DE102008013715A1

DE102008013715A1 - Method for DNA analysis

Info

Publication number: DE102008013715A1
Application number: DE200810013715
Authority: DE
Inventors: Claudia Bauer; Peter Dr. Bauer; Olaf Prof. Dr. Rieß
Original assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Current assignee: Eberhard Karls Universitaet Tuebingen
Priority date: 2008-02-29
Filing date: 2008-02-29
Publication date: 2010-04-08
Anticipated expiration: 2028-03-01
Also published as: WO2009106322A1; DE102008013715B4

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von kleineren DNA-Fragmenten aus komplexer genomischer DNA, sowie ein Verfahren zur Anlyse von genomischer DNA, wobei das Verfahren zur Anreicherung eingesetzt wird.The present invention relates to a method for the enrichment of smaller DNA fragments from complex genomic DNA, as well as a method for the analysis of genomic DNA, wherein the method of enrichment is used.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung zusammenhängender genomischer DNA-Fragmente aus zu untersuchender komplexer genomischer DNA, und ein Verfahren zur Analyse der mit diesem Anreicherungsverfahren gewonnenen DNA-Fragmente, sowie den Einsatz des Verfahrens zur Untersuchung von Mutationen in genomischer DNA, insbesondere von Mutationen bei Genen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind und/oder zur Identifizierung von Genen, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind.The The present invention relates to a process for enriching related Genomic DNA fragments from complex genomic to be examined DNA, and a method of analysis using this enrichment method recovered DNA fragments, as well as the use of the method for investigation of mutations in genomic DNA, in particular of mutations in Genes associated with certain diseases and / or to Identification of genes associated with certain diseases are.

In der modernen molekularen Biologie ist die gezielte Anreicherung von spezifischen Regionen aus komplexen Genomen ein wichtiger Schritt, um nachfolgend spezifische Sequenzabschnitte analysieren und identifizieren zu können, wobei gegenwärtig insbesondere die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt wird, die sich innerhalb der letzen Jahre als die herausragende Anreicherungsmethode erwiesen hat. Daneben sind im Stand der Technik ferner Verfahren zu schnellen und kostengünstigen Produktion dichter DNA-Microarrays bekannt, sowie Verfahren, mit welchen DNA im Hochdurchsatz parallel sequenziert werden kann. Der Einsatz von Microarrays in Kombination mit den weiteren Verfahren der Sequenzierung und PCR hat es der Wissenschaft ermöglicht, riesige Mengen von Daten zu verarbeiten und zu verstehen.In Modern molecular biology is targeted enrichment of specific regions of complex genomes is an important step, to subsequently analyze and identify specific sequence segments at present, in particular the Polymerase chain reaction (PCR) is used, which is within In recent years, it has proved to be the outstanding enrichment method Has. In addition, methods are also to be speeded up in the prior art and cost-effective production of dense DNA microarrays as well as methods by which DNA is sequenced in high throughput in parallel can be. The use of microarrays in combination with the Further methods of sequencing and PCR have science allows to process huge amounts of data and to understand.

Ein großes Ziel der molekulardiagnostischen Wissenschaft ist es nämlich, mit den verfügbaren Verfahren und Techniken mittels einer spezifischer Anreicherung innerhalb der komplexen Struktur der genomischen DNA Sequenzabschnitte bzw. Gene zu identifizieren, über welche Krankheiten diagnostiziert und ggf. auch gezielt behandelt werden können.One great goal of molecular diagnostic science is namely, with the available procedures and Techniques by means of a specific enrichment within the complex structure of the genomic DNA sequence sections or genes to identify what diseases are diagnosed and if necessary, can also be targeted.

So erlauben gegenwärtig neuartige Sequenziertechnologien (hochdichte Parallelsequenzierung) die Resequenzierung von mehreren Megabasen von individuellen Genomen. Auf diese Weise lassen sich bspw. komplette Bakteriengenome (100 Mb) auf einmal innerhalb von drei bis fünf Tagen re-sequenzieren bzw. de-novo-sequenzieren. Allerdings übersteigt das menschliche Genom, wie auch die Genome vieler anderer Spezies, die Sequenzierkapazität dieser Technologien um das Vielfache, weil gerade Abweichungen vom Normalzustand etwa 5 bis 20 Mal unabhängig untersucht werden müssen, bevor mit hinreichender Sicherheit bspw. eine krankhafte Mutation entdeckt werden kann.So currently allow novel sequencing technologies (high density Parallel sequencing) the resequencing of several megabases of individual genomes. In this way can be, for example, complete Bacterial genomes (100 Mb) at once within three to five Re-sequence or de-novo sequence days. However, it exceeds the human genome, as well as the genomes of many other species, the sequencing capacity of these technologies many times over, because deviations from the normal state are about 5 to 20 times independent have to be examined before with reasonable assurance for example, a pathological mutation can be detected.

Die genomische Forschung und die molekulargenetische Diagnostik bei Menschen wie auch bei vielen anderen Spezies oder Modellorganismen pflanzlicher oder tierischer Art stellt die Wissenschaft vor zwei wiederkehrende aufwändige bzw. überfordernde Herausforderungen.The genomic research and molecular genetic diagnostics Humans as well as many other species or model organisms of plant or animal-type science presents two recurring time-consuming or overwhelming challenges.

So wird gegenwärtig bei der Mutationssuche in bekannten Krankheitsgenen mit der konventionellen Sanger-Sequenziermethode das Krankheitsgen bzw. die Krankheitsgene in einzelnen Exonen analysiert und dann Dutzende Einzelbefunde zu einem Gesamtergebnis zusammengefügt. Die Nachteile bei diesem Ansatz liegen darin, dass einerseits eine Vielzahl von Einzeluntersuchungen erforderlich ist, die zeitlich synchronisiert werden müssen; so erfordert bspw. eine Mutationssuche in den bekannten Brustkrebsgenen 76 Einzelanalysen von 100 bis 500 Basenpaaren. Ferner ist von Nachteil, dass der Verlust größerer genomischer Abschnitte (”exonische Deletionen”) nicht bemerkt werden, da die PCR-Analytik in solchen Bereichen regelmäßig zu fälschlich unauffälligen Befunden führt (”allelic drop out”). Für die Brustkrebsgene müssten diese Mutationsformen, die immerhin 5 bis 10% aller bekannten Mutationen darstellen, durch aufwändig etablierte Spezialuntersuchungen kontrolliert werden.So is currently in the mutation search in known disease genes with the conventional Sanger sequencing method the disease gene or the disease genes are analyzed in single exons and then dozens Individual findings combined to form an overall result. The Disadvantages of this approach are that on the one hand a variety required by individual examinations, which synchronized in time Need to become; For example, a mutation search in the known breast cancer genes 76 individual analyzes from 100 to 500 Base pairs. Furthermore, it is disadvantageous that the loss of larger genomic sections ("exonic deletions") not be noticed, since the PCR analysis in such areas regularly leads to falsely inconspicuous findings ("Allelic drop out"). For the breast cancer genes would have these mutation forms, which at least 5 to 10% of all represent known mutations, by consuming established Special examinations are controlled.

Daher besteht trotz dieser gegenwärtig verfügbaren Verfahren bei der Größe der Säugetiergenome (bis zu 3 Gb) der große Nachteil, dass mit einzelnen Experimenten keine sorgfältigen Screenings durchgeführt werden können.Therefore exists despite these currently available methods at the size of mammalian genomes (to to 3 Gb) the big disadvantage that with individual experiments no careful screenings are done can.

