnet der Begriff medizinischer Praktiker Ärzte, Zahnärzte, Chirurgen, Krankenschwestern, medizinische. Laborassistenten und Studenten in Gesundheitsvorsorgeprogrammen, ist jedoch keinesfalls nur auf diesen Personenkreis beschränkt.
In einer anderen Ausführungsform ist das Individuum ein Neugeborenes. Es kann sich um ein Neugeborenes handeln, das von einer HIV-1-infizierten Mutter geboren wurde.
Die Dosis der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Abnahme der Population von HIV-1 in dem HIV-1 ausgesetzten Individuum bewirkt, kann mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren leicht bestimmt werden. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Dosis ausreichend, um dem Individuum bei intramuskulärer Verabreichung zwischen etwa 10 mg/kg und 150 mg/kg Protein zuzuführen. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Dosis ausreichend, um dem Individuum bei intravenöser Verabreichung zwischen etwa 100 mg/kg und 2 g/kg Protein zuzuführen.
Die Impfstoffe und Arzneimittel gemäß der vorliegenden Erfindung können auch den Fortschritt einer HIV-1-bedingten Krankheit eines Individuums verlangsamen, dem die Impfstoffe oder Arzneimittel verabreicht wurden, während das Individuum entweder nicht HIV-1 ausgesetzt oder HIV-1 ausgesetzt, jedoch noch nicht HIV-1 infiziert war.
Schließlich liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines nicht HIV-1 ausgesetzten Individuums, mit HIV-1 infolge einer Exposition gegen HIV-1 während eines Ereignisses infiziert zu werden, bei dem ein erhöhtes Risiko der Exposition gegen HIV-1 besteht; das Verfahren umfaßt die Verabreichung unmittelbar vor dem Ereignis einer Dosis der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Abnahme der Population von HIV-1 bewirkt, der die Person während des Ereignisses ausgesetzt war, und somit eine Verringerung der Wahrscheinlichkeit dieses Individuums, mit HIV-1 infiziert zu werden. In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Individuum ein medizinischer Praktiker.
Ein Ereignis mit erhöhtem Expositionsrisiko gegen HIV-1 kann zum Beispiel folgendes sein: der Empfang einer Bluttransfusion, sexueller Kontakt mit einem HIV-1 infizierten Individuum oder die Ausführung ärztlicher Tätigkeiten, die eine Exposition gegen HIV-1-haltige Körperflüssigkeiten beinhalten.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet "unmittelbar vor dem Ereignis" innerhalb eines Monats vor dem Ereignis. In der bevorzugten Ausführungsform bedeutet "unmittelbar vor dem Ereignis" innerhalb eines Tages vor dem Ereignis.
Die Dosis der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Abnahme der Population von HIV-1 bewirkt, der das Individuum während des Ereignisses durch den Zwischenfall ausgesetzt ist, kann mit den Fachleuten wohlbekannten Verfahren leicht bestimmt werden. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Dosis ausreichend, um dem Individuum bei intramuskulärer Verabreichung zwischen etwa 10 mg/kg und 150 mg/kg Protein zuzuführen. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Dosis ausreichend, um dem Individuum bei intravenöser Verabreichung zwischen etwa 100 mg/kg und 2 g/kg Protein zuzuführen.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur wesentlichen Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines nichtinfizierten medizinischen Praktikers, während einer ärztlichen Tätigkeit an einem Patienten, die eine Exposition zu HIV-1-haltigen Körperflüssigkeiten beinhaltet, mit HIV-1 infiziert zu werden; das Verfahren umfaßt die Verabreichung über einen geeigneten Zeitraum einer Menge der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine wesentliche Verringerung der Wahrscheinlichkeit des nichtinfizierten medizinischen Praktikers, durch Kontakt mit der Körperflüssigkeit des Patienten während der ärztlichen Tätigkeit mit HIV-1 infiziert zu werden, bewirkt.
Im Zusammenhang dieser Arbeit bedeutet Körperflüssigkeit jede Flüssigkeit im menschlichen Körper eines HIV-1 infizierten Patienten, die infektiöse HIV-1 enthalten kann. Dazu zählen unter anderem Speichel, Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit, Tränen, Vaginasekrete, Urin, Alveolarflüssigkeit, Gelenkschmiere und Pleuralfüssigkeit.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur wesentlichen Verringerung der Wahrscheinlichkeit eines nicht-HIV-1-infizierten Neugeborenen vor oder während der Geburt durch eine HIV-1 infizierte Mutter mit HIV-1 infiziert zu werden; das Verfahren umfaßt die Verabreichung an die Mutter vor der Geburt einer Menge der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine wesentliche Verringerung der Wahrscheinlichkeit des nicht-HIV-1 infizierten Neugeborenen, durch Kontakt mit der Körperflüssigkeit der Patientin mit HIV-1 infiziert zu werden, bewirkt.
Zum besseren Verständnis des folgenden Abschnitts Versuchsdetails wird auf Maniatis et al. (23) verwiesen, wo sich die besten Beschreibungen bestimmter, häufig vorkommender Verfahren und/oder Begriffe finden.
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf den folgenden Abschnitt Versuchsdetails besser verstanden werden, Fachleute jedoch werden verstehen, daß die beschriebenen Versuchsdetails nur als Beipiele für die vollständiger in den nachstehenden Patentansprüchen beschriebene Erfindung dienen.

Versuchsdetails

Nomenklatur

Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezeichnet "V3(-)" eine V3-Schleifen- Deletion bei einem HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezeichnet "CD4(-)" eine Punktmutation in der C4-Domäne eines HIV-1-gp120- Hüllglykoproteins, die CD4-Bindungen an das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein hemmt. Die Struktur des HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins ist in Fig. 1 dargestellt.

