CN121182766B - 羰基还原酶突变体、基因、工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种羰基还原酶突变体、基因、工程菌及应用。本申请实施例的羰基还原酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其对前手性酮类化合物进行不对称还原氢化催化效率提高，并且对催化形成的手性羟基化合物的立体选择性提高，有利于提高(S)‑1‑(5‑氟‑2‑碘苯基)乙醇的合成效率。

Description

羰基还原酶突变体、基因、工程菌及应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，特别是涉及一种羰基还原酶突变体、基因、工程菌及应用。

背景技术

(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇是合成劳拉替尼（Lorlatinib）的关键中间体。劳拉替尼作为第三代ALK/ROS1双靶点酪氨酸激酶抑制剂，在肿瘤治疗领域具有重要临床价值。

目前，越来越多的药物或者中间体可以通过生物催化的方式来合成的， (S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇可以通过对5-氟-2-碘苯乙酮进行酮还原催化得到。背景技术中，羰基还原酶的转化效率不佳，不利于(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇合成效率的提高。

发明内容

基于此，本申请提供一种羰基还原酶突变体、基因、工程菌及应用，以解决现有技术中不利于提高(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇合成效率的技术问题。

第一方面，申请实施例提供一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

第二方面，申请实施例提供一种羰基还原酶突变体基因，所述羰基还原酶突变体基因编码上述的羰基还原酶突变体。

第三方面，申请实施例提供一种重组载体，所述重组载体包括上述的羰基还原酶突变体基因。

第四方面，申请实施例提供一种工程菌，所述工程菌包括上述的重组载体。

第五方面，申请实施例提供一种(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的合成体系，包括羰基还原酶突变体、辅酶NAD⁺/NADH以及辅酶再生系统，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

可选地，所述辅酶再生系统包括辅底物和氧化还原酶，所述辅底物为异丙醇、甲酸盐或葡萄糖，所述氧化还原酶为异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。

可选地，所述羰基还原酶突变体来源于含羰基还原酶突变体编码基因的第一重组工程菌，所述氧化还原酶来源于含氧化还原酶编码基因的第二重组工程菌。

第六方面，申请实施例提供一种(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的制备方法，使上述的羰基还原酶突变体或含有上述的羰基还原酶突变体的宿主细胞与5-氟-2-碘苯乙酮接触，将5-氟-2-碘苯乙酮转化为(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇。

可选地，在辅酶NAD⁺/NADH以及辅酶再生系统存在下，利用含有羰基还原酶突变体的宿主细胞催化所述5-氟-2-碘苯乙酮进行酮还原以生成(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇，所述辅酶再生系统包括异丙醇和异丙醇脱氢酶。

可选地，所述异丙醇与反应体系的体积比为0.35～0.45:1，所述宿主细胞的浓度与所述5-氟-2-碘苯乙酮的初始浓度之比为100g/L:100 g/L～200 g/L，反应温度为30℃～40℃。

本申请实施例的羰基还原酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其对前手性酮类化合物进行不对称还原氢化催化效率提高，并且对催化形成的手性羟基化合物的立体选择性提高，有利于提高(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的合成效率。

附图说明

图1为本申请实施例的(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的合成体系的反应原理图。

图2为本申请实施例的(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的合成体系另一实施方式的反应原理图。

图3为产物标准品消旋体的手性HPLC分析谱图。

图4为产物标准品S构型的手性HPLC分析谱图。

图5为一实施例中反应产物的手性HPLC分析谱图。

图6为实施例2-实施例4的5-氟-2-碘苯乙酮添加量实验的底物变化对比图。

图7为实施例2-实施例4的5-氟-2-碘苯乙酮添加量实验的产物变化对比图。

图8为实施例5的底物和产物变化图。

图9为实施例6和实施例7的底物和产物变化对比图。

图10为实施例8-实施例11的不同反应温度实验结果图。

图11为实施例12-实施例16的异丙醇添加量实验结果图。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本文中术语“羰基还原酶”及“羰基还原酶突变体”均为表现出前手性酮类化合物不对称还原氢化活性的酶，其能够将前手性酮类化合物进行不对称还原氢化，将前手性酮类化合物转化为手性羟基化合物。