Auch muss berücksichtigt werden, dass bei den konventionellen Verfahren nur exonische Abschnitte der Gene analysiert werden, weil die großen Introns Aufwand und Kosten vervielfachen. Obgleich oftmals klinisch relevante Mutationen in diesen intronischen Abschnitten seltener sind, werden diese jedoch dadurch systematisch übersehen.Also must be taken into account that with the conventional Procedures only exonic sections of genes are analyzed because the big introns multiply effort and cost. Although often clinically relevant mutations in these intronic sections However, they are systematically overlooked.

Ferner müssen die PCR-Ansätze, die der Mutationssuche zugrunde gelegt werden, zunächst getestet werden, was sehr zeitaufwändig ist und zu einem hohen personellem Aufwand führt. Auch die Durchführung der PCR-Reaktionen verursacht einen hohen Kosten- und Zeitaufwand, da diese mit vergleichbaren Protokollen durchgeführt werden müssen, um reproduzierbare und aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, so dass einerseits diese Reaktionen erst etabliert werden müssen, und andererseits auch nach der Etablierung oft mehrere der Reaktionen für die Analyse eines Individuums erforderlich sind.Further need the PCR approaches that the mutation search be based on, first tested, which is very is time-consuming and at a high staff effort leads. Also performing the PCR reactions causes a high cost and time, since these with comparable Logs must be performed to be reproducible and deliver meaningful results, so on the one hand these reactions must first be established, and on the other hand after establishing often several of the reactions for the Analysis of an individual are required.

Auch die Mutationssuche in unbekannten Krankheitsgenen stellt heute die Wissenschaft vor große Herausforderungen. Hierbei wurde insbesondere die positionelle Klonierungstechnik eingesetzt, mithilfe derer Krankheitsgene identifiziert werden konnten, und die dadurch zu relevanten medizinischen Durchbrüchen geführt hat. Dabei werden beginnend mit der Kopplungsanalyse in großen Familien mit der nachfolgenden Sequenzierung von Kandidatengenen immer wiederkehrend umschriebene Abschnitte des humanen Genoms analysiert.Also, the mutation search in unknown disease genes today presents the science with great challenges. In particular, the positional cloning technique was used to identify disease genes, leading to relevant medical breakthroughs. Beginning with the coupling analysis in large families, the subsequent sequencing of Kandi datengenen repeatedly circumscribed sections of the human genome analyzed.

Die Nachteile bei dieser Methode sind dabei u. a., dass selbst in großen, aufwändig vorbereiteten Studien oft Dutzende von Genen in zahlreichen Patienten jeweils exonweise durchsequenziert werden, wobei es selten gelingt, alle Abschnitte in ausgezeichneter Qualität darzustellen. Ferner sind diese Analysen seriell und damit sehr zeit- und kostenintensiv. Gleichzeitig ist dabei das Risiko, durch Fehlannotation das entscheidende Gen überhaupt nicht zu untersuchen, sehr hoch.The Disadvantages of this method are u. a. that even in big, lavishly prepared studies often contain dozens of genes be sequenced exonweise in numerous patients, wherein It rarely manages all sections in excellent quality display. Furthermore, these analyzes are serial and therefore very time and cost intensive. At the same time there is the risk, through Fehlannotation the decisive gene not at all examine, very high.

Kandidatenregionen, also Regionen, in denen mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit Mutationen vorliegen, die Krankheiten hervorrufen können, sind regelmäßig etwa 500 kb bis 10 Mb groß. Daher wäre es wünschenswert, ein Verfahren zu entwickeln, mit welchem DNA-Moleküle beliebiger Patienten dieser jeweiligen Kandidatenregion anzureichern und nachfolgend zu analysieren.Candidate regions, ie regions where with a certain probability There are mutations that can cause disease regularly about 500 kb to 10 Mb in size. Therefore, it would be desirable to have a method too develop with which DNA molecules of any patient to enrich this respective candidate region and subsequently analyze.

Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein robustes und flexibles Anreicherungsverfahren bereitzustellen, mit welchem relativ kleine Abschnitte eines komplexen Genoms (50 kb bis 10 Mb) angereichert werden können.In front This is the object of the present invention to provide a robust and flexible enrichment process, with which relatively small sections of a complex genome (50 kb up to 10 Mb) can be enriched.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, welches die folgenden Schritte aufweist:

a) Bereitstellen von doppelsträngigen DNA-Sonden, die Sequenzen aufweisen, welche Sequenzen in der zu untersuchenden komplexen genomischen DNA entsprechen,
b) Immobilisierung der doppelsträngigen DNA-Sonden aus Schritt a) an einen Träger,
c) Denaturieren der doppelsträngigen DNA-Sonden zur Herstellung von an den Träger gebundenen einzelsträngigen DNA-Sonden,
d) Fragmentieren und ggf. Denaturieren der zu untersuchenden genomischen DNA zur Herstellung von genomischen DNA-Fragmenten,
e) Inkubieren und Hybridisieren von fragmentierter und ggf. denaturierter genomischer DNA mit an den Träger immobilisierten einzelsträngigen DNA-Sonden,
f) ggf. Entfernen von nicht hybridisierter genomischer DNA, und
g) Eluieren von spezifisch an die DNA-Sonden gebundenen genomischen DNA-Fragmenten von dem Träger.

According to the invention, this object is achieved by a method comprising the following steps:

a) providing double-stranded DNA probes having sequences which correspond to sequences in the complex genomic DNA to be examined,
b) immobilization of the double-stranded DNA probes from step a) to a carrier,
c) denaturing the double-stranded DNA probes to produce carrier-bound single-stranded DNA probes,
d) fragmenting and optionally denaturing the genomic DNA to be examined for the production of genomic DNA fragments,
e) incubating and hybridizing fragmented and optionally denatured genomic DNA with single-stranded DNA probes immobilized on the support,
f) optionally removing unhybridized genomic DNA, and
g) eluting genomic DNA fragments bound specifically to the DNA probes from the support.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst.The The object underlying the invention is complete in this way solved.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Anreicherungsverfahren kleinerer DNA-Fragmente aus zu untersuchender komplexer genomischer DNA bereitgestellt, welches höchst flexibel ist und welches es ermöglicht, DNA-Fragmente von Interesse schnell und gezielt anzureichern, wonach diese nachfolgend zuverlässig analysiert werden können, bspw. mittels einer in vitro-Amplifikation bzw. einer direkten Sequenzierung.With In the present invention, an enrichment process becomes smaller Provided DNA fragments of complex genomic DNA to be examined, which is highly flexible and which allows To enrich DNA fragments of interest quickly and purposefully, after which these can be reliably analyzed below, For example, by means of an in vitro amplification or direct sequencing.

Mit der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren zur Probenanreicherung bereitgestellt, mit welchem die Komplexität von genomischer DNA erfolgreich und in reproduzierbarer Weise reduziert werden kann.With The present invention provides a novel method for sample enrichment provided with which the complexity of genomic DNA can be successfully and reproducibly reduced.

