CN121057577A

CN121057577A - 经修饰的脂质组合物及其用途

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Publication number: CN121057577A
Application number: CN202480022079.XA
Authority: CN
Inventors: S·帕特尔; 张晓雪; A·豪; J·尤尼恩; S·巴尔穆里; T·查尔; D·萨勒诺; M·卡达姆
Original assignee: Sail Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Sail Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-01-27
Filing date: 2024-01-26
Publication date: 2025-12-02
Also published as: WO2024159172A1; JP2026503676A; AU2024212425A1; KR20250153793A; EP4654952A1

Abstract

本文公开了经修饰的脂质组合物，这些经修饰的脂质组合物包含(a)结构组分，该结构组分包含选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇组成的组的一种或多种脂质；并且由(b)可电离脂质修饰。本公开还包括一种用于制备经修饰的脂质组合物的方法，该方法包括在(b)可电离脂质的存在下重构(a)包含选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇和/或葡糖基胆固醇组成的组的一种或多种脂质的结构组分，以产生该经修饰的脂质组合物，以及将一种或多种异源功能剂装载到该经修饰的脂质组合物中。

Description

经修饰的脂质组合物及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2023年1月27日提交的美国临时申请第63/441,666号和2023年11月8日提交的美国临时申请第63/597,249号的优先权权益，这两项申请均以引用的方式全文并入本文。

背景技术

异源功能剂(诸如治疗剂或免疫剂)的递送可受药剂可穿透细胞屏障并由此有效作用于生物体的程度的限制。因此，本领域持续需要开发可有效递送异源功能剂并促进药剂的细胞摄取的新型递送系统。

发明内容

在一个方面，本文提供了一种经修饰的脂质组合物，该经修饰的脂质组合物包含：

(a)结构组分，该结构组分包含选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇和葡糖基胆固醇组成的组的一种或多种脂质；由以下物质修饰

(b)可电离脂质。

在一些实施方案中，(a)中列出的一种或多种脂质增加了经修饰的脂质组合物向脾脏的递送，其特征在于增加的脾脏与肝脏递送比率。

在一些实施方案中，结构组分包含心磷脂，例如源自牛心脏的心磷脂。在一些实施方案中，结构组分包含鞘脂诸如鞘磷脂脂质，例如源自动物脑的鞘磷脂脂质。

在一些实施方案中，包含一种或多种脂质的结构组分是大豆衍生脂质。

因此，在一个方面，本文提供了一种经修饰的脂质组合物，该经修饰的脂质组合物包含：

(a)包含大豆衍生脂质的结构组分，由以下物质修饰

(b)可电离脂质。

在一些实施方案中，大豆衍生脂质增加了经修饰的脂质组合物向脾脏的递送，其特征在于增加的脾脏与肝脏递送比率。

在一些实施方案中，脾脏与肝脏递送比率增加至约1.0、约2.0、约3.0、约4.0、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0、约10.0、约15.0、约20.0或更大。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物中的结构脂质组分的量的增加增加了脾脏与肝脏递送比率。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以是复合脂质颗粒(CLP)，该复合脂质颗粒(CLP)包含天然脂质提取物和衍生物(诸如大豆脂质提取物或大豆衍生脂质)，以及可电离脂质。

在另一方面，本文提供了一种用于将一种或多种异源功能剂递送至细胞或受试者的方法，该方法包括将细胞与一种或多种异源功能剂和如本文所描述的经修饰的脂质组合物接触或向受试者施用一种或多种异源功能剂和如本文所描述的经修饰的脂质组合物，其中异源功能剂被经修饰的脂质组合物包封、嵌入在经修饰的脂质组合物的表面上或缀合至经修饰的脂质组合物的表面，

在一些实施方案中，将一种或多种异源功能剂递送至脾细胞、免疫细胞、淋巴细胞、造血干细胞和/或骨髓细胞。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物增加脾细胞、免疫细胞、淋巴细胞、造血干细胞和/或骨髓细胞的转染。

在一些实施方案中，淋巴细胞(例如，脾淋巴细胞)以亲本群体的1％、2％、5％或更高的频率被转染。

在一些实施方案中，骨髓细胞(例如，脾骨髓细胞)以亲本群体的5％、10％、15％或更高的频率被转染。

在一些实施方案中，造血干细胞以亲本群体的5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或更高的频率被转染。

在本发明的任何方面，在一些实施方案中，大豆衍生脂质组分包含大豆PC(磷脂酰胆碱)、大豆PE(磷脂酰乙醇胺)、大豆PI(磷脂酰肌醇)、大豆PA(磷脂酸)、大豆溶血PC(LPC)、大豆溶血PI(LPI)、大豆PG(磷脂酰甘油)、大豆PS(磷脂酰丝氨酸)、大豆溶血PS(LPS)、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)或它们的组合。

在一些实施方案中，结构组分是大豆PI、大豆LPI、大豆PG、大豆极性脂质、大豆LPC、大豆PC、大豆PE、大豆PA、大豆PL(磷脂)混合物、大豆PS、大豆LPS、HSPC、心磷脂或它们的任何组合。在一些实施方案中，大豆衍生脂质是大豆极性脂质组合物、大豆PL混合物或它们的组合。

在一些实施方案中，大豆极性脂质组合物是从大豆提取的极性脂质混合物，例如源自用丙酮沉淀大豆然后用乙醚提取丙酮不溶性物质的那些极性脂质。在一些实施方案中，大豆极性脂质组合物包含大豆磷脂(PL)的混合物。

在一些实施方案中，大豆极性脂质组合物包含PC、PE、PI、PA和任选的LPC。在一些实施方案中，大豆极性脂质组合物包含

约40％至约50％的PC，

约15％至约30％的PE，

约10％至约25％的PI，

约1％至约15％的PA，

约0％至约10％的LPC，和

约0％至约15％的其他脂质。

在一个实施方案中，大豆极性脂质组合物包含百分比比率为约45.7:22.1:18.4:6.9:0:6.9的PC:PE:PI:PA:LPC:其他脂质。

在一些实施方案中，大豆PL混合物包含PC、PE、PI、PA和LPC。在一些实施方案中，大豆PL混合物包含

约30％至约50％的PC，

约20％至约40％的PE，

约10％至约25％的PI，

约1％至约15％的PA，

约1％至约15％的LPC，和

约0％至约10％的其他脂质。

在一个实施方案中，大豆PL混合物包含百分比比率为约38:30:18:7:7:0的PC:PE:PI:PA:LPC:其他脂质。

在另一方面，本文提供了一种经修饰的脂质组合物，该经修饰的脂质组合物包含多种脂质重构结构组分，其中这些脂质重构组分通过包括以下步骤的方法产生：(a)提供多种结构脂质；(b)处理该多种脂质以产生脂质膜；(c)在选自由乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1-丁醇、二甲基亚砜、乙腈:乙醇、乙腈：甲醇、丙酮:甲醇、甲基叔丁基醚:丙醇、四氢呋喃:甲醇、二甲基亚砜:甲醇和二甲基甲酰胺:甲醇组成的组的有机溶剂中重建脂质膜，从而产生脂质溶液；和(d)在包含水相的微流体装置中处理步骤(c)的脂质溶液，从而产生经修饰的脂质组合物。

在另一方面，本文提供了一种用于制备经修饰的脂质组合物的方法。该方法包括在(b)可电离脂质的存在下重构(a)包含选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇组成的组的一种或多种脂质的结构组分，以产生经修饰的脂质组合物。该方法还包括将一种或多种异源功能剂装载到经修饰的脂质组合物中。可电离脂质具有以下所列特征中的两种或更多种特征：

(i)至少2个可电离胺；

(ii)至少3个脂质尾部，其中脂质尾部中的每个脂质尾部的长度为至少6个碳原子；

(iii)约4.5至约7.5的pKa；

(iv)由具有至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及

(v)至少10的N:P比率。

在一些替代实施方案中，可电离脂质具有以下所列特征中的两种或更多种特征：

(i)至少2个可电离胺；

(iii)约4.5至约7.5的pKa；

(v)至少3的N:P比率。

在另一方面，本文提供了一种用于将经修饰的脂质组合物递送至靶细胞的方法，该方法包括将经修饰的脂质组合物引入至靶细胞，该经修饰的脂质组合物包含(a)结构组分，该结构组分包含选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇组成的组的一种或多种脂质；和(b)可电离脂质。

在一些实施方案中，结构组分包含分离的天然细胞外囊泡。在一些实施方案中，结构组分源自天然来源。在一些实施方案中，天然来源是大豆或动物(例如猪、牛等)。

在一些实施方案中，通过在可电离脂质的存在下重构包含结构组分的膜来修饰结构组分。

在一些实施方案中，结构组分包含大豆衍生脂质，并且结构脂质通过用可电离脂质重构包含纯化的大豆衍生脂质的膜而被修饰。

在一些实施方案中，可电离脂质具有选自由以下各项组成的组的一种或多种特征：

(i)至少2个可电离胺；

(iii)约4.5至约7.5的pKa；

(v)至少10的N:P比率。

在一些替代实施方案中，可电离脂质具有选自由以下各项组成的组的一种或多种特征：

(i)至少2个可电离胺；

(iii)约4.5至约7.5的pKa；

(v)至少3的N:P比率。

在一些实施方案中，可电离脂质选自由1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5、SM-102(脂质H)和ALC-315组成的组。在一个实施方案中，可电离脂质是C12-200。

在一些实施方案中，可电离脂质是其中R是C₈-C₁₄烷基。

在一些实施方案中，可电离脂质可选自以下化合物组之一：

i)式的化合物、其药学上可接受的盐或前述中的任一者的立体异构体，其中：

每个A独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₁-C₁₆支链或非支链烯基，该烷基或烯基任选地被杂原子取代或被OH、SH或卤素取代；

每个B独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₁-C₁₆支链或非支链烯基，该烷基或烯基任选地被杂原子取代或被OH、SH或卤素取代；

每个X独立地是可生物降解部分；并且

W是或其中：

R₅是OH、SH或NR₁₀R₁₁；

每个R₆独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基或环烷基；

每个R₇和每个R₈独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、卤素、OH、SH或NR₁₀R₁₁，其中每个R₁₀和R₁₁独立地是H、C₁-C₃烷基，或R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；R₇和R₈合在一起形成环；

每个s独立地是1、2、3、4或5；

每个u独立地是1、2、3、4或5；

t是1、2、3、4或5；

每个Z独立地不存在，是O、S或NR₁₂，其中R₁₂是H、C₁-C₇支链或非支链烷基或C₂-C₇支链或非支链烯基，并且

Q是O、S或NR₁₃，其中每个R₁₃是H或C₁-C₅烷基；

ii)式的化合物、其药学上可接受的盐或前述中的任一者的立体异构体，其中：

是环状或杂环部分；

Y是烷基、羟基、羟烷基或

A不存在，是-O-、-N(R⁷)-、-O-亚烷基-、-亚烷基-O-、-OC(O)-、-C(O)O-、

-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-、-N(R⁷)C(O)N(R⁷)-、-S-、-S-S-或二价杂环；

X和Z中的每一者独立地不存在，是-O-、-CO-、-N(R⁷)-、-O-亚烷基-；

-亚烷基-O-、-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-或-S-；

每个R⁷独立地是H、烷基、烯基、环烷基、羟基、羟烷基或氨基烷基；

每个M独立地是可生物降解部分；

R₃₀、R₄₀、R₅₀、R₆₀、R₇₀、R₈₀、R₉₀、R₁₀₀、R₁₁₀和R₁₂₀中的每一者独立地是H，任选地被杂原子间杂或被OH、SH或卤素取代的C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₁-C₁₆支链或非支链烯基，或环烷基或经取代的环烷基；

l和m中的每一者是1至10的整数；

t1是0至10的整数；并且

W是羟基、经取代的或未经取代的羟烷基、经取代的或未经取代的氨基、经取代的或未经取代的氨基羰基或经取代的或未经取代的杂环基或杂芳基；

iii)式

的化合物、其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体，其中：

R₂₀和R₃₀各自独立地是H、C₁-C₅支链或非支链烷基或C₂-C₅支链或非支链烯基，或R₂₀和R₃₀与相邻N原子一起形成3至7元环，该环任选地被R^a取代；

R^a是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、卤素、OH或SH；

每个R₁和每个R₂独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁，或者

R₁和R₂合在一起形成环；

每个R₁₀和R₁₁独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基，或R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；

n是0、1、2、3或4；

Y是O或S；

Z不存在，是O、S或N(R₁₂)，其中每个R₁₂独立地是H、C₁-C₇支链或非支链烷基或C₂-C₇支链或非支链烯基，条件是当Z并非不存在时，相邻的R₁和R₂不能是OH、NR₁₀R₁₁或SH；

v是0、1、2、3或4；

y是0、1、2、3或4；

每个A各自独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₂-C₁₆支链或非支链烯基，该烷基或烯基任选地被一个或多个杂原子间杂或任选地被OH、SH或卤素取代；

每个B各自独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₂-C₁₆支链或非支链烯基，该烷基或烯基任选地被一个或多个杂原子间杂或任选地被OH、SH或卤素取代；并且

每个X独立地是可生物降解部分；和

iv)包含至少一个头部基团和式(TI)或(TI')

的至少一个尾部基团的脂质、其药学上可接受的盐或前述中的任一者的立体异构体，

其中：

E各自独立地是-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-、-C(O-R₁₃)-O-、

-C(O)O(CH₂)_r-、-C(O)N(R⁷)(CH₂)_r-、-S-S-或-C(O-R₁₃)-O-(CH₂)_r-，其中每个R⁷独立地是H、烷基、烯基、环烷基、羟烷基或氨基烷基；

R₁₃是支链或非支链C₃-C₁₀烷基；

r是1、2、3、4或5；

R^a各自独立地是C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基；

u1和u2各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；

R^t各自独立地是H，任选地被杂原子间杂或被OH、SH或卤素取代的C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₁-C₁₆支链或非支链烯基，或环烷基或经取代的环烷基；并且