Material und Methoden

1). Konstruktion des Expressionsvektors PPI4-tPA-gp120LAI

Es wurde ein Expressionsvektor konstruiert, der aus dem sehr frühen Hauptpromoter/Enhancer des Cytomegalievirus (CMV-MIE), gebunden an das menschliche HIV-1LAIenv-Gen, dessen Signalsequenz durch die tPA-Signalsequenz ersetzt worden war, besteht. Die CMV-MIE- Promoter-/Enhancersequenzen wurden aus pSVCC1 (24) abgeleitet, bestehend aus 1580 Basenpaaren durchgehender DNA, die unmittelbar 5' des Initiator-ATG liegen. Die funktionellen Domänen des CMV-Promoters liegen in folgender Reihenfolge vor: die Promoter- /Enhancerregion; eine Transkriptionsinitiationsstelle; Exon A (ein nichtcodierendes Exon); Intron A; und 17 Nucleotide des Exons B (nichtcodierende Sequenzen). Die viralen Promotersquenzen wurden an ein Genkonstrukt, das aus den Nucleotidsequenzen, die die Aminosäuren -35 bis -1 des menschlichen tPA codieren (25), die im Leserahmen an die HIV-1LAI-env- Aminosäuren 31 bis 515 gebunden sind, besteht und das mit dem Stoppcodon TGA endet, ligiert. Die Konstruktion erfolgte in zwei Schritten. Der Großteil des CMV-Promoters konnte als Hinc II/Pst I-Fragment von 1560 bp isoliert werden, das an ein Pst I/Not I-DNA-Fragment von 1590 bp ligiert wurde, welches den Rest des CMV-Promoters, das Initiator-ATG, die tPA-Signalsequenz und die Codierungssequenz des reifen HIV-1LAI-env-Proteins enthielt.
Das letztere Fragment wurde mittels der Polymerasekettenreaktion folgendermaßen zusammengesetzt: Primer 1 (GATCCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGATGGATGCAATGAAGAGA) und Pritet 2 (AAGTCTTCTCCTCGGTCTTGTCTTTTTAACACCCAG) wurden verwendet, um die Nucleinsäuresequenzen zu amplifizieren, die die Aminosäuren -35 bis -1 der tPA-Signalsequenz des Plasmids pMAM neo-s (Clonetech) codieren, womit man ein 150 bp-Fragment erhielt. Ein zweites Fragment von 1440 bp wurde unter Verwendung von Primer 3 (TTCAGAAGAGGAGCCAGAACAGAAAAATTGTGGGTC), Primer 4 (GGAA- AAAAGCGGCCGCTCATTTTTCTCTCTGCACCACTC) und pENV (26) als Matrize amplifiziert. Die PCR-Fragmente wurden vereinigt, entsalzt, und überschüssiger Primer wurde durch Ultrafiltration durch eine Centricon-100-Einheit (Amicon) entfernt. Anschließend wurde ein Aliquot des vereinigten Materials einem zweiten Amplifikationsschritt in Gegenwart der Primer 1 und 4 unterworfen; man erhielt ein 1590 bp-Fragment, welches dann mit Pst I und Not I verdaut wurde. Das CMV-Promoterfragment und das HIV-1LAI-env-Fragment wurden miteinander ligiert und die ganze Transkriptionseinheit in PPI4 subcloniert; PPI4 ist ein eukaryontischer Shuttlevektor, der ein Ampicillinresistenzgen, einen SV40-Replikationsursprung und ein DHFR-Gen, dessen Transkription vom 13-Globin-Promoter gesteuert wird, enthält. Das Endkonstrukt, PPI4-tPA-gp120LAI, ist in Fig. 2 dargestellt.
Der Expressionsvektor wird dann als Prototypvektor für die Expression von gp120-Proteinen verwendet, die aus anderen Stämmen abgeleitet, oder wie im Abschnitt Methoden beschrieben, mutiert sind. Der Vektor wurde so konstruiert, daß die gp120-Sequenz von einmal vorhandenen Nar I- und Not I-Stellen flankiert wird, was die Entnahme der gp120-Genkassette und das anschließende Einsetzen anderer Genkassetten erleichtert (Fig. 2).

2.) Expression von HIV-1LAI-gp120 in Säugerzellen

a) Vorübergehende Expression: In DMEM mit 10% fötalem Kalbserum gezüchtete CosM5- Zellen wurden zu 75% Konfluenz verteilt. Am nächsten Tag wurden die Zellen 16-20 Stunden lang mit 10 ug CsCl gereinigter PPI4-tPA-gp120LAI-DNA nach dem CaPO&sub4;-Standardfällungsverfahren (5) transfiziert. Nach der Transfektion wurde den Zellen frisches Medium hinzugefügt. Die Analyse der innerhalb von 96 bis 120 Stunden nach der Transfektion synthetisierten Produkte wurde mittels 12-18-stündiger radioaktiver Markierung der Transfektanten mit ³&sup5;S-Cystein und anschließender Ausfällung von Medium unter Verwendung eines CD4- Immunglobulin-Protein A-Sepharosekomplexes und nachfolgender SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen vorgenommen (Fig. 4).
b) Stabile Expression: DHFW&supmin;-Zellen aus den Ovarien Chinesischer Hamster (CHO) wurden mit 20 ug CsCl-gereinigter DNA transfiziert. Ungefähr 3-5 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in selektives Medium (nucleosidfreies alpha-MEM mit 10% dialysiertem fötalem Kälberserum) gebracht. Ungefähr 10-15 Tage nach der Selektion wurden einzelne Zellclone entnommen. Die Medien wurden mittels 12-18-stündiger radioaktiver Markierung der Zellen mit ³&sup5;S-Cystein und anschließender Ausfällung des Mediums unter Verwendung eines CD4-Immunglobulin-Protein A-Sepharosekomplexes und wiederum nachfolgender SDS- PAGE unter reduzierenden Bedingungen auf gp120-Expression untersucht (Fig. 6). Die gp120-Spiegel in den Medien dieser Clone wurden ebenfalls quantifiziert (Fig. 5), und zwar durch ELISA nach folgendem Verfahren: Schalen mit 96 Vertiefungen werden mit polyclonalen, gegen das hochgradig konservierte C-Ende von gp120 gerichteten Antikörpern von Schafen (D7234, Aalto Bioreagents) beschichtet. Nach dem Waschen werden Verdünnungen eines gp120-Standardansatzes in Zellwachtumsmedium oder Überstand der stabil transfizierten Zellen eine Stunde lang inkubiert. Die Schalen werden nochmals gewaschen und eine Stunde lang mit einem Meerrettichperoxidase konjugierten monoclonalen Antikörper gegen gp120 (9204, DuPont) inkubiert. Nach einem abschließenden Waschgang wird das Peroxidase- Substrat OPD (DuPont) hinzugefügt und die gp120-Menge durch Vergleich der Absorptionen von Unbekannten mit einer Standardkurve bestimmt. Die Standards wurden aus gereinigtem, in CHO-Zellen hergestelltem gp120 zubereitet, von dem eine kleine Menge von Celltech Ltd. bezogen wurde. Clone, die den höchsten Spiegel exprimierten, wurden aufeinanderfolgenden Amplifikationsrunden der neu eingeführten DNA-Sequenzen in steigenden Methotrexatkonzentrationen unterworfen. So wurden stabile CHO-Zellinien erzeugt, die mindestens 1ug/ml HIV-1LAI sekretieren.