利用上述的羰基还原酶或羰基还原酶突变体将5-氟-2-碘苯乙酮转化为(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的反应原理如下所示：

。

本文中描述为“具有如SEQ ID NO：n所示氨基酸序列的多肽、蛋白、突变体或酶”，显然，具有如SEQ ID NO：n所示氨基酸序列的多肽、蛋白、突变体或酶，其中一些序列缺失、修饰、取代、保守取代或添加，也可以用于本申请，只要其能够表现出与如SEQ ID NO：n所示氨基酸序列的多肽、蛋白、突变体或酶相同或相应的活性。例如，不排除在“如SEQ ID NO：n所示氨基酸序列的多肽、蛋白、突变体或酶”之前或之后添加不改变蛋白功能的序列、天然存在的突变、其沉默突变或保守取代；并且，具有如SEQ ID NO：n所示氨基酸序列的多肽、蛋白、突变体或酶，当其被添加上述的不改变蛋白功能的序列、天然存在的突变、其沉默突变或保守取代时，也落入本申请的范围内，只要其被添加上述序列后表现出如SEQ ID NO：n所示氨基酸序列相同或相应的活性，其中，n为自然数。

本申请实施例提供一种羰基还原酶突变体，该羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其中，该羰基还原酶突变体产生在如SEQ ID NO：1所示中第87位的缬氨酸V突变为异亮氨酸I的突变。

其中，如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列来源于Lentilactobacillus sp.的羰基还原酶，其NCBI编号为WP_288639724.1。将如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列进行蛋白质三维结构预测，对所得蛋白质三维预测结构进行分析，发现SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中第87位的缬氨酸V为催化的关键位点。

本申请实施例的羰基还原酶突变体产生了有利于提高不对称还原氢化催化活性的突变，其对前手性酮类化合物进行不对称还原氢化催化效率提高，并且对催化形成的手性羟基化合物的立体选择性提高，该羰基还原酶突变体催化5-氟-2-碘苯乙酮进行不对称还原氢化时，大大提高了(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的合成效率。

本申请实施例提供一种羰基还原酶突变体基因，羰基还原酶突变体基因编码上述的羰基还原酶突变体。

其中，该羰基还原酶突变体基因为多核苷酸。

其中，该多核苷酸具有SEQ ID NO：2对应的核苷酸序列。

其中，该多核苷酸为若干个核苷酸聚合形成的DNA链或RNA链。

其中，该多核苷酸只要能够编码上述羰基还原酶突变体即可，可以对该多核苷酸中的任一核苷酸进行化学修饰。

本申请实施例还提供一种重组载体，包括上述的编码羰基还原酶突变体的多核苷酸。

其中，重组载体为上述的编码羰基还原酶突变体的核酸分子的任何天然或人工构建的表达载体，该编码羰基还原酶突变体的核酸分子可被细胞转录酶和/或翻译酶催化。

具体地，重组载体是指一种DNA制备物，其含有编码羰基还原酶突变体的多核苷酸的核酸序列，其还可以含有控制序列，在重组载体中编码羰基还原酶突变体的多核苷酸的核酸序列可操作地连接到合适的控制序列上，使得羰基还原酶突变体可以在合适的宿主中表达。具体地，控制序列可以包括但不限于能够启动转录的启动子、用于调节转录的任意操纵子序列、合适的mRNA核糖体结合位点以及用于控制转录和翻译终止的序列。在转化到合适的宿主细胞中后，重组载体可以独立于宿主基因组进行复制或发挥作用，或者可以整合到基因组本身中进行复制或发挥作用。

