DE10212570B4

DE10212570B4 - Amperometric thick-film biosensor for determining the hydrogen peroxide concentration in a solution and method for producing the sensor

Info

Publication number: DE10212570B4
Application number: DE2002112570
Authority: DE
Inventors: Dorothea Dr. Pfeiffer; Dirk Dr. Schönfuß; Jan Dr. Szeponik; Ingrid Gall; Ulla Dr. Wollenberger
Original assignee: BST BIO SENSOR TECHNOLOGIE GmbH; BST Bio Sensor Tech GmbH
Current assignee: BST BIO SENSOR TECHNOLOGIE GmbH; BST Bio Sensor Tech GmbH
Priority date: 2002-03-12
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2004-02-19
Anticipated expiration: 2022-03-13
Also published as: DE10212570A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung eines amperometrischen Biosensors zur Bestimmung der Wasserstoffperoxid-Konzentration unter Verwendung eines dickschicht-technologisch hergestellten 2-Elektrodensystems auf einem Substrat und Aufbringen eines Enzyms und eines. Mediators auf die Elektroden, wobei ein im Siebdruckverfahren hergestelltes 2-Elektrodensystem verwendet wird, das auf einem Substrat eine Platin- oder Goldelektrode als Arbeitselektrode, eine Silberelektrode als Gegenelektrode, deren Kontaktbahnen und Kontaktierungspunkte und eine elektrisch isolierende Lackschicht aufweist, die die nicht mit den Elektroden bedruckten Flächen des Substrats und die aufgebrachten Kontaktbahnen bedeckt, die Silberelektrode des 2-Elektrodensystems elektrochemisch mit einer Silberchloridschicht überzogen wird, indem in einer chloridhaltigen Lösung ein anodischer Strom durch die Silberelektrode geleitet wird, danach eine Lösung oder Suspension, die ein Polymer, den Mediator und das Enzym enthält, homogen auf die Elektroden und deren Zwischenraum oder nur auf die Arbeitselektrode aufgebracht und getrocknet wird.Method for producing an amperometric biosensor for determining the hydrogen peroxide concentration using a 2-electrode system produced using thick-film technology on a substrate and applying an enzyme and one. Mediators on the electrodes, using a 2-electrode system manufactured by screen printing, which has on a substrate a platinum or gold electrode as the working electrode, a silver electrode as the counter electrode, its contact tracks and contact points and an electrically insulating lacquer layer that does not match the electrodes printed surfaces of the substrate and the applied contact tracks, the silver electrode of the 2-electrode system is electrochemically coated with a silver chloride layer by passing an anodic current through the silver electrode in a chloride-containing solution, then a solution or suspension containing a polymer, the mediator and the enzyme contains, is applied homogeneously to the electrodes and their space or only on the working electrode and dried.

Description

Die Erfindung betrifft einen preiswerten, einfach zu fertigenden und leicht zu betreibenden amperometrischen Dickschicht-Biosensor zur quantitativen H₂O₂-Bestimmung von niedrigen Konzentrationen und ein Verfahren zur Herstellung dieses Sensors. Der erfindungsgemäfle Biosensor erlaubt die H₂O₂-Bestimmung im Konzentrationsbereich von 10 bis 10.000 nM, insbesondere im submikromolaren Bereich.The invention relates to an inexpensive, easy-to-manufacture and easy-to-operate amperometric thick-film biosensor for the quantitative determination of H ₂ O ₂ at low concentrations and a method for producing this sensor. The biosensor according to the invention permits H ₂ O ₂ determination in the concentration range from 10 to 10,000 nM, in particular in the submicromolar range.

Vor allem im medizinischen und umweltanalytischen Bereich. ist es wünschenswert, über preiswerte und einer Massenfertigung leicht zugängliche Biosensoren zur H₂O₂-Bestimmung im submikromolaren Bereich zu verfügen.Especially in the medical and environmental analytical field. it is desirable to have inexpensive and easily accessible mass production biosensors for H ₂ O ₂ determination in the submicromolar range.

Amperometrische Biosensoren, mit deren Hilfe die Konzentration von bestimmten Stoffen in Lösungen bestimmt werden kann, funktionieren nach dem Grundprinzip, dass die Reaktion des zu bestimmenden Stoffes mit einer biologischen Komponente, oft einem Enzym, mit dem elektrochemischen Detektionsmechanismus kombiniert wird. Dieser enzymatisch-elektrochemische Detektionsmechanismus ist die Reaktion einer Mediatorsubstanz mit dem Enzym im Endzustand nach seiner Reaktion mit dem zu bestimmenden Stoff in der Weise, dass nach der Reaktion des Enzyms und der Mediatorsubstanz das Enzym wieder in seinem ursprünglichen Zustand vorliegt, während die Mediatorsubstanz in einem oxidierten oder reduzierten Zustand vorliegt und in einer elektrochemischen Reaktion an einer Elektrode wieder in seinen Ausgangszustand überführt werden kann. Der bei dieser elektrochemischen Reaktion durch die Elektrode fließende Strom ist der Konzentration des zu bestimmenden Stoffes proportional und kann gemessen werden. Mit Hilfe einer Kalibration ist somit die quantitative Bestimmung von unbekannten Konzentrationen der zu bestimmenden Stoffe in Lösungen möglich.Amperometric biosensors, with whose help determines the concentration of certain substances in solutions can work on the basic principle that the reaction of the substance to be determined with a biological component, often an enzyme combined with the electrochemical detection mechanism becomes. This enzymatic-electrochemical The detection mechanism is the reaction of a mediator substance the enzyme in the final state after its reaction with the one to be determined Substance in such a way that after the reaction of the enzyme and the mediator the enzyme back to its original Condition is present while the mediator substance in an oxidized or reduced state is present and in an electrochemical reaction on an electrode can be returned to its original state. The one at this electrochemical reaction current flowing through the electrode is proportional to the concentration of the substance to be determined and can be measured. With the help of a calibration is the quantitative Determination of unknown concentrations of the substances to be determined in solutions possible.