表示将尾部基团与头部基团连接的键；并且

其中脂质的pKa是约4至约8。

在本发明的所有这些方面，在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物是包含天然脂质(诸如大豆衍生脂质)和可电离脂质的CLP。因此，本文中描述与经修饰的脂质组合物有关的特征的所有实施方案均适用于CLP调配物。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物还包含固醇。因此，结构组分的重构(或重建)在可电离脂质和固醇的存在下进行。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物还包含聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。因此，结构组分的重构(或重建)在可电离脂质和聚乙二醇化脂质(或PEG-脂质缀合物)的存在下进行。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物还包含固醇和/或聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。因此，结构组分的重构(或重建)在可电离脂质、固醇和/或聚乙二醇化脂质(或PEG-脂质缀合物)的存在下进行。

在一些实施方案中，固醇是胆固醇或谷固醇。

在一些实施方案中，PEG-脂质缀合物是C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k。在一些实施方案中，PEG-脂质缀合物是PEG-DMG或PEG-PE。在一些实施方案中，PEG-PEG-脂质缀合物是PEG2000-DMG或PEG2000-PE。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含：

约20mol％至约50mol％的可电离脂质，

约10mol％至约75mol％的结构组分，

约0mol％至约45mol％的固醇，和

约0.5mol％至约3mol％的聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含：

约20mol％至约50mol％的可电离脂质，

约20mol％至约60mol％的结构组分(例如，结构脂质)，

约7mol％至约45mol％的固醇，和

约0.5mol％至约3mol％的聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含：

约30mol％至约40mol％的可电离脂质，

约20mol％至约50mol％的结构组分(例如，结构脂质)，

约12mol％至约43mol％的固醇，和

约1.5mol％至约3mol％的聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含：

约35mol％的可电离脂质，

约50mol％的结构组分(例如，结构脂质)，

约12.5mol％的固醇，和

约2.5mol％的聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:50:12.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:20:42.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约22.5:75:0:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:30:32.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:16:46.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:25:37.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:40:22.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约45:10:43.5:1.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约50:20:28.5:1.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约50:10:38.5:1.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一些实施方案中，结构脂质包含结构脂质1和结构脂质2，其中结构脂质1和结构脂质2是不同的结构脂质。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:(3+13):46.5:2.5的可电离脂质:(结构脂质1+结构脂质2):固醇:PEG-脂质，

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:(15+5):42.5:2.5的可电离脂质:(结构脂质1+结构脂质2):固醇:PEG-脂质，

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:(45+5):12.5:2.5的可电离脂质:(结构脂质1+结构脂质2):固醇:PEG-脂质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含：

选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇和葡糖基胆固醇组成的组的脂质，

C12-200，

胆固醇，以及

DMPE-PEG2k。

在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含：

选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇和葡糖基胆固醇组成的组的极性脂质，

C12-200，

胆固醇，以及

DMPE-PEG2k。经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为约35:50:12.5:2.5或约35:20:42.5:2.5的C12-200:结构脂质:胆固醇:DMPE-PEG2k。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为22.5:75:0:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为35:50:12.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为35:30:32.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为35:20:42.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为35:16:46.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为35:(3+13):46.5:2.5的可电离脂质:(结构脂质1+结构脂质2):固醇:PEG-脂质(结构脂质1可以是本文描述的结构脂质；结构脂质2可以是本文描述的不同于结构脂质1的结构脂质，或者结构脂质2可以是适合于制备脂质纳米颗粒组合物的任何脂质)。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物是选自由脂质复合体(lipoplex)、脂质体、脂质纳米颗粒、基于聚合物的载剂、外泌体、层状体、胶束和乳液组成的组的亲脂性部分。在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物是选自由阳离子脂质体、纳米脂质体、蛋白脂质体、单层脂质体、多层脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体和多囊脂质体组成的组的脂质体。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物是脂质纳米颗粒。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的颗粒具有小于约200nm的尺寸。在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物的颗粒

具有小于约150nm的尺寸。在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物的颗粒具有小于约100nm的尺寸。在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物的颗粒具有约55nm至约95nm的尺寸。在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物的颗粒具有约85nm至约95nm的尺寸。在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物的颗粒具有约85nm至约90nm的尺寸。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的颗粒的平均多分散指数(PDI)在约0.1至约0.5的范围内。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的颗粒的平均PDI在约0.1至约0.4的范围内。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的颗粒的平均PDI在约0.2至约0.3的范围内。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含一种或多种异源功能剂。在一些实施方案中，异源功能剂被经修饰的脂质组合物包封。在一些实施方案中，异源功能剂嵌入在经修饰的脂质组合物的表面上。在一些实施方案中，异源功能剂缀合至经修饰的脂质组合物的表面。

在一些实施方案中，异源功能剂是多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸选自mRNA、环状RNA(circRNA)、siRNA或siRNA前体、微小RNA(miRNA)或miRNA前体、质粒、Dicer底物小干扰RNA(dsiRNA)、短发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代、锁核酸(LNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶、脱氧核酶(DNAzyme)、适体、向导RNA(gRNA)或编码这些RNA中的任一种的DNA分子。在一些实施方案中，多核苷酸是mRNA。在一些实施方案中，多核苷酸是circRNA。在一些实施方案中，mRNA源自DNA分子或RNA分子(例如，自我复制RNA分子)。在一些实施方案中，多核苷酸是siRNA或其前体。在一些实施方案中，多核苷酸是质粒。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物对多核苷酸的包封效率为至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或大于99％。在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物对多核苷酸的包封效率为至少约90％。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物具有约50:1至约10:1的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物具有约44:1至约24:1的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物具有约40:1至约28:1的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物具有约38:1至约30:1的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物具有约37:1至约33:1的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物被配制用于递送至动物或人。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物被配制用于递送至植物。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物通过包括脂质挤出的方法产生。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物通过包括在包含水相的微流体装置中处理包含来自经修饰的脂质组合物的脂质的溶液的方法产生，从而产生经修饰的脂质组合物。

在一些实施方案中，异源功能剂经由水相配制到经修饰的脂质组合物中。在一些实施方案中，水相和脂质溶液(有机相)以3:1的体积比混合。

在一些实施方案中，水相包含多核苷酸。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物(例如，水相)还包含HEPES或TRIS缓冲液。HEPES或TRIS缓冲液的pH可以为约7.0至约8.5。HEPES或TRIS缓冲液的浓度可以为约7mg/mL至约15mg/mL。水相还可以包含约2.0mg/mL至约4.0mg/mL NaCl。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物(例如，水相)包含水、PBS或柠檬酸盐缓冲液。在一个实施方案中，水相包含pH为约3.2的柠檬酸盐缓冲液。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物还包含一种或多种冷冻保护剂。一种或多种冷冻保护剂可以是蔗糖、甘油或其组合。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含蔗糖，例如，浓度为约70mg/mL至约110mg/mL。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含甘油，例如，浓度为约50mg/mL至约70mg/mL。在一个实施方案中，经修饰的脂质组合物包含蔗糖(例如，浓度为约70mg/mL至约110mg/mL)和甘油(例如，浓度为约50mg/mL至约70mg/mL)的组合。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物是冷冻干燥或冻干的组合物。冷冻干燥或冻干的经修饰的脂质组合物可以包含一种或多种冻干保护剂。冻干的经修饰的脂质组合物可以包含泊洛沙姆、山梨酸钾、蔗糖或它们的任何组合。在一个实施方案中，冻干的经修饰的脂质组合物包含泊洛沙姆(例如，约0.01至约1.0％w/w的泊洛沙姆)。在一个实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物是冻干的组合物。在一些实施方案中，冻干的经修饰的脂质组合物包含约0.01至约1.0％w/w的异源功能剂(例如，多核苷酸)。在一些实施方案中，冻干的经修饰的脂质组合物包含约1.0至约5.0％w/w的脂质。在一些实施方案中，冻干的经修饰的脂质组合物包含约0.5至约2.5％w/w的TRIS缓冲液。在一些实施方案中，冻干的经修饰的脂质组合物包含约0.75至约2.75％w/w的NaCl。在一些实施方案中，冻干的经修饰的脂质组合物包含约85至约95％w/w的糖，例如蔗糖。在一些实施方案中，冻干的经修饰的脂质组合物包含约0.01至约1.0％w/w的泊洛沙姆(例如，约0.01至约1.0％w/w的泊洛沙姆)，诸如泊洛沙姆188。在一些实施方案中，冻干的经修饰的脂质组合物包含约1.0至约5.0％w/w的山梨酸钾。

定义

如本文所用，术语“有效量”、“有效浓度”或“有效……的浓度”是指足以在目标生物体内或目标生物体上实现所述结果或达到目标水平(例如，预定水平或阈值水平)的经修饰的脂质组合物或核酸组合物的量。

如本文所用，术语“治疗剂”是指可以作用于动物的药剂，该动物例如哺乳动物(例如，人)、动物病原体或病原体载体，诸如抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或驱虫剂。

如本文所用，术语“异源”是指对于经修饰的脂质组合物被递送至的生物体而言是外源的药剂。

如本文所用，术语“功能剂”是指使用体内或体外方法与经修饰的脂质组合物缔合或可以与经修饰的脂质组合物缔合(例如，装载到经修饰的脂质组合物中或上(例如，被经修饰的脂质组合物包封、嵌入在经修饰的脂质组合物中或缀合至经修饰的脂质组合物))并且能够实现所述结果(例如，增加或降低植物、植物害虫、植物共生体、动物(例如，人)病原体或动物病原体载体的适应性)的药剂(例如，农业剂(例如，农药剂、施肥剂、除草剂、植物修饰剂)或治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或驱虫剂))。在一些实施方案中，异源功能剂是多核苷酸。

如本文所定义，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换，并且是指这样的RNA或DNA：线性、支链或环状；单链或双链；或其杂交体，无论长度如何(例如，至少2个、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、150、200、250、500、1000个或更多个核酸)。该术语还涵盖RNA/DNA杂交体。核苷酸通常通过磷酸二酯键连接在核酸中，但术语“核酸”还涵盖具有其他类型的键或骨架(例如，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺、吗啉代、锁核酸(LNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)和肽核酸(PNA)键或骨架等)的核酸类似物。核酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列两者的部分。核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，包括例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和经修饰或非规范的碱基(包括例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5羟甲基胞嘧啶)。

如本文所用，术语“线性多核糖核苷酸”、“线性多核糖核苷酸分子”、“线性RNA”和“linRNA”可互换使用，并且是指具有5'和3'端的多核糖核苷酸分子。5'和3'端中的一者或两者可以是自由端或连接到另一个部分。线性RNA包括尚未经历环化(例如，预环化)的RNA，并且可以用作通过例如夹板连接或化学、酶、核酶或剪接催化的环化方法进行环化的起始材料。

如本文所用，术语“环状多核糖核苷酸”、“环状多核苷酸分子”、“环状RNA”和“circRNA”可互换使用，并且是指具有不具有自由端(即，不具有自由3'和/或5'端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价键(例如，共价闭合)或非共价键形成环状或无端结构的多核糖核苷酸分子。环状多核糖核苷酸可以是例如共价闭合的多核糖核苷酸。

如本文所用，术语“肽”、“蛋白质”或“多肽”涵盖天然或非天然存在的氨基酸(D-氨基酸或L-氨基酸)的任何链，无论其长度(例如，至少2个3、4、5、6、7、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或超过1000个氨基酸)、是否存在翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)或是否存在例如与肽共价连接的一个或多个非氨基酰基(例如，糖、脂质等)，并且包括例如天然蛋白质、合成或重组多肽和肽、杂交分子、类肽或肽模拟物。多肽的大小可以为例如至少0.1kD、至少1kD、至少5kD、至少10kD、至少15kD、至少20kD、至少30kD、至少40kD、至少50kD或大于50kD。多肽可以是全长蛋白。可替代地，多肽可以包含蛋白质的一个或多个结构域。

如本文所用，术语“动物”是指人和非人动物(包括例如狗、猫、马、兔、动物园动物、牛、猪、绵羊、鸡和非人灵长类动物)。

如本文所用，术语“感染”是指病原体在动物体内(例如，在动物的一个或多个部位中)、在动物身上(例如，在动物的一个或多个部位上)或在动物周围栖息地中的存在或定殖，特别是其中感染例如通过引起疾病、疾病症状或免疫(例如，炎性)反应而降低动物的适应性。

如本文所用，术语“病原体”是指通过例如以下在动物中引起疾病或疾病症状的生物体，如微生物体或无脊椎动物：(i)直接感染动物，(ii)产生在动物中引起疾病或疾病症状的药剂(例如，产生致病毒素的细菌等)，和/或(iii)通过在动物中引发免疫(例如，炎性反应)(例如，叮咬昆虫，例如，臭虫)。如本文所用，病原体包括但不限于细菌、原生动物、寄生虫、真菌、线虫、昆虫、类病毒和病毒或其任何组合，其中每种病原体能够通过自身或与另一种病原体协同引发人类的疾病或症状。

如本文所用，术语“抗体”涵盖能够特异性结合抗原的免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或全部合成产生的免疫球蛋白及其片段。该术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。这些蛋白质可以源自天然来源，或部分或全部合成产生。“抗体”还包括包含来自免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽，其特异性结合并识别抗原。术语“抗体”的使用意在包括完整抗体；多克隆、单克隆和重组抗体；其片段；并且还包括单链抗体(纳米抗体)；人源化抗体；鼠抗体；嵌合的小鼠-人、小鼠-灵长类、灵长类-人单克隆抗体；抗独特型抗体；抗体片段，例如scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段；双抗体；以及抗体相关多肽。“抗体”还包括双特异性抗体和多特异性抗体。

如本文所用，两个序列之间的“同一性百分比”是通过BLAST 2.0算法确定的，该算法描述于Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。

