DD285113A5

DD285113A5 - METHOD FOR OBTAINING PURE HUMAN GROWTH HORMONE (HGH)

Info

Publication number: DD285113A5
Application number: DD32979389A
Authority: DD
Inventors: Bernhard Schlott; Rudolf Dettmer; Alexander Makower; Guenter Gryschek; Guenter Butschak; Margit Werner
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1989-06-21
Filing date: 1989-06-21
Publication date: 1990-12-05

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von reinem menschlichem Wachstumshormon (hGH), das in der biotechnologischen Produktion von hGH angewendet werden kann. Erfindungsgemaesz wird der zellfreie hGH-haltige Kulturueberstand einer Umkehrphasenchromatographie (reversed phase chromatography) unterworfen und hGH mittels eines organischen Loesungsmittels eluiert, die hGH-haltige Fraktion mit einer physiologischen Pufferloesung oder Wasser um ein Vielfaches des Elutionsvolumens verduennt und diese verduennte Fraktion ueber eine Antikoerper-Affinitaetssaeule chromatographiert. Damit wird ein einfaches, nur aus zwei Reinigungsschritten bestehendes Verfahren zur Gewinnung von ueber 90%ig reinem hGH aus Kulturueberstaenden in hoher Ausbeute bereitgestellt.{Wachstumshormon, menschliches; Produktion, biotechnologische; Kulturueberstand; Reversephasen-Chromatographie; Antikoerper-Affinitaetssaeule; Reinigungsschritte, zwei; Ausbeute, hohe}The invention relates to a method for obtaining pure human growth hormone (hGH) which can be used in the biotechnological production of hGH. According to the invention, the cell-free hGH-containing culture supernatant is subjected to reversed phase chromatography and hGH is eluted by means of an organic solvent, the hGH-containing fraction is diluted with a physiological buffer solution or water by a multiple of the elution volume, and this diluted fraction is subjected to an antibody affinity column Chromatograph. This provides a simple, two-purification process for recovering more than 90% pure hGH from culture supernatants in high yield. Production, biotechnological; Culture supernatant; Reverse phase chromatography; Antibodies-Affinitaetssaeule; Purification steps, two; Yield, high}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein einfaches Verfahren zur Gewinnung von reinem menschlichen Wachstumshormon. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Biotechnologie, insbesondere die biotechnologische ProduKtion von hGH.The invention relates to a simple method for obtaining pure human growth hormone. The field of application of the invention is biotechnology, in particular the biotechnological production of hGH.

Characteristic of the known state of the art

hGH ist ein Hormon des Hypophysenvorderlappens. Es beeinflußt regulatorisch mehrere Stoffwechselwege. Äußere Auswirkungen sind beispielsweise die Regulation des Körperwachstums und bestimmter regenerativer Vorgänge (z. B.hGH is a hormone of the anterior pituitary. It regulates several metabolic pathways. External effects include, for example, the regulation of body growth and certain regenerative processes (eg

Geweberekonstitutionen, Wundheilungen u.a.). Die Wirkungen sind der Grund dafür, daß hGH u. a. als Therapeutikum für die Behandlung von Zwergenwuchs eingesetzt wird.Tissue preparations, wound healing, etc.). The effects are the reason that hGH u. a. is used as a therapeutic for the treatment of dwarfism.

Zunächst wurde das Präparat aus Hypophysenextrakten isoliert und gereinigt. Gegen bärtig wird hGH fast ausschließlich nach biotechnologischen Verfahren hergestellt. Genetisch manipulierte» Bakterien bzw. mammalische Zellen liefern das Ausgangsmaterial. In letzterem Fall wird hGH in das Kulturmedium sezerniert. Das Kulturmedium ist somit Ausgangsmaterial für die anschließende Reinigung.First, the preparation was isolated from pituitary extracts and purified. Against bearded hGH is produced almost exclusively by biotechnological processes. Genetically manipulated »bacteria or mammalian cells provide the starting material. In the latter case, hGH is secreted into the culture medium. The culture medium is thus starting material for the subsequent purification.

Anhand von Literaturdaten ist festzustellen, daß e.n breites Methodenspektrum für die Reinigung von hGH anwendbar ist.From literature data it can be seen that a wide range of methods is applicable for the purification of hGH.

Eingesetzt werden Methoden wie Fällungsreaktionen (z. B. mit Ammoniumsulfat bei unterschiedlichen Sättigungsmethoden) und Ultrafiltrationstechniken. Nachteile dieser Verfahren sind vor allem die üblicherweise erheblichen Verluste der zu reinigenden Substanz. Außerdem ist eine kontinuierliche Prozeßführung unter Einsatz dieser Methoden nicht realisierbar.Methods are used such as precipitation reactions (eg with ammonium sulfate with different saturation methods) and ultrafiltration techniques. Disadvantages of these methods are above all the usually considerable losses of the substance to be cleaned. In addition, continuous process control using these methods is not feasible.

