DE10249903B4

DE10249903B4 - Mechanischer Bioreaktor

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Publication number: DE10249903B4
Application number: DE2002149903
Authority: DE
Inventors: Michael Prof. Dr. Winkler; Wolfgang Dipl.-Ing. Schüttler; Jörg Viering; Ralph Dr. Lorenz
Original assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Current assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Priority date: 2002-10-22
Filing date: 2002-10-22
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2022-10-23
Also published as: DE10249903A1

Abstract

Bioreaktor zum Kultivieren von Zellen enthaltend mindestens eine die Zellen tragende elastische Membran (10) und eine Kammer (30) zur Aufnahme der Membran, dadurch gekennzeichnet, dass die elastische Membran durch Druckbeaufschlagung eines durch die Membran (10) und die Kammer (30) abgeschlossenen Volumens (31) auslenkbar ist und ein Sensorsystem (50) zur Messung der Auslenkung der elastischen Membran (10) vorgesehen ist.

Description

Die Erfindung betrifft einen Bioreaktor zum Kultivieren von Zellen unter mechanischer Dehnungsbeanspruchung, die Verwendung des erfindungsgemäßen Bioreaktors zur Kultivierung von Zellen unter mechanischer Beanspruchung sowie Verfahren zur Gewinnung von unter mechanischer Dehnungsbeanspruchung kultivierten Zellen und Geweben und ihre Verwendung als biologisches Ersatzgewebe, insbesondere als autologe oder allogene Transplantate.
Die Erfindung betrifft das technische Gebiet des sogenannten "Tissue Engineering" zur Herstellung künstlicher Binde-, Muskel- oder Epithelgeweben sowie weiteren kultivierbaren Geweben auf der Basis von isolierten, kultivierten Zellen und mit Hilfe verschiedener Biomatrices außerhalb des Körpers.
Es ist bekannt, die kultivierten Zellen beziehungsweise Zell-Gewebe-Konstrukte beispielsweise zur Defektdeckung in den tierischen oder menschlichen Körper zu implantieren. Schwerpunkte des Tissue Engineering sind zum einen die Herstellung räumlich definierter Gewebe und organoider Strukturen für die Implantation, zum anderen aber auch die Bereitstellung dieser Gewebe in mechanisch beanspruchbaren Ausführungen, nicht zuletzt, damit diese den im tierischen oder menschlichen Körper auftretenden und mechanischen Belastungen auch ohne zusätzliche, beispielsweise biologisch inerte, alloplastische Stützmatrices dauerhaft widerstehen können.
Allgemein werden für die Herstellung transplantierbarer Gewebe meist körpereigene Zellen (autologe Transplantate) oder aber auch körperfremde Zellen tierischen oder humanen Ursprungs (allogene Transplantate) auf geeignete Matrices aufgebracht und kultiviert, wobei normalerweise ihre Proliferation und/oder Differenzierung sowie ihre dreidimensionale Ausbreitung gesteuert wird, um einen vitalen und funktionalen Gewebeersatz zu fertigen. Dabei ist bekannt, dass ein positiver Einfluss von in vitro applizierten mechanischen Beanspruchungen auf die Proliferations- und Syntheserate sowie auf die Zell zu Zell- und die Zell zu Matrix-Interaktion primärer Zellen besteht (Zhuang et al. Circ. Res. (2000) 87(4):316–322). Nachgewiesen ist dieser Effekt für adulte Fibroblasten sowie für Kardiomyocyten, Myocyten, Keratinocyten, Chondrocyten (Mauck et al. J. Biomech. Eng. (2000) 122(3):252–260) und Endothelzellen, welche sowohl auf synthetischen als auch auf biologischen Matrices kultiviert werden.
Bei mechanischen Beanspruchungen, die auf zu kultivierende Zellen ausgeübt werden können, sind verschiedene Belastungstypen zu unterscheiden:

1. Bei der Scherbeanspruchung kommt es über eine an den Zellen im Wesentlichen tangential angreifende Tangentialspannung zu einer Scherung, das heißt zu einer Verschiebung der Zellen in sich, wobei beispielsweise – vereinfacht dargestellt – die "Oberseite" einer Zelle zu der ihr gegenüber liegenden "Unterseite", welche beispielsweise auf einem Sub strat haftet, im Wesentlichen parallel verschoben wird.
2. Im Gegensatz dazu werden bei der Dehnungsbeziehungsweise Stauchungsbeanspruchung die Zellen durch eine im Wesentlichen auf die Zelloberfläche senkrecht wirkende Normalspannung im Ganzen gestaucht beziehungsweise gedehnt.

Im Bereich des kardiovaskulären Tissue Engineering wird insbesondere eine pulsatile Scherbeanspruchung verwendet, um bei den kultivierten Endothel- oder glatten Muskelzellen in einer dem Körperkreislauf nachempfundenen Beanspruchung durch pulsierend strömendes Blut zu simulieren (Mitchell et al. IEEE Trans. Biomed. Eng. (2001) 48(2):268–273; Sodian et al. J. Biomed. Mater. Res. 2001) 58(4):401–405). Es ist auch bekannt, dass zur Generierung funktioneller, mechanisch belasteter Gewebe des Bewegungs- und Halteapparates, das heißt von Sehnen, Muskeln oder Knorpeln, die mechanische Beanspruchung in Form einer Stauchungs- oder Dehnungsbeanspruchung durch Druck- oder Zugkräfte die de novo-Synthese extrazellulärer Matrixkomponenten, das heißt kollagener und elastischer Fasern, sowie die Zellteilung verbessert und beschleunigt werden kann (Zhuang et al. Circ. Res. (2000) 87(4):316-322; Fauza et al. J. Pediatr. Surg. (2001) 36(1):146–151; Zeichen et al. Am. J. Sports. Med. (2000) 28(6):888–892.
Es besteht daher die Notwendigkeit, Vorrichtungen zur Kultivierung dieser Gewebe, insbesondere Bioreaktoren, zu entwickeln, welche die zu kultivieren den Zellen und/oder Gewebe einer mechanischen Belastung -entsprechend einer im späteren Zielort der Transplantation vorherrschenden mechanischen Situation- aussetzen.
Aus der DE 10053014 A1 ist ein Verfahren zur in vitro-Herstellung von vitalem, biologischem Ersatzgewebe unter Verwendung eines Bioreaktors bekannt, wobei ein eingespanntes Gewebestück wiederkehrend mechanisch beaufschlagt wird, so dass eine Zellkulturflüssigkeit an der einen Oberfläche des eingespannten Gewebestücks entlang strömt und durch den pulsatilen Fluss der Flüssigkeit eine Scherbeanspruchung der sich an der einen Oberfläche des Zell-Gewebe-Konstrukts befindlichen Zellen erreicht wird. Zusätzlich wird durch die Druckbeaufschlagung der einen Seite des eingespannten Gewebestücks durch die einströmende Flüssigkeit das Gewebestück in unkontrollierter Weise gedehnt, um eventuell die Windkesselfunktion der elastischen zentralen Arterien zu simulieren. Dieses Verfahren beziehungsweise diese Vorrichtung eignet sich lediglich für die Kultivierung von Gewebestücken von Herzmuskel- beziehungsweise Gefäßgewebe.
Aus Zeichen et al. (Am. J. Sports. Med. (2000) 28(6):888–892) ist eine Vorrichtung zur Kultivierung von isolierten Fibroblasten beschrieben: Rechteckige Kulturkammern aus Silikon nehmen die Fibroblastenkulturen auf und eine elektromechanische Vorrichtung übt wiederkehrende Zugkräfte auf die elastischen Silikonkammern aus. Die dabei auf die Fibroblastenkulturen ausgeübte mechanische Be anspruchung besteht in einer eindimensionalen, das heißt biaxialen, Dehnungsbeanspruchung.
Eine ähnliche lineare, das heißt eindimensionale, biaxiale, Dehnungsbeanspruchung wird durch die in Zhuang et al. (Circ. Res. (2000) 87:316–322) zur Kultivierung von isolierten ventrikulären Myozyten in konfluenten Einzellschichten auf Silikonmembranen beschrieben.
Aus Fauza et al. (J. Pediatr. Surg. (2001) 36:146–151) ist eine Vorrichtung zur Kultivierung von fötalen Myoblasten in einem Kollagenhydrogel bekannt, wobei das mit den Myoblasten besiedelte Hydrogel in eine kreisrunde Silikonform gegossen wird. Durch die mechanischen Bedingungen beim Erkalten werden die Myoblasten einer radialen, das heißt strahlenförmigen, zweidimensionalen, andauernden, Dehnung unterzogen.