3.) Konstruktion von PPI4-tPA-gp120JR-FL

a) Die env-Nucleotidsequenz von HIV-1LAI-gp120 in PPI4-tPA-gp120LAI wurde durch die das reife gp120JR-FL-Protein codierende Nucleotidsequenz ersetzt. Mittels der Polymerase- Kettenreaktion wurden die JR-FL-Sequenzen von pUC112-1 (27) unter Verwendung der Primer 5 (GATCGGCGCCAGAGTAGAAAAGTTGTGGGTCAC) und Primer 4 amplifiziert. Das PCR-Fragment wurde mit den Restriktionsendonucleasen Nar I und Not I verdaut, und das Fragment zwischen den Nar I- und Not I-Stellen in PPI4-tPA-gp120LAI subcloniert, um PPI4-tPA-gp120JR-FL zu erzeugen (Fig. 7).
b) Vorübergehende Expression: In DMEM mit 10% fötalem Kälberserum gezüchtete CosMS- Zellen wurden zu 75% Konfluenz verteilt. Am nächsten Tag wurden die Zellen 16-20 Stunden lang mit 10 Mikrogramm CsCl gereinigter PPI4-tPA-gp120JR-FL-DNA nach dem CaPO&sub4;- Standardfällungsverfahren (5) transfiziert. Nach der Transfektion wurde den Zellen frisches Medium hinzugefügt. Die Analyse der innerhalb von 96 bis 120 Stunden nach der Transfektion synthetisierten Produkte wurde mittels 12-18-stündiger radioaktiver Markierung der Transfektanten mit ³&sup5;S-Cystein und anschließender Ausfällung von Medium unter Verwendung eines CD4-Immunglobulin-Protein A-Sepharosekomplexes und nachfolgender SDS- PAGE unter reduzierenden Bedingungen vorgenommen (Fig. 4).

4.) Konstruktion von PPI4-tPA-gp120LAI-V3(-)

Die V3-Schleife von tPA-gp120LAI besteht aus den Aminosäuren Cys&sub3;&sub0;&sub6; bis Cys&sub3;&sub3;&sub3;. Bei der V3(-)-Mutante sind die Aminosäuren zwischen diesen Cysteinen durch die Pentapeptidsequenz Thr-Gly-Ala-Gly-His ersetzt. Mittels des Transformer Site-Directed Mutagenesis Kits (Clonetech) wird die V3-Schleifen-Sequenz von PPI4-tPA-gp120LAI verändert, indem der mutagene Primer 6 (CTGTAGAAATTAATTGTACAGGTGCTGGACATTGTAACAT- TAGTAGAGC) und Primer 7 (CTCGAGCATGCATTCGAAGCTCGCTGATC) als Selektionsprimer verwendet werden. Der Primer 7 ändert eine einmal vorhandene Xba I-Stelle im Rückgrat des PPI4-Elternplasmids in eine einmal vorhandene BstB I-Stelle. Kurz gesagt, erfordert das Mutageneseverfahren die Inkubation des Elternplasmids mit dem mutagenen Primer und dem Selektionsprimer, 3-minütige Denaturierung bei 100ºC und dann Abkühlung auf Eis. In Gegenwart von gepufferten Desoxynucleotidtriphosphaten und von T4-DNA- Polymerase läßt man die Primer die Polymerisation eines Stranges Plasmid-DNA initiieren. Zur Versiegelung des neusynthetisierten DNA-Stranges zur Bildung eines kovalent geschlossenen Ringes wird T4-DNA-Ligase verwendet. Anschließend werden Hybridplasmide in einen MutS-Stamm von E. coli transformiert, der Fehlpaarungsreparatur-defizient ist. Nachdem transformierte Zellen herangewachsen sind, wird DNA aus diesen Zellen gereinigt und mit der Selektions-Restriktionsendonuclease, in diesem Fall Xba I, verdaut. Elternplasmide werden von Xba I gespalten, während das mutierte Plasmid aufgrund der Xba I-zu-BstB I- Konversion spaltungsresistent bleibt. Verdaute DNA wird dann zur Transformation von E. coli verwendet, und Kolonien, die das mutierte Plasmid enthalten, werden entnommen. In einer einzigen Mutageneserunde können mehrere mutagene Primer verwendet werden. Die Aminosäuresequenz des modifizierten Proteins ist in Fig. 8 dargestellt.

5.) Konstruktion von PPI4-tPA-gp120JR-FL-V3(-)

Die V3-Schleife von tPA-gp120JR-FL besteht aus den Aminosäuren Cys&sub2;&sub9;&sub3; bis Cys&sub3;&sub2;&sub7;. Bei der V3(-)-Mutante sind die Aminosäuren zwischen diesen Cysteinen durch die Pentapeptidsequenz Thr-Gly-Ala-Gly-His ersetzt. Mittels des Transformer Site-Directed Mutagenesis Kits (Clonetech) wird die V3-Schleifen-Sequenz von PPI4-tPA-gp120JR-FL verändert, indem der mutagene Primer 6 (CTGTAGAAATTAATTGTACAGGTGCTGGACATTGTAACATTAGTAGAGC) und Primer 7 als Selektionsprimer verwendet werden. Die Aminosäuresequenz des modifizierten Proteins ist in Fig. 9 dargestellt.

6.) Konstruktion von PPI4-tPA-gp120LAI-CD4(-)

Mittels des Transformer Site-Directed Mutagenesis Kits (Clonetech), des Selektionsprimers 7 und des mutagenen Primers 8 (CAATTTATAAACATGGTGCAGGAAGTAGG) wird das Trp&sub4;&sub3;&sub7; von tPA-gp120LAI im Expressionsvektor PPI4-tPA-gp120LAI, das in einer zum Tryptophanrest im HXBc2-Stamm von HIV-1 äquivalenten Position liegt, zu Valin mutiert, wodurch PPI4-tPA-gp120LAI-CD4(-) erzeugt wird. Die Sequenz von gp120LAI-CD4(-) ist in Fig. 12 dargestellt.