如本文所用，术语“未经修饰的结构组分”是指包含结构组分(例如，分离的天然细胞外囊泡、其他天然来源的脂质或合成结构脂质)的组合物，该组合物缺乏能够增加结构组分的细胞摄取(例如，动物细胞摄取、植物细胞摄取、天然细胞摄取或真菌细胞摄取)的异源细胞摄取剂。

如本文所用，对结构组分的术语“经修饰的”或“修饰”是指经修饰的脂质组合物，包括结构组分和一种或多种异源剂(例如，一种或多种外源脂质，诸如可电离脂质、固醇和/或聚乙二醇化脂质)，相对于未经修饰的结构组分，能够增加对经修饰的脂质组合物或其一部分或组分的细胞摄取(例如，动物细胞摄取、植物细胞摄取、天然细胞摄取或真菌细胞摄取)；能够通过经修饰的脂质组合物实现或增加异源功能剂(例如，农业剂或治疗剂)向细胞的递送，和/或能够实现或增加异源功能剂(例如，农业剂或治疗剂)的装载(例如，装载效率或装载能力)。结构组分可以在体外或在体内被修饰。

如本文所用，术语“细胞摄取”是指细胞(诸如动物细胞、植物细胞、天然细胞或真菌细胞)对经修饰的脂质组合物或其一部分或组分(例如，经修饰的脂质组合物携带的多核苷酸)的摄取。例如，摄取可以涉及将经修饰的脂质组合物或其组分的一部分从细胞外环境转移到或穿过细胞膜、细胞壁、细胞外基质或转移到细胞的细胞内环境中。对经修饰的脂质组合物的细胞摄取可以通过主动或被动细胞机制发生。细胞摄取包括整个经修饰的脂质组合物被细胞摄取(例如，通过内吞作用摄取)的方面。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸在内吞作用和内质体逃逸后暴露于靶细胞的细胞质。在一些实施方案中，包含可电离脂质的经修饰的脂质组合物(例如，包含可电离脂质和固醇和/或聚乙二醇化脂质的经修饰的脂质组合物)相对于未经修饰的结构组分(例如，结构脂质)具有增加的内体逃逸速率。细胞摄取还包括经修饰的脂质组合物与靶细胞膜融合的方面。在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸在膜融合后暴露于靶细胞的细胞质。在一些实施方案中，相对于未被可电离脂质修饰的结构组分，经修饰的脂质组合物与靶细胞膜的融合速率增加(例如，更具融合性)。

如本文所用，术语“细胞渗透剂”是指改变细胞(例如，动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞)的细胞壁、细胞外基质或细胞膜的性质(例如，渗透性)的药剂，相对于未与该药剂接触的细胞促进增加的细胞摄取。

本文描述了包含脂质重构结构组分的“经修饰的脂质组合物”。结构组分源自脂质结构(例如，脂质双层、单层、多层结构；例如，囊泡脂质结构)，该脂质结构可以源自(例如，富集、分离或纯化自)天然来源，并且该脂质结构被破坏(例如，通过脂质提取破坏)并使用标准方法在液相(例如，含有货物的液相)中重组或重建，例如通过包括脂质膜水合和/或溶剂注入的方法重建，以产生脂质重构的结构组分，如本文所描述的。如果需要，该方法还可以包括超声处理、冷冻/解冻处理和/或脂质挤出，例如以减小重建的经修饰的脂质组合物的尺寸。可替代地，经修饰的脂质组合物可以使用微流体装置(诸如IGNITE^TM微流体仪器(Precision NanoSystems))来产生。可替代地，结构组分包含不是源自天然来源而是合成衍生的结构脂质。

如本文所用，术语“天然细胞外囊泡”、“天然EV”或“EV”是指天然存在于天然物质中的封闭脂质双层结构。任选地，天然EV包括一种或多种天然EV标志物。如本文所用，术语“天然EV标志物”是指与天然物质相关的组分，诸如天然蛋白质、天然核酸、天然小分子、天然脂质或它们的组合。

如本文所用，术语“复合脂质颗粒”是指具有复杂性的脂质颗粒，其特征在于包含多种脂质，包括从一种或多种天然来源提取的结构脂质，以及任选地至少一种外源可电离脂质。复合脂质颗粒可以包含源自来自一种或多种天然来源的脂质结构的10％w/w至99％w/w结构脂质，例如，复合脂质颗粒可以含有源自来自一种或多种天然来源的脂质结构的至少10％w/w、至少20％w/w、至少30％w/w、至少40％w/w、至少50％w/w、至少60％w/w、至少70％w/w、至少80％w/w、至少90％w/w、至少95％w/w或约99％w/w脂质。在一些情况下，掺入天然脂质提取物的复合脂质颗粒也可以被称为天然信使包(NMP)。例如，掺入植物脂质提取物的复合脂质颗粒也可以被称为植物信使包(PMP)。在一些情况下，掺入天然脂质提取物和至少一种外源可电离脂质的复合脂质颗粒也可以被称为脂质重构的天然信使包(LNMP)。例如，掺入植物脂质提取物和至少一种外源可电离脂质的复合脂质颗粒也可以被称为脂质重构的植物信使包(LPMP)。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒掺入大豆脂质提取物或大豆衍生脂质。

复合脂质颗粒可以含有从一种或多种天然来源提取的3-1000种脂质。复合脂质颗粒可以含有来自天然来源的脂质的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同类别或亚类的天然脂质。复合脂质颗粒可以包含存在于来自天然来源的脂质结构中的脂质物质的全部或一部分，例如，该复合脂质颗粒可以含有存在于来自天然来源的脂质结构中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或几乎100％的脂质物质。复合脂质颗粒可以包含存在于来自特定天然来源的脂质结构中的脂质物质的全部或一部分。例如，它可以含有存在于来自特定天然来源的脂质结构中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或几乎100％的脂质物质。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有3种或更多种从大豆提取或源自大豆的脂质。

复合脂质颗粒可以包含对于一种或多种天然来源是内源的减少或最小化的蛋白质物质，例如，它可以含有0％w/w、小于1％w/w、小于5％w/w、小于10％w/w、小于15％w/w、小于20％w/w、小于30％w/w、小于40％w/w或小于50％w/w的对于一种或多种天然来源是内源的蛋白质物质。在一些情况下，复合脂质颗粒的脂质双层不含有蛋白质。

复合脂质颗粒还可以包括合成结构脂质，如中性脂质作为结构脂质组分。复合脂质颗粒的结构脂质组分可以包含10％w/w至99％w/w的源自合成脂质结构的结构脂质(与从天然来源提取的脂质相反)，例如，复合脂质颗粒可以含有源自合成脂质结构的至少10％w/w、至少20％w/w、至少30％w/w、至少40％w/w、至少50％w/w、至少60％w/w、至少70％w/w、至少80％w/w、至少90％w/w、至少95％w/w或约99％w/w的脂质。

复合脂质颗粒还可以包含至少两种外源脂质。复合脂质颗粒可以包括至少1％w/w、至少2％w/w、至少5％w/w、至少10％w/w、至少15％w/w、至少20％w/w、至少25％w/w、至少30％w/w、至少40％w/w、至少50％w/w、至少60％w/w、至少70％w/w、至少80％w/w或约90％w/w的外源脂质。示例性外源脂质包括固醇和PEG-脂质缀合物。复合脂质颗粒可以用于包封编码一种或多种肽、多肽或蛋白质的一种或多种外源核酸或多核苷酸，以使得外源核酸或多核苷酸能够递送到靶细胞或组织。

如本文所用，术语“外源脂质”是指对于天然来源是外源的脂质，即源自不是提取脂质的天然来源的来源的脂质(例如，使用本文描述的方法添加到复合脂质颗粒调配物中的脂质)。术语“外源脂质”不排除天然来源的脂质(如植物来源的固醇)。也就是说，外源脂质可以是天然来源的脂质(如对于提取脂质的植物来源是外源的植物来源的固醇，例如，外源脂质可以是添加到复合脂质颗粒调配物中的植物来源的固醇)。作为另一个实例，外源脂质可以是对于从中提取脂质的特定天然来源是外源的天然来源的脂质(例如，对于从中提取脂质的植物来源是外源的细菌来源的脂质，或反之亦然)。外源脂质可以是细胞渗透剂，可以能够通过复合脂质调配物增加一种或多种多核苷酸对细胞的递送，和/或可以能够增加多核苷酸的装载(例如，装载效率或装载能力)。在一些实施方案中，外源脂质可以是稳定脂质。在一些实施方案中，外源脂质可以是结构脂质(例如，合成结构脂质)。示例性外源脂质包括可电离脂质、合成结构脂质、固醇和PEG化脂质。

如本文所用，术语“阳离子脂质”是指带正电荷的含有阳离子基团(例如，阳离子头部基团)的两亲分子(例如，脂质或类脂质)。

如本文所用，术语“可电离脂质”是指含有可以在给定条件(例如，pH)下电离(例如，解离)以产生一种或多种带电物质的基团(例如，头部基团)的两亲分子(例如，脂质或类脂质，例如，合成脂质或类脂质)。

已经令人惊讶地发现，包含具有多个不饱和位点，例如至少两个或三个不饱和位点的烷基链的可电离脂质对于形成具有增加的膜流动性的脂质颗粒特别有用。适用于本文的许多可电离脂质和相关类似物已经在以下文献中进行了描述：美国专利公开号20060083780和20060240554；美国专利第5,208,036号；第5,264,618号；第5,279,833号；第5,283,185号；第5,753,613号；和第5,785,992号；以及PCT公开号WO 96/10390，这些文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，可电离脂质是可电离的，使得其可以根据pH解离以带正电荷的形式存在。在不同pH条件下，可电离脂质的电离影响包含可电离脂质的修饰脂质的表面电荷。反过来，修饰脂质的表面电荷可以影响其血浆蛋白吸收、血液清除和组织分布(Semple,S.C.等人,Adv.Drug Deliv Rev 32:3-17(1998))以及其形成可以影响核酸的细胞内递送的内体溶解非双层结构的能力(Hafez,I.M.等人,Gene Ther 8:1188-1196(2001))。

在一些实施方案中，可电离脂质是通常中性的脂质，例如，在生理pH(例如，pH为约7)下，但是可以在酸性pH或碱性pH下携带净电荷。在一个实施方案中，可电离脂质是在pH为约7下通常中性的脂质，但是可以在酸性pH下携带净电荷。在一个实施方案中，可电离脂质是在pH为约7下通常中性的脂质，但是可以在碱性pH下携带净电荷。

在一些实施方案中，可电离脂质不包括通常在生理pH(例如，pH为约7)下携带净电荷的那些阳离子脂质或阴离子脂质。

如本文所用，术语“类脂质”是指具有一个或多个脂质特性的分子。

如本文所用，术语“稳定的结构脂质调配物”或“稳定的CLP调配物”是指这样的经修饰的脂质组合物或CLP调配物，即在一段时间(例如，至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天或至少90天)内相对于任选地在限定的温度范围(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃或0℃)或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃或-30℃)的温度)内的结构脂质调配物或CLP调配物中的颗粒数量(例如，在制备或配制时)，保持经修饰的脂质组合物或CLP的初始颗粒数量(例如，每mL溶液的颗粒)的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)；或相对于任选地在限定的温度范围(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃或0℃)或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃或-30℃)的温度)内的经修饰的脂质组合物或CLP调配物的初始活性(例如，在制备或配制时)，保持留其活性(例如，细胞壁渗透活性和/或配制在经修饰的脂质组合物内的mRNA的活性)的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。

可替代地，该表达是指CLP调配物或经修饰的脂质组合物在一段时间(例如，至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天或至少90天)内相对于任选地在限定的温度范围(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃或0℃)、或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃或-30℃)的温度)内的CLP调配物或经修饰的脂质组合物的初始活性(例如，在制备或配制时)，保持其活性的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)。

可替代地，该表达是指CLP调配物或经修饰的脂质组合物在一段时间(例如，至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天或至少90天)内相对于任选地在限定的温度范围(例如，至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)、至少20℃(例如，至少20℃、21℃、22℃或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃或15℃)、至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃或-30℃)的温度)内的CLP或经修饰的脂质组合物的初始粒度(例如，在制备或配制时)，保持其粒度(即，粒度不增加)或增加不超过5％(例如，不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、150％、2倍、2.5倍或3倍)。

在一些实施方案中，稳定的CLP或经修饰的脂质组合物继续包封或保持与已装载的CLP或经修饰的脂质组合物的外源肽、多肽或蛋白质缔合，例如继续包封或保持与外源肽、多肽或蛋白质缔合至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天、至少90天或90天或更多天。

如本文所用，术语“治疗”是指出于预防性和/或治疗性目的向动物施用药物组合物。“预防感染”是指对尚未患有疾病或病症但易患特定疾病或疾患或处于特定疾病或疾患风险中的动物进行预防性治疗。“治疗感染”是指对已经患有疾病的动物施用治疗，以改善或稳定动物的状况。

如本文所用，术语“治疗感染”是指向已经患有疾病的个体(例如，动物)施用治疗以改善或稳定个体的状况。这可以涉及相对于起始量减少一种或多种病原体在动物体内、在动物身上或在动物周围的定殖(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)和/或使个体受益(例如，减少足以缓解症状的量的定殖)。在此类情况下，治疗后的感染可能表现为症状的减少(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些情况下，治疗后的感染有效地增加个体的生存可能性(例如，生存可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)或增加群体的总体生存期(例如，生存可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。例如，组合物和方法可以有效地“基本上消除”感染，这是指感染的减少量足以持续缓解动物的症状(例如，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。