Derzeit werden in Deutschland jährlich cirka 150.000 operative Verschlüsse von Leistenbrüchen (Herniotomien) durchgeführt. Bei etwa 30 bis 50 dieser Eingriffe, insbesondere bei Re-Operationen, kommen zur Defektdeckung meist Netze aus alloplastischen Materialien wie Prolene^® oder Vicryl^® zum Einsatz. Weiterhin finden diese Netze Verwendung bei Verschluss der Bauchdecken nach Transplantationen relativ großer adulter Organe in relativ kleine kindliche Empfänger. Es ist jedoch bekannt, dass diese Netze im Empfängerorganismus zu schmerzhaften Fremdkörperreaktionen, zu Strikturen der Samenleiter, zu entzündlichen Veränderungen der Leistengegend und konsekutiv zu Nahtrupturen mit einem Wiederauftreten (Rezidiv) des Leistenbruchs führen können.
Es besteht daher der Wunsch, mechanisch stabile und vital rebesiedelte, sowohl autologe als auch allogene Transplantate bereitzustellen. Insbesondere autologe Transplantate würden aufgrund der Verwendung empfängereigener mesenchymaler Zellen kein antigenes Potential besitzen. Auch wäre eine Fremdkörperreaktion des Empfängers gegen die transplantierten Faszien wegen des möglichen Verzichts auf alloplastische Materialien nicht zu erwarten. Leider stehen zur Zeit keine Vorrichtungen, insbesondere Bioreaktoren, zur Verfügung, die zu befriedigenden Ergebnissen bei der Generierung von derartigen mechanisch stabilen Transplantaten führen. Keine der vorgenannten Vorrichtungen zur Kultivierung von Zellen unter mechanischer Beanspruchung genügt den Anforderungen, die an einen Bioreaktor zur Generierung solcher Transplantate idealer Weise gestellt werden.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Mittel zur Kultivierung von Zellen unter mechanischer Dehnungsbeanspruchung bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch einen Bioreaktor zum Kultivieren von Zellen unter mechanischer Dehnungsbeanspruchung mit einer Kammer zur Aufnahme von mindestens einer die Zellen tragenden elastischen Membran, wobei der Bioreaktor dadurch gekennzeichnet ist, dass die elastische Membran durch auf die elastische Membran einwirkende Druckbeaufschlagung eines durch die mindestens eine elastische Membran (10) und die Kammer (30) abgeschlossenen Volumens (31) auslenkbar ist und ein Sensorsystem (50) zur Messung der Auslenkung der elastischen Membran (10) vorgesehen ist.
Insbesondere ist in bevorzugter Ausführung der erfindungsgemäßen einen Kammer (30) eine zweite Kammer (20) zugeordnet, welche zusammen mit der elastischen Membran (10) ein Volumen (21) auf der dem Volumen (31) abgewandten, insbesondere gegenüberliegenden, Seite der Membran (10) abschließt, wobei die beiden Volumina durch die zwischen ihnen liegende Membran getrennt sind. Das durch die mindestens eine elastische Membran (10) und die Kammer (20) abgeschlossene Volumen (21) und/oder das durch die elastische Membran (10) und die Kammer (30) abgeschlossene Volumen (31) ist bevorzugt mit mindestens einem Druckantrieb verbunden.
Die kultivierten Zellen, welche an der elastischen Membran (10) angeordnet sind, werden durch die erfindungsgemäß vorgesehene Art der Auslenkung der elastischen Membran, nämlich durch eine Beaufschlagung mit einer auf die Oberfläche der elastischen Membran senkrecht wirkenden bevorzugt pneumatischen und/oder hydraulischen Druckkraft, welche zu einer Auslenkung der elastischen Membran hauptsächlich in Form einer Auswölbung führt, multiaxial, das heißt zweidimensional, beansprucht, das heißt gedehnt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der erfindungsgemäße Bioreaktor mit mindestens einem Sensorsystem (50) zur Aufnahme, das heißt Messung, der durch die Druckbeaufschlagung bedingten Auslenkung der mindestens einen elastischen Membran (10) ausgestattet, insbesondere ist das Sensorsystem mit dem Bioreaktor mechanisch verbunden, besonders bevorzugt dort eingebaut. Dadurch kann vorteilhafterweise erreicht werden, dass die unter mechanischer Dehnungsbeanspruchung kultivierten und insbesondere für die Generierung sowohl autologer als auch allogener Transplantate vorgesehenen Zellen, die an der mindestens einen elastischen Membran des Bioreaktors angeordnet sind, einer äußerst genau dosierten Dehnungsbeanspruchung ausgesetzt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Bioreaktor können zelluläre vitale und mechanisch besonders stabile Implantate für die Transplantation generiert werden, da die kultivierten Zellen in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor entsprechend ihrer (vorher bestimmten) maximalen Dehnbarkeit belastet werden. Beispielsweise im Falle von darin kultivierten Faszientransplantaten, welche normalerweise für die Implantation in die Bauchwand dienen und die hauptsächlich aus Fibroblasten und mehreren übereinanderliegenden kollagenen Faserbündeln (Kollagen I und III) sowie wenigen elastischen Faserbündeln bestehen, können die kollagenen Fasern zu maximal 7 bis 12 %, die elastischen Fasern zu maximal 150 % gedehnt werden. Die im erfindungsgemäßen Bioreaktor bevorzugt generierten Faszientransplantate halten deshalb beispielsweise nach Implantation in die Bauchwand den dort herrschenden mechanischen Belastungen, insbesondere die durch die physiologische Atemmechanik und die Peristaltik ausgeübten multiaxialen Druck- und Zugkräfte stand.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer „Kammer" ein Gehäuse oder Gehäuseteil verstanden, welches ein Volumen vollständig oder teilweise um- beziehungsweise einschließt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter dem Begriff "zu kultivierende Zellen" oder "Zellen" einzelne Zellen, aber auch Zellverbände, Gewebe, Zell-Gewebe-Konstrukte, Einzellschichten (Monolayer) sowie Mehrzellschichten, verstanden, wobei unter dem Begriff "Gewebe" ein Verband von Zellen gleichartiger Differenzierung und deren Interzellularsubstanz wie kollagene Fasern, elastische Fasern oder argyrophile Fasern wie Epithel-, Binde-, Stütz-, Muskel-, Nerven- oder Gliagewebe und Blut verstanden werden. Derartige Zellen können gesunde, kranke, zum Beispiel entartete, und/oder gentechnisch veränderte Zellen sein. Derartige Zellen können auch spezifische Zellen sein, die von pluripotenten oder quasi pluripotenten Stammzellen oder stammzellähnlichen Zellen abgeleitet werden, insbesondere Zellen, welche mindestens eine Eigenschaft von Knorpelzellen, Chondrozyten, Osteoblasten oder Osteozyten zeigen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist mindestens ein Volumen (21) und/oder (31) mit Flüssigkeit, insbesondere mit einem Zellkulturmedium, gefüllt, was mit den kultivierten Zellen, die an der mindestens einen die Zellen tragenden elastischen Membran (10) angeordnet sind, in Kontakt steht. Bevorzugt wird die durch die erfindungsgemäße Druckbeaufschlagung ausgelenkte elastische Membran in das flüssigkeitsgefüllte Volumen hinein auf gewölbt, wodurch es durch mechanische Wechselbewegung der elastischen Membran zu einem Ein- beziehungsweise Ausströmen der Flüssigkeit, insbesondere des Zellkulturmediums, kommt. Bevorzugt ist dabei an der zusammen mit der elastischen Membran (10) das flüssigkeitsgefüllte Volumen bildende Kammer mindestens eine Ein- beziehungsweise Austrittsöffnung zum Wechsel der Flüssigkeit angebracht, die insbesondere mit einem Vorratsgefäß in Verbindung steht.