Ein derartiges Sensor-Prinzip wird im Patent US 4,882,013 mit Tetrathiafulvalen (TTF) als Mediatorsubstanz in verschiedenen Ausführungsvarianten beschrieben.Such a sensor principle is described in the patent US 4,882,013 described with tetrathiafulvalene (TTF) as a mediator substance in different versions.

Die in US 4,882,013 beschriebene erste Ausführungsvariante des Sensor-Prinzips besteht aus einer Graphitfolien-Scheibe auf einem Substrat, die als Elektrode dient und in ein Glasrohr eingeklebt ist. Ein Draht, welcher mit silberhaltigem Klebstoff an der Rückseite der Graphitfolie befestigt ist, dient der Kontaktierung. Diese Elektrode wird für 2 Stunden in eine TTF-haltige Lösung getaucht und danach 60 Minuten an der Luft getrocknet. Danach wird die Elektrode für 90 Minuten in eine Lösung von 1-Cyclohexyl-3(2-morpholinoethyl) carbodiimidmetho-p-toluensulfonat getaucht, welches als bifunktioneller Ligand für die kovalente Anbindung des Enzyms Glucoseoxidase (GOD) dient. Diese so vorbehandelte Elektrode wird nach Abspülen mit destilliertem Wasser 60 Minuten in eine GOD-Lösung getaucht und ist nach abermaligem Spülen mit einem Phosphat-Puffer einsatzbereit. Der so angefertigte Glucose-Biosensor liefert im Konzentrationsbereich bis 25 mM Glucose ein lineares Stromsignal. Die kleinste mit diesem Sensor gemessene Konzentration beträgt 5 mM Glucose. Die Aufbewahrung erfolgt in einer Phosphat-Puffer-Lösung.In the US 4,882,013 The first embodiment variant of the sensor principle described consists of a graphite foil disk on a substrate, which serves as an electrode and is glued into a glass tube. A wire, which is attached to the back of the graphite foil with silver-containing adhesive, is used for contacting. This electrode is immersed in a TTF-containing solution for 2 hours and then air-dried for 60 minutes. The electrode is then immersed for 90 minutes in a solution of 1-cyclohexyl-3 (2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate, which serves as a bifunctional ligand for the covalent attachment of the enzyme glucose oxidase (GOD). This electrode, pretreated in this way, is immersed in a GOD solution for 60 minutes after rinsing with distilled water and is ready for use after rinsing again with a phosphate buffer. The glucose biosensor produced in this way delivers a linear current signal in the concentration range up to 25 mM glucose. The smallest concentration measured with this sensor is 5 mM glucose. It is stored in a phosphate buffer solution.

Die zweite Ausführungsvariante besteht aus der oben beschriebenen TTF-modifizierten Elektrode, auf die eine konzentrierte Glucosedehydrogenase-Lösung appliziert wird, welche durch eine mit einem Gummiring befestigte modifizierte Dialyse-Membran auf der Oberfläche gehalten wird. Der so angefertigte Glucose-Biosensor liefert im Konzentrationsbereich bis 10 mM Glucose ein lineares. Stromsignal. Die kleinste mit diesem Sensor gemessene Konzentration beträgt 1 mM Glucose.The second variant consists of the TTF-modified electrode described above, on which a concentrated Glucose solution is applied, which is secured by a rubber ring modified dialysis membrane is held on the surface. The so made Glucose biosensor delivers glucose in the concentration range up to 10 mM a linear. Current signal. The smallest measured with this sensor Concentration is 1 mM glucose.

Eine weitere Ausführungsvariante mit einer verbesserten Enzymimmobilisierung nutzt die Möglichkeit, GOD über seine Kohlenhydratketten aneinander und an die Elektrodenoberfläche zu binden. Dazu wird die oben beschriebene Elektrode 15 Minuten in eine ethanolische Lösung von Hexadecylamin getaucht und danach getrocknet. Die trockene Elektrode wird dann 1 Stunde in eine TTF-Lösung getaucht und wiederum getrocknet. Nach dieser Prozedur wird die Elektrode für 90 Minuten in eine periodatoxidierte GOD Lösung getaucht und danach umgehend in eine Adipin Dihydräzin-haltige Pufferlösung überführt. Nach 30 weiteren Minuten kann die Elektrode mit Wasser gespült und eingesetzt werden oder man bewahrt sie in einer Phosphat-Puffer-Lösung auf. Der so angefertigte Glucose-Biosensor liefert im Konzentrationsbereich bis 15 mM Glucose ein lineares Stromsignal. Die kleinste mit diesem Sensor gemessene Konzentration beträgt 5 mM Glucose.Another variant with an improved Enzyme immobilization takes advantage of the possibility GOD about to bind his carbohydrate chains to each other and to the electrode surface. To the electrode described above is placed in an ethanolic for 15 minutes solution immersed in hexadecylamine and then dried. The dry electrode is then in a TTF solution for 1 hour dipped and dried again. After this procedure the Electrode for Immersed in a periodate-oxidized GOD solution for 90 minutes and then immediately into an adipine containing dihydrazine Buffer solution transferred. To The electrode can be rinsed with water for another 30 minutes and inserted or they are kept in a phosphate buffer solution. The glucose biosensor produced in this way delivers in the concentration range up to 15 mM glucose a linear current signal. The smallest with this The concentration measured by the sensor is 5 mM glucose.