如本文所用，术语“预防感染”是指预防一种或多种病原体在动物体内、在动物身上或在动物周围的定殖增加(例如，相对于未治疗的动物增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)，其量足以维持初始病原体群体(例如，大约在健康个体中发现的量)，预防感染的发生和/或预防与感染相关的症状或疾患。例如，个体(例如，动物，例如，人)可以在准备进行侵入性医疗程序(例如，准备手术，诸如接受移植、干细胞疗法、移植物、假体、接受长期或频繁静脉内导管插入术或在重症监护室中接受治疗)时、在免疫功能低下的个体(例如，患有癌症、患有HIV/AIDS或服用免疫抑制剂的个体)中或在经历长期抗生素疗法的个体中接受预防性治疗以预防真菌感染。

如本文所用，术语“配制用于递送至动物”是指包含药学上可接受的载剂的经修饰的脂质组合物。如本文所用，“药学上可接受的”载剂或赋形剂是适于施用于动物(例如，人)的载剂或赋形剂，例如，不会对动物(例如，人)产生过度的不良副作用。

附图说明

图1A示出了小鼠静脉内施用使用结构脂质DOPE、DOPC、DSPC、LPC、脑鞘磷脂(SM)、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、乳糖基PE、MGDG、DGDG、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇、甘油三酯(TG)或心磷脂(CA)以16％、30％、50％或75％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图1B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。

图2A示出了小鼠静脉内施用使用结构脂质DOPE、DOPS、大豆PS、脑PS、LPS、DOPG、大豆PG、DOPA、14:0PA、大豆PA、蛋PA和LPA以3％、16％、30％或50％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图2B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。

图3A示出了与携带相同货物的相同摩尔比的DOPE LNP组合物相比，小鼠静脉内施用使用结构脂质大豆极性脂质、大豆PL混合物、大豆PC、大豆LPC、大豆PE、大豆PS、大豆PG、大豆PA和大豆PI以16％、30％或50％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的示例性经修饰的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图3B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。

图4A示出了与携带相同货物作为对照的LNP组合物相比，小鼠静脉内施用使用可电离脂质2213和结构脂质半乳糖基胆固醇、脑鞘磷脂(SM)、神经酰胺、心脏心磷脂(CA)、大豆极性脂质或大豆LPC以16％或50％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的示例性经修饰的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图4B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。

图5A示出了与携带相同货物作为对照的LNP组合物相比，小鼠静脉内施用使用可电离脂质2231和结构脂质葡糖基胆固醇、脑SM、心脏CA、大豆PC、大豆LPC、大豆PS、大豆极性脂质和大豆PL混合物以16％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的示例性经修饰的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图5B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。

图6A示出了与携带相同货物作为对照的LNP组合物相比，小鼠静脉内施用使用可电离脂质2252和结构脂质脑SM、CA、大豆PC、大豆LPC、大豆PS、大豆极性脂质和大豆PL混合物以16％或50％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的示例性经修饰的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图6B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。

图7A示出了以PBS和2213LNP(0.375mg/kg；4:1CRE:FLuc mRNA)作为对照，在静脉内给药使用可电离脂质2213和结构脂质脑SM(16％脂质摩尔比)、大豆LPC(16％脂质摩尔比)和大豆极性脂质(50％脂质摩尔比)(0.375mg/kg；4:1CRE:FLuc mRNA)的经修饰的脂质组合物三天后收集的Ai9小鼠的脾脏中的淋巴细胞转染。N＝3/组。图7B示出了以PBS和2213LNP(0.375mg/kg；4:1CRE:FLuc mRNA)作为对照，在静脉内给药使用可电离脂质2213和结构脂质脑SM(16％脂质摩尔比)、大豆LPC(16％脂质摩尔比)和大豆极性脂质(50％脂质摩尔比)(0.375mg/kg；4:1CRE:FLuc mRNA)的经修饰的脂质组合物三天后收集的Ai9小鼠的脾脏中的骨髓细胞转染。N＝3/组。

图8A示出了大豆衍生的经修饰的脂质组合物的脂质摩尔比。图8B示出了在单剂量肌内递送来自图8A的大豆衍生的经修饰的脂质组合物(SmRNA 10μg)之后28天后小鼠血液中对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)具有特异性的抗体(IgG)的水平。N＝3/组。对照是PBS。

图9A示出了在静脉内给药经修饰的脂质组合物(表10，1.25mg/kg CRE mRNA)三天后收集的脾脏中tdTomato小鼠中的淋巴细胞转染，以初始小鼠作为对照。N＝4/实验组。

图9B示出了在静脉内给药经修饰的脂质组合物(表10，1.25mg/kg CRE mRNA)三天后收集的脾脏中tdTomato小鼠中的骨髓细胞转染，以初始小鼠作为对照。N＝4/实验组。

图10示出了在静脉内给药经修饰的脂质组合物(表10中的组6-8、16-18，1.25mg/kg CRE mRNA)三天后收集的骨髓中tdTomato小鼠中的造血干细胞(HSC)转染，以初始小鼠作为对照。N＝3-4/实验组。

图11A示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，1ug)后仓鼠血液中S特异性IgG的水平。N＝14/组。对照是单价疫苗(1ug，n＝14)和汇总的初始仓鼠。图11B示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有S mRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有S mRNA，1ug)后仓鼠血液中RBD特异性IgG的水平。N＝14/组。对照是单价疫苗(1ug，n＝14)和汇总的初始仓鼠。

图12A示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，1ug)后仓鼠血液中S特异性IgG的量。N＝14/组。对照是单价疫苗(1ug，n＝14)和汇总的初始仓鼠。图12B示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有S mRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有S mRNA，1ug)后仓鼠血液中RBD特异性IgG的量。N＝14/组。对照是单价疫苗(1ug，n＝14)和汇总的初始仓鼠。

图13示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，1ug)后仓鼠中的抑制百分比。N＝14/组。对照是单价疫苗(1ug，n＝14)。

图14A示出了在一次肌内给药各种经修饰的脂质组合物调配物(SmRNA 10μg/40μL，参见表12中的调配物)后七天或十天汇集淋巴结中生发中心B细胞的绝对数量。N＝6/组。对照是LNP调配物(参见表12)或初始小鼠。图14B示出了在一次肌内给药各种经修饰的脂质组合物调配物(S mRNA 10μg/40μL，参见表12中的调配物)后七天或十天汇集淋巴结中T滤泡辅助细胞的绝对数量。N＝6/组。对照是LNP调配物(参见表12)或初始小鼠。图14C示出了在一次肌内给药各种经修饰的脂质组合物调配物(S mRNA 10μg/40μL，参见表12中的调配物)后七天或十天汇集淋巴结中B细胞中生发中心B细胞的频率。N＝6/组。对照是LNP调配物(参见表12)或初始小鼠。图14D示出了在一次肌内给药各种经修饰的脂质组合物调配物(SmRNA 10μg/40μL，参见表12中的调配物)后七天或十天汇集淋巴结中CD4 T细胞中T滤泡辅助细胞的频率。N＝6/组。对照是LNP调配物(参见表12)或初始小鼠。图14E示出了在一次肌内给药各种经修饰的脂质组合物调配物(S mRNA 10μg/40μL，参见表12中的调配物)后七天或十天汇集淋巴结中类别转换B细胞的绝对数量。N＝6/组。对照是LNP调配物(参见表12)或初始小鼠。

图15A示出了小鼠肌内施用以10ug/40uL给药的包封1:1mRNA FLuc:hEPO的各种示例性经修饰的脂质组合物调配物(参见表13)后4小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝3/组。使用的阳性对照是LNP 1和LNP 2(n＝3/组)，而阴性对照是用PBS给药的小鼠(n＝2)。图15B和图15C示出了小鼠肌内施用以10ug/40uL给药的包封1:1mRNA FLuc:hEPO的各种示例性经修饰的脂质组合物调配物(参见表13)后4小时的肝脏(图15B)和脾脏(图15C)辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝3/组。使用的阳性对照是LNP 1和LNP 2(n＝3/组)，而阴性对照是用PBS给药的小鼠(n＝2)。图15D示出了小鼠肌内施用以10ug/40uL给药的包封1:1mRNA FLuc:hEPO的各种示例性经修饰的脂质组合物调配物(参见表13)后4小时的右侧和左侧淋巴结辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝3/组。使用的阳性对照是LNP 1和LNP 2(n＝3/组)，而阴性对照是用PBS给药的小鼠(n＝2)。

具体实施方式

本文的特征在于经修饰的脂质组合物，这些经修饰的脂质组合物含有(a)结构组分，该结构组分包含选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇组成的组的一种或多种脂质；和(b)可电离脂质，该可电离脂质可增加对结构组分的细胞摄取。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以是复合脂质颗粒(CLP)，该复合脂质颗粒(CLP)包含天然脂质提取物和衍生物(诸如大豆脂质提取物或大豆衍生脂质)，以及可电离脂质。

这些经修饰的脂质组合物可以与一种或多种异源功能剂(诸如多核苷酸)一起配制，并且可以用作这些异源功能剂(例如，多核苷酸)的递送媒介物。

复合脂质颗粒

本文描述的复合脂质颗粒(CLP)包含多种脂质，包括从一种或多种天然来源(诸如植物或细菌)提取的结构脂质。在一些实施方案中，复合脂质颗粒是掺入天然脂质提取物的天然信使包(NMP)。在一些实施方案中，复合脂质颗粒是掺入天然脂质提取物和至少一种外源可电离脂质的脂质重构天然信使包(LNMP)。

复合脂质颗粒还可以至少包含外源可电离脂质。可电离脂质具有以下所列特征中的两种或更多种特征：

(i)至少2个可电离胺；

(ii)至少3个脂质尾部；其中这些脂质尾部中的每个脂质尾部的长度为至少6个碳原子；

(iii)约4.5至约7.5的pKa；

(v)至少3的N:P比率。

复合脂质颗粒可以包含源自来自一种或多种天然来源的脂质结构的10％w/w至99％w/w结构脂质，例如，复合脂质颗粒可以含有源自来自一种或多种天然来源的脂质结构的至少10％w/w、至少20％w/w、至少30％w/w、至少40％w/w、至少50％w/w、至少60％w/w、至少70％w/w、至少80％w/w、至少90％w/w、至少95％w/w或约99％w/w脂质。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒包含约10-95％w/w的天然(例如，植物、细菌)脂质。例如，基于复合脂质调配物中总脂质的量，复合脂质颗粒包含约25％-95％w/w、约30％-95％w/w、约35％-95％w/w、约40％-95％w/w、约45％-95％w/w、约50％-95％w/w、约55％-95％w/w、约60％-95％w/w、约65％-95％w/w、约70％-95％w/w、约75％-95％w/w、约80％-95％w/w或约85％-95％w/w的天然脂质。

复合脂质颗粒可以含有从一种或多种天然(例如，植物、细菌)来源提取的3-1000种脂质。在一些实施方案中，天然来源是植物、植物提取物或植物的片段或部分。在一些实施方案中，天然来源是细菌、细菌片段或细菌的一部分。在一些实施方案中，天然来源是柠檬。在一些实施方案中，天然来源是大豆。在其他实施方案中，天然来源是大肠杆菌。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有至少10种天然脂质，这些天然脂质属于选自由以下组成的组的类别中的一种或多种：脂肪酰基(FA)、脂肪酰基缀合物、磷脂、甘油脂、糖脂、甘油磷脂、鞘脂、蜡和固醇。例如，复合脂质颗粒含有至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少150种、至少200种、至少250种、至少300种、至少400种、至少500种、至少600种、至少700种或至少800种天然脂质，这些天然脂质属于选自由以下组成的组的类别中的一种或多种：脂肪酰基(FA)、脂肪酰基缀合物、磷脂、甘油脂、糖脂、甘油磷脂、鞘脂、蜡、和固醇。在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有来自这些不同类别中的至少两个或至少三个类别的脂质。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有至少10种天然脂质，这些天然脂质属于选自由甘油脂、鞘脂和固醇组成的组的类别中的一种或多种。例如，复合脂质颗粒含有至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少150种、至少200种、至少250种、至少300种、至少400种、至少500种、至少600种、至少700种或至少800种天然脂质，这些天然脂质属于选自由甘油脂、鞘脂和固醇组成的组的类别中的一种或多种。在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有来自这些不同类别中的至少两个或至少三个类别的脂质。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒可以含有一种或多种甘油脂(GL)或甘油磷脂(GP)，其还可以包括糖脂。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒可以含有一种或多种选自由以下组成的组的甘油脂：磷脂(PL)、半乳糖脂、三酰基甘油(TG)和硫脂质(SL)。在一些实施方案中，CLP含有一种或多种选自由以下组成的组的甘油磷脂(GP)：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰肌醇(PI)。在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有一种或多种选自由以下组成的组的鞘脂(SP)：磷脂质(SL)、糖基肌醇磷基神经酰胺(GIPC)、葡糖基神经酰胺(GCer)、神经酰胺(Cer)和游离长链碱基(LCB)。在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有一种或多种选自由以下组成的组的植物固醇：菜油固醇、豆固醇、β-谷固醇、Δ5-燕麦固醇、菜籽固醇、燕麦固醇、4-去甲基固醇、4α-单甲基固醇、Δ5-固醇、Δ7--固醇、α-菠菜固醇、Δ5,Δ7-固醇、植物甾烷醇和谷固醇。

CLP可以含有一种或多种天然脂质，这些天然脂质属于选自由以下组成的组的一种或多种类别或亚类：脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醛、脂肪酰胺、非环状氧脂素、环状氧脂素、甘油脂、单酰甘油、双酰甘油、三酰甘油、酸酐(estolide)、糖基单酰甘油、磺基喹啉基单酰甘油、单半乳糖基单酰甘油、二半乳糖基单酰甘油、磺基喹啉基二酰甘油、单半乳糖基二酰甘油、二半乳糖基二酰甘油、糖基二酰甘油、甘油磷脂、磷脂、溶血磷脂、磷脂酰肌醇磷酸酯、n-修饰的磷脂、氧化(oxygenated/oxidized)磷脂、鞘脂、鞘氨醇(sphingoid base)、神经酰胺、神经酰胺磷酸脂(phosphocereamide)、鞘糖脂(glycophingolipid)、固醇、胆固醇、胆固醇酯、固醇酯、胆汁酸、固醇糖苷(sterylglycoside)和酰基固醇糖苷(acylsterylglycosides)。复合脂质颗粒可以含有一种或多种天然脂质，这些天然脂质属于选自由上文所列的类别或亚类组成的组的类别或亚类中的一种或多种。例如，复合脂质颗粒含有至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少150种、至少200种、至少250种、至少300种、至少400种、至少500种、至少600种、至少700种或至少800种天然脂质，这些天然脂质属于选自由上文所列的类别或亚类组成的组的类别或亚类中的一种或多种。