In einer Variante dieser Ausführungsform erfolgt die Druckbeaufschlagung der mindestens einen elastischen Membran durch Druckerhöhung beziehungsweise Druckverminderung in dem mindestens einen mit Flüssigkeit gefüllten Volumen des erfindungsgemäßen Bioreaktors, welches besonders bevorzugt mit einem, insbesondere hydraulischen, Druckantrieb in Verbindung steht. In einer Variante sind dabei beide Volumina des erfindungsgemäß bevorzugten Bioreaktors, das heißt das Volumen auf der einen Seite der elastischen Membran sowie das Volumen auf deren anderen Seite mit Flüssigkeit gefüllt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das in dem erfindungsgemäß bevorzugten Bioreaktor dem flüssigkeitsgefüllten Volumen der ersten Kammer gegenüberliegende Volumen der zweiten Kammer luftgefüllt, wobei insbesondere die Druckerhöhung beziehungsweise Druckverminderung in dem luftgefüllten Volumen geeignet ist, die Druckbeaufschlagung der elastischen Membran und damit ihre Auslenkung zu verursachen. Bevorzugt steht das durch die zweite Kammer und die elastische Membran gebildete luftgefüllte Volumen mit einem, insbesondere pneumatischen, Druckantrieb in Verbindung. Bevorzugt weist der Bioreaktor mindestes eine an dieser Kammer angeordnete Ein- beziehungsweise Auslassöffnung auf. In einer besonders bevorzugten Variante ist das flüssigkeitgefüllte Volumen Teil eines geschlossenen Kreislaufsystems, wodurch ein kontinuierlicher Zu- und Abfluss von Nährmedium in dem Bioreaktor gegeben ist. Durch die bevorzugte Anwendung eines geschlossenen Kreislaufsystems kann über einen langen Zeitraum eine gleichbleibend hohe Sterilität des Systems erreicht werden, da ein Öffnen des Bioreaktors zum Wechsel des Nährmediums entfällt.
Erfindungsgemäß bevorzugt umfasst die mindestens eine elastische Membran der vorgenannten Bioreaktoren ein biologisch inertes elastisches Material, insbesondere ist eine Membran aus einem künstlichen oder natürlichen Polymer oder besteht aus diesem. In einer weiteren Ausführungsform stellt die elastische Membran eine biologische Matrix dar. Im Falle, dass lediglich ein Volumen flüssigkeitsgefüllt ist, sind die zu kultivierenden Zellen auf der der Flüssigkeit zugewandten Seite der elastischen Membran angeordnet und die elastische aus Polymermaterial ausgebildete Membran ist vorzugsweise wasser- und insbesondere wasserdampfdicht. Bevorzugt wird eine elastische Silikonmembran eingesetzt. Die Membran kann aber auch aus anderen elastischen Materialien bestehen. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden die Zellen nicht direkt an der elastischen Membran angeordnet, sondern auf oder in einer zusätzlich zur vorgenannten Membran vorhandenen biologischen Matrix ausgesät, eventuell vorkultiviert und dann zusammen mit der biologischen Matrix auf die elastische Membran verbracht. Die biologische Matrix ist dabei in bevorzugter Ausführung eine Kollagenmatrix, bevorzugt eine azellularisierte Kollagenmatrix.
Im Falle, dass beide Volumen des erfindungsgemäß bevorzugten Bioreaktors mit Flüssigkeit gefüllt sind, besteht die elastische Membran bevorzugt aus einer gasdurchlässigen und insbesondere semipermeablen Membran, insbesondere einer biologischen, elastischen Matrix, insbesondere bevorzugt einer Kollagenmatrix. Die zu kultivierenden Zellen werden bevorzugt direkt auf diese biologische Matrix ausgesät.
Die Matrix und/oder Polymer-Membran kann ein- oder beidseitig mit den zu kultivierenden Zellen versehen sein, insbesondere bewachsen. Die Matrix und/oder Polymer-Membran kann ein- oder beidseitig eine dichte oder poröse Struktur aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform besitzt der erfindungsgemäße Bioreaktor einen zum Beispiel einoder zweistückig ausgebildeten Halterahmen zur Fixierung der mindestens einen elastischen Membran, wobei insbesondere die mindestens eine elastische Membran zwischen zwei Hälften des Halterahmens bevorzugt in ihrem Randbereich eingespannt wird; dieser wird in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor angeordnet.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist die elastische Membran kreisrund ausgeführt und weist dabei einen Durchmesser von bevorzugt 20 bis 100 mm, besonders bevorzugt von 30 bis 60 mm, auf. Selbstverständlich kann auch eine von der Kreisform abweichende Form, insbesondere eine rechteckige oder symmetrisch vieleckige Form, gewählt werden, wobei die Abmessungen der von der Kreisform abweichenden Ausführungen entsprechend den Abmessungen der Kreisform gewählt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt besitzt die elastische Membran mit den vorgenannten Abmessungen eine Dicke von 0,1 bis 1,5 mm, bevorzugt von 0,2 bis 1,0 mm. Normalerweise besitzt eine die zu kultivierenden Zellen tragende biologische Matrix, insbesondere Kollagenmatrix, welche erfindungsgemäß bevorzugt an der elastischen Membran fixiert wird, an die elastische Membran angepasste Abmessungen, normalerweise eine Dicke von etwa 90 bis 300 μm, bevorzugt von etwa 100 μm. Wird die biologische Matrix direkt, das heißt ohne eine stützende biologisch inerte elastische Membran eingespannt, wird eine Dicke der biologischen Matrix, insbesondere Kollagenmatrix, von etwa 600 bis 1500 μm, insbesondere von etwa 800 bis 1000 μm bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zur Aufnahme der zu kultivierenden Zellen vorgesehene biologische Matrix eine azellularisierte Kollagenmatrix, die in an sich bekannter Weise aus geeignetem Gewebe gewonnen werden kann. In einer besonders bevorzugten Variante besteht die Kollagenmatrix aus durch mechanische und enzymatische Behandlung azellularisierter, das heißt von sämtlichen Zellbe standteilen und Schleimhäuten befreiter, Darmwand porcinen Ursprungs.
Erfindungsgemäß ist dem Bioreaktor ein Druckantrieb zugeordnet, welcher mit mindestens einem Volumen des erfindungsgemäßen Bioreaktors in Verbindung steht. In einer Variante steht der Druckantrieb über mindestens einen Zugang (32) mit dem Volumen (31) in Verbindung; in einer weiteren Variante steht der Druckantrieb zusätzlich oder ausschließlich über den mindestens einen Zugang (22) mit dem Volumen (21) in Verbindung. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Druckantrieb mindestens ein Ventil auf, welches mit einer Druckvorlage und/oder einem Unterdruckspeicher in Verbindung steht und das mindestens eine Ventil ein Mehrwegeventil ist, welches die oder das Volumen (21) und/oder (31) wahlweise mit der Druckvorlage oder mit einer druckausgleichenden Entlüftung in Verbindung bringt.
Die Druckbeaufschlagung beträgt dabei, abhängig von der beabsichtigten Auslenkung, das heißt Dehnungsbeanspruchung, maximal 80 mmHg über Normaldruck. In einer Variante besteht die Druckbeaufschlagung im Anlegen eines Unterdrucks von maximal 80 mmHg unter Normaldruck. Selbstverständlich kann die Druckbeaufschlagung auch einen höheren Betrag aufweisen, wenn dies für die individuelle vorgesehene Aufgabe des Bioreaktors notwendig erscheint.
In einer besonders bevorzugten Variante des Druckantriebs wird über ein Steuermodul das Signal des bevorzugt dem erfindungsgemäßen Bioreaktor zugeordneten Sensorsystems (50) die über den Druckantrieb bewirkte Druckbeaufschlagung und damit Auslenkung der elastischen Membran begrenzt, sobald eine vordefinierte, das heißt eingestellte, Auslenkung der elastischen Membran durch die Druckbeaufschlagung erreicht worden ist. Auf diese Weise kann mittels der erfindungsgemäß bevorzugten Anordnung aus Bioreaktor, Sensorsystem und Druckantrieb eine exakt kontrollierte Dehnung des im Bioreaktor kultivierten Zellmaterials, insbesondere die Begrenzung der maximalen Dehnung durch Begrenzung der maximalen Auslenkung erreicht werden. Dadurch ist es möglich, die für die Transplantation vorgesehenen Zellen genau denjenigen mechanischen Beanspruchungen auszusetzen, denen sie auch nach Transplantation in dem tierischen oder menschlichen Organismus an Ort und Stelle ausgesetzt sind. Durch die kontrolliert zu dosierende mechanische Beanspruchung sind die mit der erfindungsgemäß bevorzugten Vorrichtung kultivierten mechanisch beanspruchten Zellen gegenüber den mit bekannten Verfahren generierten Zellen nach Transplantation deutlich mechanisch stabiler und haltbarer und kommen insbesondere ohne zusätzliche, ohne synthetische oder biologische Stützmatrices aus.