Dabei werden also zunächst DNA-Sonden bereitgestellt, die – bspw. über bestimmte Markierungen – an einem Träger immobilisiert werden. Die DNA-Sonden, bzw. die Quelle für die Sonden, werden dabei gezielt im Hinblick auf den zu untersuchenden Genomabschnitt ausgewählt, und können eine zufällige Fragmentlänge von ca. 100 bp bis 3000 bp, insbesondere von zwischen 250 bp und 1000 bp als vorteilhaft erwiesen haben. Nach der Immobilisierung der Sonden werden diese denaturiert, d. h. der Doppelstrang der DNA-Sonden wird in zwei Einzelstränge aufgebrochen. Parallel dazu wird die zu untersuchende genomische DNA (zufällig) fragmentiert, wobei sich Fragmente mit einer Größe von etwa 100 bis 3000 bp, insbesondere von 250 bis 1000 bp als besonders vorteilhaft herausgestellt haben. Diese Angaben zu den Fragmentlängen sind aber lediglich beispielhaft, weshalb auch kleinere oder größere Längen eingesetzt werden können. Nach der Fragmentierung wird die genomische DNA ggf. denaturiert, also in Einzelstränge zerlegt, wobei dies bspw. durch Erhitzen der Fragmente in einem Puffer, vorzugsweise in einem Hybridisierungspuffer, vorgenommen wird, oder aber alkalisch. Andererseits, insbesondere bei Verwendung von sogenannter Library-DNA ist eine Denaturierung nicht immer notwendig, da diese bereits auch in einzelsträngiger Form vorliegt. Dem Fachmann wird klar sein, dass er, je nach Art und Form der zu untersuchenden genomischen DNA, einen Denaturierungsschritt vorsehen muss oder nicht.there Thus, first DNA probes are provided, which - for example. About certain markings - immobilized on a support become. The DNA probes, or the source for the probes, be targeted with regard to the genome section to be examined selected, and can be a random one Fragment length of about 100 bp to 3000 bp, in particular between 250 bp and 1000 bp have proved to be advantageous. After immobilization of the probes they are denatured, d. H. the double strand of DNA probes is split into two single strands broken up. In parallel, the genomic to be examined Fragmented DNA (random), fragments with a Size of about 100 to 3000 bp, in particular of 250 to 1000 bp have been found to be particularly advantageous. However, these details of the fragment lengths are merely exemplary. which is why smaller or larger lengths can be used. After fragmentation becomes the genomic DNA possibly denatured, ie in single strands decomposing, for example, by heating the fragments in one Buffer, preferably in a hybridization buffer made becomes, or alkaline. On the other hand, especially when used of so-called library DNA, denaturation is not always necessary since this is already present in single-stranded form. It will be clear to a person skilled in the art that, depending on the type and form of the genomic DNA must provide for a denaturation step or not.

Die Fragmentierung der genomischen DNA kann dabei bspw. mittels eines oder mehrerer Restriktionsenzymen, durch Ultraschallbeschallung, durch Nebulisation durchgeführt werden.The Fragmentation of the genomic DNA can, for example, by means of a or multiple restriction enzymes, by sonication Nebulization be performed.

Die fragmentierte und ggf. denaturierte genomische DNA wird anschließend zu den auf den Träger immobilisierten Sonden gegeben, bspw. in einer Menge von 0,1–20 μg, wobei sich eine Menge von 10 bis 20 μg als vorteilhaft erwiesen hat, wonach der Ansatz anschließend zur Hybridisierung über einen Zeitraum inkubiert wird. Bei diesem Schritt lagern sich zwei DNA-Einzelstränge, die komplementäre Rasensequenzen besitzen, zu Doppelsträngen zusammen.The fragmented and possibly denatured genomic DNA is subsequently given to the immobilized on the carrier probes, eg. in an amount of 0.1-20 μg, wherein one Amount of 10 to 20 ug has proved to be advantageous, after which Approach to hybridization via a Period is incubated. In this step, two DNA single strands, have the complementary Rasensequenzen to double strands together.

Die Hybridisierungsbedinungen zwischen Sonde und Ziel (also die Fragmente) sollten dabei derart gewählt werden, dass die spezifische Wechselwirkung zwischen Sonde und Ziel, bzw. die Erkennungs- und Bindungsreaktion (”Hybridisierung”) der beiden Moleküle sowohl ausreichend spezifisch als auch hinreichend stabil ist. Dabei werden regelmäßig Bedingungen gewählt, die allgemein gleichmäßig stabil unabhängig von den spezifisch beteiligten Sequenzen sind, wobei Puffer, Inkubationsdauer und Inkubationstemperatur zu berücksichtigende Faktoren sind.The Hybridization conditions between probe and target (ie the fragments) should be chosen in such a way that the specific Interaction between probe and target, or the recognition and Binding reaction ("hybridization") of the two Molecules both sufficiently specific and sufficient is stable. There are regular conditions chosen, the generally uniformly stable are independent of the specific sequences involved, taking into account buffer, incubation time and incubation temperature Factors are.

Vorliegend wird bspw. ein Hybridisierungspuffer eingesetzt, der 5 × SSC (0,75 M NaCl, 75 mM NaCitrat, pH 7 0,1% (w/v) N-Laurly-Sarcosin; 0,02% (W/V) SDS; 2% Blocking Reagens (Kasein-Fraktion fettfreier Trockenmilch) enthält. Die Reaktion wird dann bspw. für eine Dauer von 1 bis 80 Stunden, vorzugsweise von 60 Stunden inkubiert.present For example, a hybridization buffer containing 5 × SSC is used (0.75 M NaCl, 75 mM Na citrate, pH 7 0.1% (w / v) N-lauryl sarcosine; 0.02% (w / v) SDS; 2% Blocking Reagent (casein fraction less fat Dry milk). The reaction is then, for example, for a period of 1 to 80 hours, preferably incubated for 60 hours.

Nach der Hybridisierungsreaktion kann der Träger gewaschen werden, bspw. über ein bis mehrere, vorzugsweise drei, Waschschritte mit einem Waschpuffer, wodurch alle nicht durch Hybridisierung gebundenen Anteile der Ziel-DNA entfernt werden. Dabei kann jeder beliebige Waschpuffer eingesetzt werden, der keinen Einfluss auf die hybridisierten Produkte hat, mit dem jedoch nicht gebundene genomische DNA-Fragmente abgewaschen werden können.To the hybridization reaction, the carrier can be washed, for example, one to several, preferably three, washing steps with a wash buffer, eliminating all bound by hybridization Shares of the target DNA are removed. Anyone can do this Wash buffer can be used, which does not affect the hybridized products has, however, washed off with the unbound genomic DNA fragments can be.

Im letzten Schritt werden dann die komplementär zu den einzelsträngigen DNA-Sonden gebundenen, ebenfalls einzelsträngigen DNA-Fragmente (die ”Targets” bzw. Ziele) der genomischen DNA mobilisiert, bspw. durch alkalische Lyse oder durch Hitze. Unter ”Eluieren” ist dabei jede Verfahrensmaßnahme zu verstehen, mit dem die Targets vom Träger – und damit von den an den Träger immobilisierten Sonden – gelöst werden. Es versteht sich, hierdurch gewonnenen Fragmente für eine weitere Analyse ggf. noch in der Lösung neutralisiert werden müssen, insbesondere bei einem Einsatz einer alkalischen Lyse für die Immobilisierung. Dem Fachmann wird klar sein, welche Bedingungen er für welche Analyse wählen muss, um diese durchführen zu können.in the The last step will then be complementary to the single-stranded ones DNA probes bound, also single-stranded DNA fragments (the "targets" or Targets) of the genomic DNA, for example by alkaline lysis or by heat. Each one is under Eluting To understand procedural measure with which the targets of Carrier - and thus from the to the carrier immobilized probes - to be solved. It understands itself, fragments obtained thereby for a further analysis if necessary still need to be neutralized in the solution, in particular when using an alkaline lysis for immobilization. The skilled person will be clear what conditions he for what analysis must choose to perform this to be able to.