Es wird weiterhin erwähnt, dass TTF ein geeigneter Mediator für das Enzym L-Aminosäureoxidase ist. Außerdem wird gezeigt, dass ein signifikanter Elektronentransfer über TTF zu einer unbehandelten Glas-Kohle-Elektrode erfolgt, wenn sowohl TTF, GOD sowie Glucose in Lösung vorliegen. Das Cyclovoltammogramm zeigt in einer ca. 20 mM Glucoselösung einen deutlichen Peak.It is also mentioned that TTF a suitable mediator for the enzyme L-amino acid oxidase is. Moreover shows that a significant electron transfer via TTF to an untreated glass-carbon electrode if both TTF, GOD and glucose in solution available. The cyclic voltammogram shows one in an approx. 20 mM glucose solution clear peak.

Der in US 4,882,013 vorgeschlagene Aufbau von Sensoren, d.h. von auf Kohlenstoff basierenden Elektroden, auf denen Enzyme und Mediatoren immobilisiert sind, so dass mit ihnen ohne weitere Zusätze Stoffkonzentrationen in Lösungen bestimmt werden können, bringt wesentliche Nachteile mit sich. Der Aufbau ist kompliziert, sehr zeitaufwendig und damit teuer und für eine Massenproduktion ungeeignet. Mit den resultierenden Sensoren können nur Konzentrationen im Bereich von 1–25 mM bestimmt werden. Die fertigen Sensoren müssen in einer Pufferlösung aufbewahrt werden.The in US 4,882,013 The proposed structure of sensors, ie of carbon-based electrodes on which enzymes and mediators are immobilized, so that substance concentrations in solutions can be determined with them without further additions, entails significant disadvantages. The structure is complicated, very time-consuming and therefore expensive and unsuitable for mass production. With the resulting sensors, only concentrations in the range of 1-25 mM can be determined. The finished sensors must be kept in a buffer solution.

Das Patent WO 98/35053 beschreibt einen Sensor für den Nachweis und die Messung eines Analyten in einer biologischen Flüssigkeit. Der Sensor umfasst zwei Enzyme. Eine Ausführungsform des Sensors misst die Wasserstoffperoxid-Konzentration, wobei hierfür eine thermostabile Peroxidase benutzt wird, welche in einem Redox-Hydrogel immobilisiert ist und auf diese Weise eine sensitive Schicht auf einer Arbeitselektrode bildet. Dieser Sensor beinhaltet weiterhin ein zweites, Wasserstoffperoxid generierendes Enzym, das von der Redox-Hydrogelschicht. und der Elektrode isoliert ist. Dieses zweite Enzym (z.B. Glucoseoxidase oder Lactatoxidase) generiert Wasserstoffperoxid in Abhängigkeit von der Anwesenheit eines Analyten (z.B. Glucose oder Lactat) oder einer aus dem Analyten gebildeten Verbindung. Das zweite Enzym kann von der Elektrode isoliert werden, indem eine elektrisch isolierende Schicht zwischen sensitive Schicht und zweite Enzymschicht gebracht wird. Alternativ kann das zweite Enzym in einer anorganischen polymeren Matrix immobilisert werden, was vorzugsweise in einem Sol-Gel-Polymerisationsprozess realisiert wird. Eine weitere Stabilisierung des Enzyms kann durch die gemeinsame Immobilisierung mit einem Polyelektrolyt-Polymer in einer Sol-Gel-Matrix erreicht werden.Patent WO 98/35053 describes a sensor for the detection and measurement of an analyte in a biological fluid. The sensor comprises two enzymes. An embodiment The sensor measures the hydrogen peroxide concentration, using a thermostable peroxidase, which is immobilized in a redox hydrogel and thus forms a sensitive layer on a working electrode. This sensor also contains a second, hydrogen peroxide generating enzyme, that of the redox hydrogel layer. and the electrode is insulated. This second enzyme (eg glucose oxidase or lactate oxidase) generates hydrogen peroxide depending on the presence of an analyte (eg glucose or lactate) or a compound formed from the analyte. The second enzyme can be isolated from the electrode by placing an electrically insulating layer between the sensitive layer and the second enzyme layer. Alternatively, the second enzyme can be immobilized in an inorganic polymer matrix, which is preferably implemented in a sol-gel polymerization process. Further stabilization of the enzyme can be achieved by joint immobilization with a polyelectrolyte polymer in a sol-gel matrix.

WO 98/35053 betrifft das Gebiet thermostabiler Enzym-Sensoren für unterschiedliche Analyte. Als Beispiele sind Blut-Glucose und Blut-Lactat angeführt. Bei den beschriebenen Sensoren wurde bei einer Temperatur von 37°C eine Abnahme der Empfindlichkeit von 10% festgestellt. Es, wird insbesondere auf das Einsatzfeld der in vivo kontinuierlichen Messungen von Blut-Glucose und Blut-Lactat abgezielt.WO 98/35053 relates to the field of more thermostable Enzyme sensors for different analytes. Examples are blood glucose and blood lactate cited. With the sensors described, there was a decrease at a temperature of 37 ° C the sensitivity of 10%. It will, in particular on the field of application of in vivo continuous measurements of blood glucose and targeted blood lactate.