Der Aufbau eines kontinuierlichen Reinigungsverfahren ist bei Verwendung säulenchromatographischer Verfahren prinzipiell möglich. Zur Reinigung von hGH wird jedoch bisher die Mehrzahl der chromatographischen Trennmethoden nur im Labormaßstab angewandt. Für die industriemäßige Präparation wäre eine Vielzahl von Chromatographieschritten (bis zu zehn) nötig, um die notwendige Produktreinheit zu erzielen. Der Grund liegt einerseits bei der mangelnden Selektivität in bezug auf hGH (z.B. lonenaustauschchromatographie und Gelchromatographie). Andererseits sind einzelne Methoden hinsichtlich ihres Mengendurchsatzes beschränkt und erlauben deshalb nicht ohne weiteres die für den technischen Einsatz notwendige Maßstabserweiterung.The construction of a continuous purification process is possible in principle when using column chromatographic methods. For purification of hGH, however, the majority of chromatographic separation methods has hitherto been used only on a laboratory scale. For industrial preparation, a variety of chromatography steps (up to ten) would be needed to achieve the necessary product purity. This is due, on the one hand, to the lack of selectivity with respect to hGH (e.g., ion exchange chromatography and gel chromatography). On the other hand, individual methods are limited in terms of quantity throughput and therefore do not readily allow the scale extension necessary for technical use.

Zur Reinigung von hGH im Labormaßstab wurde auch die Umkehrphasenchromatographie eingesetzt. Der Nachteil dieser Methode besteht im notwendigen Einsatz organischer Lösungsmittel, die die Gefahr einer Proteindenaturierung in sich bergen (J.Chromatogr. 296 (1984), 61; J.Chromatogr. 317 [1984], 227).For purifying hGH on a laboratory scale, reversed-phase chromatography was also used. The disadvantage of this method is the necessary use of organic solvents which entail the risk of protein denaturation (J. Chromatogr., 296 (1984), 61, J. Chromatogr., 317 [1984], 227).

Als selektive Methode zur hGH-Reinigung im Labormaßstab hat sich die Affinitätschromatographie erwiesen (B. Schwenzer, M.Werner, FRESENIUS-Z-ANAL-CHEM1983,330,347). Der Nachteil dieser Methods besteht darin, daß sie sehr kostenaufwendig ist. Ein effektives Verfahren zur industriemäßigen Reinigung von hGH aus Kulturüberständen ist bisher nicht bekannt geworden.Affinity chromatography has been shown to be a selective method for hGH purification on a laboratory scale (B. Schwenzer, M.Werner, FRESENIUS-Z-ANAL-CHEM 1983,330,347). The disadvantage of these methods is that they are very expensive. An effective method of industrially purifying hGH from culture supernatants has not been previously known.