其中，对于重组载体的类型不作特别限制，只要其能够在宿主细胞中复制，可以使用本领域已知的任意载体。示例性地，本领域常用载体可以包括天然或重组状态的质粒、粘粒、病毒、噬菌体或转座子等。例如，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、 Charon21A等作为噬菌体载体或粘粒载体，并且可以使用pBR系统、pUC系统、pBluescript II系统、pGEM系统、pTZ系统、pCL系统、pET系统等作为质粒载体。具体地，可以使用pDZ、 pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。

本申请实施例还提供了一种工程菌，包括上述的重组载体。

其中，该工程菌为宿主细胞，上述的重组载体转化至宿主细胞中，使得羰基还原酶突变体可以在本实施例的宿主细胞中合成。重组载体导入至宿主细胞，重组载体中编码羰基还原酶突变体的多核苷酸能够在宿主细胞中表达，以使宿主细胞能够合成上述的羰基还原酶突变体。该多核苷酸可以插入宿主细胞的染色体中或位于宿主细胞的染色体外或同时插入宿主细胞的染色体及位于染色体外，该多核苷酸可以为DNA或RNA，只要能在宿主细胞中表达即可。示例性地，该重组载体可以为表达盒，包括与该多核苷酸可操作连接的启动子、转录终止元件、核糖体结构域及翻译终止元件。

其中，宿主细胞可以为真核细胞或原核细胞，进一步地，该原核细胞可以为细菌细胞。

作为一种实施方式，该宿主细胞可以为埃希氏菌（Escherichia）属、欧文氏菌（Erwinia）属、沙雷氏菌（Serratia）属、普罗威登斯菌（Providencia）属、棒状杆菌（Corynebacterium）属或短杆菌（Brevibacterium）属；示例性地，该宿主细胞可以为大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）或米曲霉菌（Aspergillus oryzae）。

本申请实施例提供一种(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的合成体系，其包括羰基还原酶突变体、辅酶NAD⁺/NADH以及辅酶再生系统，该羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

其中，5-氟-2-碘苯乙酮为一种前手性酮类化合物，5-氟-2-碘苯乙酮作为底物，羰基还原酶突变体作为催化剂，利用羰基还原酶突变体的不对称还原氢化的催化活性，将底物5-氟-2-碘苯乙酮转化为(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇。

其中，由于羰基还原酶突变体为NAD⁺/NADH依赖型氧化还原酶，不对称还原氢化的催化反应需要在辅酶NAD⁺和辅酶再生系统存在下进行。

其中，NAD⁺为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide）的氧化态，其不带有额外的氢化物（即带有负电荷的氢原子），因此呈现正电荷。NAD⁺在细胞中主要作为电子受体，参与多种氧化还原反应。NADH为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，其在结构上包含一个额外的氢化物（即带有负电荷的氢原子）。

如图1所示，在羰基还原酶突变体催化5-氟-2-碘苯乙酮发生不对称还原氢化反应生成(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的过程中，NADH转化为NAD⁺。在辅酶再生系统的存在下，NAD⁺被转化为NADH。

其中，辅酶再生系统包括辅底物和氧化还原酶，辅底物在氧化还原酶的催化下被氧化形成副产物的过程中，NAD⁺被转化为NADH。具体地，辅底物可以为异丙醇，氧化还原酶可以为异丙醇脱氢酶，异丙醇被异丙醇脱氢酶氧化形成异丙酮。辅底物可以为甲酸盐，氧化还原酶可以为甲酸脱氢酶。辅底物还可以为葡萄糖，氧化还原酶可以为葡萄糖脱氢酶。

作为一种实施方式，羰基还原酶突变体来源于含羰基还原酶突变体编码基因的第一重组工程菌，氧化还原酶来源于含氧化还原酶编码基因的第二重组工程菌。

具体地，构建能够表达羰基还原酶突变体的第一重组载体，第一重组载体包括编码羰基还原酶突变体的多核苷酸，该多核苷酸包括上述羰基还原酶突变体的氨基酸序列对应的核苷酸序列。该多核苷酸为若干个核苷酸聚合形成的DNA链或RNA链。该多核苷酸只要能够编码上述羰基还原酶突变体即可，可以对该多核苷酸中的任一核苷酸进行化学修饰。