Der beschriebene Sensor ist eindeutig nicht für die Detektion von Konzentrationen im unteren nanomolaren Bereich geeignet. Die beschriebenen Anwendungen für den Sensor zielen auf eine Konzentration des Analyten im millimolaren Bereich ab. Im Ausführungsbeispiel 15 wird die Empfindlichkeit des Sensors mit 0,8 nA/mM Glucose angegeben und ist damit um etwa 5 Größenordnungen schlechter als die geforderte Empfindlichkeit. Aufgrund der Anordnung des Mehrschichtsystems und der daraus resultierenden großen Schichtdicke der sensitiven Schicht des Sensors können lediglich Ansprechzeiten im Minuten-Bereich erzielt werden. Als besonders nachteilig ist auch das langwierige Herstellungsverfahren des Sensors einzuschätzen (vgl. Ausführungsbeispiel 1).The sensor described is clear not for the detection of concentrations in the lower nanomolar range suitable. The applications described for the sensor are aimed at one Concentration of the analyte in the millimolar range. In the embodiment 15 the sensitivity of the sensor is given as 0.8 nA / mM glucose and is about 5 orders of magnitude worse than the required sensitivity. Because of the arrangement of the multilayer system and the resulting large layer thickness The sensitive layer of the sensor can only respond times can be achieved in the minute range. Is particularly disadvantageous also assess the lengthy manufacturing process of the sensor (cf. embodiment 1).

Der Stand der Technik umfasst weiterhin verschiedene Vorrichtungen sowohl zur Messung von Wasserstoffperoxid als auch die Verwendung einer Referenz- bzw. Gegenelektrode bestehend aus Ag/AgCl.The prior art also includes various devices for both measuring hydrogen peroxide as well as the use of a reference or counter electrode from Ag / AgCl.

EP 1 026 500 A1 beschreibt eine Silber/Silberhalogenid-Elektrode als Ableitelektrode eines ionenselektiven Elektrodenelementes, also einen chemischen Sensor, der nach dem potentiometrischen Messprizip arbeitet. Das ionenselektive Elektrodenelement kann für die Konzentrationsbestimmung von biochemisch aktiven Ionen in Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin und Speichel verwendet werden. Dieses Elektrodenelement besitzt eine verbesserte Empfindlichkeit, was gemäß EP 1 026 500 A1 darauf zurückzuführn ist, dass die Silberchloridschicht im wesentlichen keine Schwermetallelemente enthält. Die Silberchloridschicht wird hergestellt durch chemische Oxidation der Silberschicht auf der Elektrode in Gegenwart von Halogenionen mit einem Oxidationsmittel, das entweder keine Schwermetallelemente enthält oder diese aus der gebildeten Silberchloridschicht leicht entfernt werden können (z. B. durch Auswaschen). EP 1 026 500 A1 describes a silver / silver halide electrode as the lead-off electrode of an ion-selective electrode element, ie a chemical sensor that works according to the potentiometric measurement principle. The ion-selective electrode element can be used to determine the concentration of biochemically active ions in body fluids such as blood, urine and saliva. This electrode element has an improved sensitivity, which according to EP 1 026 500 A1 this is due to the fact that the silver chloride layer contains essentially no heavy metal elements. The silver chloride layer is produced by chemical oxidation of the silver layer on the electrode in the presence of halogen ions with an oxidizing agent which either does not contain any heavy metal elements or which can be easily removed from the silver chloride layer formed (for example by washing out).

DE 19642413 A1 beschreibt eine Vorrichtung zur Dosierung wasserstoffperoxidhaltiger Lösungen. Ein Bestandteil dieser Vorrichtung ist die Messzelle zur Messung der Konzentration des Wasserstoffperoxids. Die 3-Elektrodenanordnung besitzt als Bezugselektrode eine Silber- oder eine Silberchloridelektrode. Die Messvorrichtung ist für die selektive Messung von Wasserstoffperoxid geeignet, allerdings nicht im submikromolaren Bereich. DE 19642413 A1 describes a device for dosing solutions containing hydrogen peroxide. A component of this device is the measuring cell for measuring the concentration of the hydrogen peroxide. The 3-electrode arrangement has a silver or a silver chloride electrode as a reference electrode. The measuring device is suitable for the selective measurement of hydrogen peroxide, but not in the submicromolar range.

US 5 938 917 A beschreibt einen chemischen Sensor zur Bestimmung von Peroxiden, u.a. auch Wasserstoffperoxid. Dazu wird eine Elektrode benutzt, die mit einem Polymer beschichtet ist, das Ferrocenyl- oder Ferrocenylalkyl-Gruppen trägt. Das Fe(II) wird in Anwesenheit von Peroxiden oxidiert und der Strom für die nachfolgende Reduktion des gebildeten Fe(III) an der Elektrode gemessen. Eine Ag/AgCl-Elektrode dient als Referenzelektrode. Nachteilig an dieser Erfindung ist die fehlende Selektivität für den Analyten Wasserstoffperoxid sowie die Tatsache, dass Konzentrationen nicht im submikromolaren Bereich gemessen werden können. US 5 938 917 A. describes a chemical sensor for the determination of peroxides, including hydrogen peroxide. For this purpose an electrode is used which is coated with a polymer which carries ferrocenyl or ferrocenylalkyl groups. The Fe (II) is oxidized in the presence of peroxides and the current for the subsequent reduction of the Fe (III) formed is measured at the electrode. An Ag / AgCl electrode serves as the reference electrode. A disadvantage of this invention is the lack of selectivity for the hydrogen peroxide analyte and the fact that concentrations cannot be measured in the submicromolar range.