在一些实施方案中，CLP含有一种或多种天然脂质，这些天然脂质属于选自由以下组成的组的亚类中的一种或多种：酰基二酰基甘油基萄糖苷酸、酰基己糖神经酰胺、酰基甾基糖苷、胆汁酸、酰基肉碱、胆固醇酯、神经酰胺、心磷脂质、辅酶Q、二酰基甘油、二半乳糖二酰基甘油、二酰基甘油基葡糖苷酸、二溶血心磷脂、脂肪酸、羟基脂肪酸的脂肪酸酯、半双单酰基甘油磷酸酯、己糖神经酰胺、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、N-酰基-溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰、溶血磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰丝氨酸、单半乳糖酰二酰基甘油、溶血心磷脂、N-酰基乙醇胺、N-酰基甘氨酸、N-酰基甘氨酰基丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、神经酰胺磷酸肌醇、磷脂酰甲醇、磷脂酰丝氨酸、固醇酯、豆固醇、硫苷脂、磺酸脂质、鞘磷脂、磺基异鼠李糖基二酰基甘油、固醇和三酰基甘油。在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有至少10种天然(例如，植物、细菌)脂质，这些天然脂质属于选自由上文所列的亚类组成的组的亚类中的一种或多种。例如，复合脂质颗粒含有至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少150种、至少200种、至少250种、至少300种、至少400种、至少500种、至少600种、至少700种或至少800种天然脂质，这些天然脂质属于选自由上文所列的亚类组成的组的亚类中的一种或多种。

复合脂质颗粒可以含有10种或更多种天然脂质，这些天然脂质属于选自由以下组成的组的亚类中的一种或多种：酰基甾基糖苷、神经酰胺、二半乳糖二酰基甘油、二酰基甘油基葡糖苷酸、半双单酰基甘油磷酸酯、己糖神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、单半乳糖酰二酰基甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磺基异鼠李糖基二酰基甘油和固醇。例如，复合脂质颗粒含有至少15种、至少20种、至少25种、至少30种、至少35种、至少40种、至少45种、至少50种、至少60种、至少70种、至少80种、至少90种、至少100种、至少150种、至少200种、至少250种、至少300种、至少400种、至少400种、至少500种、至少600种、至少700种或至少800种天然脂质，这些天然脂质属于选自由上文所列的亚类组成的组的亚类中的一种或多种。

复合脂质颗粒可以含有来自天然来源的脂质的至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同类别或亚类的天然脂质。在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有来自单个天然来源(例如，仅来自植物来源或仅来自细菌来源)的至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同类别或亚类的天然脂质。在一些实施方案中，CLP可以含有来自天然来源的脂质的仅一个类别或仅一个亚类的天然脂质。

通过脂质组学分析，通过将脂质提取物或复合脂质颗粒溶解于相容溶剂中并通过质谱分析(例如，MS/MS)分析，可以分析从天然来源提取的脂质的身份(以及类别和亚类)和量。也可以使用其他已知方法，如带电气溶胶检测(CAD)(例如，HPLC-CAD、正相高效液相色谱法(NP-HPLC-CAD)或反相高效液相色谱法(RP-HPLC-CAD))。

复合脂质颗粒可以包含存在于来自特定天然来源的脂质结构中的脂质物质的全部或一部分，例如，复合脂质颗粒可以含有存在于来自特定天然来源的脂质结构中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或几乎100％的脂质物质。

复合脂质颗粒可以包含减少的或最小化的对于一种或多种天然来源是内源的蛋白质物质。例如，复合脂质颗粒可以含有小于50％w/w、小于45％w/w、小于40％w/w、小于35％w/w、小于30％w/w、小于25％w/w、小于20％w/w、小于15％w/w、小于10％w/w、小于9％w/w、小于8％w/w、小于7％w/w、小于6％w/w、小于5％w/w、小于4％w/w、小于3％w/w、小于2％w/w、小于1％w/w、小于0.5％w/w、小于0.1％w/w或基本上不含对于一种或多种天然来源是内源的蛋白质物质。在一些情况下，复合脂质颗粒的脂质双层不含有蛋白质。为了计算对于一种或多种天然来源是内源的残余蛋白质物质的％w/w，将蛋白质浓度除以天然脂质提取物的浓度，并且然后乘以100。可替代地，％w/w计算为基于总脂质提取物的质量对于一种或多种天然来源是内源的总蛋白质的质量的百分比。

复合脂质颗粒可以包含减少的或最小化的对于一种或多种天然来源是内源的残余dsDNA物质。例如，复合脂质颗粒可以含有小于15％w/w、小于10％w/w、小于5％w/w、小于1％w/w、小于0.5％w/w、小于0.1％w/w、小于0.05％w/w、小于0.01％w/w、小于0.005％w/w、小于0.001％w/w或基本上不含对于一种或多种天然来源是内源的残余dsDNA物质。在一些情况下，复合脂质颗粒的脂质双层不含有残余dsDNA。为了计算对于一种或多种天然来源是内源的残余dsDNA物质的％w/w，将总调整后的dsDNA浓度除以天然脂质提取物的浓度，并且然后乘以100。可替代地，％w/w计算为基于总脂质提取物的质量对于一种或多种天然来源是内源的总残余dsDNA的质量的百分比。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒进一步掺入合成结构脂质，如中性脂质。在一些实施方案中，复合脂质颗粒的结构脂质组分可以包含源自合成脂质结构的10％w/w至99％w/w的结构脂质，例如，复合脂质颗粒可以含有源自合成脂质结构的至少10％w/w、至少20％w/w、至少30％w/w、至少40％w/w、至少50％w/w、至少60％w/w、至少70％w/w、至少80％w/w、至少90％w/w、至少95％w/w或约99％w/w的脂质。

除了外源可电离脂质之外，复合脂质颗粒还可以包含至少两种其他外源脂质。复合脂质颗粒可以包括至少1％w/w、至少2％w/w、至少5％w/w、至少10％w/w、至少15％w/w、至少20％w/w、至少25％w/w、至少30％w/w、至少40％w/w、至少50％w/w、至少60％w/w、至少70％w/w、至少80％w/w、至少90％w/w或约95％w/w的外源脂质。示例性外源脂质包括可电离脂质、合成结构脂质、固醇和PEG-脂质缀合物。复合脂质颗粒还可以包含至少两种外源脂质。在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有可电离脂质、固醇和PEG-脂质缀合物。下文描述了适合于包括在复合脂质颗粒中的另外的外源脂质。

在一些实施方案中，CLP含有天然脂质，这些天然脂质包含脂肪酸衍生的尾部，这些天然脂质的所述脂肪酸衍生的尾部是：

约5％至20％的脂肪酸16:0

约0％至10％的脂肪酸18:1(C9)

约0％至10％的脂肪酸18:1(C7)

约5％至30％的脂肪酸18:2

约2％至20％的脂肪酸18:3。

在一些实施方案中，CLP含有磷脂酰胆碱(PC)脂质，这些磷脂酰胆碱(PC)脂质包含脂肪酸衍生的尾部，这些PC脂质的所述脂肪酸衍生的尾部是：

约10％至20％的脂肪酸16:0

约2％至5％的脂肪酸18:0

约7％至15％的脂肪酸18:1

约50％至75％的脂肪酸18:2

约2％至10％的脂肪酸18:3。

在一些实施方案中，CLP含有磷脂酰乙醇胺(PE)脂质，这些磷脂酰乙醇胺(PE)脂质包含脂肪酸衍生的尾部，这些PE脂质的所述脂肪酸衍生的尾部是：

约0.25％至5％的脂肪酸14:0

约25％至45％的脂肪酸16:0

约5％至15％的脂肪酸16:1

约10％至25％的脂肪酸17:0

约25％至45％的脂肪酸18:1

约2％至7％的脂肪酸19:0。

在一些实施方案中，CLP含有天然脂质，这些天然脂质属于磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和心磷脂的亚类并且包含：

约50wt/wt％至75wt/wt％的磷脂酰乙醇胺(PE)

约15wt/wt％至30wt/wt％的磷脂酰甘油(PG)

约5wt/wt％至15wt/wt％的心磷脂(CL)。

在一些实施方案中，CLP含有天然脂质，这些天然脂质包含：

约10wt/wt％至50wt/wt％的磷脂酰胆碱(PC)

约5wt/wt％至50wt/wt％的磷脂酰乙醇胺(PE)

约0wt/wt％至15wt/wt％的三酰基甘油(TG)

约5wt/wt％至35wt/wt％的己糖神经酰胺(HexCer)

约0wt/wt％至5wt/wt％的磷脂酰甘油(PG)

约0wt/wt％至7wt/wt％的磷脂酰丝氨酸(PS)

约0wt/wt％至10wt/wt％的磷脂酰肌醇(PI)

约0wt/wt％至5wt/wt％的心磷脂(CL)。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有小于12％w/w的对于一种或多种天然来源是内源的叶绿体。在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有小于20％w/w、小于15％w/w、小于10％w/w、小于5％w/w、小于1％w/w、小于0.5％w/w或小于0.1％w/w的对于一种或多种天然源是内源叶绿体。

在一些实施方案中，复合脂质颗粒含有小于5％w/w的外源抗氧化剂。

在一些实施方案中，CLP含有天然脂质，这些天然脂质包含约0wt/wt％至20wt/wt％的心磷脂(CL)。

结构组分

结构组分包含选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇组成的组的一种或多种脂质。结构组分还可以包含表1至表7和表9至表13中列出的一种或多种结构脂质。

在一些实施方案中，结构组分源自天然来源。在一些实施方案中，天然来源可以是植物或动物。在一些实施方案中，动物是猪或牛。在一些实施方案中，植物是大豆。在其他实施方案中，结构组分是合成衍生的。

结构组分可以具有脂质(例如，脂质双层、单层或多层结构)结构，其包括天然细胞外囊泡(EV)或其区段、部分或提取物(例如，脂质提取物)。

在一些实施方案中，结构组分包含分离的天然细胞外囊泡。天然EV是指天然存在于来源中的封闭脂质双层结构。天然EV源自天然来源(例如植物、细菌、动物等)，包含结构脂质，并且还可以包含纳米颗粒中所含的天然蛋白质和/或天然核酸和/或碳水化合物部分。天然EV可以包含1、2、3、4、5、10或超过10种不同的脂质物质。在一个实施方案中，天然来源是大豆、猪脑或牛心脏。

结构组分可以包括天然EV或其区段、部分或提取物。在一些实施方案中，天然EV的直径为约5-1000nm。例如，结构组分可以包括平均直径为约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm、约1000-1250nm、约1250-1500nm、约1500-1750nm或约1750-2000nm的天然EV或其区段、部分或提取物。在一些情况下，结构组分可以包括平均直径为约5-950nm、约5-900nm、约5-850nm、约5-800nm、约5-750nm、约5-700nm、约5-650nm、约5-600nm、约5-550nm、约5-500nm、约5-450nm、约5-400nm、约5-350nm、约5-300nm、约5-250nm、约5-200nm、约5-150nm、约5-100nm、约5-50nm或约5-25nm的天然EV或其区段、部分或提取物。在某些情况下，结构组分可以包括平均直径为约50-200nm、约50-300nm、约200-500nm或约30-150nm的天然EV或其区段、部分或提取物。可以使用本领域中的多种标准方法(例如，动态光散射方法)来测量天然EV或其片段、部分或提取物的粒径。

在一些情况下，结构组分可以包括平均表面积为至少77nm²(例如，至少77nm²、至少100nm²、至少1000nm²、至少1x10⁴nm²、至少1x10⁵nm²、至少1x10⁶nm²或至少2x10⁶nm²)的天然EV或其区段、部分或提取物。在一些情况下，结构组分可以包括平均表面积为77nm²至3.2x10⁶nm²(例如，77-100nm²、100-1000nm²、1000-1x10⁴nm²、1x10⁴-1x10⁵nm²、1x10⁵-1x10⁶nm²或1x10⁶-3.2x10⁶nm²)的天然EV或其区段、部分或提取物。

在一些情况下，结构组分可以包括平均体积为至少65nm³(例如，至少65nm³、至少100nm³、至少1000nm³、至少1x10⁴nm³、至少1x10⁵nm³、至少1x10⁶nm³、至少1x10⁷nm³、至少1x10⁸nm³、至少2x10⁸nm³、至少3x10⁸nm³、至少4x10⁸nm³或至少5x10⁸nm³)的天然EV或其区段、部分或提取物。在一些情况下，结构组分可以包括平均体积为65nm³至5.3x10⁸nm³(例如，65-100nm³、100-1000nm³、1000-1x10⁴nm³、1x10⁴-1x10⁵nm³、1x10⁵-1x10⁶nm³、1x10⁶-1x10⁷nm³、1x10⁷-1x10⁸nm³、1x10⁸-5.3x10⁸nm³)的天然EV或其区段、部分或提取物。