In einer besonders bevorzugten Variante besteht das zugeordnete Sensorsystem zur Ermittlung beziehungsweise Aufnahme der Auslenkung der elastischen Membran aus einem induktiven Wegstreckenaufnehmer, welcher mechanisch in an sich bekannter Weise an die elastische Membran gekoppelt ist. Insbesondere beinhaltet das Sensorsystem einen Stempel (51), welcher in körperlichem Kontakt mit der elastischen Membran (10) steht, welcher der durch die Druckbe aufschlagung erwirkte Auslenkung der Membran folgt. Das von dem Sensorsystem (50) erzeugte Signal wird insbesondere auf elektrischem Wege an die Steuerung des Druckantriebs übertragen und enthält Informationen über die Größe, das heißt Amplitude, der Auslenkung der Membran. Selbstverständlich ist auch vorgesehen, alternative Sensorsysteme einzusetzen, die dem Fachmann geeignet erscheinen, die Auslenkung der elastischen Membran zu bestimmen. Dies sind insbesondere kapazitive oder induktive Wegaufnehmer, welche bevorzugt berührungslos die Auslenkung der elastischen Membran messen, sowie photooptische Messsysteme zur Positionsbestimmung.
In einer bevorzugten Variante ist der dem erfindungsgemäß bevorzugten Bioreaktor zugeordnete Druckantrieb mit einem Steuerungsmodul, insbesondere einem Taktgenerator, zur periodischen, wiederholten Druckbeaufschlagung der im Bioreaktor angeordneten elastischen Membran ausgestattet. Dadurch ist es möglich, eine pulsatile Be- und Entlastung der Dehnungsbeanspruchung der kultivierten Zellen durchzuführen, wobei bevorzugt eine Frequenz von 10 mHz bis 60 Hz, besonders bevorzugt von 100 mHz bis 10 Hz, eingesetzt wird. In einer vorteilhaften Ausführung ist ein Wechsel von kontinuierlichen, das heißt konstanten, und diskontinuierlichen, das heißt periodisch wiederholten, Belastungsphasen vorgesehen. Dadurch kann ein physiologisches, der Empfängersituation entsprechendes Belastungsprofil erzeugt werden. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die mit einer diskontinuierlichen Dehnungsbeanspruchung beaufschlagten Zellen eine erhöhte mechanische Stabilität gegenüber Zellen auf weisen, die einer kontinuierlichen Dehnungsbeanspruchung ausgesetzt waren.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Druckantrieb zusätzlich mit einer Drossel, bevorzugt in der Druckbeziehungsweise Verbindungsleitung zwischen dem vorgenannten Ventil und dem druckbeaufschlagten Volumen des Bioreaktors, versehen, um die Geschwindigkeit des Druckanstiegs beziehungsweise des Druckabfalls in dem Volumen des Bioreaktors zu regulieren. Besonders bevorzugt wird über einen im System angeordneten Drucksensor zusätzlich der Druckverlauf in dem mit Druck beaufschlagten Volumen kontinuierlich gemessen und insbesondere zur Kompensation von Druckschwankungen und Nichtlinearitäten eingesetzt, mit dem Ziel, den Vorgang der Auslenkung, hauptsächlich dessen zeitlicher Verlauf, der Auslenkung der im Reaktor angeordneten elastischen Membran beziehungsweise der mechanischen Dehnungsbeanspruchung der auf der elastischen Membran angeordneten Zellen zu kontrollieren. In einer besonders bevorzugten Variante können folgende Parameter eingestellt werden: Die maximale Auslenkung der Membran, die Haltedauer der maximalen Auslenkung, die minimale Auslenkung der Membran, die Haltedauer der minimalen Auslenkung, die Zeit bis zum Erreichen der maximalen Auslenkung (Ausdehnungsphase), die Zeit bis zum Erreichen der minimalen Ausdehnung (Entspannungsphase) sowie dadurch bedingt die Frequenz der wiederkehrenden beziehungsweise periodischen Dehnungsbeanspruchung. Selbstverständlich sind sowohl symmetrische als auch asymmetrische Verläufe der Auslenkung der elastischen Membran beziehungsweise der Dehnungsbe anspruchung der kultivierten Zellen vorgesehen. Die maximale Dehnung wird dabei normalerweise in einem Bereich von 3 bis 15% variiert.
In diesem Zusammenhang wird die Dehnung der auf der elastischen Membran angeordneten Zellen über die Differenz der Position der am weitesten ausgelenkten Stelle (Scheitelpunkt) der elastischen Membran unter maximaler Druckbeaufschlagung und der Position dieser Stelle bei minimaler Auslenkung bei minimaler Druckbeaufschlagung, im Verhältnis der Abmessung der aufgespannten elastischen Membran definiert. Als konkretes Beispiel führt die Auslenkung einer kreisrunden elastischen Membran mit einem Durchmesser von 30 mm aus dem entspannten Zustand (minimale Auslenkung) um eine Höhe von 6 mm, gemessen am Scheitelpunkt der ausgelenkten Membran (maximale Auslenkung), zu einer Dehnung der auf der elastischen Membran angeordneten Zellen um 10%.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der modulare Aufbau des vorgenannten Systems vorgesehen, welches eine beliebige Erweiterung erlaubt, so dass gruppenweise Bioreaktoren bestückt und mit unterschiedlichen Parametern zeitgleich betrieben werden können.
Der erfindungsgemäße Bioreaktor besteht bevorzugt aus hitzebeständigen Glas-, Metall- und/oder Kunststoff-Komponenten, so dass er nach jedem Gebrauch autoklaviert werden kann, oder umfasst diese Komponenten. Selbstverständlich sind zelltoxische Stoffe in den Komponenten des Reaktors nicht enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht der erfindungsgemäße Bioreaktor aus den Werkstoffen FPM (Fluorkautschuk) insbesondere in den Handelsformen DAI-EL^®, Fluorel^®, Tecnoflon^® oder Viton^®, sowie Silicon. In einem erfindungsgemäß bevorzugten Bioreaktor kommen in einer oberen Kammer, die bevorzugt mit Medium gefüllt ist, außerdem die Materialien PSU (Polysulfon), insbesondere in den Handelsformen Udel^® oder UltrasonS^®, sowie V2A und Glas zum Einsatz.
Die Verwendung des hier beschriebenen Bioreaktors ist für sämtliche Zellarten vorgesehen und sinnvoll, deren Kultur unter mechanischer Belastung zu verbesserten mechanischen Eigenschaften des durch die Kultivierung gewonnenen bioartifiziellen Gewebes führt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist daher vorgesehen, mit dem erfindungsgemäßen Bioreaktor Skelettmuskelzellen und Myofibroblasten für das Tissue Engineering von muskulären Strukturen sowie Chondrozyten und Osteoblasten für den bioartifiziellen Knochen- und Knorpelersatz sowie Endothelzellen zur intraluminären Besiedlung von Gefäßmatrices und Keratinozyten für einen mechanisch stabilen Hautersatz zu kultivieren. Auch werden aus Stammzellen differenzierte Zelltypen, insbesondere Fibroblasten, Chondrozyten oder Osteoblasten, bevorzugt in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor eingesetzt.
Beispielsweise sind dies primäre ortsständige, insbesondere aus porcinen Faszien der muskulären Bauchwand enzymatisch gewonnene, Fibroblasten für die Generierung autologer und mechanisch stabiler Faszientransplantate. Insbesondere deshalb, da die se unter definiertem physiologischem mechanischem Stress wesentliche Bestandteile der extrazellulären Matrix wie Procollagen I und III, Elastin, Proteoglycane, Laminin oder Fibronektin bilden und sich entsprechend der mit dem erfindungsgemäßen Bioreaktor vermittelten mechanischen Dehnung ausrichten und dadurch mechanisch stabilisiert werden. Im Falle der Generierung autologer und stabiler Faszientransplantate wird durch den erfindungsgemäßen Bioreaktor in besonders vorteilhafter Weise die für die Transplantation der in die Bauchwand oder in die Thoraxwand vorgesehenen Faszientransplantate benötigte radiäre, das heißt von zentral nach peripher gerichtete, multiaxiale Dehnung erzeugt.