7.) Konstruktion von PPI4-tPA-gp12JR-FL-CD4(-)

In ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben, wird das Trp&sub4;&sub2;&sub4; von tPA-gp120JR-FL im Expressionsvektor PPI4-tPA-gp120JR-FL, mittels des Selektionsprimers 7 und des mutagenen Primers 9 (CAAATTATAAACATGGTGCAGGAAGTAGG) zu Valin mutiert, wodurch PPI4- tPA-gp120JR-FL-CD4(-) erzeugt wird. Die Sequenz von gp120JR-FL-CD4(-) ist in Fig. 13 dargestellt.

8.) Konstruktion von PPI4-tPA-gp120LAI-V3(-)-CD4(-)

Die doppelte Mutante von tPA-gp120LAI, V3(-)-CD4(-), wird erzeugt, indem die mutagenen Primer 6 und 8 und der Selektionsprimer 7 gleichzeitig in das Reagenzglas mit PPI4-tPA- gp120LAI als DNA-Matrize gegeben werden. Das Endkonstrukt wird PPI4-tPA-gp120LAI- V3(-)-CD4(-) genannt, und seine Sequenz wird in Fig. 10 dargestellt.

9.) Konstruktion von PPI4-tPA-gp120JR-FL-V3(-)-CD4(-)

Die doppelte Mutante von tPA-gp120JR-FL, V3(-)-CD4(-), wird erzeugt, indem die mutagenen Primer 6 und 9 und der Selektionsprimer 7 gleichzeitig in das Reagenzglas mit PPI4-tPA- gp120JR-FL als DNA-Matnze gegeben werden. Das Endkonstrukt wird, PPI4-tPA-gp120JR-FL- V3(-)-CD4(-) genannt, und seine Sequenz ist in Fig. 11 dargestellt.

10.) Expression von mutiertem HIV-1-gp120 in Säugerzellen

a) Vorübergehende Expression: In DMEM mit 10% fötalem Kälberserum gezüchtete CosMS- Zellen wurden zu 75% Konfluenz verteilt. Am nächsten Tag wurden die Zellen 16-20 Stunden lang mit 10 Mikrogramm CsCl gereinigter mutierter HIV-1-DNA nach dem CaPO&sub4;-Standardfällungsverfahren (5) transfiziert. Nach der Transfektion wurde den Zellen frisches Medium hinzugefügt. Die Analyse der innerhalb von 96 bis 120 Stunden nach der Transfektion synthetisierten Produkte wurde mittels 12-18-stündiger radioaktiver Markierung der Transfektanten mit ³&sup5;S-Cystein und anschließender Ausfällung von Medium unter Verwendung von gegen das hochgradig konservierte C-Ende von gp120 gerichtetem polyclonalem IgG von Schafen vorgenommen.
b) Stabile Expression: DHFR&supmin;-Zellen aus den Ovarien Chinesischer Hamster (CHO) wurden mit 20 Mikrogramm CsCl gereinigter DNA, die das native oder mutierte HIV-1-gp120- Glykoprotein codiert, transfiziert. Ungefähr 3-5 Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in selektives Medium (nucleosidfreies alpha-MEM mit 10% dialysiertem fötalem Kälberserum) gebracht. Ungefähr 10-15 Tage nach der Selektion wurden einzelne Zellclone entnommen. Die Medien wurden mittels 12-18-stündiger radioaktiver Markierung der Zellen mit ³&sup5;S-Cystein und anschließender quantitativer Immunausfällung des Mediums unter Verwendung von gegen das hochgradig konservierte C-Ende von gp120 gerichtetem polyclonalem IgG von Schafen und wiederum nachfolgender SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen auf gp120-Expression untersucht. Alternativ kann man den gp120-Spiegel mittels ELISA folgendermaßen bestimmen: Schalen mit 96 Vertiefungen werden mit polyclonalen, gegen das hochgradig konservierte C-Ende von gp120 gerichteten Antikörpern von Schafen (D7234, Aalto Bioreagents) beschichtet. Nach dem Waschen werden Verdünnungen eines gp120- Standardansatzes in Zellwachtumsmedium oder Überstand der stabil transfizierten Zellen eine Stunde lang inkubiert. Die Schalen werden nochmals gewaschen und eine Stunde lang mit menschlichen MoAbs (F105, AIDS Research & Reference Reagent Program, Nr. 857) inkubiert. Die Schalen werden nochmals gewaschen und eine Stunde lang mit Meerrettichperoxidase konjugierten, gegen Menschen gerichteten IgGs von Ziegen (Cappel) inkubiert. Nach einem abschließenden Waschgang wird das Peroxidase-Substrat OPD (DuPont) hinzugefügt und die gp120-Menge durch Vergleich der Absorptionen von Unbekannten mit einer Standardkurve bestimmt. Die Standards werden aus gereinigtem, in CHO-Zellen hergestelltem gp120 zubereitet, von dem eine kleine Menge von Celltech Ltd. bezogen wurde. Clone, die den höchsten Spiegel exprimieren, werden aufeinanderfolgenden Amplifikationsrunden der neueingeführten DNA-Sequenzen in steigenden Methotrexatkonzentrationen unterworfen. So werden stabile CHO-Zellinien erzeugt, die mindestens 1 Mikrogramm/Milliliter mutiertes HIV-1-gp120 sekretieren.

11.) Reinigung von HIV-1-gp120-Proteinen

Zur Reinigung der beschriebenen rekombinanten gp120-Moleküle wird ein einstufiges Immunaffinitätsverfahren verwendet. Kurz gesagt, wird der Kulturüberstand gesammelt und durch Zentrifugieren geklärt. Zur spezifischen Adsorption von gp120 aus dem Zellkulturmedium wird eine Immunaffinitätssäule mit einer an polyclonales, gegen das hochgradig konservierte C-terminale Ende (APTKAKRRVVQREKR) von gp120 gerichtetes anti-gp120-IgG von Schafen (D7234, Aalto Bioreagents) gekoppelten Matrix verwendet. Dieses Antiserum erkennt naives gp120, die V3-Schleifen-Deletionsmutanten und die CD4(-)-Mutanten, da das C-terminale Ende dieser Moleküle unverändert bleibt. Das gebundene gp 120 wird mit 2M MgCl&sub2; eluiert, durch Amicon-Filtration konzentriert und in 10 mM HEPES, pH 7,0 dialysiert. Die Reinheit der Proteine wird durch SDS-PAGE und Silberfärbung bestimmt.