在一些情况下，结构组分可以包括完整的天然EV。可替代地，结构组分可以包括天然EV的囊泡的整个表面积的区段、部分或提取物(例如，包括囊泡的整个表面积的小于100％(例如，小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于10％、小于5％或小于1％)的区段、部分或提取物)。区段、部分或提取物可以具有任何形状，如周向区段、球形区段(例如，半球形)、曲线区段、直线区段或扁平区段。在区段是囊泡的球形区段的情况下，球形区段可以表示沿着一对平行线分裂球形囊泡产生的球形区段，或者沿着一对非平行线分裂球形囊泡产生的球形区段。因此，结构组分可以包括多个完整的天然EV、多个天然EV区段、部分或提取物或完整EV和EV区段的混合物。本领域技术人员将理解，完整与分段天然EV的比率将取决于所使用的具体分离方法。例如，与非破坏性提取方法(诸如真空渗透)相比，研磨或共混天然物或其一部分可以产生含有更高百分比的天然EV区段、部分或提取物的结构组分。

在结构组分包括天然EV的区段、部分或提取物的情况下，EV区段、部分或提取物的平均表面积可以小于完整囊泡的平均表面积，例如小于77nm²、100nm²、1000nm²、1x10⁴nm²、1x10⁵nm²、1x10⁶nm²或3.2x10⁶nm²的平均表面积。在一些情况下，结构组分可以包括天然EV或其区段、部分或提取物，其平均体积小于完整囊泡的平均体积，例如小于65nm³、100nm³、1000nm³、1x10⁴nm³、1x10⁵nm³、1x10⁶nm³、1x10⁷nm³、1x10⁸nm³或5.3x10⁸nm³的平均体积。结构组分可以包括天然EV区段和/或提取的脂质或它们的混合物。

在一些实施方案中，结构组分不是源自天然来源。在一些实施方案中，结构组分是合成衍生的。

在一些实施方案中，结构组分可以包含至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％的结构脂质。

结构组分的产生

结构组分可以是由天然EV产生的天然来源的脂质，或其区段、部分或提取物(例如，脂质提取物)。产生结构组分(含有天然来源的脂质)的示例性方法包括(a)提供来自天然来源的初始样品；以及(b)从初始样品中分离粗天然级分，其中相对于初始样品中的水平，该粗天然级分具有降低的来自来源的至少一种污染物或不需要的组分的水平。该方法还可以包括另外的步骤(c)，包括纯化粗天然级分，从而产生纯结构组分，相对于粗EV级分中的水平，该纯结构组分具有降低的来自天然来源的至少一种污染物或不需要的组分的水平。

在一些情况下，结构组分(含有天然来源的脂质)可以通过包括以下步骤的方法从天然来源分离：(a)提供来自天然来源的初始样品；(b)从初始样品中分离粗天然级分，其中相对于初始样品中的水平，粗天然级分具有降低的来自天然来源的至少一种污染物或不需要的组分的水平(例如，降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％或100％的水平)；以及(c)纯化粗天然级分，从而产生纯结构组分，相对于粗EV级分中的水平，该纯结构组分具有降低的来自天然来源的至少一种污染物或不需要的组分的水平(例如，降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％或100％的水平)。

结构组分(含有天然来源的脂质)可以通过全细胞提取来产生。例如，首先破碎细胞，然后细胞内和细胞膜/细胞壁相关的脂质以及细胞外碳氢化合物可以与细胞团分离，诸如通过使用离心。在一些实施方案中，在裂解来源的细胞后提取天然来源(例如细菌、植物、动物等)中产生的细胞内脂质。提取结构脂质(含有天然来源的脂质)的其他方法可以在美国专利第8,592,188号中找到，该专利以引用的方式整体并入本文。结构组分可以通过合成手段产生。

结构组分(含有天然来源的脂质)可以通过多种方法从天然来源产生。例如，天然EV可以通过破坏性(例如，研磨或共混天然来源)或非破坏性(洗涤或真空渗透天然来源)方法与来源分离。例如，可以对来源进行真空渗透、研磨、共混或上述方法的组合，以将EV与来源分离。例如，分离步骤可以涉及真空渗透来源(例如，用囊泡分离缓冲液)。可替代地，分离步骤可以涉及研磨或共混来源以释放EV。

在分离天然EV后，可以将结构组分分离或收集到粗天然级分(例如，质外体级分)中。例如，分离步骤可以涉及使用离心(例如，差速离心或超速离心)和/或过滤将结构组分分离到粗天然级分中，以将含天然级分与大污染物(包括天然组织碎片或细胞)分离。因此，与来自来源的初始样品相比，粗天然级分中的大污染物的数量将会减少。根据所使用的方法，与来自来源的初始样品相比，粗天然级分可以另外包含降低水平的天然细胞器。

在一些情况下，分离步骤可以涉及离心(例如，差速离心或超速离心)和/或过滤。

粗天然级分可以通过另外的纯化方法进一步纯化。例如，粗天然级分可以通过超速离心纯化，例如使用密度梯度(碘克沙醇或蔗糖)和/或使用其他方法去除聚集的组分(例如，沉淀或尺寸排阻色谱法)。相对于在早期分离步骤期间产生的一种或多种级分，或者相对于预先建立的阈值水平(例如，商业发布规范)，所得纯结构组分可以具有降低的来自天然来源的污染物或其他不需要的组分(例如，蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构、细胞核、细胞壁组分、细胞器或它们的组合)的水平。例如，相对于初始样品中的水平，纯结构组分可以具有降低的污染物或其他不需要的组分(例如，蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构、细胞核、细胞壁组分、细胞器或它们的组合)的水平(例如，约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)，或者其水平降低至约1/2、1/4、1/5、1/10、1/20、1/25、1/50、1/75、1/100或小于1/100)，或者基本上不含污染物或其他不需要的组分。

例如，可以从结构组分中除去蛋白质聚集体。例如，结构组分可以通过一系列pH(例如，如使用pH探针所测量的)来沉淀出溶液中的蛋白质聚集体。可以用添加例如氢氧化钠或盐酸将pH调节至例如pH 3、pH 5、pH 7、pH 9或pH 11。一旦溶液处于指定pH下，就可以过滤以去除微粒。可替代地，可以通过添加带电聚合物(诸如Polymin-P或Praestol 2640)来絮凝结构组分。简单来说，将Polymin-P或Praestol 2640添加到溶液中并且用叶轮混合。然后可以过滤溶液以去除微粒。可替代地，可以通过增加盐浓度来溶解聚集体。例如，可以将NaCl添加到结构组分中，直到其为例如1mol/L。然后可以过滤溶液以分离结构组分。可替代地，通过提高温度来溶解聚集体。例如，可以在混合下加热结构组分5分钟，直到溶液达到例如50℃的均匀温度。然后可以过滤结构组分混合物。可替代地，来自结构组分溶液的可溶性污染物可以根据标准程序通过尺寸排阻色谱法分离，其中结构脂质在第一级分中洗脱，而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白随后被洗脱。蛋白质聚集体去除的效率可以通过BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较去除蛋白质聚集体前后的蛋白质浓度来确定。

可替代地，结构脂质(例如，大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇)可以从可商购获得的来源获得。

本文描述的任何生产方法可以补充有本领域已知的任何定量或定性方法，以在生产过程的任何步骤中表征或鉴定结构组分(例如，选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇组成的组的结构脂质)。例如，结构组分(例如，选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇组成的组的结构脂质)可以通过多种分析方法来表征，以通过本领域已知的能够进行可视化、定量或定性表征(例如，组合物的鉴定)的许多方法(诸如显微镜(例如，透射电子显微镜)、动态光散射、纳米颗粒跟踪、光谱法(例如，傅立叶变换红外分析)或质谱法(蛋白质和脂质分析))来估计产量、浓度、纯度、组成或尺寸。

在生产过程中，可以任选地制备结构组分(例如，选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇组成的组的结构脂质)，使得结构组分相对于对照或初始样品中的水平处于增加的浓度(例如，增加约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％；或增加约2倍、4倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍或超过100倍)。结构组分可占经修饰的脂质组合物的约0.1％至约100％，例如约0.01％至约100％、约1％至约99.9％、约0.1％至约10％、约1％至约25％、约10％至约50％、约50％至约99％或约75％至约100％。

经修饰的脂质组合物-结构组分的脂质修饰

经修饰的脂质组合物包含(a)结构组分；和(b)可电离脂质。可电离脂质和/或其他外源脂质用于修饰结构组分。

修饰是指修饰含有脂质结构(例如，脂质双层、单层、多层结构；例如，囊泡脂质结构)的结构组分，该脂质结构可以源自(例如，富集、分离或纯化自)天然来源，并且该脂质结构被破坏(例如，通过脂质提取破坏)并使用标准方法在液相(例如，含有货物的液相)中重组或重建，例如通过包括脂质膜水合和/或溶剂注入的方法重建，以产生经修饰的脂质组合物，如本文所描述的。在一些实施方案中，通过在可电离脂质的存在下重构包含结构组分的膜来修饰结构组分。

在一些实施方案中，结构组分包含大豆衍生脂质，并且结构脂质通过用可电离脂质重构包含结构组分的纯化的大豆衍生脂质的膜而被修饰。

可替代地，经修饰的脂质组合物可以使用微流体装置(诸如IGNITE^TM微流体仪器(Precision NanoSystems))来产生。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物是通过包括以下步骤的方法产生的：(a)提供结构组分(例如，如上文所描述的纯化的结构组分)；(b)处理结构组分以产生脂质膜；(c)在有机溶剂或溶剂组合中重建脂质膜，从而产生脂质溶液；以及(d)在可电离脂质的存在下，在包含水相的微流体装置中处理步骤(c)的脂质溶液，从而产生经修饰的脂质组合物。

在一些情况下，处理结构组分以产生脂质膜包括使用Bligh-Dyer方法(Bligh和Dyer,J BiolchemPhysiol,37:911-917,1959)提取脂质，该Bligh-Dyer方法以引用的方式整体并入本文。所提取的脂质可以作为储备溶液，例如氯仿:甲醇溶液提供。产生脂质膜可以包含例如用惰性气体(例如，氮气)流蒸发溶剂。

如果需要，该方法还可以包括超声处理、冷冻/解冻处理和/或脂质挤出，例如以减小重建的经修饰的脂质组合物的尺寸。

结构脂质

在一些实施方案中，结构组分包含源自天然来源的结构脂质。经修饰的脂质组合物可以包含10％至100％的源自来自天然来源的脂质结构的脂质，例如，该经修饰的脂质组合物可以含有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的源自来自天然来源的脂质结构的脂质。经修饰的脂质组合物可以包含存在于来自经修饰的脂质组合物的脂质结构中的脂质物质的全部或一部分，例如，该经修饰的脂质组合物可以含有存在于来自天然来源的脂质结构中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的脂质物质。经修饰的脂质组合物可以不包含存在于来自天然来源的脂质结构中的蛋白质物质、包含该蛋白质物质的一部分或全部，例如，该经修饰的脂质组合物可以含有0％、小于1％、小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于30％、小于40％、小于50％、小于60％、小于70％、小于80％、小于90％、小于100％或100％的存在于来自天然来源的脂质结构中的蛋白质物质。在一些情况下，经修饰的脂质组合物的脂质双层不含蛋白质。在一些情况下，相对于来自天然来源的脂质结构，经修饰的脂质组合物的脂质结构含有减少量的蛋白质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的结构脂质选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇组成的组。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的结构脂质包含表1至表7和表9至表13中列出的那些结构脂质中的一种或多种。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的结构脂质是从大豆中提取的。

外源脂质

结构组分可以被修饰以包含异源剂(例如，细胞渗透剂)，相对于未经修饰的结构组分，该异源剂能够增加细胞摄取(例如，动物细胞摄取(例如，哺乳动物细胞摄取，例如，人细胞摄取)、植物细胞摄取、天然细胞摄取或真菌细胞摄取)。例如，经修饰的结构组分可以包含(例如，装载有，例如，包封或缀合至)或配制有细胞渗透剂(诸如可电离脂质)(例如，悬浮或重悬在包含细胞渗透剂的溶液中)。每种经修饰的结构组分可以包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的可电离脂质。

经修饰的脂质组合物可以包含一种或多种外源脂质，例如，对于脂质来源是外源的脂质(例如，源自不是产生结构组分的来源的来源)。经修饰的脂质组合物的总脂质可以包含0％、小于1％或至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或大于95％的外源脂质。在一些实例中，添加外源脂质(例如，可电离脂质)至制剂中总脂质的25％或40％(w/w)的量。在一些实例中，在步骤(b)之前将外源脂质添加到制剂中，例如在步骤(b)之前与结构脂质混合。

示例性外源脂质包括可电离脂质。

外源脂质还可以包括阳离子脂质。

在一些情况下，外源脂质可以是选自1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、DLin-MC3-DMA(MC3)、二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DODAP)、DC-胆固醇、DOTAP、乙基PC、GL67、DLin-KC2-DMA(KC2)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5(Moderna)、阳离子磺酰胺氨基脂质、两亲性两性离子氨基脂质、DODAC、DOBAQ、YSK05、DOBAT、、DOBAQ、DOPAT、DOMPAQ、DOAAQ、DMAP-BLP、DLinDMA、DODMA、DOTMA、DSDMA、DOSPA、DODAC、DOBAQ、DMRIE、DOTAP-胆固醇、GL67A和98N12-5以及它们的组合的可电离脂质或阳离子脂质。

在一些实施方案中，外源脂质可以是选自C12-200、MC3、DODAP、DC-胆固醇、DOTAP、乙基PC、GL67、KC2、MD1、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5(Moderna)、阳离子磺酰胺氨基脂质和两亲性两性离子氨基脂质以及它们的组合的可电离脂质或阳离子脂质。在一些实施方案中，可电离脂质选自C12-200、MC3、DODAP和DC-胆固醇或它们的组合。在一些情况下，可电离脂质是可电离脂质。在一些实施方案中，可电离脂质是1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)或4-(二甲氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-甲酯、DLin-MC3-DMA(MC3)。在一些情况下，外源脂质是阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质是DC-胆固醇或二油酰基-3-三甲胺丙烷(DOTAP)。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％的可电离脂质。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含至少0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或大于90％的可电离脂质，例如1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的可电离脂质，例如约30％-75％的可电离脂质(例如，约30％-75％的可电离脂质)，以mol％计。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含25％的C12-200，以mol％计。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含35％的C12-200，以mol％计。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含50％的C12-200，以mol％计。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含40％的MC3，以mol％计。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含50％的C12-200，以mol％计。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含20％或40％的DC-胆固醇，以mol％计。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含25％或40％的DOTAP，以mol％计。