In einer besonders bevorzugten Variante sind dies auch isolierte, insbesondere allogene, Knorpelzellen und/oder Osteoblasten, die bevorzugt, insbesondere durch externe Stimulation der Diffenzierung, aus Stammzellen oder stammzellenähnlichen Zellen des tierischen oder menschlichen Körpers gewonnen werden. Die kultivierten Zellen sind aufgrund der erfindungsgemäß vermittelten mechanischen Dehnungsbeanspruchung in der Lage, die erfindungsgemäß bevorzugte Kollagenmatrix als biologischer Träger der Zellen gleichmäßig und auch mehrschichtig zu infiltrieren. Besonders vorteilhaft führt die durch die kontrollierte mechanische Dehnungsbeanspruchung induzierte de novo-Synthese von Matrixproteinen in Verbindung mit einer mehrschichtigen Rebesiedlung der erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzten Kollagenmatrix zu wesentlich optimierten mechanischen Eigenschaften der kultivierten Zellen, insbesondere zur Generierung mechanisch besonders stabiler Transplantate.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Bioreaktor zum Kultivieren von Zellen, insbesondere von Skelettmuskelzellen, Myofibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, Endothelzellen, Keratinozyten und aus Stammzellen differenzierte Zelltypen, insbesondere Fibroblasten, Chondrozyten oder Osteoblasten, unter mechanischer Dehnungsbeanspruchung, welcher umfasst:

– eine erste Kammer (30) zur Aufnahme von mindestens einer die Zellen tragenden elastischen Membran (10),
– eine zweite Kammer (20), wobei die elastische Membran (10) zwischen der ersten und der zweiten Kammer angeordnet ist und in der ersten Kammer (30) ein Volumen (31) abschließt und auf der dem Volumen (31) abgewandten Seite der Membran (10) in der zweiten Kammer (20) ein zweites Volumen (21) abschließt, und zwar derart, dass die Membran (10) die beiden Kammern (20) und (30) und die durch die Kammern (20) beziehungsweise (30) und der elastischen Membran (10) abgeschlossenen Volumina (21) beziehungsweise (31) trennt,
– mindestens einen Druckantrieb zur Erzeugung einer Druckbeaufschlagung, das heißt einer Druckdifferenz zwischen den beiden Volumina (21) und (31), wobei der Druckantrieb mit mindestens einem der Volumen (21) oder (31) verbunden ist, sowie
– ein Sensorsystem (50) zur Aufnahme und bevorzugt exakten Kontrolle der Auslenkung der elastischen Membran beziehungsweise der mechanischen Dehnungsbeanspruchung der auf der elastischen Membran angeordneten Zellen, insbesondere durch Rückkopplung der Informationen der Auslenkung an ein dem Druckantrieb zugeordnetes Steuergerät.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der vorgenannten Bioreaktoren zur Kultivierung von Zellen, insbesondere von Skelettmuskelzellen, Myofibroblasten, Chondrozyten, Osteoblasten, Endothelzellen, Keratinozyten und aus Stammzellen differenzierte Zelltypen, insbesondere Fibroblasten, Chondrozyten oder Osteoblasten, unter mechanischer Beanspruchung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung mechanisch beanspruchter Zellen mittels einer der vorgenannten Bioreaktoren, wobei dieses Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Das Aussäen zu kultivierender Zellen auf einer biologischen Matrix, insbesondere einer Kollagenmatrix, bevorzugt einer azellularisierten Kollagenmatrix, anschließendes Anordnen der Zellen auf mindestens einer elastischen Membran, wobei die auf ausgesäten Zellen auf der mindestens einen elastischen Membran fixiert werden, wobei die elastische Membran insbesondere eine Silikonmembran ist.
In einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Auslenkung der elastischen Membran aufgrund der auf die elastische Membran einwirkenden Druckkraft, das heißt durch Druckbe aufschlagung, statt, wobei die von der elastischen Membran getragenen Zellen mechanisch beansprucht, insbesondere dehnungsbeansprucht, werden und anschließend mechanisch beanspruchte Zellen an der mindestens einen elastischen Membran des Bioreaktors erhalten werden.
Bevorzugt werden für das erfindungsgemäße Verfahren die vorgenannten erfindungsgemäßen Bioreaktoren eingesetzt.
In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Stärke der mechanischen Beanspruchung, insbesondere Dehnungsbeanspruchung, der auf der elastischen Membran angeordneten Zellen durch Aufnahme und Kontrolle der Auslenkung der durch Druckbeaufschlagung ausgelenkten elastischen Membran exakt bestimmt. Bevorzugt ist die mechanische Beanspruchung der auf der elastischen Membran angeordneten Zellen eine multiaxiale Dehnungsbeanspruchung, insbesondere aufgrund einer im Wesentlichen kalottenförmigen, das heißt konvexen, Auslenkung der aufgespannten elastischen Membran.
In einer besonders bevorzugten Variante ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die durch die Druckbeaufschlagung erzeugte mechanische Beanspruchung periodisch auf die Zellen ausgeübt wird, wobei insbesondere ein Wechsel zwischen kontinuierlicher, das heißt konstanter, und diskontinuierlicher, das heißt periodisch wiederkehrender, mechanischer Beanspruchung durchgeführt wird. Normalerweise wird dies durch die Verwendung des vorstehend dargestellten erfindungsgemäß bevorzugten Druckantriebs bewerkstelligt.
Weitere vorteilhafte Ausführungen der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die Figuren und die nachstehenden Beispiele näher erläutert, wobei die Erfindung nicht auf die konkret genannten Ausführungsformen der Beispiele beschränkt ist. Gleiche Bezugszeichen in den Figuren weisen auf bau- oder/und funktionsgleiche Bauteile hin.
1 zeigt den schematischen Querschnitt einer bevorzugten ersten Variante A des Bioreaktors, im Wesentlichen umfassend einen ringförmigen, zweiteiligen Halterahmen (11) mit darin an deren Umfang fixierten elastischen Membran (10), welcher zusammen mit der Kammer (20) nach oben das Volumen (21) abgrenzt und nach unten zusammen mit der Kammer (30) das Volumen (31) abgrenzt.
2 zeigt eine Ansicht der bevorzugten ersten Variante A des Bioreaktors, wobei die Kammern (20) und (30) aus Glas ausgeführt sind und jeweils Ein- und Auslassöffnungen (22) beziehungsweise (32) aufweisen und die beiden Kammern durch einen Stahlring zusammengespannt werden.
3 zeigt eine zweite bevorzugte Variante B des Bioreaktors in einem schematischen Querschnitt. Gegenüber der bevorzugten ersten Variante weist diese Variante zusätzlich ein Sensorsystem (50) auf, das mit einem Stempel (51) mit der eingespannten elastischen Membran (10) in körperlicher Verbindung steht, und ein planares Deckglas (24) zur visuellen Kontrolle der auf der elastischen Membran (10) angeordneten Zellen auf. Die untere Kammer (30) ist nach unten durch eine Grundplatte (33) begrenzt.
4 zeigt die Histologie einer mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter mechanischer Dehnungsbeanspruchung kultivierten Fibroblastenkultur an Tag 7 der Kultivierung unter der erfindungsgemäßen mechanischen Dehnungsbeanspruchung: 4A zeigt eine Pentachromfärbung, bei der sich neu synthetisierte ungeformte extrazelluläre Matrixkomponenten (Proteoglycane) blau anfärben; 4B zeigt eine HE-Färbung, worin dunkel-violett die mehrschichtig wachsenden und teilweise die Matrix infiltrierenden Zellen dargestellt sind.
5 zeigt die Histologie einer in einem Kontrollexperiment ohne mechanische Dehnungsbeanspruchung kultivierten Fibroblastenkultur: 5A zeigt eine Pentachromfärbung; 5B zeigt eine HE-Färbung.
6 zeigt die Histologie einer mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter mechanischer Dehnungsbeanspruchung kultivierten Fibroblastenkultur an Tag 21 der Kultivierung unter der erfindungsgemäßen mechanischen Dehnungsbeanspruchung: 6A zeigt eine Pentachromfärbung; 6B zeigt eine HE-Färbung.
Beispiel 1: Mechano-Bioreaktor Version A
Es wird ein Bioreaktor bereitgestellt, der aus zwei übereinander liegenden Gehäuseteilen oder Kammern (20) und (30) besteht. Diese können wie in 2 gezeigt, durch einen außen um den Umfang der Gehäuseteile (20), (30) verlaufenden gürtelförmigen Stahlring zusammengehalten werden. Die 1 zeigt, dass das Gehäuseteil (20) zwei Ein-/Auslässe (22) und das Gehäuseteil (30) einen Ein-/Auslass (32) aufweist. Die beiden Gehäuseteile sind über einander angeordnet und weisen in dieser Form eine ringförmig verlaufende Nut auf, in welcher eine zweiteilige im Querschnitt gesehen ringförmige Haltevorrichtung, insbesondere Halterahmen (11) angeordnet ist. Dieser zweiteilige Halterahmen (11) spannt eine im lichten Durchgang dieses Halterahmens angeordnete kreisförmige elastische Membran (10) fest ein. Durch einen elektronisch gesteuerten pneumatischen Druckantrieb, der mit der unteren, luftgefüllten Kammer (30) in Verbindung steht, wird Druckluft pulsatil in die untere Kammer zugeführt. Dabei kann der Druck über einen Bereich von 0 bis 50 mmHg (über Normaldruck) und die Frequenz der periodisch wiederkehrenden Druckbeaufschlagung von 0,1 bis 2,6 Hz individuell variiert werden. Die obere Kammer (20) wird über ein geschlossenes Kreislaufsystem kontinuierlich mit Zellkulturmedium aus einem Vorratsgefäß beschickt und entsorgt, dazu wird insbesondere eine Medienpumpe, beispielsweise eine Peristaltikpumpe verwendet. Zwischen den beiden Kammern (20) und (30) ist durch zwei Kunststoffringe, die einen Halterahmen (11) bilden, eine runde, elastische Silikonfolie mit einer Stärke von 0,5 mm und einem Durchmesser von etwa 30 bis 40 mm gespannt. Auf dieser Silikonfolie befindet sich beispielsweise eine zuvor über 48 Stunden mit primären Blasten statisch besiedelte biologische porcine Kollagenmatrix von etwa 100 μm Stärke.