Die Erfindung hat das Ziel, ein effektives, in der biotechnologischen Produktion anwendbares Verfahren zur Gewinnung von mindestens 90%ig reinem hQH aus Kulturüberständen in hohen Ausbeuten bereitzustellen, das die Beibehaltung einer kontinuierlichen Prozeßführung In der biotechnologischen Produktion von hGH erlaubt.The object of the invention is to provide an effective method, which can be used in biotechnological production, for obtaining at least 90% pure hQH from culture supernatants in high yields, which permits the maintenance of continuous process control in the biotechnological production of hGH.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Aufgabe der Erfindung ist es, die Anzahl der notwendigen Reinigungsschritte gering zu halten und sie so zu gestalten, daß sie koppelbar sind. Das bedeutet, daß das Endprodukt des vorhergehenden Reinigungsschrittes ohne aufwendige Zwischenoperationen in den nächsten Reinigungsschritt überführbar sein muß. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von menschlichem Wachstumshormon umfaßt zwei chromatographische Trennschritte. Zunächst wird hGH-haltiger Kulturüberstand durch Zentrifugation oder in bestimmten Fällen durch Filtration über Glasfilterfritten von Zellen bzw. Bruchstücken befreit. Im ersten Reinigungsschritt wird hGH durch Umkehrphasenchromatographie (reversed phase chromatogr.) aus dem zellfreien Kulturüberstand angereichert. Dies geschieht durch Bindung des hGH an die Träger RP8 oder RP4 (Fa. Merck) mit anschließender Elution durch ein organisches Lösungsmittel. Vorzugsweise wird der Träger RP8 mit einer Korngröße von 25-40pm eingesetzt. Bei der Elution wird als organisches Lösungsmittel ein Alkohol/Puffer-Gemisch, vorzugsweise ein Propanol/Puffer-Gemisch, mit steigenden Propanolkonzentrationen vorwendet. In der Literatur beschriebene Denaturationserscheinungen traten unter den von uns gewählten Bedingungen überraschenderweise nicht auf. Überraschenderweise ist auch die adsorptive Wirkung des Trennmaterials im Hinblick auf die Anlagerung von hGH selektiver als erwartet. Anhand elektrophoretischer Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, daß das die Chromatographiesäule ungebunden passierende Material noch alle Hauptbestandteile des eingesetzten Kulturmediums enthält, während hOH gleichzeitig zu etwa 90% an den Träger gebunden wird. Damit ist die Möglichkeit einer kontinuierlichen Produktreinigung mit Rückführung des Zellzuchtmediums in den Fermentationsprozeß gegeben. Andere Vorzüge der im ersten Reinigungsschritt eingesetzten Methode sind hoher Mengendurchiatz an Ausgangsmaterial und die Regenerierungsmöglichkeit des Trägers bei obendrein niedrigen Beschaffungskosten. Im zweiten Reinigungsschritt wird hGH durch Affinitätschromatographie unter Einsatz eines monoklonalen anti-hGH-Antikörpers bis auf eine Reinheit von über 90% geführt. Ein speziell ausgewählter Antikörper wird für diese Zwecke an cyanogenbromidaktivierter Sepharose 4 B (Fa. Pharmacia) oder nach DD 219490 an N-IChlorcarbonyloxyj-B-norbornen^.S-dicarboximid-aktivierter Perlcellulose immobilisiert. Als monoklonaler anti-hGH-Antikörpei· wird vorzugsweise der vom Hybridomklon Il A9(ZIM-0289) produzierte monoklonale Antikörper eingesetzt. Durch die Auswahl dieses Antikörpers wird eine hohe Adsorptions- und Desorptionseffektivität der Affinitätschromatographie gewährleistet. Um die beiden Chromatographieschritte ohne aufwendige Zwischenoperationen koppeln zu können, werden die vereinigten hGH-haltigen Fraktionen des ersten Reinigungsschrittes erfindungsgemäß mit einer physiologischen Pufferlösung oder Wasser um ein Vielfaches des Elutionsvolumens verdünnt. Vorzugsweise wird mit PBS um das maximal 10fache des Elutionsvolumens verdünnt. Diese verdünnte Fraktion wird dann unmittelbar über die antikörperbeladene Trennmatrix geschickt. Durch milde Elution mit Glycinpuffer oder einem flüchtigen Puffer wird über 90%ig reines hGH in 60% Ausbeute eluiert.The object of the invention is to keep the number of necessary cleaning steps low and to make them so that they can be coupled. This means that the final product of the previous cleaning step without complicated intermediate operations in the next cleaning step must be convertible. The method of obtaining human growth hormone according to the invention comprises two chromatographic separation steps. First, hGH-containing culture supernatant is freed of cells or fragments by centrifugation or, in certain cases, by filtration through glass filter frits. In the first purification step hGH is enriched by reverse phase chromatography from the cell-free culture supernatant. This is done by binding the hGH to the carrier RP8 or RP4 (Merck) with subsequent elution by an organic solvent. Preferably, the carrier RP8 is used with a particle size of 25-40pm. In the elution, the organic solvent used is an alcohol / buffer mixture, preferably a propanol / buffer mixture, with increasing concentrations of propanol. The denaturation phenomena described in the literature surprisingly did not occur under the conditions chosen by us. Surprisingly, the adsorptive effect of the separation material with regard to the addition of hGH is more selective than expected. By means of electrophoretic investigations, it was possible to demonstrate that the material which passes unbound the chromatographic column still contains all the main constituents of the culture medium used, while at the same time about 90% of the hHOH is bound to the support. This provides the possibility of continuous product purification with recycling of the cell culture medium into the fermentation process. Other advantages of the method used in the first cleaning step are high throughput of starting material and the possibility of regeneration of the carrier, in addition to low procurement costs. In the second purification step hGH is up to a purity of over 90% by affinity chromatography using an anti-hGH monoclonal antibody. A specially selected antibody is immobilized for these purposes on cyanogen bromide-activated Sepharose 4 B (Pharmacia) or according to DD 219490 on N-IChlorcarbonyloxyj-B-norbornene. S-dicarboximide-activated perlcellulose. The monoclonal anti-hGH antibody used is preferably the monoclonal antibody produced by hybridoma clone II A9 (ZIM-0289). The selection of this antibody ensures a high adsorption and desorption efficiency of the affinity chromatography. In order to be able to couple the two chromatographic steps without expensive intermediate operations, the combined hGH-containing fractions of the first purification step are diluted according to the invention with a physiological buffer solution or water by a multiple of the elution volume. Preferably, it is diluted with PBS by a maximum of 10 times the elution volume. This diluted fraction is then passed directly over the antibody-loaded separation matrix. By mild elution with glycine buffer or a volatile buffer, over 90% pure hGH is eluted in 60% yield.