In der vorliegenden Erfindung wird dabei unter ”genomischer DNA” bzw. ”Genom” das gesamte genetische Material eines Organismus verstanden. Dabei ist die DNA (Desoxyribonucleinsäure), die aus dem genetischen Material in dem Chromosom eines bestimmten Organismus abgeleitet ist, die ”genomische DNA”. Ferner ist unter einer ”genomischen Bibliothek” oder ”genomische Library-DNA” eine Sammlung von Klonen zu verstehen, die aus einem Satz von zufällig generierten, überlappenden DNA-Fragmenten, die das gesamte Genom eines Organismus repräsentieren, hergestellt wurde. Diese – vorliegend auch ”Library-DNA” genannte – genomische DNA liegt oftmals auch bereits in Einzelstrangform vor. In diesem Zusammenhang sind vorliegend unter genomischen ”DNA-Fragmenten” kleinere Abschnitte des Gesamtgenoms zu verstehen, die eine Länge von ca. 50 bis ca. 5000 bp aufweisen können, wobei als Vergleich das Genom von bspw. Säugetieren eine Größe von bis zu 3 Gb besitzen kann. Vorliegend kann also, wenn von ”genomischer DNA” die Rede ist, nicht nur die aus dem genetischen Material in dem Chromosom eines bestimmten Organismus abgeleitete oder gewonnene gesamte genomische DNA eines Organismus zu verstehen sein, sondern eben auch die in Form einer Bibliothek oder Library vorliegenden DNA-Fragmente, die das gesamte Genom eines Organismus repräsentieren.In The present invention is under genomic DNA "or" genome "the entire genetic Understood material of an organism. The DNA (deoxyribonucleic acid), those from the genetic material in the chromosome of a particular one Organism is derived, the "genomic DNA". Further, under a "genomic library" or "genomic library Library DNA "a collection of clones that understand from a set of randomly generated, overlapping ones DNA fragments that represent the entire genome of an organism, was produced. This - also referred to as "library DNA" - genomic DNA is often already present in single stranded form. In this In the present case, context are smaller among genomic "DNA fragments" To understand sections of the total genome that have a length may have from about 50 to about 5000 bp, where as Compare the genome of, for example, mammals a size of up to 3 Gb. In the present case, then, if of "genomic DNA "is not just the genetic material derived or derived in the chromosome of a particular organism entire genomic DNA of an organism to be understood, but just the DNA fragments in the form of a library or library, which represent the entire genome of an organism.

Zur Herstellung einer genomischen Bibliothek wird die gesamte zelluläre DNA eines Organismus durch Restriktionsenzyme in Fragmente zerlegt, die danach in einen geeigneten Klonierungsvektor, bspw. Bakteriophagen oder Cosmide, eingefügt und vermehrt werden. Wenn nur ein Teil aller im Genom eines Organismus vorkommenden DNA-Bereiche in einer Genbibliothek enthalten ist, so wird diese als subgenomische Bibliothek bezeichnet.to Making a genomic library becomes the entire cellular DNA of an organism is broken down into fragments by restriction enzymes, the thereafter into a suitable cloning vector, for example bacteriophages or cosmids, inserted and propagated. If only one Part of all occurring in the genome of an organism DNA areas in one Gene library is included, so this is called subgenomic library designated.

Unter einer ”Sonde” wird vorliegend ein Oligonucleotid verstanden, das in der Lage ist, in einer Basen-spezifischen Art und Weise mit einem komplementären Strang Nucleinsäure eine Bindung einzugehen. Dabei ist unter ”Oligonucleotid” jede Nucleinsäure zu verstehen, wie bspw. DNA oder RNA, die darüber hinaus einzel- oder doppelsträngig vorliegen kann. Es versteht sich, dass Oliconucleotide natürlich vorkommend sein können, oder synthetisch sind, normalerweise werden diese jedoch mithilfe synthetischer Mittel hergestellt. Die Länge der Oligonucleotide ist gewöhnlich mindestens 5, 10 oder 20 Basen lang, und kann bis zu 50, 100, 1000 oder weitere Basen lang sein. Dabei können Oligonucleotide auch Peptidnucleinsäuren oder analoge Nucleinsäuren mit einschließen.Under a "probe" in the present case is an oligonucleotide that is capable of being in a base-specific manner and way with a complementary strand of nucleic acid to make a bond. Where "oligonucleotide" is any To understand nucleic acid, such as DNA or RNA, above it may be single or double stranded. It understands that oligonucleotides can be naturally occurring, or synthetic, but these are usually Synthetic agent produced. The length of the oligonucleotides is usually at least 5, 10 or 20 bases long, and can be up to 50, 100, 1000 or more bases long. It can Oligonucleotides also include peptide nucleic acids or analogous nucleic acids include.

Unter einem ”Träger” ist vorliegend jedes Substrat zu verstehen, an den Nucleinsäuresonden angebracht werden können bzw. angebracht sind. Dabei können typischerweise eine Vielzahl von verschiedenen Sonden an die Oberfläche des Trägers an verschiedenen bekannten Stellen gekoppelt sein. Derartige Träger werden dann auch als ”Chips” oder ”Microarrays” bezeichnet. Die Oberfläche des Trägers bzw. des Substrats kann praktisch in jeder Form oder in einer Vielzahl von Oberflächen hergestellt sein, so dass bspw. Träger in Form von (Mikrotiter-)Platten, eines Blatts, von Kügelchen, Fasern oder Glas, oder in jeder anderen Form eingesetzt werden können, die für eine Anheftung von Sonden geeignet ist.Under In the present case, a "carrier" is any substrate to be attached to the nucleic acid probes can or are appropriate. It can typically a variety of different probes to the surface coupled to the carrier at various known locations be. Such carriers are then also referred to as "chips" or "microarrays". The surface of the carrier or the substrate can be used in virtually any shape or in a variety of surfaces be prepared, so that, for example, carrier in the form of (microtiter) plates, a sheet of globules, fibers or glass, or in Any other form that can be used for An attachment of probes is suitable.

Das zu untersuchende Genom bzw. die genomische DNA ist dabei nicht auf den Menschen als Quelle beschränkt, sondern erstreckt sich auf einschließlich, jedoch nicht limitierend, allgemein auf Säugetiere, ferner auf Pflanzen, Bakterien oder Zellen, die von jedem der oben Genannten abgeleitet sind. Dabei versteht sich, dass auch auf ”Library-DNA” als Ausgangsmaterial für genomische DNA zurückgegriffen werden kann.The to be examined genome or genomic DNA is not on limited to man as a source, but extends including, but not limited to, general mammals, plants, bacteria or cells, which are derived from each of the above. It understands itself, that too on "library DNA" as starting material can be used for genomic DNA.

Dabei ist bei dem Verfahren in einer Ausführungsform bevorzugt, wenn die DNA-Sonden in Schritt a) durch eine Fragmentierung von größeren DNA-Abschnitten gewonnen werden, wobei ferner bevorzugt ist, wenn hierfür eine DNA eingesetzt wird, die in BAC-Klonen (”bacterial artificial chromosome”, künstliches Bakterienchromosom) enthalten ist.there is preferred in the method in one embodiment, if the DNA probes in step a) by a fragmentation of larger DNA sections are obtained, wherein It is furthermore preferred if a DNA is used for this purpose in BAC (bacterial artificial chromosome) clones Bacterial chromosome) is included.