将第一重组载体转化至宿主细胞中得到第一重组工程菌，使得羰基还原酶突变体可以在第一重组工程菌中合成。

第一重组载体可以具体参见上述实施例的重组载体，第一重组工程菌可以具体参见上述实施例的宿主细胞。

具体地，氧化还原酶构建能够表达氧化还原酶的第二重组载体，第二重组载体包括编码氧化还原酶的多核苷酸，该多核苷酸包括上述氧化还原酶的氨基酸序列对应的核苷酸序列。该多核苷酸为若干个核苷酸聚合形成的DNA链或RNA链。该多核苷酸只要能够编码上述氧化还原酶即可，可以对该多核苷酸中的任一核苷酸进行化学修饰。

第二重组载体是指一种DNA制备物，其含有编码氧化还原酶的多核苷酸的核酸序列，其还可以含有控制序列，在第二重组载体中编码氧化还原酶的多核苷酸的核酸序列可操作地连接到合适的控制序列上，使得氧化还原酶可以在合适的宿主中表达。

将第二重组载体转化至宿主细胞中得到第二重组工程菌，使得氧化还原酶可以在第二重组工程菌中合成。

在一些实施方式中，该合成体系中的羰基还原酶突变体可以为第一重组工程菌诱导培养获得的第一湿菌体，或上述的第一湿菌体破碎得到的粗酶液，或上述的第一湿菌体制备的固定化细胞。该合成体系中的氧化还原酶为第二重组工程菌诱导培养获得的第二湿菌体，或上述的第二湿菌体破碎得到的粗酶液，或上述的第二湿菌体制备的固定化细胞。

本申请实施例提供一种(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的制备方法，使上述的羰基还原酶突变体或含有上述的羰基还原酶突变体的宿主细胞与5-氟-2-碘苯乙酮接触，将5-氟-2-碘苯乙酮转化为(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇。

作为一种实施方式，在辅酶NAD⁺/NADH以及辅酶再生系统存在下，利用含有羰基还原酶突变体的宿主细胞催化5-氟-2-碘苯乙酮进行酮还原以生成(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇，辅酶再生系统包括异丙醇和异丙醇脱氢酶。

请参阅图2所示，在氧化态辅酶转化为还原态辅酶的反应中，异丙醇作为底物，异丙醇脱氢酶作为催化剂，利用异丙醇脱氢酶的氧化催化活性，将异丙醇转化为丙酮；异丙醇在异丙醇脱氢酶的催化下被氧化形成产物丙酮的过程中，NAD⁺被转化为NADH。

请继续参阅图2所示，在还原态辅酶转化为氧化态辅酶的反应中，5-氟-2-碘苯乙酮作为底物，羰基还原酶突变体作为催化剂，利用羰基还原酶突变体的不对称还原氢化的催化活性，将底物5-氟-2-碘苯乙酮转化为(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇；在羰基还原酶突变体催化5-氟-2-碘苯乙酮发生不对称还原氢化反应生成(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的过程中，NADH转化为NAD⁺。

在一些实施方式中，在反应体系中， NADH和NAD⁺的总浓度为0.08 mM（mmol/L）～0.15mM（mmol/L）。示例性地，在反应体系中，NADH和NAD⁺的总浓度为0.1 mM（mmol/L）。

在一些实施方式中，异丙醇与反应体系的体积比为0.35～0.45:1，宿主细胞的浓度与5-氟-2-碘苯乙酮的初始浓度之比为100g/L:100 g/L～200 g/L，反应温度为30℃～40℃。

羰基还原酶突变体的制备

羰基还原酶突变体以及羰基还原酶的编码基因可以称为Aldehyde-KetoneReductase基因，该Aldehyde-Ketone Reductase基因含有上述的羰基还原酶突变体或羰基还原酶突变酶的氨基酸序列对应的核苷酸序列，例如，该Aldehyde-Ketone Reductase基因含有如SEQ ID NO ：1～SEQ ID NO ：2所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列，将该Aldehyde-Ketone Reductase基因构建于pET-28a质粒中获得第一重组载体。