Erfindungswesentlich ist, daß die Kopplung beider Reinigungsschritte zur gegenseitigen Aufhebung von Nachteilen dieser Trennmethoden, die bei deren separater Anwendung auftreten, führt. Der wesentliche Nachteil der Umkehrphasenchromatographie besteht in der Anwesenheit einer organischen Phase (Propanol) im Wirkstoff-Eluat. Erfindungsgemäß wird aber dieser Nachteil überwunden, da in der sich anschließenden Antikörper-Affinitätschromatographie auf Grund des äußerst selektiven Reinigungseffektes das hGH zu 100% an den Träger gebunden wird, während Propanol die Ch' omatographiesäule in den ungebundenen Fraktionen durchläuft und damit sehr vorteilhaft entfernt wird. A' idererseits kommt bei der Antikörper-Affinitätschromatographie aus Kostengründen einer häufigen Wiederverwendbarkeit der antikörperbeladenen Trennmatrix Bedeutung zu. Die Wiederverwendbarkeit wird erfindungsgemäß durch den Einr.atz von vorgereinigtem Material aus dem 1. Reinigungsschritt erhöht.It is essential to the invention that the coupling of the two purification steps leads to the mutual elimination of disadvantages of these separation methods which occur when they are used separately. The main disadvantage of reversed-phase chromatography is the presence of an organic phase (propanol) in the active ingredient eluate. According to the invention, however, this disadvantage is overcome since, in the subsequent antibody affinity chromatography, the hGH is bound to the support to 100% due to the extremely selective purification effect, while propanol passes through the chromatography column in the unbound fractions and is thus very advantageously removed. On the other hand, for reasons of cost, frequent reusability of the antibody-loaded separation matrix is of importance in antibody affinity chromatography. The reusability is increased according to the invention by the Einr.atz of pre-cleaned material from the 1st cleaning step.

Damit wird durch die Erfindung ein einfaches, nur aus zwei Reinigungsschritten bestehendes Verfahren i'ur Gewinnung von über 90%ig reinem hGH aus Kulturüberständen in hoher Ausbeute bereitgestellt, das kostengünstig ist. Gleichzeitig erlaubt das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren die Beibehaltung einer kontinuierlichen Prozeßführung in der biotechnologischen Produktion von hGH. Die spezifische Aktivität des gereinigten hGH-Präparates wird internationalen Ansprüchen gerecht.Thus, the invention provides a simple, only two purification steps existing method i'ur recovery of over 90% pure hGH from culture supernatants in high yield, which is inexpensive. At the same time, the purification process according to the invention allows the maintenance of continuous process control in the biotechnological production of hGH. The specific activity of the purified hGH preparation meets international requirements.