So ist bspw. die frei erhältliche BAC-Klonsammlung 32k ( Osoegawa et al., „A Bacterial Artificial Chromosome Library for Sequencing the Complete Human Genome”, Genome Research 2001; 11: 483–496 ) geeignet, bei der 150.000 bis 250.000 zusammenhängende Basen des humanen Genoms jeweils in einem künstlichen Bakterien chromosom enthalten sind, welche jederzeit hochrein durch Bakterien hergestellt werden können.For example, the freely available BAC clone collection 32k ( Osoegawa et al., "A Bacterial Artificial Chromosome Library for Sequencing the Complete Human Genome", Genome Research 2001; 11: 483-496 ), in which 150,000 to 250,000 contiguous bases of the human genome are each contained in an artificial bacterial chromosome, which can be produced at any time highly pure by bacteria.

Es versteht sich jedoch, dass jede andere Quelle von Genomen geeignet ist, und das vorliegende Verfahren nicht auf den Einsatz von BACs beschränkt ist.It It is understood, however, that any other source of genomes is suitable and the present process does not focus on the use of BACs is limited.

Auch bei dieser Ausführungsform des Verfahrens kann die Fragmentierung mittels eines oder mehrerer Restriktionsenzyme, durch Ultraschall, durch Nebulization (Druckluft oder Stickstoff) in kleinere Abschnitte aufgeteilt werden.Also In this embodiment of the method, the fragmentation by means of one or more restriction enzymes, by ultrasound Nebulization (compressed air or nitrogen) into smaller sections be split.

In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist bevorzugt, wenn die Sonden in Schritt b) über eine Markierung an den Träger immobilisiert werden. Dabei wird vorliegend unter einer Markierung jede chemische, biologische oder physikalische Modifizierung der Sonden verstanden, die eine Anbindung der Sonden an den Träger und damit deren Immobilisierung daran ermöglichen.In a development of the method according to the invention is preferred if the probes in step b) over a Label are immobilized on the carrier. It will in the present case under a label any chemical, biological or physical modification of the probes understood that a binding the probes to the carrier and thus their immobilization enable it.

Dabei ist bevorzugt, wenn zur Markierung der doppelsträngigen DNA-Sonden ein Marker eingesetzt wird, der eine spezifische oder unspezifische Affinität für den Träger besitzt.there is preferred when used to label the double-stranded DNA probes a marker is used, which has a specific or Non-specific affinity for the carrier has.

Wenn der an die Sonden anzubringende Marker eine unspezifische Affinität für den Träger besitzt, dann binden die Sonden – über den Marker – beliebig an den Träger, d. h., dass es nicht auf die Beschaffenheit der Oberfläche des Trägers ankommt, an welche die Sonden gebunden werden sollen. Andererseits, bei einer spezifischen Affinität des Markers für den Träger, binden die Sonden ganz spezifisch an die – ggf. entsprechend bearbeitete – Oberfläche des Trägers und ggf. an spezifische Stellen auf dieser.If the label to be attached to the probes has a non-specific affinity owns for the carrier, then the probes bind - over the marker - arbitrarily to the carrier, d. h. that it does not depend on the texture of the surface of the vehicle arrives to which the probes are to be bound. On the other hand, at a specific affinity of the marker for the carrier, the probes bind specifically to the - possibly appropriately processed - surface of the vehicle and, if necessary, to specific places on this.

Dabei ist bei einer spezifischen Affinität des Markers bevorzugt, wenn der Marker Biotin-dUTP ist. Dieser kann dann, in einer bevorzugten Weiterbildung des Verfahrens, terminal an der Sonde angebracht sein, wobei wiederum bevorzugt ist, wenn für die Markierung eine terminale Transferase eingesetzt wird. Die terminale Transferase ist ein Enzym, das die matrizenunabhängige Anheftung von Desoxynucleotiden (2'-Desoxyribonucleosidmonophosphate) an die endständigen 3'-OH-Gruppen von DNA-Molekülen vermittelt. Daher kann dieses Enzym bspw. Biotin-dUTP an die DNA-Sonden anheften.there is preferred for a specific affinity of the marker, when the marker is biotin-dUTP. This can then, in a preferred Development of the method, be attached terminal to the probe, which is again preferred when the mark a terminal transferase is used. The terminal transferase is an enzyme that matrices-independent attachment of Deoxynucleotides (2'-deoxyribonucleoside monophosphates) to the terminal 3'-OH groups of DNA molecules mediated. Therefore, can for example, attach biotin-dUTP to the DNA probes.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist der Träger eine Beschichtung mit einer spezifischen Affinität für den Marker auf, wobei dann, wenn der Marker Biotin-dUTP ist, bevorzugt ist, wenn die Immobilisierung der markierten doppelsträngigen DNA-Sonden in Schritt c) über Streptavidin erfolgt, mit welchem der Träger beschichtet ist. Streptavidin, ein aus einem Bakterium isoliertes Protein, bindet Biotin an seine vier Untereinheiten. Ganz allgemein kann aber jede Modifizierung eingesetzt werden, welche durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, wie z. B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti-Hapten-Antikörper, Zucker/Lectin etc., vermittelt werden.According to one Another preferred embodiment, the carrier a coating with a specific affinity for the marker, wherein if the marker is biotin-dUTP, preferred is when the immobilization of the labeled double-stranded DNA probes in step c) via streptavidin, with which the carrier is coated. Streptavidin, one out A protein isolated from a bacterium binds biotin to its four Subunits. In general, however, any modification can be used which through high-affinity interactions between the partners of a specific binding pair, such. Biotin / streptavidin or avidin, Hapten / anti-hapten antibody, sugar / lectin, etc., mediated become.

Bei dem Verfahren ist ferner insgesamt bevorzugt, wenn der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mikrotiterplatten, Zentrifugationssäulen, magnetische Beads, paramagnetische Beads. Es versteht sich dabei, dass dabei jedes Substrat als Träger dienen kann, das für die vorliegenden Zwecke entsprechend modifiziert und eingesetzt werden kann. Im Stand der Technik sind eine Vielzahl von Trägersubstraten offenbart, die für das vorliegende Verfahren geeignet und dem Fachmann hinreichend bekannt sind.at The method is also generally preferred when the carrier is selected from the group consisting of microtiter plates, Centrifugation columns, magnetic beads, paramagnetic beads. It is understood that each substrate as a carrier can serve that according to the present purposes modified and can be used. In the prior art are discloses a variety of carrier substrates suitable for the present method suitable and sufficient to the skilled person are known.