第一重组载体为含有Aldehyde-Ketone Reductase基因的pET-28a质粒，以下称为pET-28a-Aldehyde-Ketone Reductase；本申请中各实施例及对比例中所采用的宿主细胞为大肠杆菌。pET-28a质粒的结构和序列可以参见CN202410706921.3中pET-28a质粒，再将本申请实施例1以及对比例1中SEQ ID NO ：1～SEQ ID NO ：2所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列作为目标表达基因构建至其中。

羰基还原酶突变体的表达

a. 将pET-28a-Aldehyde-Ketone Reductase转化至大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中；挑取pET-28a-Aldehyde-Ketone Reductase的单克隆或-80℃保存菌株，在超净工作台中划线接种至含相应抗生素（如卡那霉素，终浓度50 μg/mL）的LB固体培养基表面，随后置于37 ℃恒温培养箱中静置培养12 h，直至形成清晰单菌落。

b. 用无菌接种环挑取新鲜平板上单菌落，接种至10 mL含相同抗生素的LB液体培养基中，于37 ℃、200 rpm振荡培养12 h，获得OD600≈3.0的种子液，确保菌体处于对数生长期。

c. 将种子液按1%（v/v）接种量转移至含50 mL LB液体培养基（卡那霉素，终浓度50 ～100μg/mL）的锥形瓶中，在37 ℃、200 rpm条件下振荡培养2 h，监测菌体生长至 OD600约为 0.6-0.8，为后续催化反应提供高活性菌体。

d. 降低摇床温度至16 ℃-18 ℃，待培养的菌液温度降低后，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside， IPTG）至终浓度0.5 mM，诱导表达14-16 h。

e. 表达完成后，将上述培养菌液收集到瓶中，将离心机预冷到4℃，5500 rpm，离心10 min。

f. 去除上清，加入30 mL蛋白纯化缓冲液，用旋涡振荡器重悬菌体。

g. 全细胞催化剂的获取：将重悬的菌体再次离心5500 rpm，10 min，倒掉上清，收集到的湿菌体即为全细胞催化剂，该湿菌体可以作为羰基还原酶突变体催化剂直接使用。

h．全细胞催化剂的保存：将湿菌体加入30 mL蛋白纯化缓冲液，用旋涡振荡器将菌体重悬（不能有固体颗粒状），倒入50 mL 离心管中，-80 ℃冰箱保存。

羰基还原酶突变体蛋白的纯化

a. 粗酶液的制备：将收集的1.0 g湿菌体（全细胞催化剂）加入到20 mL的平衡缓冲中进行重悬，利用细胞破碎仪对重悬细胞进行破碎，细胞破碎仪参数设置为300 W，防止温度过高对酶活有影响，破碎程序设置为工作1 s，暂停3 s，同时破碎液需一直用冰水混合液降温，混悬液澄清透明时即可停止破碎。将破碎液在4 ℃，12000 rpm离心10 min，收集上清液，并通过0.22 µm滤膜进行过滤获得粗酶液，该粗酶液可以作为羰基还原酶突变体催化剂直接使用。

b. 离子交换层析柱再生与平衡：利用DEAE Sepharose Fast Flow 阴离子交换柱进行蛋白纯化，用高盐浓度的缓冲液（含1~2 M NaCl）按1 mL/min的流速冲洗3~5个柱体积，然后用0.1 M NaOH冲洗3~5个柱体积，然后用洗脱缓冲液冲洗3~5个柱体积，接着用平衡液洗到平衡3~5个柱体积，直至检测器的OD280、电导率、pH值等参数信号稳定。

c. 粗酶液的上样和洗脱：将制备好的粗酶液以0.5 mL/min的上样速度上样，上样量为20 mL。上样完成后使用平衡缓冲液冲洗3~5柱体积，然后采用增大盐浓度梯度洗脱的方式，使用洗脱缓冲液进行洗脱，收集各组分，并用蛋白电泳进行确认，若出现纯化效果不佳，可重复此步骤，或使用琼葡糖凝胶G75 FF在次纯化。