US 6 033 866 beschreibt einen Einweg-Biosensor zur Messung des Blutzuckers, in dem Arbeits- und Gegenelektrode in einer Sandwich-Struktur angeordnet sind. Die Elektroden dieses Sensors sind in Siebdruck-Technik hergestellt. Die Gegenelektrode wird hier in einem einzigen Schritt als Gemisch aus Ag und AgCl gedruckt und ist in ihrer Dicke nicht für die Erfassung submikromolarer Konzentrationen geeignet. US 6 033 866 describes a disposable biosensor for measuring blood sugar, in which the working and counter electrodes are arranged in a sandwich structure. The electrodes of this sensor are made using screen printing technology. The counterelectrode is printed in a single step as a mixture of Ag and AgCl and its thickness is not suitable for the detection of submicromolar concentrations.

In US 5 401 377 wird ein potentiometrischer Sensor beschrieben, der durch Eintauchen eines isolierten Drahts, der an seiner Spitze keine Isolierung besitzt, in eine ein Ionophor enthaltene PVC-Lösung hergestellt wird. Dieser Draht kann ein mit AgCl beschichteter Ag-Draht sein. Er bildet die Ableitelektrode des Sensors.In US 5,401,377 describes a potentiometric sensor which is produced by immersing an insulated wire, which has no insulation at the tip, in a PVC solution containing an ionophore. This wire can be an Ag wire coated with AgCl. It forms the lead electrode of the sensor.

Nachteilig bei all diesen Lösungen ist, dass diese Vorrichtungen weder über eine gute Selektivität zur Erfassung von Wasserstoffperoxid noch über eine entsprechende Empfindlichkeit zur Erfassung submikromolarer Konzentrationen verfügen.The disadvantage of all these solutions is that these devices have neither good selectivity for Detection of hydrogen peroxide via a corresponding sensitivity to record submicromolar concentrations.

Aufgabe der Erfindung war es, einen preiswerten, einfach zu fertigenden und somit massenproduktionstauglichen Sensor für die quantitative H₂O₂-Konzentrationsbestimmung im submikromolaren Bereich bereitzustellen, der sich durch eine kurze run in-Phase auszeichnet. Der Sensor soll einfach handhabbar, leicht zu betreiben, robust gegenüber mechanischen Einflüssen, haltbar und ohne großen Aufwand lagerfähig sein. Aufgabe der Erfindung war es auch, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Sensors anzugeben.The object of the invention was to provide an inexpensive, easy-to-manufacture and therefore mass-production-compatible sensor for quantitative H ₂ O ₂ concentration determination in the submicromolar range, which is characterized by a short run-in phase. The sensor should be simple manageable, easy to operate, robust against mechanical influences, durable and easy to store. The object of the invention was also to provide a method for producing such a sensor.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass sich ein solcher H₂O₂-Sensor gemäß den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 herstellen lässt. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Herstellungsverfahrens sind Gegenstand der Unteransprüche.Surprisingly, it has been shown that such an H ₂ O ₂ sensor can be produced in accordance with the characterizing features of claim 1. Advantageous embodiments of the manufacturing method are the subject of the subclaims.

Zur Herstellung des 2-Elektrodensystems wird im Siebdruckverfahren auf ein Substrat, das vorzugsweise ein übliches Keramiksubstrat, z.B. der Firmen Ceramtec, Kyocera oder Coors ist, eine Platin- oder Goldelektrode als Arbeitselektrode aufgebracht. Als Gegenelektrode wird eine Silberelektrode aufgedruckt. Dazu stehen entsprechende kommerziell erhältliche Platin-Pasten, Gold-Pasten und Silber-Pasten z.B. der Firmen Du Pont, Heraeus, ESL oder Acheson zur Verfügung. Die zugehörigen Kontaktbahnen und Kontaktierungspunkte können z.B. mit einer Silber/Palladium-Paste oder Goldpaste aufgedruckt werden. Auch solche Pasten sind kommerziell erhältlich.To produce the 2-electrode system by screen printing on a substrate, which is preferably a conventional one Ceramic substrate, e.g. the company is Ceramtec, Kyocera or Coors, a platinum or gold electrode applied as the working electrode. As A silver electrode is printed on the counter electrode. Stand by corresponding commercially available Platinum pastes, gold pastes and silver pastes e.g. of companies you Pont, Heraeus, ESL or Acheson are available. The associated contact paths and contact points e.g. printed with a silver / palladium paste or gold paste become. Such pastes are also commercially available.

Wird als Substrat ein polymerer Träger, z.B. auf Polyimidbasis oder auf Basis von epoxidharzgetränkten Glasfasergeweben, z.B. FR-4 verwendet, so werden polymere Druckpasten z.B. von den Firmen Acheson oder DuPont zum Aufbringen der Elektroden eingesetzt.If a polymeric support, e.g. on Polyimide base or based on epoxy resin impregnated glass fiber fabrics, e.g. FR-4 is used, polymeric printing pastes e.g. from the Acheson companies or DuPont to apply the electrodes.