12.) Charakterisierung der rekombinanten HIV-1-gp120-Proteine

Die gereinigten Glykoproteine werden einer ausgedehnten biochemischen und immunologischen Charakterisierung unterworfen. Die Integrität der Proteine wird durch SDS-PAGE und Silberfärbung unter reduzierenden und unter nicht reduzierenden Bedingungen bestimmt. Die Glykoproteine werden durch Behandlung mit dem Enzym N-Glykosidase F, das N-gebundene Oligosaccharide spaltet, deglykosyliert, und mittels SDS-PAGE und Silberfärbung auf Molekulargewichtsverschiebungen untersucht. Die gereinigten Glykoproteine werden auch mit mehreren wohlcharakterisierten monoclonalen anti-gp120-Antikörpern, die sowohl lineare als auch unzusammenhängende Epitope erkennen, auf ihre Reaktivität getestet. Die Bindungsaffinität zu sCD4 wird mittels eines ELISA-Tests abgeschätzt.
Die gerinigten HIV-1-Proteine gp120LAI, gp120LAI-V3(-), gp120LAI-V3(-) -CD4(-), gp120JR-FL, gp120JR-FC-V3(-) und gp120JR-FL-V3(-)-CD4(-) wurden auf ihre Fähigkeit getestet, menschliches Zelloberflächen-CD4 zu binden. In T-Kolben wurden DG44 #3-Zellen, eine rekombinante Zellinie, die zur Expression von menschlichem CD4 auf der Membranoberfläche entwickelt wurde, gezüchtet und trypsinisiert. 5 · 10&sup5; Zellen/Versuch wurden in FACS- Puffer (PBS + 2% BSA und 0,1% NaN&sub3;) aufgeteilt, mehrmals im gleichen Puffer gewaschen, und dann mit 100 ul einer Lösung mit 5 ug/ml gereinigtem gp120-Protein 2 Std. lang bei 37ºC in FACS-Puffer inkubiert. Die Zellen wurden in FACS-Puffer gewaschen und dann in 100 ul Lösung, die 5 ug/ml polyclonales Schafs-IgG gegen das hochgradig konservierte C- Ende von gp120 enthielt, 2 Std. lang bei 37ºC in FACS-Puffer inkubiert. Die Zellen wurden in FACS-Puffer gewaschen und dann in 100 ul Lösung, die FITC-markierte, gegen Schaf-IgG gerichtete polyclonale Antikörper von Kaninchen enthielt, 2 Std. lang bei 37ºC bebrütet. Die Zellen wurden mit FACS-Puffer gewaschen und dann mit 500 ul FACS-Puffer resuspendiert. Dann wurden die Zellen mit einem Becton Dickinson FACScan nach den Angaben des Herstellers analysiert. Als Kontrolle für die Expression von CD4 auf den DG44 #3-Zellen wurden FITC-markierte OKT4A (Becton Dickinson) verwendet.

13.) Verfahren zur Inokulation von Tieren mit den mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteinen

In der Inokulationsreihe wird Alaun als Adjuvans verwendet. Das Inokulum wird durch Auflösung des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteinantigens in physiologischer Kochsalzlösung bis zu einer Antigenendkonzentration von 100 ug/ml hergestellt. Der Lösung wird vorgefertigtes Alaun (Aluminiumhydroxidgel) bis zu einer Menge von 500 ug/ml Aluminium hinzugefügt. Man läßt das Antigen zwei Stunden lang bei Zimmertemperatur an das Alaungel adsorbieren. Nach der Adsorption wird das Gel mit dem Antigen zweimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in der Kochsalzlösung bis zu einer Proteinkonzentration von 100 ug/ml resuspendiert.
Affen und/oder Meerschweinchen werden individuell mit vier 100 ug-Dosen der an Alaun adsorbierten mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteinantigene inokuliert. Alle Dosen werden intramuskulär injiziert. Die Dosen werden im Abstand von einem oder fünf Monaten verabreicht (Wochen 0, 4, 8 und 28). Alle zwei oder vier Wochen werden den Tieren Blutproben entnommen. Von jeder Blutprobe werden Serumproben hergestellt, um die Entwicklung spezifischer Antikörper zu verfolgen, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben.

14.) Analyse der Seren auf IgG-Antikörper gegen mutierte HIV 1-gp120-Hüllglykoproteine

Jede Serumprobe wird mittels ELISA untersucht. Mikrotiterplatten aus Polystyrol werden bei 4ºC mit 0.5 ug reinem mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) pro Vertiefung beschichtet. Dann wird jede Vertiefung mit PBS mit 0,5% TWEEN-20 (PBS-TW) gewaschen. Das Serum der Proben wird nach aufeinanderfolgenden Verdünnungen in PBS-TW zu den Vertiefungen mit mutiertem HIV-1- gp120-Hüllglykoprotein hinzugefügt, und man läßt es eine Stunde lang bei 37ºC mit dem adsorbierten mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein reagieren. Dann werden die Vertiefungen gründlich in PBS-TW gewaschen. Anschließend wird in jede Vertiefung 0,1% p-Nitrophenylphosphat in 10% Diethanolamin, pH 9,8, mit 0,5 mM MgCl&sub2; 6 H&sub2;O gegeben. Man läßt die folgende Reaktion bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang fortschreiten, dann wird sie durch Zugabe von 3,0 N NaOH gestoppt.
Je größer die Wechselwirkung der Antikörper im Probenserum mit dem mutierten HIV-1- gp120-Hüllglykoprotein, desto größer ist die Menge der alkalischen Phosphatase, die an die Schale bindet. Das Phosphataseenzym bewirkt den Abbau von p-Nitrophenylphosphat in eine molekulare Substanz, die Licht bei einer Wellenlänge von 405 nm absorbiert. Somit besteht eine direkte Beziehung zwischen der Absorption von Licht bei 405 nm am Ende der ELISA- Reaktion und der Menge der an mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein gebundenen Antikörper. Alle mit mutiertem HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein inokulierten Tiere, deren Serum spezifisch mit dem mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein in dem ELISA reagiert, haben eine positive Antikörperantwort auf mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein.