d. 蛋白浓缩：利用超滤膜浓缩法对收集的目的蛋白进行浓缩，使用10 kDa的蛋白浓缩管进行浓缩，4 ℃，5000 rpm离心30 min。

e. 蛋白脱盐：加入适量的PBS缓冲液（20 mM，pH 7.0）对浓缩后的蛋白进行稀释，并将其装在透析袋内（截留分子量 8~14 kDa），使用20 mM，pH 7.0的PBS透析液，4 ℃冰箱静置过夜，中途需更换一次透析液。

f. 离子交换层析柱的保存：使用后的离子交换层析柱用1 M的NaOH冲洗3~5个柱体积，并用20 %的乙醇冲洗后，置于4 ℃冰箱保存。

羰基还原酶突变体蛋白的电泳分析

a. 蛋白样品的处理：将纯化后的蛋白溶液和5 × 上样缓冲液按1 : 4（v/v）的比例添加，沸水加热10 min，结束后备用。

b. 上样，电泳：将蛋白预制胶（Genscript，SurePAGE，4%~20%）置于电泳槽内，通过移液枪将蛋白样品及Marker添加到蛋白胶上样孔中。

c. 染色、脱色：将电泳结束的预制胶，去除外壳，通过蛋白染色脱色仪自动脱色，染色，时间设置为15 min。

d. 蛋白胶图分析：染色，脱色后的蛋白胶通过凝胶成像仪拍照保存。

异丙醇脱氢酶的制备

异丙醇脱氢酶的编码基因可以称为IPADH基因，该IPADH基因含有上述的异丙醇脱氢酶的氨基酸序列对应的核苷酸序列，例如，该异丙醇脱氢酶的氨基酸序列可以参见现有技术CN202411939556.7采用的异丙醇脱氢酶，该IPADH基因含有现有技术CN202411939556.7中的如SEQ ID NO ：7所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列，将该IPADH基因构建于pET-28a质粒中获得第二重组载体。

第二重组载体为含有IPADH基因的pET-28a质粒，以下称为pET-28a- IPADH；本申请中各实施例及对比例中所采用的宿主细胞为大肠杆菌。

异丙醇脱氢酶的表达

a．将pET-28a- IPADH转化至大肠杆菌中；挑取pET-28a- IPADH的单克隆或-80℃保存菌株在超净工作台中划线接种至含相应抗生素（如卡那霉素，终浓度50 μg/mL）的LB固体培养基表面，随后置于37 ℃恒温培养箱中静置培养12 h，直至形成清晰单菌落。

b. 用无菌接种环挑取新鲜平板上单菌落，接种至10 mL含相同抗生素的LB液体培养基中，于37 ℃、200 rpm振荡培养12 h，获得OD600≈3.0的种子液，确保菌体处于对数生长期。

c. 将种子液按1%（v/v）接种量转移至含50 mL LB液体培养基（卡那霉素，终浓度50 ～100μg/mL）的锥形瓶中，在37 ℃、200 rpm条件下振荡培养2 h，监测菌体生长至 OD600约为 0.6-0.8，为后续催化反应提供高活性菌体。

d. 降低摇床温度至16 ℃-18 ℃，待培养的菌液温度降低后，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside， IPTG）至终浓度0.5 mM，诱导表达14-16 h。

e. 表达完成后，将上述培养菌液收集到瓶中，将离心机预冷到4℃，5500 rpm，离心10 min。

f. 去除上清，加入30 mL蛋白纯化缓冲液，用旋涡振荡器重悬菌体。

g. 全细胞催化剂的获取：将重悬的菌体再次离心5500 rpm，10 min，倒掉上清，收集到的湿菌体即为全细胞催化剂，该湿菌体可以作为异丙醇脱氢酶催化剂直接使用。

h．全细胞催化剂的保存：将湿菌体加入30 mL蛋白纯化缓冲液，用旋涡振荡器将菌体重悬（不能有固体颗粒状），倒入50 mL 离心管中，-80 ℃冰箱保存。

酶催化反应

体外酶催化反应条件：

反应的缓冲液：浓度为100mM、200mM、300mM的磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液；