Zum Erreichen der angestrebten Sensitivität ist es erfindungswesentlich, dass die Arbeitselektrode mittels einer Pt- oder Au-Paste hergestellt wird. Im Gegensatz dazu wird üblicherweise aufgrund der großen Oberfläche Kohlepaste als Elektrodenmaterial oder aufgrund seiner elektrochemischen (große elektrochemische Überspannung für die elektrochemische Sauerstoff- und Wasserstoffentwicklung) und chemischen Eigenschaften (Möglichkeit der chemischen Immobilisierung von Enzymen auf der Elektrodenoberfläche) Kohlenstoff als Elektrodenmaterial verwendet.It is to achieve the desired sensitivity essential to the invention that the working electrode by means of a Pt or Au paste is produced. In contrast, is usually because of the big surface Carbon paste as an electrode material or due to its electrochemical (large electrochemical overvoltage for the electrochemical oxygen and hydrogen evolution) and chemical Properties (possibility the chemical immobilization of enzymes on the electrode surface) carbon used as electrode material.

Auf die nicht mit den Elektroden bedruckten Flächen des Substrates und auf die aufgebrachten Kontaktbahnen (aber nicht auf die Kontaktierungspunkte) wird als elektrisch isolierendes Material eine Lackschicht aufgedruckt. Sie dient der Isolation der Leiterbahnen.Not with the electrodes printed surfaces of the substrate and on the applied contact tracks (but not on the contact points) is used as an electrically insulating material printed a layer of lacquer. It serves to isolate the conductor tracks.

Das so hergestellte substratbasierte 2-Elektrodensystem aus Arbeits- und Gegenelektrode, den Kontaktbahnen und Kontaktierungspunkten und der Lackschicht ist auch kommerziell erhältlich und wird gemäß der Erfindung zum hochsensitiven Biosensor zur H₂O₂-Bestimmung modifiziert.The substrate-based 2-electrode system produced in this way, consisting of the working and counterelectrode, the contact tracks and contacting points and the lacquer layer, is also commercially available and is modified according to the invention into a highly sensitive biosensor for H ₂ O ₂ determination.

Erfindungsgemäß wird nun die aufgedruckte Silberelektrode vor Aufbringen einer Polymerschicht, die Mediator und Enzym immobilisiert, elektrochemisch modifiziert. Dazu wird in einer chloridhaltigen Lösung ein anodischer Strom durch die Silberelektrode geleitet, wobei sich diese mit einer dünnen Silberchloridschicht überzieht. Dadurch wird erreicht, dass die Referenzelektrode beim Messprozess ein nahezu konstantes Potential behält. Druckt man dagegen, wie es nahe liegt, eine silberchloridhaltige Paste auf, um eine potentialstabile Elektrode zu erzeugen, so wird die gewünschte Sensitivität des Biosensors nicht erreicht.According to the invention, the silver electrode is now printed before applying a polymer layer that immobilizes the mediator and enzyme, modified electrochemically. This is done in a chloride-containing solution anodic current is passed through the silver electrode, whereby this with a thin one Silver chloride layer covers. This ensures that the reference electrode during the measuring process maintains an almost constant potential. If you print how it suggests a paste containing silver chloride to make a potential stable To produce an electrode, the desired sensitivity of the biosensor is not reached.

Im nächsten Schritt wird die einen Mediator und ein Enzym enthaltende Polymerschicht auf die Elektroden aufgebracht. Die Polymerschicht wird in der Weise hergestellt, dass eine Lösung oder Suspension, die Polymer, Mediator und Enzym enthält, gleichmäßig sowohl auf die Arbeitselektrode als auch auf die Gegenelektrode und den Zwischenraum zwischen den Elektroden oder nur auf die Arbeitselektrode aufgebracht und eintrocknen gelassen wird. Vorzugsweise sollte das Aufbringen und Trocknen bei einer Temperatur von 18–35°C erfolgen, bevorzugt bei 20 bis 25°C.The next step is one Mediator and an enzyme-containing polymer layer on the electrodes applied. The polymer layer is produced in such a way that a solution or suspension containing polymer, mediator and enzyme, both equally on the working electrode as well as on the counter electrode and the Gap between the electrodes or only on the working electrode applied and allowed to dry. Preferably, that should Apply and dry at a temperature of 18-35 ° C, preferably at 20 to 25 ° C.

Als Mediatoren werden Tetrathiafulvalen (TTF) oder seine Derivate, wie z.B. Mono- und Polycarbonsäurederivate oder Mono- und Polyaminoderivate, Ferrocen, Hexacyanoferrat, N-Methylphenazinium (NMP⁺), Methylacridinium (NMA) oder 7,7,8,8-Tetracyanparachinodimethan (TCNQ) eingesetzt.Mediators are tetrathiafulvalene (TTF) or its derivatives, such as mono- and polycarboxylic acid derivatives or mono- and polyamino derivatives, ferrocene, hexacyanoferrate, N-methylphenazinium (NMP ⁺ ), methylacridinium (NMA) or 7,7,8,8-tetracyano parachinodimethane ( TCNQ) used.