15.) Analyse der Seren auf Aktivität, die spezifisch die HIV-1-Infektiosität neutralisiert

Die virusneutralisierende Aktivität wird mittels eines Tests bestimmt, der auf der Verwendung von Multiplizitätskurven beruht, mit denen das Verhältnis von infektiösen Viren, die die Antikörperbehandlung überstehen (Vn), zu den infektiösen Viren in nichtgehemmten Kulturen (Vo) bei verschiedenen Verdünnungsstufen von Antiseren verglichen wird. Der Neutralisierungstiter c er Seren wird dann als jene Serumverdünnung interpoliert, der eine Verringerung des infektiösen Titers um einen Zehnerlogarithmus bewirkt (d. h. Vn/Vo, = 0,1). Kurz gesagt, werden 4-liche Verdünnungen von Viren (laborbearbeitete und primäre Isolate) hergestellt, die infektiöse Dosen von 0,1 bis 100 TCID&sub5;&sub0; (Tissue Culture Infection Dose) in 20 ul ergeben. Es werden auch aufeinanderfolgende 3-fache Verdünnungen von Seren hergestellt, und 20 ul jeder Serumverdünnung werden mit jeder Virusverdünnung in doppelten Ansätzen in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen 60 Minuten lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Dann werden 20 ul AA5-Zellen (PHA stimulierte PBMCs für primäre HIV-1-Isolate) zu den Serum/Virus-Gemischen hinzugefügt. Die Zellen werden 7 Tage lang unter täglicher Hinzufügung vor frischem Medium gezüchtet. Am siebten Tag wird der Überstand von jeder Vertiefung abgeschöpft und auf die Gegenwart von reverser Transkriptase (RT) getestet. Die Infektion in jeder Vertiefung wird je nach RT-Zählung als positiv oder negativ bewertet, und die infektiöse Dosis von Viren in jeder Behandlungsgruppe wird nach der Reed und Münch- Formel (28) berechnet. Die Neutralisationstiter sind der Kehrwert der Serumverdünnung, die erforderlich ist, um die infektiöse Virendosis um einen Zehnerlogarithmus zu verringern. Die vorstehende Kultivierungszeit gilt für das als Prototyp fungierende HIV-1LAI-Isolat, das an der AA5-Zellinie getestet wurde. Im Fall von primären Isolaten ist der Endzeitpunkt gewöhnlich nach 11-14 Tagen. Die Kulturbedingungen für PBMCs sind nicht so anspruchsvoll, da die Verdopplungszeit beschränkt ist. Im Fall der PBMCs werden am Tag 0 einen Tag lang PHA-Stimulationen bei einer Endkonzentration von 1,5 · 106/ml verwendet. Die Hälfte dieser Zahl frischer PBMCs werden dann nochmals an den Tagen 4 und 8 hinzugefügt. Diese Mehrfachzugabe von PBMCs bezweckt eine Verstärkung des Virusausstoßes nach erfolgreicher Infektion, so daß das RT-Signal beim Ablesen stark ist. Auch hier ist der Ablesetiter für das primäre Isolat/PBMC der Kehrwert der Serumverdünnung, die den infektiösen Titer um einen Zehnerlogarithmus verringert.

16. Passive Hyperimmuntherapie

Nicht HIV-1 infizierte Menschen werden mit dem mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteinantigenen nach einem Verfahren ähnlich dem vorstehend unter Punkt 12 beschriebenen behandelt. Für die passive Hyperimmuntherapie HIV-1 infizierter Individuen wird Blutplasma von mit mutiertem HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein immunisierten, nicht HIV-1 infizierten Spendern gewonnen, das einen hohen Spiegel neutralisierender Antikörper aufweist. Das Plama mehrerer Spender wird in einem gemeinsamen Pool gemischt, gereinigt, um Nichtimmunglobulinproteine zu entfernen, und anschließend sterilisiert, um jegliche andere Viren oder Krankheitserreger abzutöten. Dann wird das behandelte Plasma den mit HIV-1 infizierten Individuen mit wöchentlich, alle zwei Wochen oder monatlich wiederholten Injektionen gespritzt.