反应pH：pH7；

5-氟-2-碘苯乙酮的浓度为100 g/L、200g/L、300g/L；

异丙醇体积浓度为250μL/1mL、300μL/1mL、350μL /1mL、400μL /1mL、450μL /1mL、20mL/50mL；

NAD⁺的浓度为0.08 mM、0.1 mM、0.12 mM、0.15 mM；

羰基还原酶突变体（全细胞催化剂、粗酶液）的添加量为100g/L；

异丙醇脱氢酶（全细胞催化剂、粗酶液）的添加量为100g/L；

反应温度：25℃、30℃、35℃、40℃；

反应时间：2h、4h、6h、8h、10h、12h、15h、16h、18h、20h、22h、或24h；

反应总体系为1mL、50mL。

(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的检测

检测方法： OD-H 手性柱；

流动相：正己烷：异丙醇 98：2；

检测器：2998 PDA；

其中，图3和图4为购买的标准品进行的图谱分析，用于进行结果对比；图3为产物标准品消旋体的手性HPLC分析谱图，用于比较反应产物与消旋体的手性差异；图4为产物标准品S构型的手性HPLC分析谱图，用于确认反应产物为S构型。图5为一实施例中反应产物的手性HPLC分析谱图。

实施例1中羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，对比例1中羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例1及对比例1催化反应条件

反应的缓冲液：浓度为100mM的磷酸钠缓冲液；

反应pH：pH7；

5-氟-2-碘苯乙酮的初始浓度为100 g/L；

异丙醇初始体积浓度为400μL /1mL；

NAD⁺的浓度为0.1 mM；

羰基还原酶突变体（全细胞催化剂）的添加量为100g/L；

异丙醇脱氢酶（全细胞催化剂）的添加量为100g/L；

反应温度： 35℃；

反应时间： 8h；

反应总体系为1mL。

实施例1及对比例1的结果具体参见表1所示，其中，对比例1中羰基还原酶的相对活性为1，实施例1中羰基还原酶突变体的相对活性为基础进行示出。

表1 实施例1及对比例参数

5-氟-2-碘苯乙酮添加量实验

羰基还原酶突变体和异丙醇脱氢酶分别为第一重组工程菌的诱导培养湿菌体经破碎后所得粗酶以及第二重组工程菌的诱导培养湿菌体经破碎后所得粗酶。

反应的缓冲液：浓度为100mM的磷酸钠缓冲液；

反应pH：pH7；

异丙醇体积浓度为400μL /1mL；

NAD⁺的浓度为0.1 mM；

羰基还原酶突变体（粗酶）的添加量为100g/L；

异丙醇脱氢酶（粗酶）的添加量为100g/L；

反应温度： 35℃；

反应时间： 16h；

反应总体系为1mL。

各实施例中5-氟-2-碘苯乙酮的浓度如表2所示：

表2 各实施例5-氟-2-碘苯乙酮的添加量

请参阅图6和图7所示，实施例2和实施例3的底物5-氟-2-碘苯乙酮均被消耗，实施例5中底物5-氟-2-碘苯乙酮被消耗约230 g/L；并且，实施例2至实施例5中手性纯度(S型)均超过90%。