Als Polymer finden erfindungsgemäß bevorzugt Polyurethane, z.B. aliphatische Polycarbonatdiolurethane, aliphatische Polyesterurethane, aliphatische Polyetherurethane, aromatische Polyesterurethane, Mischungen dieser Urethane oder Mischungen dieser Urethane mit Acrylaten wie z.B. mit anionischen Acrylaten, nichtionischen Acrylaten, anionischen Methacrylaten und modifizierten anionoschen Acrylaten Verwendung. Auch Polyacrylate können eingesetzt werden.According to the invention, the preferred polymer is Polyurethanes, e.g. aliphatic polycarbonate diol urethanes, aliphatic Polyester urethanes, aliphatic polyether urethanes, aromatic polyester urethanes, Mixtures of these urethanes or mixtures of these urethanes with acrylates such as. with anionic acrylates, nonionic acrylates, anionic Methacrylates and modified anionic acrylates use. Polyacrylates can also be used become.

Als Enzym finden Peroxidasen Verwendung. In einer erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym Meerrettich-Peroxidase oder Sojabohnen-Peroxidase. Es ist nicht erforderlich, dass das Enzym thermostabil ist.Peroxidases are used as the enzyme. In one preferred according to the invention embodiment is the enzyme horseradish peroxidase or soybean peroxidase. The enzyme is not required to be thermostable.

Je nach eingesetztem Polymer, Mediator und Enzym wird eine Lösung, oder eine Suspension hergestellt, welche alle drei Komponenten enthält. Dazu werden zunächst Lösungen des Enzyms und des Mediators hergestellt. Für die Lösung des Enzyms und des Mediators eignen sich, je nach dem, welches Enzym und welcher Mediator verwendet werden, Wasser, Ethanol, Essigsäureethylester, Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF) und Mischungen aus diesen Lösungsmitteln. Diese Lösungen werden mit einer wässrigen Suspension des Polymers vermischt. Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, zunächst z.B. eine wässrige Peroxidaselösung mit einer wässrigen aliphatischen Polyurethan-Suspension zu mischen und dieses Gemisch wiederum mit einer essigsäureethylesterhaltigen alkoholischen TTF-Lösung zu vermischen. Bevorzugt werden Enzym-, Mediator- oder Polymerkonzentrationen von 0,5–2% eingesetzt. Für Enzym und Mediator sind Konzentrationen von 1–1,5% besonders bevorzugt. Die Konzentration des Polymers sollte in einer besonders bevorzugten Ausführungsform 1,5–2% betragen.Depending on the polymer, mediator and enzyme used, a solution or suspension is prepared that contains all three components. For this purpose, solutions of the enzyme and the mediator are first prepared. Depending on the enzyme and mediator used, water, ethanol, ethyl acetate, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF) and mixtures of these solvents are suitable for the solution of the enzyme and the mediator. These solutions are mixed with an aqueous suspension of the polymer. It has proven to be advantageous to first mix, for example, an aqueous peroxidase solution with an aqueous aliphatic polyurethane suspension and in turn to mix this mixture with an alcoholic TTF solution containing ethyl acetate. Enzyme, mediator or polymer concentrations of 0.5-2% are preferably used. For enzyme and media Concentrations of 1-1.5% are particularly preferred. In a particularly preferred embodiment, the concentration of the polymer should be 1.5-2%.

Es hat sich gezeigt, dass der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte H₂O₂-Biosensor eine run-in Zeit von weniger als 30 Minuten hat und sich H₂O₂-Konzentrationen im nanomolaren Bereich zuverlässig messen lassen. Die Herstellung des Grundsensors auf der Basis des Siebdruckes in Dickschichttechnologie ist ein für eine Massenproduktion geeignetes und preiswertes Verfahren. Die Immobilisierung des Enzyms und des Mediators mit Hilfe eines Polymers erfolgt zeitsparend in einem Schritt und lässt sich ebenfalls automatisieren. Der Sensor ist ohne besondere Hilfsmittel lange haltbar und bei geringer Größe gut lagerbar.It has been shown that the H ₂ O ₂ biosensor produced according to the method according to the invention has a run-in time of less than 30 minutes and that H ₂ O ₂ concentrations can be measured reliably in the nanomolar range. The production of the basic sensor on the basis of screen printing in thick-film technology is a suitable and inexpensive method for mass production. The immobilization of the enzyme and the mediator using a polymer saves time in one step and can also be automated. The sensor can be stored for a long time without special aids and can be stored well in small sizes.

In einer bevorzugten geometrischen Ausgestaltung ist das Substrat 1 planar und besonders bevorzugt weist der Sensor die in 1 dargestellte geometrische Ausgestaltung auf. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung enthält die Polymerschicht des erfindungsgemäßen Biosensors das Enzym, den Mediator und das Polymer im Verhältnis (w/v) von 0,25–4 0,25–4 : 1, vorzugsweise von 0,5–1,3 : 0,5–1,3 : 1.In a preferred geometric configuration, the substrate 1 is planar, and the sensor particularly preferably has the in 1 shown geometric design. In a further advantageous embodiment, the polymer layer of the biosensor according to the invention contains the enzyme, the mediator and the polymer in a ratio (w / v) of 0.25-4 0.25-4: 1, preferably 0.5-1.3: 0.5-1.3: 1.