Ergebnisse

Es wurden eukaryontische Expressionsvektoren entwickelt, die hohe Mengen von HIV-1LAI- gp120 und HIV-1JR-FL-gp120 exprimieren. Der CMV-MIE-Promoter/Enhancer wurde zur Steuerung der Transkription eines Fusionsgens aus der an reifes gp120 gebundenen menschlichen tPA-Signalsequenz verwendet (Fig. 2 und 7). Die komplette Sequenz der Transkriptionseinheit von der Hinc II-Stelle des CMV-Promoter/Enhancers bis zur Not I-Stelle unmittelbar 3' vom Stoppcodon in gp120, wird in Fig. 3 dargestellt. Dieser Vektor wurde in einem Versuch zur vorübergehenden Transfektion von COSM5-Zellen verwendet. Die transfizierten Zellen wurden mit ³&sup5;S-Cystein markiert und die Medien mit einem CD4-Immunglobulin- Protein A-Sepharosekomplex immungefällt. Die Fällungsprodukte wurden mittels reduzierendem 10% SDS-PAGE-Gel und Autoradiographie untersucht (Fig. 4). Es wurde eine 120 kD-Bande entdeckt, wenn PPI4-tPA-gp120LAI zur Transfektion der COS-Zellen verwendet worden war (Spur 3). War PPI4-tPA-gp120JR-FL zur Transfektion der COS-Zellen verwendet worden, so ergab sich eine mit einer etwas niedrigeren Molekularmasse wandernde Bande (Spur 4). In den scheininfizierten Zellen wurden keine radioaktiv markierten Produkte entdeckt. Mit einem ELISA-Test unter Verwendung von polyclonalen, gegen das hochgradig konservierte C-Ende von HIV-1-gp120 gerichteten Antikörpern von Schafen wurde die Expressionsmenge von HIV-1-gp120 bestimmt; er betrug 2350 ng/ml.
Anschließend wurde der Vektor PPI4-tPA-gp120LAI verwendet, um die DHFR&supmin;-CHO- Zellinie DXB11 stabil zu transfizieren. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in niedriger Dichte auf nucleosidfreies Medium ausplattiert. Acht Tage nach der Transfektion wurden überlebende Clone isoliert und expandiert. Einzelne primäre Transfektanten wurden mit dem im Abschnitt Methoden beschriebenen ELISA-Verfahren auf gp120-Expression getestet. Mehrere primäre CHO-Transfektanten exprimierten signifikante Mengen (10- 120 ng/ml) gp120 (Fig. 5). Drei der höchstexprimierenden Clone wurden steigenden Methotrexatkonzentrationen unterworfen, um die Kopienzahl der DHFR- und gp120-Gene in Tandem zu erhöhen. Es wurden Zellinien etabliert, die hohe gp120-Mengen mit Sekretionsraten von größer als 1 mg/Liter exprimierten. Diese wurden dann verwendet, um gp120 bis zur Homogenität zu reinigen.
Mit den vorstehend beschriebenen Verfahren wurden sechs CHO-Zellinien etabliert, die hohe Mengen der folgenden Proteine exprimierten: HIV-1-gp120LAI, -gp120LAI-V3(-), -gp120LAI-V3(-)-CD4(-)-gp120JR-FL, -gp120JR-FL-V3(-) und -gp120JRFL-V3(-)-CD4(-). Die metabolische Markierung dieser Zellen mit ³&sup5;S-Cystein, anschließende Immunfällung mit dem menschlichen monclonalen Antikörper F105 und SDS-PAGE-Analyse und Autoradiographie zeigten die Anwesenheit der gp120-Proteine im Kulturüberstand (Fig. 14). Aus diesen Zellinien wurden die gp120-Proteine bis zur Homogenität gereinigt. Die SDS-PAGE-Analyse und anschließende Silberfärbung zeigten, daß die Reinheit dieser Proteine größer als 90% war (Fig. 15).
Mittels einer FACScan-Analyse wurde gezeigt, daß die beiden CD4 bindenden Mutanten HIV-1-gp120LAI-V3(-)-CD4(-) und HIV-1-gp120JR-FL-V3(-)-CD4(-) keine nennenswerte Bindung zu rekombinanten Zellinien aufwiesen, die zur Expression höher Mengen menschlichen CD4 auf ihrer Membranoberfläche entwickelt worden waren (Fig. 16, Tafel 4 bzw. nicht dargestellte Daten).

Diskussion

Der Vorteil der Verwendung des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins als Immungen besteht darin, daß diese Proteine keine Immunantwort gegen die V3-Schleife, ein hochgradig immundominantes Epitop auf gp120, auslösen. Das ist wichtig, weil die V3-Schleife die humorale Immnunantwort von unzusammenhängenden Epitopen in der CD4-Bindungsstelle abbringen kann. Es wurden mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoproteine hergestellt, die teilweise und vollständige V3-Schleifen-Deletionen aufwiesen (30). Deletionen der V3-Schleife setzt die CD4-Bindungsstelle dem Immunsystem aus und erlaubt diesem, eine Immunantwort gegen diese kritische Region auszulösen (18). Ein anderer Vorteil des mutierten HIV-1-gp120- Hüllglykoproteins als Immungen besteht darin, daß es eine wesentlich verringerte Affinität zum CD4 der Zelloberfläche hat. Eine wirkungsvolle humorale Immunantwort hängt von der Bindung des Antigens an B-Zellen-Oberflächenimmunglobulin ab. Die Anwesenheit des hoch affinen CD4-Rezeptors auf einer großen Zahl von Körperzellen kann die Fähigkeit des nativen gp120, eine wirkungsvolle humorale Immunantwort auszulösen, erheblich verringern. Der Sinn einer Mutierung von gp120 an der CD4-Bindungsstelle liegt darin, das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein von der Zelloberflächen-CD4 weg- und zu den immunglobulintragenden B-Zellen hinzuziehen, und somit dem Immunsystem zu ermöglichen, eine Antwort unter anderem gegen die CD4-Bindungsstelle auszulösen.

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30) Shiow-Her, C., et al., (1992) J. of Cellular Biochem, Supplement 16E, Abstract Q105

Sequenzprotokoll

(1) Allgemeine Information
(i) Anmelder: Progenics Pharmaceuticals, Inc.
(ii) Titel der Erfindung: Impfstoffe gegen HIV-1; damit zusammenhängende Antikörperzusammensetzungen, und therapeutische und prophylaktische Verwendungen davon
(iii) Anzahl der Sequenzen: 29
(iv) Korrespondenzanschrift:
(A) Adressat: Cooper & Dunham
(B) Straße: 30 Rockefeller Plaza
(C) Stadt: New York
(D) Bundesstaat: New York
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl : 10112
(v) Computerlesbare Form:
(A) Medium: Diskette
(B) Computer: IBM PC-kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn, Release # 1.24
(vi) Daten der vorliegenden Anmeldung:
(A) Anmeldenummer:
(B) Anmeldedatum:
(C) Klassifizierung:
(vii) Daten früherer Anmeldungen:
(A) Anmeldenummer: US 08/037.816
(B) Anmeldedatum: 26. März 1993
(viii) Daten zum Anwalt-/Vertreter:
(A) Name: White, John P.
(B) Registrierungsnummer: 28.678
(C) Referenz/Aktenzeichen 41190-A-PCT/JPW/AJM
(ix) Daten zur Fernmeldeverbindung
(A) Telefon: (212) 977-9550
(B) Telefax: (212) 664-0525
Telex: 422523 COOPUI
(2) Information zur SEQ ID Nr. 1
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 45 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 1:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 2
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 45 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 2:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 3
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 45 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 45 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
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(D) Topologie: linear
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 36 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch) (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 5:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 6
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 36 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 39 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 33 Basenpaare
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(i) Sequenzmerkmale:
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(B) Typ: Nucleinsäure
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 29 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 29 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 3125 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
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(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Eigenschaft
(A) Name/Schlüssel: CDS
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(B) Typ: Aminosäure
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 1532 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
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(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Eigenschaft
(B) Name/Schlüssel: CDS
(C) Lage: 1...1522
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 507 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
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(i) Sequenzmerkmale:
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(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Eigenschaft
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 1...1474
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 491 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 1448 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
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(ix) Eigenschaft
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 1...1439
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(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 479 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
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(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 20:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 21
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 1484 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Eigenschaft
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 1...1454
(D) Weitere Informationen: (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 21:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 22
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 484 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
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(2) Information zur SEQ ID Nr. 23
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 1448 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
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(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Eigenschaft
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 1...1438
(C) Weitere Informationen: (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 23:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 24
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 479 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
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(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 24:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 25
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 1571 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(S) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(ix) Eigenschaft
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 1...1567
(D) Weitere Informationen: (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 25:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 26
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 522 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 26:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 27
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 1532 Basenpaare
(B) Typ: Nucleinsäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: DNA (genomisch)
(iii) Eigenschaft
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Lage: 1...1522
(D) Weitere Informationen: (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 27:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 28
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 507 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 28:
(2) Information zur SEQ ID Nr. 29
(i) Sequenzmerkmale:
(A) Länge: 15 Aminosäuren
(B) Typ: Aminosäure
(C) Strangform: Einzelstrang
(D) Topologie: linear
(ii) Molekültyp: Protein (iii) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 29