Der Mechano-Bioreaktor der Variante A besteht aus hitzebeständigem Glas-, Metall- und Kunststoff-Komponenten und kann somit nach jedem Gebrauch autoklaviert werden. Die 1 und 2 zeigen den Bioreaktor der Variante A.
Durch den pulsatilen Einstrom der Druckluft wird eine definierte Druckbeaufschlagung auf die Silikonfolie übertragen, was zu einer konvexen Auslenkung der aufgespannten Silikonfolie und somit zu einer multiaxialen Dehnung und Längenzunahme des auf der Silikonfolie aufgebrachten Zell-Matrix-Konstrukts von etwa 10 % zur Folge hat. Durch die elektronische Antriebssteuerung wird die mechanische Belastung beispielsweise im Wechsel zwischen mechanisch statischer und pulsatiler Dehnungsbeanspruchung für bis mehrere Wochen auf beispielsweise autologe artifizielle Faszien-Patches appliziert.
Beispiel 2: Mechanobioreaktor Variante B
Es wird ein Bioreaktor bereitgestellt, der wie aus 3 hervorgeht, im Wesentlichen aus einem oberen Kompartiment, das aus einer Kammer oder Gehäuseteil (20) und daran angeordneten Ein- und Auslassöffnungen (22) zur Zu- und Abfuhr von Zellkulturmedium, sowie insbesondere einem Planaren Deckglas (24) zur Beobachtung der auf der eingespannten elastischen Membran (10) angeordneten Zellen aufgebaut ist.
Der Bioreaktor ist weiter aus einem unteren Kompartiment aufgebaut, welches aus der Kammer oder Gehäuseteil (30) mit einer daran angeordneten Einbeziehungsweise Auslassöffnung (32) und einer Grundplatte (33) mit einem darin angeordneten Sensorsystem (50) bestehend aus einem induktiven Wegnehmer und einem Stempel (51), der mit der aufgespannten elastischen Membran (10) in körperlichem Kontakt steht, gebildet wird. Die Funktion des zweiteiligen Halterahmens (11) gemäß der Ausführung nach 1 wird von dem unteren Abschnitt der oberen Kammer (20) und dem oberen Abschnitt der unteren Kammer (30), zwischen denen die elastische Membran (10) an ihren Rändern eingespannt ist, übernommen.
Im oberen Kompartiment wird das mit Zellkulturmedium gefüllte Volumen (21) durch das Deckglas (24), die Kammer (20) und die Oberseite der elastischen Membran (10) begrenzt. Im unteren Kompartiment wird das gasgefüllte Volumen (31) durch die untere Kammer (30), die Grundplatte (33) mit dem darin angeordneten Sensorsystem (50) und durch die eingespannte elastische Membran (10) begrenzt.
Dieser Bioreaktor dient der Langzeit-in vitro-Kultivierung von Zell-Matrix-Konstrukten unter definierter zyklischer mechanischer Belastung bei kontinuierlichem Zu- und Abfluss von Zellkulturmedium in einem geschlossenen System. Sowohl der Bioreaktor als auch das Mediumreservoir inklusive der Schlauchverbindungen werden während der Kultivierung bevorzugt in einem Inkubator mit einer 5% Kohlendioxid-Atmosphäre bei cirka 37°C und 95% Luftfeuchtigkeit untergebracht. Das Medium wird in einem geschlossenen Kreislaufsystem mittels einer handelsüblichen Peristaltikpumpe (IPC-12 der Firma ISMATEC S.A., Glattbrugg, CH) und mittels sterilisierbarer Silikonschläuche bei konstanter Geschwindigkeit durch die obere Kammer (20) des Reaktors gepumpt.
Als Mediumreservoir dient eine Glasflasche, welche zur Oxigenierung des Mediums über einen Sterilfilter bevorzugt mit der CO₂-angereicherten Atmosphäre des Inkubators mit 5% CO₂ und 95% relativer Feuchte verbunden ist.
Das untere Kompartiment ist mit dem oberen Kompartiment über Schrauben verbunden. In diesem Kompartiment erfolgen die Luftdruckbeaufschlagung sowie die Wegmessung der Auslenkung der elastischen Membran. Bei der horizontal angeordneten elastischen Membran handelt es sich um eine sterilisierbare Membran aus medizinischem Silikon, auf der beispielsweise eine mit mesenchymalen Zellen rebesiedelte biologische Matrix aus azellularisiertem Kollagen aufgelegt ist, wobei diese zusammen mit der Silikonmembran mit Hilfe zweier O-Ringe zwischen den beiden Kompartimenten aufgespannt wird.
Ein induktiver Wegaufnehmer, welcher als Sensorsystem (50) im unteren Kompartiment untergebracht ist, drückt mit dem Stempel (51) von unten leicht federnd gegen die Silikonmembran und ermittelt die Auslenkung der Membran nach Druckbeaufschlagung beispielsweise nach oben, das heißt ins Volumen (21) der oberen Kammer (20), durch Ausgleiten des sich der Auslenkung der elastischen Membran nachführenden Stempels (51) aus dem induktiven Wegaufnehmer, wobei durch Änderung der Induktion infolge des Ausgleitens des Stempels (51) die Position des Stempels und damit indirekt die Amplitude der Auslenkung der elastischen Membran bestimmt werden kann.
Das Signal des Wegaufnehmers wird für die Steuerung des dem Bioreaktors zugeordneten Druckantriebs benutzt, wobei bei Erreichen eines voreingestellten maximalen Werts der Ausdehnung die Druckbeaufschlagung des unteren Volumens (31) durch den Druckantrieb gestoppt wird. Dabei wird die Verbindung zwischen einer Druckvorlage im Druckantrieb und dem Volumen (31) durch Betätigung eines Ventils im Druckantrieb unterbrochen. Die Verminderung der Druckbeaufschlagung der unteren Kammer (30) wird durch die Entlüftung des Volumens (31) über den Druckantrieb erzielt. Dabei ist in der Zuleitung zur unteren Kammer (30) zusätzlich eine einstellbare Drossel angebracht, womit die Geschwindigkeit der Druckzunahme beziehungsweise des Druckabfalls im Volumen (31) bestimmt werden kann. Über einen Drucksensor in der Druckluftzuleitung wird außerdem der Druck im System erfasst. Zusammen mit einem Rechnerprogramm können die Druckverläufe und die gemessenen Auslenkungen der elastischen Membran über die Zeit dargestellt und dokumentiert werden.
Beispiel 3: Isolierung von Fibroblasten aus autologer Muskelfaszie
a) Entnahme von Faszie
Es wird eine stabile Präparation und die Entnahme von zwei porcinen Faszien des M. rectos abdominis, das heißt beidseits der medianen Laparotomie je eine Faszie, durchgeführt. Der Transport und die Lagerung der entnommenen Faszien kann in sterilem cirka 4°C kaltem DMEM-Puffer mit Pen./Street. und ohne FCS (fötales Kälberserum) durchgeführt werden.
Während die eine entnommene Faszie zur Zellisolierung verwendet wird, kann die andere Faszie zur Azellularisierung für die Kollagenmatrices verwendet werden, wobei je zwei Matrices mit einem Durchmesser von cirka 50 mm pro Faszie erhalten werden können.
b) Isolierung reifer primärer porciner Fibroblasten (pPFB)
Die entnommene Faszie wird etwa 60 Minuten bei cirka 37°C bei 300 Upm in frischem DMEM (Fa. Gibco) mit 1 g/l Nebacetin (Fa. Gibco), 1250 μg/l Amphotericin B (Fa. Gibco) und 1% Pen./Strept. (Fa. Gibco) gewaschen und in frisches Medium überführt. Anschließend werden etwa vier- bis fünfmal je 1 g Gewebe, welches zuvor mit einem Skalpell mechanisch zerkleinert worden ist (Größe ca. 0,5 × 0,5 mm), in je 12,5 ml sterilfiltrierter 0,06%iger Kollagenase A (Roche^®) in 50 ml-FALCON-Gefäßen bei cirka 37°C im Schüttler bei 500 Upm für 20 Stunden liegend inkubiert. Anschließend wird nach Zusatz von je 12 ml 0,1% Trypsin/EDTA bei cirka 37°C im Schüttler bei 500 Upm eine Stunde inkubiert und danach jeweils 24 ml DMEM-Puffer mit 1% Pen./Strept. und 10% FCS (PFB-Medium) zugegeben und bei cirka 4°C bei 1100 Upm für 10 Minuten zentrifugiert. Die erhaltenen Pellets werden jeweils in 1 ml PFB-Medium aufgenommen.