Zum Betrieb des Sensors wird dieser bevorzugt in einer Durchflusszelle mit einem Strömungskanal so fixiert, dass der Biosensor eine Wand des Strömungskanals bildet und die mit der sensitiven Polymerschicht bedeckte Arbeitselektrode und ein Teil der Gegenelektrode von der Probe überspült werden. Der Fluss durch die Messzelle wird durch eine möglichst pulsationsarme Pumpe gewährleistet. Mit Hilfe des Potentiostaten wird zwischen Arbeitselektrode und Gegenelektrode eine Spannung angelegt und der resultierende Strom gemessen. Die Messsignale des Potentiostaten können mit analogen oder digitalen Aufzeichnungsgeräten, z.B. einem y-t-Schreiber, aufgezeichnet werden. Das Grundsignal des Sensors erhält man, wenn man eine H₂O₂-freie Lösung durch die Messzelle pumpt. Wird eine H₂O₂-haltige Lösung durch die Messzelle gepumpt, erhält man ein der Analytkonzentration entsprechendes Sensorsignal.To operate the sensor, it is preferably fixed in a flow cell with a flow channel in such a way that the biosensor forms a wall of the flow channel and the working electrode covered with the sensitive polymer layer and part of the counter electrode are washed over by the sample. The flow through the measuring cell is guaranteed by a pump with as little pulsation as possible. With the help of the potentiostat, a voltage is applied between the working electrode and the counter electrode and the resulting current is measured. The measurement signals of the potentiostat can be recorded with analog or digital recording devices, eg a yt recorder. The basic signal of the sensor is obtained when an H ₂ O ₂ -free solution is pumped through the measuring cell. If an H ₂ O ₂ -containing solution is pumped through the measuring cell, a sensor signal corresponding to the analyte concentration is obtained.

Die mit zehn erfindungsgemäßen Biosensoren ermittelten Messwerte bei H₂O₂-Konzentrationen von 15 nM bis 2.000 nM gemäß 2 zeigen, dass die Abhängigkeit des Biosensorsignals in diesem Bereich der H₂O₂-Konzentration linear ist und damit der Biosensor leicht kalibrierbar ist.The measured values determined with ten biosensors according to the invention at H ₂ O ₂ concentrations from 15 nM to 2,000 nM according to 2 show that the dependence of the biosensor signal in this area of the H ₂ O ₂ concentration is linear and that the biosensor is therefore easy to calibrate.

Untersuchungen zur Haltbarkeit des Sensors haben gezeigt, dass bei einer trockenen Lagerung im Kühlschrank bei 4°C nach 3 Monaten kein signifikanter Empfindlichkeitsverlust auftritt. Studies on the durability of the Sensors have shown that dry storage in the refrigerator at 4 ° C there is no significant loss of sensitivity after 3 months.

1. zeigt den erfindungsgemäßen Biosensor in einer bevorzugten Ausführungsform. 1 , shows the biosensor according to the invention in a preferred embodiment.

Es bedeuten:

1 Substrat
2 Platin- oder Goldarbeitselektrode
3 Ag/AgCl-Referenzelektrode
4 Lackschicht
5 Zwischenraum zwischen den Elektroden
6 Kontaktbahnen der Elektroden

It means:

1 substrate
2 platinum or gold working electrodes
3 Ag / AgCl reference electrode
4 lacquer layer
5 gap between the electrodes
6 contact paths of the electrodes

2 zeigt die durchschnittlichen Messwerte, die mit zehn erfindungsgemäßen Biosensoren (Arbeitselektrode Platin, Gegenelektrode Ag/AgCl, Keramiksubstrat, Enzym Peroxidase, Mediator TTF, Polymer Polyurethan) erhalten wurden. Es wurden Probelösungen unterschiedlicher H₂O₂-Konzentrationen von 15 nM bis 2.000 nM in 0,033 M chloridhaltigem Phospatpuffer (pH = 7,1) vermessen. Das an die Arbeitselektrode angelegte Potential betrug –100mV vs. Ag/RgCl. 2 shows the average measured values obtained with ten biosensors according to the invention (working electrode platinum, counter electrode Ag / AgCl, ceramic substrate, enzyme peroxidase, mediator TTF, polymer polyurethane). Sample solutions of different H ₂ O ₂ concentrations from 15 nM to 2,000 nM in 0.033 M chloride-containing phosphate buffer (pH = 7.1) were measured. The potential applied to the working electrode was –100mV vs. Ag / RgCl.

Claims

Method of manufacturing an amperometric biosensor to determine the hydrogen peroxide concentration using a thick-film technology manufactured 2-electrode system on a substrate and application of an enzyme and one. Mediators on the electrodes, being a screen electrode 2-electrode system is used, the on a substrate a platinum or gold electrode as the working electrode, a Silver electrode as counter electrode, its contact tracks and contact points and has an electrically insulating lacquer layer that the not with the printed surfaces of the substrate and the applied contact tracks covered, the silver electrode the 2-electrode system is electrochemically coated with a silver chloride layer, by in a chloride solution an anodic current is passed through the silver electrode, then a solution or suspension containing a polymer, the mediator and the enzyme, homogeneously the electrodes and their space or only on the working electrode is applied and dried.

A method according to claim 1, characterized in that as Mediator tetrathiafulvalen (TTF) or its derivatives used become.

A method according to claim 1, characterized in that as Polymer a polyurethane or a polyacrylate or a mixture is used from these polymers.

A method according to claim 1, characterized in that as Enzyme a peroxidase is used.

A method according to claim 1, characterized in that the solution or suspension the enzyme, the mediator and the polymer in one Concentration of 0.5–2% each contains.

A method according to claim 1, characterized in that the Application and drying of the mediator, the enzyme and the polymer containing solution or suspension is carried out at a temperature of 18-35 ° C.

Amperometric thick-film biosensor for determining the hydrogen peroxide concentration in a solution manufactured according to one of the claims 1 to 6.