Claims

1. Rekombinante Nucleinsäure, die ein mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein codiert, umfassend:

(1) eine V3-Loop-Deletion, gekennzeichnet durch die Deletion eines oder mehrerer Aminosäurerests/Aminosäurereste zwischen den terminalen Cysteinresten des V3-Loops, mit der Maßgabe, dass zumindest 3 Aminosäurereste zwischen den terminalen Cysteinresten in einer V3-Loop-Deletion sind; und

(2) eine C4-Domänen(W-X)-Punktmutation, wobei W ein konservierter Tryptophanrest und X ein anderer Aminosäurerest als Tryptophan ist.

2. Rekombinante Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei X ein Valinrest ist.

3. Rekombinante Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei die C4-Domäne eine HIV-1LAI-gp120-Hüllglykoprotein-C4-Domäne ist.

4. Rekombinante Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein ein mutiertes HIV-1JR-FL-gp120- Hüllglykoprotein ist.

5. Rekombinante Nucleinsäure nach Anspruch 1 oder 2, wobei die C4-Domäne eine HIV-1JR-FL-gp120-Hüllglykoprotein-C4-Domäne ist.

6. Rekombinante Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 5, wobei das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein ein mutiertes HIV-1JR-FL-gp120- Hüllglykoprotein ist.

7. Rekombinante Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Nucleinsäure ein DNA-Molekül ist.

8. Rekombinante Nucleinsäure nach Anspruch 7, wobei die DNA ein Plasmid ist.

9. Rekombinante Nucleinsäure nach Anspruch 8, wobei das Plasmid PPI4-tPA- gp120LAI (ATCC 75431) oder PPI4-tPA-gp120JR-FL (ATCC 75432) ist.

10. Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transfiziert ist, der die rekombinante Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst.

11. Wirtszelle nach Anspruch 10, die eine Säugerzelle ist.

12. Verfahren zur Herstellung von mutiertem HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein, umfassend:

(a) Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 10 oder 11 unter Bedingungen, so dass das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein produziert wird; und

(b) Gewinnen des so produzierten mutierten HIV-1-gp120- Hüllglykoproteins.

13. Mutiertes HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein, das von der rekombinanten Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 9 codiert wird oder durch das Verfahren nach Anspruch 12 erhalten wird.

14. Arzneimittel, umfassend das mutierte HIV-1-gp120-Hüllglykoprotein nach Anspruch 13 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

15. Mittel nach Anspruch 14, das ein Impfstoff ist, umfassend eine therapeutisch wirksame Menge des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins und ein Adjuvans.

16. Mittel nach Anspruch 14, das ein Impfstoff ist, umfassend eine prophylaktisch wirksame Menge des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins und ein Adjuvans.

17. Antikörper, der spezifisch an die CD-4-Bindungsdomäne des mutierten HIV-1- gp120-Hüllglykoproteins nach Anspruch 13 bindet, aber nicht an die CD4- Bindungsdomäne eines nicht-mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins bindet.

18. Verfahren zum Erhalten teilweise gereinigter Antikörper gemäß der Definition in Anspruch 17, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Immunisieren eines nicht-HIV-1-exponierten Individuums mit dem Mittel nach Anspruch 14 oder 15;

(b) Gewinnen von Serum, das die Antikörper umfasst, von dem immunisierten Individuum; und

(c) teilweises Reinigen der Antikörper;

dabei Erhalten von teilweise gereinigten Antikörpern, die spezifisch an die CD- 4-Bindungsdomäne des HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins binden, aber nicht an die CD-4-Bindungsdomäne eines nicht-mutierten HIV-1-gp120- Hüllglykoproteins binden.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Individuum ein Mensch ist.

20. Antikörper, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 18 oder 19.

21. Arzneimittel, das die Antikörper nach Anspruch 17 oder 20 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.

22. Verwendung des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins nach Anspruch 13 oder der Antikörper nach Anspruch 17 oder 20 zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines HIV-1-infizierten Individuums durch Reduzieren der Population von HIV-1-infizierten Zellen in dem HIV-1- infizierten Individuum.

23. Verwendung des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins nach Anspruch 13 oder der Antikörper nach Anspruch 17 oder 20 zur Herstellung eines Medikaments zum Behandeln eines HIV-1-infizierten Individuums durch Reduzieren der Population von HIV-1 in dem HIV-1-infizierten Individuum.

24. Verwendung des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins nach Anspruch 13 oder der Antikörper nach Anspruch 17 oder 20 zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Wahrscheinlichkeit eines HIV-1- exponierten Individuums mit HIV-1 infiziert zu werden, durch Reduzieren der Population von HIV-1 in dem HIV 1-exponierten Individuum.

25. Verwendung des mutierten HIV-1-gp120-Hüllglykoproteins nach Anspruch 13 oder der Antikörper nach Anspruch 17 oder 20 zur Herstellung eines Medikaments zum Reduzieren der Wahrscheinlichkeit eines nicht-HIV-1- exponierten Individuums, mit HIV-1 während eines zukünftigen Ereignisses infiziert zu werden, bei dem ein erhöhtes Risiko der Exposition mit HIV-1 besteht, durch Reduzieren der Population von HIV-1, mit der das Subjekt exponiert ist.

26. Rekombinante Nucleinsäure nach Anspruche 1, wobei das mutierte HIV-1- gp120-Hüllglykoprotein außerdem eine V1- und/oder eine V2-Loop-Deletion umfasst.