Die Zellzahl- und Vitalitätsbestimmung findet in einer Neubauer-Zellkammer mittels Trypanblau mit 100 μl Zellsuspension statt. Dabei werden je 12 μl Zell-Tryanblau-Suspension auf ein Feld der Zählkammer gegeben.
c) Kultur
Zur Kultivierung werden die durch die Zentrifugation erhaltenen Pellets in je 8 ml PFB-Medium aufgenommen und in 25T-Flaschen bei 5% CO₂, 37°C und 95% Luftfeuchtigkeit bis zur Subkonfluenz kultiviert. Bei dem zweimal öffentlich stattfindenden Mediumwechsel werden dabei etwa 50% des alten Mediums in der Flasche belassen.
d) Passage
Bei einer Subkonfluenz von cirka 80 bis 90% werden die Zellen passagiert. Dazu wird das Medium abgenommen und die entleerte Kulturflasche noch zweimal mit 10% PBS-Puffer gespült. Anschließend wird 3 Minuten bei etwa 37°C im Brutschrank mit 3 ml 0,1% Trypsin/EDTA inkubiert. Unter dem Lichtmikroskop wird begutachtet, ob noch partielle Adhärenz besteht. Die Zellsuspension wird nach Zugabe von 10 ml Stoppmedium in 50 ml-FALCON-Gefäße überführt und bei 1100 Upm bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 1 ml Medium aufgenommen.
e) Immunhistochemie
Für die immunhistochemische Untersuchung von porcinen Desmin (Myocyten), CD31 (Endothelzellen) und Vimentin (alle mesenchymalen Zellen) werden Cytospots auf silanisierte Objektträger aufgetragen.
Ergebnisse:
Mit der erfindungsgemäß bevorzugten Methode der Zellisolierung können primäre reife Fibroblasten (PFB) aus Biopsien der Muskelfaszien gewonnen werden, die zu 95 bis 98% spezifisch für Fibroblasten-Marker sind. Die übrigen 2 bis 5% der so isolierten Zellen stellen Myozyten beziehungsweise Myofibroblasten dar, was an einem positiven immunhistochemischen Nachweis von Vimentin und Desmin nachgewiesen wird. Weitere Zelltypen finden sich nicht in den Kulturen. Die Isolierungsmethode zeigt daher eine hohe Reinheit und Spezifität.
Beispiel 4: Besiedlung von Matrices mit Fibroblasten
Beispielsweise porcine Fibroblasten (PFB) aus der ersten oder zweiten Passage werden zur Besiedlung azellulären porcinen Submucosa- beziehungsweise Faszien-Patches verwendet. Die Zelldichte liegt dabei bei cirka 2 × 10⁶ Zellen pro Matrix, das heißt 1 × 10⁵ Zellen/cm²
a) Porcine Submucosa-Patches
Zur Azellularisierung der Patches werden Dünndarmabschnitte ohne Gefäßast von Schweinen nach luminaler und vaskulärer in situ-Perfusion mit cirka 4°C kalter Nebacetin-Lösung (Nebacetin-Siccum in 0,9% NaCl) und anschließend im Labor für cirka 30 Minuten bei cirka 37°C in PBS-Puffer mit Nebacetin gespült und in etwa 30 cm lange Segmente geteilt. Die Mucosa wird mechanisch, vorzugsweise mit einem Zellschaber, von der Submucosa getrennt, der Darm luminal verschlossen und über eine Braunüle (Fa. Braun, Melsungen, Deutschland) mit einer 4%igen Natriumdesoxcholat-Lösung gefüllt. Anschließend wird das Segment in 10% PBS-Puffer gelegt und bei cirka 4°C und 400 Upm im Schüttler etwa 90 Minuten inkubiert. Danach wird die Natriumdesoxcholat-Lösung über die Braunüle entleert und mit 10% PBS-Puffer weitere 18 Stunden inkubiert bevor die Ligaturen und die Braunüle entfernt werden.
Die so erhaltene azelluläre Submucosa ist bei cirka 4°C in sterilem 10% PBS-Puffer bis zu 12 Monate haltbar.
Für die Anwendung im erfindungsgemäßen Bioreaktor werden Patches mit einem Durchmesser von cirka 50 mm aus der Submucosa geschnitten und die Patches in 13 mm-Petrischalen auf sterilisierte Silikonfolie einer Stärke von cirka 0,5 mm aufgezogen; dabei zeigt die luminale Seite der Submucosa-Matrix nach oben, das heißt von der Silikonfolie weg. Die Submucosa-Matrix wird mit einem sterilen Teflonring beschwert und gegebenenfalls für 24 Stunden einer Sterilkontrolle in PFB-Medium im Inkubator unterzogen. Die aufgezogene Submucosa-Matrix wird dann unter Sterilbdingungen für cirka 3 bis 4 Stunden trocknen lassen.
Zur Besiedlung der aufgezogenen azellulären Submucosa-Matrix werden jeweils 1 ml Medium-Zell-Suspension (cirka 2 × 10⁶ Zellen) mittig auf je einen Patch gesiedelt. Der Durchmesser der mit dem einen ml bedeckten Fläche auf dem Patch beträgt etwa 30 mm. Nach einer Ruhephase von 5 Stunden werden die besiedelten Patches mit jeweils 12 ml PFB-Medium überschichtet und bei cirka 37°C im Inkubator kultiviert.
b) Faszien-Patches
Zur Gewinnung von Faszien-Patches werden aus der in Antibiotika- und Antimykotika-haltigem Medium gewaschenen Faszie runde Patches mit einem Durchmesser von cirka 50 mm ausgeschnitten. Die Oberflächen der ausgeschnittenen Faszien werden mechanisch, bevorzugt mit einem Skalpell, von Blut, Fett und lockerem Bindegewebe gereinigt und in 4%iger Natriumdesoxycholat-Lösung bei cirka 4°C bei 400 Upm inkubiert. Nach Überführung in 10% PBS-Puffer wird für weitere 18 Stunden bei cirka 4°C bei 400 Upm inkubiert, um verbleibendes Natriumdesoxycholat zu entfernen. Die so azellularisierten Faszien-Patches werden einem DNAse-Verdau in an sich bekannter Weise unterzogen. Die Lagerung dieser so azellularisierten Faszien-Matrices ist in 10% PBS-Puffer bei cirka 4°C für bis zu 12 Monaten möglich.
Zur Besiedelung der azellulären Faszien-Matrices ist – im Gegensatz zu den Submucosa-Matrices – keine Siliconfolie zur Stabilisierung und kein Trocknen der Matrices notwendig. Die Faszien-Matrices werden in 6er-Platten („6-well") mit einem Durchmesser von jeweils cirka 45 mm gegeben, wobei der Matrixrand entlang der Wand der Vertiefung nach oben ragt, so dass eine "Schale" entsteht. Darin werden jeweils 1 ml Medium-Zell-Suspension (2 × 10⁶ Zellen) gegeben. Nach einer Ruhephase von cirka 5 Stunden wird jeweils mit weiteren 3 ml/PFB-Medium überschichtet.
Beispiel 5: Kultivierung im erfindungsgemäßen Bioreaktor
a) Synchronisierung
24 Stunden vor Einbau der Matrices in den Bioreaktor wird von einer Suspension zuvor isolierter und vorkultivierter Zellen das Medium abgenommen und im Falle porciner Fibroblasten (PFB) je 12 ml DMEM-Puffer mit Pen/Strept. und 1% FCS zugegeben. Nach einer Ruhezeit von 24 Stunden werden alle Matrices wieder mit PFB-Medium versorgt. Diese Behandlung bringt den Großteil der Zellen in die G0-Phase.
b) Beschickung des Bioreaktors
Dazu werden Zell-Matrix-Konstrukte am Tag 2 nach der Besiedlung auf Silikonfolien in die Reaktoren überführt und zwischen der oberen Kammer und der unteren Kammer eingespannt. Über eine Mediumpumpe und eine Vorratsflasche wird die obere Kammer mit PFB-Medium gefüllt, welches mit einem initialen Medium-Fluss von 10 ml/min ausgetauscht wird. Die untere Kammer des Bioreaktors wird über einen Druckluftschlauch mit dem Druckantrieb verbunden und mit etwa 15 mmHg Druck die mechanische Belastung der Matrix im Reaktor begonnen. Am Steuermodul des Druckantriebs wird ein periodisches Auf- und Absteigen des Drucks in der unteren Kammer eingestellt. Dies geschieht durch Bestimmung der "oberen" und "unteren" Haltezeit, für den zu beaufschlagenden Maximaldruck (hier: 15 mmHg über Normaldruck) beziehungsweise dem minimalen Druck (hier: Normaldruck). Die Wiederholungsfrequenz be trägt an Tag 1 und Tag 2 der Kultivierung 0,133 Hz, an Tag 3 und 4 0,166 Hz und ab Tag 0,2 Hz.