Insbesondere ist in einer alternativen Ausführungsform bevorzugt, wenn Schritt d) vor oder parallel zu einem der vorherigen Schritte durchgeführt wird. Zur Beschleunigung des Verfahrens ist dabei verständlicherweise bevorzugt, wenn der Schritt des Fragmentierens und Denaturierens der genomischen DNA parallel zu der Fragmentierung und ggf. Markierung und Immobilisierung der Sonden durchgeführt wird. Dies hängt aber auch jeweils von den einzusetzenden Sonden/dem genomischen DNA-Material ab, und dem Fachmann wird anhand dieser klar sein, welche Reihenfolge jeweils angewandt werden sollte.Especially is preferred in an alternative embodiment when Step d) is performed before or in parallel to one of the previous steps. To speed up the process is understandable preferred when the step of fragmenting and denaturing the genomic DNA parallel to the fragmentation and optionally labeling and immobilization of the probes is performed. This But depends also on each of the probes to be used genomic DNA material, and the skilled artisan will use this be clear which order should be used.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ferner bevorzugt, wenn die Denaturierung der DNA-Sonden in Schritt c) und/oder der genomischen DNA in Schritt d) durch Hitze, Alkali oder Säure und Wasserstoffbrücken lösende Agenzien, wie z. B. Harnstoff, Formamid, durchgeführt wird. Es versteht sich, dass der Fachmann denaturierende Agenzien auch im Gemisch zur Anwendung bringen kann.at the method according to the invention is further preferred if the denaturation of the DNA probes in step c) and / or the genomic DNA in step d) by heat, alkali or acid and hydrogen bonding solvents, such as. As urea, formamide, is performed. It goes without saying in that the expert uses denaturing agents also in a mixture can bring.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass die Elution der genomischen DNA-Fragmente durch Verfahren vorgenommen wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend Hitzeeinwirkung, Säure- oder Alkalibehandlung und dem Einsatz aus Wasserstoffbrücken lösende Agenzien, wie z. B. Harnstoff, Formamid.In an embodiment of the invention Procedure is further provided that the elution of the genomic DNA fragments are made by methods selected are from the group heat effect, acid or alkali treatment and the use of hydrogen bonding solvents Agents, such. As urea, formamide.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Analyse von genomischer DNA, das durch die Schritte der Anreichung durch das erfindungsgemäße Verfahren sowie des Analysierens der eluierten genomischen DNA-Fragmente gekennzeichnet ist.The The invention further relates to a method for analyzing genomic DNA obtained by the steps of enrichment by the invention Method and analyzing the eluted genomic DNA fragments is marked.

Dabei ist bevorzugt, wenn das Analysieren vorgenommen wird durch eines oder mehrere der Verfahren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Polymerase-Ketten-Reaktion, Sequenzierung, insbesondere direkte Sequenzierung, und klonale Amplifikation auf Glasoberflächen.there is preferred when the analyzing is done by a or more of the methods selected from the Group consisting of polymerase chain reaction, sequencing, especially direct sequencing, and clonal amplification Glass surfaces.

Die PCR, mit der spezifische DNA-Fragmente in vitro amplifiziert werden, ist eine überaus empfindlichen Technik, mit der sich auch aus sehr geringen Mengen heterogener DNA innerhalb kurzer Zeit ein oder mehrere bestimmte doppelsträngige DNA-Fragmente millionenfach anreichern lassen. Dabei kann bspw. auch die sogenannte emPCR (emulsion based PCR) eingesetzt werden, bei der Microbeads, an die einzelsträngige DNA-Fragmente gekoppelt sind, mit den Amplifikationsreagenzien in einem Öl-Wasser-Gemisch emulgiert werden (siehe bspw. Margulies et al. (2005) Nature; 437: 376–380 ).The PCR, with which specific DNA fragments are amplified in vitro, is a very sensitive technique that can be millions of times accumulate from very small amounts of heterogeneous DNA within a short time, one or more specific double-stranded DNA fragments. In this case, for example, the so-called emPCR (emulsion based PCR) can be used in which microbeads are coupled to the single-stranded DNA fragments are emulsified with the amplification reagents in an oil-water mixture (see, for example. Margulies et al. (2005) Nature; 437: 376-380 ).

Die durch Anreicherung gewonnene genomische DNA kann bspw. auch mit sogenannten Next-generation Sequenzierautomaten sequenziert werden, bei welchen anstelle einer Klonierung in bakterielle oder virale Systeme zur Vermehrung einzelner Sequenzen eine unmittelbare klonale Amplifikation von Einzelmolekülen erfolgt. Dabei wird die genomische DNA bereits nach der Fragementierung in einem weiteren Schritt mit PCR- bzw. Sequenzieradaptern versehen (Herstellung der so genannten Library). Nach der Anreicherung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die gewonnene Library-DNA dann direkt klonal amplifiziert werden (zum Beispiel Microbead-gekoppelte emPCR ( Margulies et al. (2005) Nature; 437: 376–380 ) für das 454-Verfahren (siehe www.genome-sequencing.com ; und Roche Applied Science/454) oder klonale Amplifikation auf einer Glasoberfläche nach dem Solexa 1G Verfahren (siehe www.illumina.com )) und online in den jeweiligen Sequenzierautomaten sequenziert werden. Es versteht sich, dass auch andere Verfahren zur Ermittlung von Nukleinsäure-Sequenzen im Megabasen-Durchsatz grundsätzlich auf dieses Anreicherungsverfahren zurückgreifen können, um eine überfordernde Komplexität des Ausgangsmaterials zu reduzieren.The genomic DNA obtained by enrichment can also be sequenced, for example, with so-called next-generation sequencing machines in which, instead of cloning into bacterial or viral systems for propagation of individual sequences, a direct clonal amplification of single molecules takes place. The genomic DNA is provided after the fragmentation in a further step with PCR or Sequenzieradaptern (production of the so-called library). After enrichment according to the method of the invention, the recovered library DNA can then be amplified directly clonally (for example, microbead-coupled emPCR ( Margulies et al. (2005) Nature; 437: 376-380 ) for the 454 process (see www.genome-sequencing.com ; and Roche Applied Science / 454) or clonal amplification on a glass surface according to the Solexa 1G method (see www.illumina.com )) and be sequenced online in the respective sequencer. It is understood that also other methods for the determination of nucleic acid sequences in the megabase throughput can basically resort to this enrichment method in order to reduce an overburdening complexity of the starting material.

Insgesamt ist bevorzugt, wenn das Verfahren zur Untersuchung von Mutationen in genomischer DNA eingesetzt wird, wobei in einer Ausführungsform bevorzugt ist, wenn das Verfahren zur Untersuchung von Mutationen bei Genen eingesetzt wird, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind, und es bei einer anderen Ausführungsform bevorzugt ist, wenn das Verfahren zur Identifizierung von Genen eingesetzt wird, die mit bestimmten Krankheiten assoziiert sind.All in all is preferred when the method for studying mutations is used in genomic DNA, wherein in one embodiment preferred is when the method for studying mutations is used in genes associated with certain diseases are, and it is preferred in another embodiment, if the method is used to identify genes, that are associated with certain diseases.

Bei diesen Einsätzen werden demnach einerseits Mutationen in Genen untersucht, von denen bekannt ist, dass sie mit bestimmten Krankheiten bzw. Symptomen assoziiert sind. So wurde bspw. in jüngerer Zeit gezeigt, dass eine einzige Genmutation die Ursache bei einem von 25 Parkinson-Fällen weltweit ist. Die Studien lassen vermuten, dass die Mutation in einem erst kürzlich entdeckten Gen namens LRRK2 etwa fünf Prozent der vererbten Parkinson-Fälle und etwa zwei Prozent der sporadischen Fälle verursacht.at Therefore, these missions are mutated in Genes are studied that are known to be specific Diseases or symptoms are associated. So was, for example, in younger Time has shown that a single gene mutation is the cause of one of 25 Parkinson's cases worldwide. Leave the studies suspect that the mutation was detected in a recently discovered Gene called LRRK2 accounts for about five percent of inherited Parkinson's cases and caused about two percent of sporadic cases.