Ausführungsbeispielembodiment

Zellfreier Kulturüberstand, der hGH in einer Konzentration von 10pg/ml enthielt, wurde über eine G-4-Fritte filtriert. Im ersten Reinigungsschritt wurde eine Umkehrphasenchromatographie durchgeführt. 0,51 des Filtrats wurden über eine Säule 0,8 χ 9cm, gefüllt mit Lichroprep RP8 25-40pm (Fa. Merck), gepumpt. Dabei bindet sich das hGH an die RPS-Phase. Anschließend wurde damit 100ml eines Propanolgradienten in Ammoniumacetatpuffer (0,1 M; pH 6,0) eluiert. Der Propanolgehalt wurde dabei linear von 25% auf 40% gesteigert. hGH wurde bei einer Propanolkonzentration von 35% eluiert. Die Bestimmung des hGH-Gehalts in den Fraktionen erfolgte mit einem Enzymimmuntest. Im zweiten Reinigungsschritt wurden die vereinigten hGH-haltigen Fraktior en aus der Umkehrphasenchromatographie zunächst um das 10fache mit PBS verdünnt und dann über eine Immiina'finitätssäule Chromatographien. Diese Säule enthielt CNBr-Sepharose-4B, an die ein monoklonaler anti-hGH-Antikörpe: (IIA9-ZIM-0289) gekoppelt war. Die Säulenabmessung betrug 0,9 x 5cm. Nach dem Beladen der Säule mit dem hGH-haltigen Material wird diese nacheinander mit PBS (0,05% Tween-20 enthaltend) und 0,5m Natriumchlorid; 0,02% Natriumazid gewaschen. Die Wachvolumina betrugen jeweils das Doppelte des Säulenvolumens. Die Elution des hGH erfolgte mit 0,2m Glycinpuffer (pH 2,8), der 0,5mM Natriumchlorid enthielt. Der pH-Wert der Eluat-Fraktionen wurde durch Vorlage vonCell-free culture supernatant containing hGH at a concentration of 10pg / ml was filtered through a G-4 frit. In the first purification step, reverse phase chromatography was performed. 0.51 of the filtrate was pumped through a column 0.8 χ 9 cm, filled with Lichroprep RP8 25-40pm (Merck). The hGH binds to the RPS phase. Subsequently, 100 ml of a propanol gradient was eluted in ammonium acetate buffer (0.1 M, pH 6.0). The propanol content was linearly increased from 25% to 40%. hGH was eluted at a propanol concentration of 35%. The determination of the hGH content in the fractions was carried out with an enzyme immunoassay. In the second purification step, the combined hGH-containing fractions from reverse phase chromatography were first diluted 10-fold with PBS and then chromatographed on an imminity column. This column contained CNBr-Sepharose-4B to which an anti-hGH monoclonal antibody: (IIA9-ZIM-0289) was coupled. The column size was 0.9 x 5cm. After loading the column with the hGH-containing material, it is sequentially treated with PBS (containing 0.05% Tween-20) and 0.5M sodium chloride; Washed 0.02% sodium azide. The awake volumes were each twice the column volume. Elution of the hGH was with 0.2m glycine buffer (pH 2.8) containing 0.5mM sodium chloride. The pH of the eluate fractions was determined by submitting

1M Trispuffer (pH 7,4) sofort neutralisiert. Die quantitative hGH-Bestimmung erfolflte erneut im Enzymimmuntest. Untersuchungen des Präparats in der SDS-Polyakrylamidgelolektrophorese mit Silberfärbung ergab eine Reinheit von über 90%, hGH wurde nach diesem Verfahren mit einer Ausbeute von 60% erhalten. Der hGH-Gehalt beträgt ohne zusätzliche Konzentrierungsmaßnahmen mehr als 250ug/ml. Die Bestimmung der biologischen Aktivität Im Tibia-Teet war positiv. Die spezifische Aktivität des gereinigten hGH-Präparats wird internationalen Ansprüchen gorecht.Immediately neutralize 1M Tris buffer (pH 7.4). The quantitative hGH determination was again carried out in the enzyme immunoassay. Examination of the preparation in SDS polyacrylamide gel electrophoresis with silver staining showed a purity of over 90%, hGH was obtained by this method in a yield of 60%. The hGH content is more than 250 μg / ml without additional concentration measures. The determination of biological activity in the tibia teet was positive. The specific activity of the purified hGH preparation will meet international requirements.

Claims

A process for obtaining pure human growth hormone (hGH) by chromatographic methods, which comprises subjecting the cell-free hGH-containing culture supernatant to reverse phase chromatography, and eluting hGH with an organic solvent, the hGH-containing fraction with a physiological buffer solution or water diluted a multiple of the elution volume and this diluted fraction chromatographed on an antibody affinity column.

2. The method according to claim 1, characterized in that is used as a carrier in reverse phase chromatography RP8 or RP4.

3. The method according to claim 2, characterized in that the carrier RP8 is used with a particle size of 25-40pm.

4. The method according to claim 1, characterized in that an alcohol / buffer mixture is used as the organic solvent.

5. The method according to claim 4, characterized in that is used as alcohol propanol.

6. Process according to Claims 4 and 5, characterized in that the propanol / buffer mixture is used with increasing propanol concentrations.

7. The method according to claim 1, characterized in that the hGH-containing fraction is diluted with PBS by a maximum of 10 times the elution volume.

8. The method according to claim!, Characterized in that is used as a carrier for the antibody affinity column cyanogen bromide activated Sepharose 4B or N -'Chlorcarbonyloxy) -5-norbornene-2,3-dicarboximide activated perl cellulose.

9. The method according to claim 1, characterized in that immobilized on the antibody affinity column of the hybridoma Il A9 (ZIM-0289) produced monoclonal antibody to hGH.