实施例5：放大反应体系

反应的缓冲液：浓度为100mM的磷酸钠缓冲液；

反应pH：pH7；

5-氟-2-碘苯乙酮的初始浓度为100 g/L；

异丙醇初始体积浓度为400μL /1mL；

NAD⁺的浓度为0.1 mM；

羰基还原酶突变体（全细胞催化剂）的添加量为100g/L；

异丙醇脱氢酶（全细胞催化剂）的添加量为100g/L；

反应温度： 35℃；

反应时间： 16h；

反应总体系为50mL。

请参阅图8所示，反应体系放大后，底物也被完全消耗。

全细胞催化剂与粗酶液对比实验

反应的缓冲液：浓度为100mM的磷酸钠缓冲液；

反应pH：pH7；

5-氟-2-碘苯乙酮的浓度为100 g/L；

异丙醇体积浓度为400μL /1mL；

NAD⁺的浓度为0.1 mM；

羰基还原酶突变体的添加量为100g/L；

异丙醇脱氢酶（粗酶）的添加量为100g/L；

反应温度： 35℃；

反应时间： 16h；

反应总体系为1mL。

表3 各实施例羰基还原酶突变体形态

请参阅图9所示，采用全细胞催化剂和采用粗酶液的催化效果相当。

反应温度对比实验

反应的缓冲液：浓度为100mM的磷酸钠缓冲液；

反应pH：pH7；

5-氟-2-碘苯乙酮的浓度为100 g/L；

异丙醇体积浓度为400μL /1mL；

NAD⁺的浓度为0.1 mM；

羰基还原酶突变体（全细胞催化剂）的添加量为100g/L；

异丙醇脱氢酶（全细胞催化剂）的添加量为100g/L；

反应时间： 30min；

反应总体系为1mL。

表4 各实施例反应温度

请参阅图10所示，反应温度为30℃～40℃较佳，反应温度为35℃最佳。

异丙醇添加量实验

反应的缓冲液：浓度为100mM的磷酸钠缓冲液；

反应pH：pH7；

5-氟-2-碘苯乙酮的浓度为100 g/L；

NAD⁺的浓度为0.1 mM；

羰基还原酶突变体（全细胞催化剂）的添加量为100g/L；

异丙醇脱氢酶（全细胞催化剂）的添加量为100g/L；

反应温度： 35℃；

反应时间： 30min；

反应总体系为1mL。

表5 各实施例异丙醇体积

请参阅图11所示，异丙醇体积浓度为350μL /1mL～450μL /1mL较佳，异丙醇体积浓度为400μL /1mL最佳。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本申请的优选的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

2.一种羰基还原酶突变体基因，其特征在于，所述羰基还原酶突变体基因编码如权利要求1所述的羰基还原酶突变体。

3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求2所述的羰基还原酶突变体基因。

4.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌包括如权利要求3所述的重组载体。

5.一种(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的合成体系，其特征在于，包括羰基还原酶突变体、辅酶NAD⁺/NADH以及辅酶再生系统，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

6.根据权利要求5所述的(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的合成体系，其特征在于，所述辅酶再生系统包括辅底物和氧化还原酶，所述辅底物为异丙醇、甲酸盐或葡萄糖，所述氧化还原酶为异丙醇脱氢酶、甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。

7.根据权利要求6所述的(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的合成体系，其特征在于，所述羰基还原酶突变体来源于含羰基还原酶突变体编码基因的第一重组工程菌，所述氧化还原酶来源于含氧化还原酶编码基因的第二重组工程菌。

8.一种(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的制备方法，其特征在于，使权利要求1所述的羰基还原酶突变体或含有权利要求1所述的羰基还原酶突变体的宿主细胞与5-氟-2-碘苯乙酮接触，将5-氟-2-碘苯乙酮转化为(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇。

9.根据权利要求8所述的(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的制备方法，其特征在于，在辅酶NAD⁺/NADH以及辅酶再生系统存在下，利用含有羰基还原酶突变体的宿主细胞催化所述5-氟-2-碘苯乙酮进行酮还原以生成(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇，所述辅酶再生系统包括异丙醇和异丙醇脱氢酶。

10.根据权利要求9所述的(S)-1-(5-氟-2-碘苯基)乙醇的制备方法，其特征在于，所述异丙醇与反应体系的体积比为0.35～0.45:1，所述宿主细胞的浓度与所述5-氟-2-碘苯乙酮的初始浓度之比为100g/L:100 g/L～200 g/L，反应温度为30℃～40℃。