Zweimal pro Woche wird das sich im Bioreaktor in Rezirkulation befindliche Medium (hier: cirka 300 ml) gewechselt, wobei nur jeweils cirka 50% des gesamten Mediums ausgetauscht werden. Die Zell-Matrix-Konstrukte werden für 7, 14, 21 oder 30 Tage kultiviert.
c) Enzym-Assay und Immunhistologie
Neben einer in an sich bekannter Weise durchgeführten HE-Färbung zur Übersicht über Zellularität, Alignment der Zellen und Bestimmung der Anzahl der Zellschichten (4B, 5B und 6B) werden an den aus den Bioreaktoren nach Abschluss der Kultivierung gewonnenen Zell-Matrix-Konstrukten zur Bestimmung der zellulären Stoffwechselaktivität sequenzielle MTS/Formazan-Assays in an sich bekannter Weise durchgeführt.
Zur Bestimmung der Proliferation und der de novo-Synthese von ECM-Proteinen, das heißt Procollagen I und III und Elastin, wurden die Pentachromfärbung nach Movat durchgeführt und immunhistochemische Methoden eingesetzt. Die Pentachromfärbungen nach Movat werden dabei an Kryo- und gegebenenfalls Paraffin-Präparaten der erhaltenen Zell-Matrix-Konstrukte durchgeführt (4A, 5A und 6A). Die Immunhistologie für porcines Procollagen und Elastin werden an Kryo-Schnitten durchgeführt.
Ergebnisse:

– Die mittels der erfindungsgemäßen mechanischen Dehnungsbeanspruchung erhaltenen Gewebe zeigen eine im Verlauf der Kultivierung signifikant ansteigende und im Vergleich zu statischen Kontrollen stets höhere Stoffwechselaktivität. Insbesondere kommt es bereits ab Tag 5 aufgrund der enzymatischen Reduktion zu Formazan bedingten Rotfärbung zu einer signifikanten Zunahme der Extinktion bei 490 nm. Ebenfalls aufgrund der stimulierten Stoffwechselaktivität nimmt die enzymatische Umsetzung von MTS zu.
– Mechanischer Stress bewirkt ab Tag 14 eine gleichmäßigere Verteilung und ein zunehmend mehrschichtiges Wachstum der Zellen, wobei es zu einer Infiltration der Matrix kommt (4B). Das angeregte mehrschichtige Zellwachstum und die Infiltration setzen sich auch über den Tag 21 der Kultivierung fort (6B).
– Kultivierte Fibroblasten zeigen bereits ab Tag 7 eine Ausrichtung in Richtung der mechanischen Belastung (4B), wobei sich der signifikante Effekt auch über eine Kultivierungsdauer von mehr als 21 Tagen fortsetzt und verstärkt (6B). Hingegen ist in der statischen Kontrollkultur lediglich ein ungerichtetes Zellwachstum der Fibroblasten zu beobachten (5B), welches auch nach Tag 21 nicht in ein gerichtetes Wachstum übergeht (nicht gezeigt).
– In allen der erfindungsgemäßen mechanischen Dehnungsbeanspruchung ausgesetzten Zell-Matrix-Konstrukten konnte nach Tag 14 und über Tag 21 hinaus die Neubildung von extrazellulären Matrixproteinen (ECM-Proteinen) immunhistologisch nachgewiesen werden (4A). In statischen Kontrollkulturen findet hingegen auch an Tag 7 (5A) und über eine Kultivierungsdauer von 21 Tagen hinaus (nicht gezeigt) keine Neubildung von ECM-Proteinen statt.

Die Ergebnisse belegen den positiven Effekt von in vitro applizierten mechanischen multiaxialen Dehnungsstimuli auf die Proliferation und Syntheseleistung der kultivierten Zellen oder Gewebe, hier: porcine Fibroblasten.
Darüber hinaus zeigen die der erfindungsgemäßen mechanischen multiaxialen Dehnungsbeanspruchung ausgesetzten Zell-Matrix-Konstrukte eine wesentlich erhöhte mechanische Stabilität, insbesondere in Richtung der erfindungsgemäß ausgeübten Dehnungsbeanspruchung.

Claims

Bioreaktor zum Kultivieren von Zellen enthaltend mindestens eine die Zellen tragende elastische Membran (10) und eine Kammer (30) zur Aufnahme der Membran, dadurch gekennzeichnet, dass die elastische Membran durch Druckbeaufschlagung eines durch die Membran (10) und die Kammer (30) abgeschlossenen Volumens (31) auslenkbar ist und ein Sensorsystem (50) zur Messung der Auslenkung der elastischen Membran (10) vorgesehen ist.
Bioreaktor nach Anspruch 1, wobei der einen Kammer (30) eine zweite Kammer (20) zugeordnet ist, welche zusammen mit der elastischen Membran (10) ein Volumen (21) auf der dem Volumen (31) abgewandten Seite der Membran (10) abschließt und die beiden Volumina durch die Membran (10) getrennt werden.
Bioreaktor nach Anspruch 2, wobei mindestens ein Volumen (21, 31) mit einem Druckantrieb verbunden ist.
Bioreaktor nach einem der Ansprüche 2 oder 3, wobei mindestens eines der Volumen (21, 31) mit Flüssigkeit, insbesondere einem Zellkulturmedium, gefüllt ist.
Bioreaktor nach einem der vorangehenden Ansprüche mit einem Halterahmen (11) zur Fixierung der mindestens einen elastischen Membran.
Bioreaktor nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine elastische Membran eine Membran ist, die ein biologisch inertes elastisches Material, insbesondere ein künstliches oder natürliches Polymer, enthält, bevorzugt eine Silikonmembran, oder eine biologische Matrix ist.
Bioreaktor nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zellen in einer biologischen Matrix, insbesondere eine Kollagenmatrix, angeordnet an der elastischen Membran (10) fixiert sind.
Bioreaktor nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei die an der Membran (10) angeordneten Zellen mit dem mindestens einen flüssigkeitsgefüllten Volumen (21, 31) in Verbindung stehen.
Bioreaktor nach Anspruch 1 enthaltend: – eine erste Kammer (30) zur Aufnahme von mindestens einer die Zellen tragenden elastischen Membran (10), – eine zweite Kammer (20), wobei die elastische Membran (10) zwischen der ersten und der zweiten Kammer angeordnet ist und in der ersten Kammer (30) ein Volumen (31) abschließt und auf der dem Volumen (31) abgewandten Seite der Membran (10) in der zweiten Kammer (20) ein zweites Volumen (21) abschließt, so dass die beiden Volumina durch die Membran getrennt sind, – mindestens ein Druckantrieb, der mit mindestens einem Volumen (21, 31) verbunden ist, und – ein Sensorsystem (50) zur Messung der Auslenkung der elastischen Membran.
Verwendung des Bioreaktors nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Kultivierung von Zellen unter mechanischer Beanspruchung.
Verfahren zum Gewinnen von mechanisch beanspruchten Zellen insbesondere unter Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9 enthaltend: – Aussäen zu kultivierender Zellen auf einer biologischen Matrix, – Anordnen der Zellen auf mindestens einer elastischen Membran, – Auslenkung der elastischen Membran auf Grund auf die elastische Membran einwirkender Druckkraft, wobei die Zellen mechanisch beansprucht werden, und – Erhalt mechanisch beanspruchter Zellen an der mindestens einen elastischen Membran.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die biologische Matrix eine azellularisierte Kollagenmatrix ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, wobei die Stärke der mechanischen Beanspruchung der auf der elastischen Membran angeordneten Zellen bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die mechanische Beanspruchung der auf der elastischen Membran angeordneten Zellen eine multiaxiale Dehnungsbeanspruchung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die mechanische Beanspruchung eine periodisch wiederkehrende Wechselbeanspruchung ist.