Andererseits können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch bisher unbekannte Gene identifiziert werden, die mit Krankheiten assoziiert sind. So wurden kürzlich Riskiogene für Morbus Crohn und Typ-2-Diabetes identifiziert. Die erfindungsgemäßen Verfahren bieten ein hervorragendes Werkzeug, um derartige Analysen zu verbessern, sowohl hinsichtlich der Kosten und des (Zeit)-Aufwands, als auch in der Zuverlässigkeit und Flexibilität.on the other hand can with the method according to the invention Also previously unknown genes are identified with diseases are associated. Recently, risk genes for Crohn's disease and type 2 diabetes identified. The invention Procedures provide an excellent tool to perform such analyzes both in terms of cost and (time) effort, as well as in reliability and flexibility.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It it is understood that the above and the following yet to be explained features not only in each case specified combination, but also in other combinations or can be used in isolation, without the scope of the present To leave invention.

Die Erfindung soll nun anhand eines Beispiels und der beigefügten Figur dargestellt werden werden, ohne sie aber auf dieses Beispiel zu beschränken. Es zeigt:The Invention will now be described by way of example and the attached Figure will be presented, but without them on this example to restrict. It shows:

1 Genomische Anreicherung humaner DNA-Abschnitte, die komplementär zum Chromosom-5-BAC (RP11 795P7) sind. 1 Genomic enrichment of human DNA sections that are complementary to chromosome 5-BAC (RP11 795P7).

Ausführungsbeispielembodiment

Für die Durchführung des erfindungegemäßen Verfahrens wurde eine fragmentierte und biotinmarkierte BAC-Sonde (RP11795P7; Chromosom 5) eingesetzt, mit einer Konzentration von 150 ng/μl. Hiervon wurden 1,0 μl, 0,5 μl bzw. 1,0 μl einer 1:10 Verdünnung eingesetzt. Die durchschnittliche Länge der Fragmente betrug ca. < 400 bp (Basenpaare).For the implementation of the erfindungegemäßen Procedure became a fragmented and biotinylated BAC probe (RP11795P7; chromosome 5), with a concentration of 150 ng / μl. Of these, 1.0 μl, 0.5 μl or 1.0 μl of a 1:10 dilution. The average length of the fragments was about <400 bp (base pairs).

Ferner wurde fragmentierte DNA eingesetzt, mit einer Konzentration c von 580 ng/μl, wobei 4,0 μl (entsprach ca. 2 μg), 2,0 μl (entsprach ca. 1 μg) bzw. 1,0 μl (entsprach ca. 0,5 μg) verwendet wurden; die Länge der Fragmente betrug ca. 600 bp; gepoolt F#17.Further fragmented DNA was used, with a concentration c of 580 ng / μl, with 4.0 μl (equivalent to about 2 μg), 2.0 μl (equivalent to about 1 μg) or 1.0 μl (equivalent to about 0.5 μg) were used; the length the fragments were about 600 bp; pooled F # 17.

Sämtliche Ansätze wurden als dreifach-Ansätze angesetzt. Eingesetzt wurden ferner Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten von Thermo Scientific (Katalog Nummer 95 029 362). Die biotinmarkierte BAC-Sonde wurde mit 50 μl Bindepuffer (10 mM Tris-HCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Tween 20, pH 7,6) in die Wells der Platte pipettiert. Anschließend wurden die Wells mit Klebefolie verschlossen, und 1 Stunde bei Raumtemperatur im Plattenschüttelthermoblock mit Geschwindigkeit 2 inkubiert. Anschließend wurde die Platte kurz anzentrifugiert und der Puffer abgenommen; es folgte ein Waschschritt mit 0,5 M NaOH sowie eine 10-minütige Inkubation mit 100 μl 0,5 M NaOH zur Denaturierung.All Approaches were set up in triplicate. In addition, streptavidin-coated microtiter plates were used from Thermo Scientific (catalog number 95 029 362). The biotin-labeled BAC probe was incubated with 50 μl binding buffer (10 mM Tris-HCl, 2M NaCl, 1mM EDTA, 0.1% Tween 20, pH 7.6) into the wells of the plate Pipette. Subsequently, the wells were covered with adhesive film sealed, and 1 hour at room temperature in Plattenschüttelthermoblock incubated at speed 2. Subsequently, the Centrifuged briefly and the buffer removed; it followed a wash with 0.5 M NaOH and a 10 min Incubate with 100 μl of 0.5 M NaOH for denaturation.

Nach der Inkubation wurde das NaOH abgenommen und die Wells mit jeweils 300 μl PBS und 0,05% Tween 20 gewaschen (jeweils vorsichtig 2 mal mit der Pipette mischen). Auch dieser Puffer wurde danach abgenommen und die Platte kurz umgekehrt auf Papier trockenen gelassen.To incubation, the NaOH was removed and the wells with each Washed 300 μl PBS and 0.05% Tween 20 (each carefully Mix 2 times with the pipette). Also this buffer was after removed and the plate left inverted on paper dry.

Parallel wurden 50 μl Hybridisierungspuffer (5 × SSC (0,75 M NaCl, 75 mM NaCitrat, pH 7 0,1% (w/v) N-Laurly-Sarcosin; 0,02% (W/V) SDS; 2% Blocking Reagens (Kasein-Fraktion fettfreier Trockenmilch)) mit der fragmentierten genomischen DNA versetzt, und 5 Minuten durch Aufkochen bei 95°C denaturiert. Je Well wurden 100 μl auf Hybridisierungstemperatur vorgemärmter Hybridisierungspuffer vorgelegt und die denaturierte DNA hinzu pipettiert; anschließend wurden die Wells mit Klebefolie verschlossen.Parallel 50 μl hybridization buffer (5 × SSC (0.75 M NaCl, 75 mM Na citrate, pH 7 0.1% (w / v) N-lauryl-sarcosine; 0.02% (W / V) SDS; 2% blocking reagent (casein fraction of nonfat dry milk) mixed with the fragmented genomic DNA, and 5 minutes through Boil up at 95 ° C denatured. Each well was 100 .mu.l hybridization buffer pre-engineered at hybridization temperature submitted and the denatured DNA pipetted; subsequently the wells were sealed with adhesive film.

Die Platte wurde ca. 60 Stunden bei ca. 55°C au dem Thermoblock mit Geschwindigkeit 2 inkubiert, um in den Wells eine Temperatur von ca. 50°C zu erzielen. Die Platte war dabei fest verschlossen, um eine Austrocknung zu vermeiden. Anschließend wurde die Platte kurz anzentrifugiert. Die Wells wurden mit ja 300 μl PBS + 0,05% Tween 20 gewaschen (und der Inhalt der Wells jeweils 2 mal vorsichtig mit der Pipette gemischt); der Puffer wurde dann abgenommen und beim letzten Waschgang kurz umgekehrt auf Papier trocknen gelassen.The Plate was about 60 hours at about 55 ° C on the thermoblock incubated at speed 2 to set a temperature in the wells of about 50 ° C to achieve. The plate was tightly closed to to avoid dehydration. Subsequently, the Centrifuge plate briefly. The wells were yes with 300 ul PBS + 0.05% Tween 20 washed (and the contents of the wells respectively Gently mixed twice with the pipette); the buffer was then taken off and at the last wash briefly reversed on paper let it dry.