药剂可以增加对经修饰的脂质组合物整体的摄取，或者可以增加对由经修饰的脂质组合物携带的经修饰的脂质组合物(例如，异源功能剂)的一部分或组分的摄取。细胞摄取增加的程度可以根据组合物被递送至的来源、经修饰的脂质组合物和对经修饰的脂质组合物进行的其他修饰而变化。例如，相对于未经修饰的结构组分，经修饰的脂质组合物可以具有至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的增加的细胞摄取(例如，动物细胞摄取、植物细胞摄取、天然细胞摄取或真菌细胞摄取)。在一些情况下，增加的细胞摄取是相对于未经修饰的结构组分增加至少2倍、4倍、5倍、10倍、100倍或1000倍的细胞摄取。

在一些实施方案中，已用可电离脂质修饰的经修饰的脂质组合物比未用可电离脂质修饰的经修饰的脂质组合物更有效地包封带负电荷的多核苷酸。在一些方面，相对于未用可电离脂质修饰的经修饰的脂质组合物，已用可电离脂质修饰的经修饰的脂质组合物具有改变的生物分布。在一些方面，相对于未用可电离脂质修饰的经修饰的脂质组合物，已用可电离脂质修饰的经修饰的脂质组合物与靶细胞的内体膜的融合改变(例如，增加)。

可电离脂质

在一些实施方案中，可电离脂质具有下列特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个或全部五个)：

(i)至少2种可电离胺(例如，至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或多于6种可电离胺，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或多于12种可电离胺)；

(ii)至少3个脂质尾部(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或多于6个脂质尾部，例如2个、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个脂质尾部)，其中每个脂质尾部独立地具有至少6个碳原子长度(例如，至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或多于18个碳原子长度，例如6个、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或多于25个碳原子长度)；

(iii)约4.5至约7.5(例如，约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的酸解离常数(pKa)(例如，约6.5至约7.5的pKa(例如，约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5的pKa))的pKa；

(iv)可电离胺和杂有机基团；以及

(v)至少10的N:P(可电离脂质的胺:核酸(诸如mRNA)的磷酸盐)比率。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物具有约12至约17的N/P比率，例如N/P比率为约15±1，或N/P比率为约15±0.5。在一些实施方案中，N/P比率为约15。可替代地，可电离脂质的特征在于N/P比率为约3至约10，例如N/P比率为约6±1，或者N/P比率为约6±0.5。在一些实施方案中，N/P比率为约6。

在一些实施方案中，可电离脂质不选自1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5(Moderna)和98N12-5。

在一些实施方案中，可电离脂质选自由1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5、SM-102(脂质H)和ALC-315组成的组。

在一些实施方案中，可电离脂质是可电离胺和杂有机基团。在一些实施方案中，杂有机基团是羟基。在一些实施方案中，杂有机基团包含氢键供体。在一些实施方案中，杂有机基团包含氢键受体。在一些实施方案中，杂有机基团是-OH、-SH、-(CO)H、-CO₂H、-NH₂、-CONH₂、任选取代的C₁-C₆烷氧基或氟。

在一些实施方案中，可电离脂质是由具有至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团。

可电离脂质可以包括如下文所描述的组i)至组iv)的化合物之一。

可电离脂质化合物i)

在一些实施方案中，可电离脂质由以下式I、其药学上可接受的盐或前述中的任一者的立体异构体表示：

其中

每个X独立地是可生物降解部分；并且

W是其中：

R₅是OH、SH或NR₁₀R₁₁；

每个R₇和每个R₈独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、卤素、OH、SH或NR₁₀R₁₁，其中每个R₁₀和R₁₁独立地是H、C₁-C₃烷基，或R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；

每个s独立地是1、2、3、4或5；

每个u独立地是1、2、3、4或5；

t是1、2、3、4或5；

Q是O、S或NR₁₃，其中每个R₁₃是H或C₁-C₅烷基。

在一些实施方案中，B是C₃-C₂₀烷基。

在一些实施方案中，式(I)中的W可以可替代地是其中：

V是支链或非支链C₂-C₁₀亚烷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基或C₂-C₁₀亚杂烷基，该亚烷基、亚烯基、亚炔基或亚杂烷基任选地被一个或多个OH、SH和/或卤素基团取代；

每个R₇和每个R₈独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、卤素、OH、SH、(CH₂)_vR₁₇或NR₁₀R₁₁，其中每个R₁₀和R₁₁独立地是H、C₁-C₃烷基，或R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；

R₁₇是OH、SH或N(CH₃)₂；并且

每个u独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，式(I)中的W可以可替代地是其中：

V是C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基或C₂-C₁₀亚杂烷基；

每个R₆独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基或环烷基；并且

每个u独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，式(I)中的W可以可替代地是其中：

R₁₄是杂环；

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；并且

每个u独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，式(I)中的W可以可替代地是其中：

Z是O、S、-C((CH₂)_vN(R₁₅)₂)-或N(R₁₅)，其中R₁₅是H、C₁-C₄支链或非支链烷基，并且v是0、1、2、3、4或5；

每个R₁₀独立地是H或C₁-C₃烷基；并且

每个u独立地是0、1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，式(I)中的W可以可替代地是其中：

每个Y是二价杂环；

Q是O、S或NH；并且

每个u独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，式(I)中的W可以可替代地是其中：

R₁₄是杂环、NR₁₀R₁₁、C(O)NR₁₀R₁₁或C(S)NR₁₀R₁₁，其中每个R₁₀和R₁₁独立地是H、C₁-C₃烷基、C₃-C₇环烷基、C₃-C₇环烯基，该烷基、环烷基、环烯基任选地被一个或多个NH和/或氧代基团取代，或者R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；

R₁₆是H、＝O、＝S或CN；

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；并且

每个u独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，式(I)中的W可以可替代地是其中：

T是–NHC(O)O-、–OC(O)NH-或任选地被一个或多个-(CH₂)_vOH、-(CH₂)_vSH和/或-(CH₂)_v-卤素基团取代的二价杂环；

R₁₇是OH、SH或N(CH₃)₂；

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；并且

每个u独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，式(I)中的W可以可替代地是其中：

T是–NHC(O)O-、–OC(O)NH-或二价杂环；并且

每个u独立地是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，当Z并非不存在时，相邻的R₁和R₂不能是OH、NR₁₀R₁₁或SH。

在一些实施方案中，杂环是哌嗪、哌嗪二酮、哌嗪-2,5-二酮、哌啶、吡咯烷、哌啶醇、二氧代哌嗪、双哌嗪、芳香族或杂芳香族。

在一些实施方案中，可电离脂质由式(IX)表示：

其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体，其中

每个R₁和每个R₂独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁，或者

每个R₁和每个R₂独立地与其所连接的碳原子合在一起形成环；

每个R₁₀和R₁₁独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基，或R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；

每个R₃和每个R₄独立地是H、C₂-C₁₄支链或非支链烷基(例如，C₃-C₁₀支链或非支链烷基)或C₃-C₁₀支链或非支链烯基，条件是R₃和R₄中的至少一者不是H；

每个X独立地是可生物降解部分；

每个q独立地是2、3、4或5；

每个R₇和每个R₈独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、卤素、OH、SH、(CH₂)_vR₁₇或NR₁₀R₁₁，其中每个v独立地是0、1、2、3、4或5，并且R₁₇是OH、SH或N(CH₃)₂；并且

每个m独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些实施方案中，V是支链或非支链的C₂-C₃亚烷基。在一些实施方案中，V是被OH取代的C₂-C₃亚烷基。在一些实施方案中，V是支链或非支链的C₂-C₃亚烯基。在一些实施方案中，每个R₆独立地是H或甲基。

在一些实施方案中，可电离脂质由以下式中的一者表示：其中变量的定义与式(X)中的定义相同。

在一些实施方案中，本公开涉及式(XI)的可电离脂质：

其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体，其中

每个X独立地是可生物降解部分；

每个s独立地是1、2、3、4或5；

T是–NHC(O)O-、–OC(O)NH-或任选地被一个或多个-(CH₂)_vOH、-(CH₂)_vSH、-(CH₂)_v-卤素基团取代的二价杂环，

每个R₇和每个R₈独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、卤素、OH、SH、(CH₂)_vR₁₇或NR₁₀R₁₁，其中R₁₇是OH、SH或N(CH₃)₂；

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；并且

每个m独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些实施方案中，T是任选地被-(CH₂)_vOH取代的二价杂环(例如，二价哌嗪或二价二氧代哌嗪)，其中v独立地是0、1或2。

在一些实施方案中，在每个上述式中，X是–OC(O)-、-C(O)O-、-SS-、-N(R¹⁸)C(O)-、-C(O)N(R¹⁸)-、-C(O-R₁₃)-O-、-C(O)O(CH₂)_a-、-OC(O)(CH₂)_a-、-C(O)N(R¹⁸)(CH₂)_a-、-N(R¹⁸)C(O)(CH₂)_a-、

-C(O-R₁₃)-O-(CH₂)_a-，其中每个R¹⁸独立地是H、烷基、烯基、环烷基、羟烷基或氨基烷基，每个R₁₃独立地是C₃-C₁₀烷基，并且每个a独立地是0-16。在一个实施方案中，每个X独立地是-OCO-、-COO-、-NHCO-或-CONH-。在一个实施方案中，至少一个X是-SS-。

在可电离脂质化合物组i)中，式(I)的可电离脂质的更多实施方案可以在于2022年11月22日提交的PCT申请号PCT/US22/50725中找到，该PCT申请的内容以引用的方式整体并入本文。具体地，PCT申请号PCT/US22/50725的式(I)-(XII)的所有可电离脂质都适合用作本公开中的可电离脂质，并且以引用的方式整体并入本文。

本文所公开的某些示例性可电离脂质化合物在下表I中阐述。

表I：示例性可电离脂质化合物。

可电离脂质化合物ii)

在一些实施方案中，可电离脂质由以下式II、其药学上可接受的盐或前述中的任一者的立体异构体表示：

其中：

是环状或杂环部分；

Y是烷基、羟基、羟烷基或

-亚烷基-O-、-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-、或-S-；

每个M独立地是可生物降解部分；

R₃₀、R₄₀、R₅₀、R₆₀、R₇₀、R₈₀、R₉₀、R₁₀₀、R₁₁₀和R₁₂₀中的每一者独立地是H,任选地被杂原子间杂或被OH、SH或卤素取代的C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₁-C₁₆支链或非支链烯基，或环烷基或经取代的环烷基；

l和m中的每一者是1至10的整数；

t1是0至10的整数；并且

W是羟基、经取代的或未经取代的羟烷基、经取代的或未经取代的氨基、经取代的或未经取代的氨基羰基或经取代的或未经取代的杂环基或杂芳基。

在一些实施方案中，Y是羟基或

在一些实施方案中，选自吡咯烷、哌啶、哌嗪、环己烷、环戊烷、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉和二噁烷。在一些实施方案中，选自由组成的组。

在一些实施方案中，可电离脂质由下式表示：

已经对该式中的所有变量进行了定义并例示为上述实施方案中描述的那些变量。

在一些实施方案中，可电离脂质由下式表示：

其中：

t1是0至10的整数；

每个M独立地是可生物降解部分；

每个m1独立地是3至6的整数，

每个l1独立地是4至8的整数，

m2和l2各自独立地是0至3的整数，

R₈₀和R₉₀各自独立地是未经取代的C₅-C₈烷基；或者R₈₀是H或未经取代的C₁-C₄烷基，并且R₉₀是未经取代的C₅-C₁₁烷基；并且

R₁₁₀和R₁₂₀各自独立地是未经取代的C₅-C₈烷基；或者R₁₁₀是H或未经取代的C₁-C₄烷基，并且R₁₂₀是未经取代的C₅-C₁₁烷基。已经对这些式中的所有其他变量进行了定义并例示为上述实施方案中描述的那些变量。在一些实施方案中，在这些式中，R₈₀是H或未经取代的C₁-C₂烷基，并且R₉₀是未经取代的C₆-C₁₀烷基；并且R₁₁₀和R₁₂₀各自独立地是未经取代的C₅-C₈烷基。在一些实施方案中，R₈₀、R₉₀、R₁₁₀和R₁₂₀各自独立地是未经取代的C₅-C₈烷基。

在一些实施方案中，在以上式中，A不存在，是-O-、-N(R⁷)-、N(R⁷)C(O)-、 -OC(O)-或-C(O)O-，其中R⁶独立地是H、烷基、羟基、羟烷基、氨基、氨基烷基、硫醇、硫代烷基或N⁺(R⁷)₃–亚烷基-Q-；并且R⁷是H或C₁-C₃烷基。

在一些实施方案中，在以上式中，t1是0、1、2、3或4；并且t是0、1或2。

在一些实施方案中，在以上式中，W是羟基、羟烷基或以下中的一者：其中：

每个Q独立地不存在，是-O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、-C(R⁷)₂-、-C(O)N(R⁷)-、