Zur Elution wurden 50 μl 50 mM NaOH in die Wells pipettiert und 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde das NaOH abgenommen und die Lösung in Eppendorf-Cups mit vorgelegten 8 μl 1 M Tris-HC1, pH 7,0 pipettiert und neutralisiert. Zu diesem Ansatz wurden jeweils 4 μl der DNA-Lösung gegeben. Aus diesem Ansatz wurden jeweils 4 μl in die Kontroll-PCR (zur Erfolgskontrolle des Verfahrens) eingesetzt.to Elution, 50 μl of 50 mM NaOH were pipetted into the wells and 5 min. incubated at room temperature. Thereafter, the NaOH was removed and the solution in Eppendorf cups with 8 ul submitted 1 M Tris-HCl, pH 7.0 pipetted and neutralized. To this approach 4 μl each of the DNA solution was added. Out In this approach, in each case 4 .mu.l in the control PCR (zur Success control of the method) used.

Der PCR-Nachweis wurde mit Primern für die Marker D5S818 (9791/9792) und D13S317 (9793/9794) in einer Multiplex-Reaktion, die anschließende Fragmentanalyse wird auf dem CEQ8000 (Beckman Coulter) durchgeführt.Of the PCR detection was performed with primers for the markers D5S818 (9791/9792) and D13S317 (9793/9794) in a multiplex reaction, followed by Fragment analysis is performed on the CEQ8000 (Beckman Coulter).

Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass der zur Anreicherung verwendete BAC-Klon (Chromosom 5) das D5S818 Allel ”13” zeigte. Die eingesetzte, heterozygote humane DNA zeigte die D5S818-Merkmale ”11” und ”12” (Chromatogram D). Alle genomischen Anreicherungen waren positiv für die erwarteten Merkmale ”11” und ”12” sowie für ein stärker oder schwächer ausgeprägtes Merkmal ”13” (Reste von BAC-DNA im Eluat; Chromatogram A–C). Wichtig für die spezifische Anreicherung ist das Fehlen von D13S317-Allelen im Eluat (die D13S317-Allele ”12” und ”13” fehlen in den Amplifikationen nach Anreicherung (Chromatogram A–C). Das bedeutet, dass im Eluat nach genomischer Anreicherung nur noch humane DNA-Abschnitte komplementär zum Chromosom-5-BAC vorhanden sind.The results are in 1 shown. It can be seen that the BAC clone (chromosome 5) used for the enrichment showed the D5S818 allele "13". The heterozygous human DNA used showed the D5S818 features "11" and "12" (Chromatogram D). All genomic enhancements were positive for the expected features "11" and "12" and for a more or less pronounced feature "13" (residues of BAC DNA in the eluate, Chromatogram A-C). Important for specific enrichment is the absence of D13S317 alleles in the eluate (the D13S317 alleles "12" and "13" are missing in the amplifications after enrichment (Chromatogram A-C), which means that in the eluate after genomic enrichment only human DNA sections complementary to the chromosome 5-BAC are present.

Die oben dargestellten Beispiele zeigen, dass die genomische Anreicherung mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens in drei parallelen Ansätzen erfolgreich war:
Alle genomischen Anreicherungen waren positiv für die erwarteten Merkmale ”11” und ”12” (siehe 1, Chromatogramm A bis D), sowie für ein stärker oder schwacher ausgeprägtes Merkmal ”13”, wobei Letzteres auf Reste von BAC-DNA im Eluat zurückzuführen ist; siehe Chromatogramm A bis C. Wichtig für die spezifische Anreicherung ist das Fehlen von D13S317-Allelen im Eluat (die D13S317-Allele 12 und 13 fehlen in den Amplifikationen nach Anreicherung) (Chromatogramm A bis C), was bedeutet, dass im Eluat nach genomischer Anreicherung nur noch humane DNA-Abschnitte vorhanden sind, die komplementär zum Chromosom-5-BAC sind.The examples presented above show that genomic enrichment using the method of the invention was successful in three parallel approaches:
All genomic accumulations were positive for the expected features "11" and "12" (see 1 , Chromatogram A to D), as well as a more or less pronounced feature "13", the latter being due to residues of BAC-DNA in the eluate; see chromatograms A to C. Important for the specific enrichment is the absence of D13S317 alleles in the eluate (the D13S317 alleles 12 and 13 are missing in the amplifications after enrichment) (chromatograms A to C), which means that in the eluate after genomic Enrichment only human DNA sections are present, which are complementary to the chromosome 5-BAC.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNGQUOTES INCLUDE IN THE DESCRIPTION

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Zitierte Nicht-PatentliteraturCited non-patent literature

Osoegawa et al., "A Bacterial Artificial Chromosomal Library for Sequencing the Complete Human Genome", Genome Research 2001; 11: 483-496 [0031]
- Margulies et al. (2005) Nature; 437: 376-380 [0045]
- Margulies et al. (2005) Nature; 437: 376-380 [0046]
- www.genome-sequencing.com [0046]
- www.illumina.com [0046]

Claims

Process for the enrichment of related genomic DNA fragments from a complex to be examined genomic DNA, with the following steps: a) Provide of double-stranded DNA probes having sequences which sequences in the complex genomic to be examined Match DNA, b) immobilizing the double-stranded DNA probes from step a) to a carrier, c) denature the double-stranded DNA probes for the preparation of carrier-bound single-stranded DNA probes, d) Fragmentation and possibly denaturation of the genomic to be examined DNA for the production of genomic DNA fragments, e) incubate and hybridizing fragmented and optionally denatured genomic DNA with immobilized on the carrier single-stranded DNA probes f) optionally removing unhybridized genomic DNA, and g) elution of specific bound to the DNA probes genomic DNA fragments from the carrier.

Method according to claim 1, characterized in that that the genomic DNA to be examined is mammalian DNA, especially from humans, is.

Method according to claim 1 or 2, characterized that the DNA probes in step a) by a fragmentation of larger DNA sections are obtained.

Method according to claim 3, characterized DNA contained in BAC clones for fragmentation is used.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the probes in step b) via a label can be immobilized on the support.

Method according to claim 5, characterized in that that for labeling the double-stranded DNA probes a Marker is used, which is a specific or nonspecific Has affinity for the carrier.

Method according to one of claims 5 or 6, characterized in that the marker is biotin-dUTP.

Method according to one of claims 6 or 7, characterized in that the DNA probes terminal with the Markers are marked.

Method according to claim 8, characterized in that that a terminal transferase was used for the labeling becomes.

Method according to one of claims 5 to 9, characterized in that the carrier has a coating with a specific affinity for the label having DNA probes.

Method according to one of claims 7 to 10, characterized in that the immobilization of the labeled double-stranded DNA probes in step b) Streptavidin occurs with which the carrier coats is.

Method according to one of claims 1 to 11, characterized in that the carrier used in step b) is selected from the group comprising microtiter plates, Beads, and columns.

Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that step d) before or parallel to a the previous steps.

Method according to one of claims 1 to 13, characterized in that the denaturations of the DNA probes in step c) and / or the genomic in step d) by heat, Acid or alkali and hydrogen bonding solvent Agents is performed.

Method according to one of claims 1 to 14, characterized in that the elution of the genomic DNA fragments by heat, acid or alkali and hydrogen bonds dissolving agents is made.

Method for analyzing DNA, characterized through the following steps: a) Enriching related Genomic DNA fragments with a method according to a of claims 1 to 15, and b) Analyze the enriched genomic DNA fragments by in vitro amplification and / or direct sequencing.

Method according to claim 16, characterized in that that it is used to study mutations in genomic DNA becomes.

Method according to claim 17, characterized in that that it is used to study mutations in genes, that are associated with certain diseases.

A method according to claim 17, characterized in that it is used to identify genes associated with certain diseases as are associated.