-C(S)N(R⁷)-或-N(R⁷)-；

每个R⁶独立地是H、烷基、羟基、羟烷基、烷氧基、氨基、氨基烷基、烷基氨基、硫醇、硫醇烷基或N⁺(R⁷)₃–亚烷基-Q-；

每个R⁸独立地是H、烷基、羟烷基、氨基、氨基烷基、硫醇或硫代烷基，或两个R⁸与氮原子一起可以形成环；

每个q独立地是0、1、2、3、4或5；并且

每个p独立地是0、1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，在以上式中，

X不存在，是-O-或–C(O)-；

Z是–O-、–C(O)O-或–OC(O)-；

M是-OC(O)-或-C(O)O-；

Y或是：

OH、

每个R^c独立地是H或C₁-C₃烷基；

每个t1独立地是1、2、3或4；

R₃₀、R₄₀、R₅₀和R₆₀中的每一者是H或C₁-C₄支链或非支链烷基；

R₇₀是H；并且R₈₀和R₉₀中的每一者独立地是H或C₁-C₁₂支链或非支链烷基；

R₁₀₀是H；并且R₁₁₀和R₁₂₀中的每一者独立地是H或C₁-C₁₂支链或非支链烷基，条件是R₈₀和R₉₀中的至少一者不是H，并且R₁₁₀和R₁₂₀中的至少一者不是H；

l是3至7；并且

m是1至5。

在一些实施方案中，在以上式中，Y或是：OH、

在可电离脂质化合物组ii)中，式(II)的可电离脂质的更多实施方案可以在于20223年3月24日提交的PCT申请号PCT/US23/16300中找到，该PCT申请的内容以引用的方式整体并入本文。具体地，PCT申请号PCT/US23/16300的式(I)、(IA-1)、(IA-2)、(IIA)-(IIC)、(IIA-1)、(IIIA)-(IIIIE)、(IIIC-1)、(IVA-1)-(IVA-3)、(IVC-1)-(IVC-2)、(VA-1)-(VA-9)、(VC-1)-(VC-6)的所有可电离脂质都适合用作本公开中的可电离脂质，并且以引用的方式整体并入本文。

本文所公开的某些示例性可电离脂质化合物在下表II中阐述。

表II.示例性可电离脂质化合物。

可电离脂质化合物iii)

在一些实施方案中，可电离脂质由式其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体表示，其中：

R₂₀和R₃₀各自独立地是H、C₁-C₅支链或非支链烷基或C₂-C₅支链或非支链烯基，或

R₂₀和R₃₀与相邻的N原子一起形成3至7元环，该环任选地被R^a取代；

R₁和R₂合在一起形成环；

每个R₁₀和R₁₁独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基，或

R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；

n是0、1、2、3或4；

Y是O或S；

Z不存在，是O、S或N(R₁₂)(R₁₂)，其中每个R₁₂独立地是H、C₁-C₇支链或非支链烷基或C₂-C₇支链或非支链烯基，条件是当Z并非不存在时，相邻的R₁和R₂不能是OH、NR₁₀R₁₁或SH；

每个B各自独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₂-C₁₆支链或非支链烯基，该烷基或烯基任选地被一个或多个杂原子间杂或任选地被OH、SH或卤素取代；

每个X独立地是可生物降解部分。

在一些实施方案中，R₂₀和R₃₀各自独立地是H或C₁-C₃支链或非支链烷基。在一些实施方案中，R₂₀和R₃₀与相邻的N原子一起形成3至7元环，该环任选地被R^a取代。在一些实施方案中，R^a是H、C₁-C₃支链或非支链烷基或OH。在一个实施方案中，R^a是H或OH。

在一些实施方案中，Z不存在，是S、O或NH。在一些实施方案中，n是0、1或2。

在一些实施方案中，可电离脂质由式(V)表示：

其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体，其中

R₁是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、OH、卤素、SH或NR₁₀R_11，并且

R₂是H、OH、卤素、SH或NR₁₀R_11，或者

R₁和R₂合在一起形成环；

R₁₀和R₁₁各自独立地是H或C₁-C₃烷基，或R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；

Q是OH或-(OCH₂CH₂)_uNR₂₀R₃₀，

u是0、1、2、3、4、5、6、7或8；

v是0、1、2、3或4；

y是0、1、2、3或4；

每个A独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₁-C₁₆支链或非支链烯基，该烷基或烯基任选地被一个或多个杂原子间杂或任选地被OH、SH或卤素取代；

每个X独立地是可生物降解部分。

在一些实施方案中，本公开涉及下式之一的可电离脂质：

其中：u是0、1、2、3、4、5、6、7或8；v是0、1、2、3或4；并且y是0、1、2、3或4。其他变量如以上式(III)和(V)中所定义。

在一些实施方案中，在以上式中，X是–OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-、

-C(O-R₁₃)-O-、-C(O)O(CH₂)_s-、-OC(O)(CH₂)_s-、-C(O)N(R⁷)(CH₂)_s-、-N(R⁷)C(O)(CH₂)_s-、

-C(O-R₁₃)-O-(CH₂)_s-，其中每个R⁷独立地是H、烷基、烯基、环烷基、羟烷基或氨基烷基，每个R₁₃独立地是C₃-C₁₀烷基，并且每个s独立地是0-16。在一些实施方案中，X是–OC(O)-、–C(O)O-、-C(O)O(CH₂)_s-或-OC(O)(CH₂)_s-。在一些实施方案中，s是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在可电离脂质化合物组iii)中，式(III)或(V)的可电离脂质的更多实施方案可以在于2022年11月16日提交的PCT申请号PCT/US22/50111中找到，该PCT申请的内容以引用的方式整体并入本文。具体地，PCT申请号PCT/US22/50111的式(IO)-(VIIO)和式(I)-(VIID)的所有可电离脂质都适合用作本公开中的可电离脂质，并且以引用的方式整体并入本文。

本文所公开的某些示例性可电离脂质化合物在下表III中阐述。

表III.示例性可电离脂质化合物。

可电离脂质化合物iv)

在一些实施方案中，可电离脂质是包含至少一个头部基团和式(TI)或(TI')：

其中：

E各自独立地是可生物降解基团；

R^a各自独立地是C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基；

u1和u2各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；

R^t各自独立地是H，任选地被杂原子间杂或被OH、SH或卤素取代的C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₁-C₁₆支链或非支链烯基，或环烷基或经取代的环烷基；

表示将尾部基团与头部基团连接的键；并且

其中脂质的pKa是约4至约8。

在一些实施方案中，E各自独立地是-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-、

-C(O-R₁₃)-O-、-C(O)O(CH₂)_r-、-C(O)N(R⁷)(CH₂)_r-、-S-S-或-C(O-R₁₃)-O-(CH₂)_r-，其中每个R⁷独立地是H、烷基、烯基、环烷基、羟烷基或氨基烷基；R₁₃是支链或非支链的C₃-C₁₀烷基；并且r是1、2、3、4或5。在一些实施方案中，E各自独立地是-OC(O)-、-C(O)O-、

-N(R⁷)C(O)-或-C(O)N(R⁷)-，其中R⁷独立地是H、烷基、烯基、环烷基、羟烷基或氨基烷基。

在一些实施方案中，脂质包含至少一个头部基团和式(TII)：

的至少一个尾部基团，其中u3和u4各自独立地是0、1、2、3或4。(TII)中的其他变量的定义与上文(TI)中的所定义的那些相同。

在一些实施方案中，脂质包含至少一个头部基团和式(TIII)：

的至少一个尾部基团(例如，其中u3是0、1、2、3、4、5、6或7；并且R^b在每种情况下独立地是H或C₁-C₄烷基。(TIII)中的其他变量的定义与上文(TI)中所定义的那些相同。

在一些实施方案中，脂质包含至少一个头部基团和式(TIV)：

的至少一个尾部基团，其中u3和u4各自独立地是0、1、2、3或4。(TIV)中的其他变量的定义与上文(TI)中的所定义的那些相同。

在一些实施方案中，脂质包含至少一个头部基团和式(TV)(例如，的至少一个尾部基团，其中u3是0、1、2、3、4、5、6或7；R⁷各自独立地是H或甲基；并且R^b在每种情况下独立地是H或C₁-C₄烷基。(TV)中的其他变量的定义与上文(TI)中的所定义的那些相同。

在一些实施方案中，脂质包含至少一个头部基团和式(TII')(例如，)的至少一个尾部基团，其中u3是0、1、2、3、4、5、6或7；并且R^b在每种情况下独立地是H或C₁-C₄烷基。(TII')中的其他变量的定义与上文(TI')中的所定义的那些相同。

在一些实施方案中，脂质包含至少一个头部基团和式(TII')(例如，)的至少一个尾部基团，其中u3是0、1、2、3、4、5、6或7；R⁷各自独立地是H或甲基；并且R^b在每种情况下独立地是H或C₁-C₄烷基。(TIII')中的其他变量的定义与上文(TI')中的所定义的那些相同。

在一些实施方案中，脂质包含式(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TII')和(TIII')的至少一个尾部基团，其中

R⁷各自独立地是H或甲基；

R^b在每种情况下独立地是H或C₁-C₄烷基；

u1和u2各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；

u3和u4各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；并且

其中脂质的pKa是约4至约8。

在一些实施方案中，脂质包含具有式(T)、(TI)、(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TII’)和/或(TIII')的两个、三个、四个或更多个尾部基团，并且每个尾部基团可以相同或不同。

在一些实施方案中，在以上式(T)、(TI)、(TII)和(TIII)、(TIV)、(TV)、(TI')、(TII')和/或(TIII')中的任一个式中，R^a各自独立地是C₁-C₅支链或非支链烷基、C₂-C₅支链或非支链烯基或C₂-C₅支链或非支链炔基。在一些实施方案中，R^a各自独立地是C₁-C₃支链或非支链烷基。在一个实施方案中，每个R^a是甲基。

在一些实施方案中，在以上式(T)、(TI)、(TII)和(TIII)、(TIV)、(TV)、(TI')、(TII')和/或(TIII')中的任一个式中，u1是3、4或5。在一些实施方案中，在以上式(T)、(TI)、(TII)和(TIII)、(TIV)、(TV)、(TI')、(TII')和/或(TIII')中的任一个式中，u2是0、1、2或3。在一些实施方案中，在以上式(T)、(TI)、(TII)和(TIII)、(TIV)、(TV)、(TI')、(TII')和/或(TIII')中的任一个式中，u3和u4各自独立地是1-7，例如，u3和u4各自独立地是1、2、3或4。

在一些实施方案中，脂质包含式(TIII)的至少一个尾部，其中每个R^a是甲基，R^b在每种情况下独立地是H、乙基或丁基，u1是3-5，u2是0-3，并且u3是1-7(例如，1-4)。在一些实施方案中，脂质包含式(TIII)的至少一两个尾部，其中式(TIII)的两个尾部相同或不同。在一些实施方案中，脂质包含式(TIII)的至少三个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质具有式(TIII)的四个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，在式(TIII)的每个尾部中，每个R^a是甲基，并且u1是3，u2是2，并且u3是4。

在一些实施方案中，脂质包含式(TII)的至少一个尾部，其中每个R^a是甲基，u1是3-5，u2是0-3，u3是1-4，并且u4是1-4。在一些实施方案中，脂质具有式(TII)的至少两个尾部，其中式(TII)的两个尾部是相同的。在一些实施方案中，脂质具有式(TII)的至少两个尾部，其中式(TII)的两个尾部是或不同的。在一些实施方案中，脂质包含式(TII)的至少三个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质具有式(TII)的四个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。

在一些实施方案中，脂质包含式(TIV)的至少一个尾部，其中每个R^a是甲基，u1是3-5，u2是0-3，u3是1-4，并且u4是1-4。在一些实施方案中，脂质包含式(TIV)的至少两个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质包含式(TIV)的至少三个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质包含式(TIV)的至少四个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。

在一些实施方案中，脂质包含式(TV)的至少两个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质包含式(TV)的至少三个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质包含式(TV)的至少四个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。

在一些实施方案中，脂质具有式(TII')的至少两个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质具有式(TII')的至少三个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质具有式(TII')的至少四个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。

在一些实施方案中，脂质具有式(TIII')的至少两个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质具有式(TIII')的至少三个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。在一些实施方案中，脂质具有式(TIII')的至少四个尾部，其中每个尾部可以相同或不同。

在一些实施方案中，脂质具有式(TII)的至少一个尾部和/或式(TIII)的至少一个尾部；脂质还包含不具有式(T)、(TI)、(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TII')和/或(TIII')的至少一个尾部。也就是说，脂质还包含至少一个尾部，该至少一个尾部不含与E(例如，-C(O)O-)旁边的相同碳键合的偕二官能团。

在一些实施方案中，脂质还包含不具有式(T)、(TI)、(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TI’)、(TII')和/或(TIII')的至少一个尾部。也就是说，脂质还包含至少一个尾部，该至少一个尾部不含与E旁边的相同碳键合的偕二官能团。

在一些实施方案中，脂质还包含不具有式(T)、(TI)、(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TI’)、(TII’)和/或(TIII')的至少一个尾部。也就是说，脂质还包含至少一个尾部，该至少一个尾部不含与E旁边的相同碳键合的偕二官能团。

在一些实施方案中，脂质还包含式(TNG-I)的至少一个尾部：

其中

E各自独立地是如本文所描述的可生物降解基团(例如，-OC(O)-、-C(O)O-、

-N(R⁷)C(O)-、-S-S-或-C(O)N(R⁷)-)；

u1和u2各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；并且

R⁷独立地是H、烷基、烯基、环烷基、羟烷基或氨基烷基。

在一些实施方案中，式(TNG-I)的至少一个尾部可以由表示，其中

u3和u4各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；并且

R^b在每种情况下独立地是H或C₁-C₄烷基。

关于E、R^b、R^t、u1、u2、u3和u4的定义的上述所有实施方案，如上文关于含有与E旁边的相同碳键合的偕二官能团的尾部基团(具有式(T)、(TI)、(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TII')或(TIII'))所描述的，也适用于不含与E旁边的相同碳键合的偕二官能团的尾部基团(具有式(TNG-I)、(TNG-II)或(TNG-III))。

在一些实施方案中，脂质还包含不具有式(T)、(TI)、(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TI’)、(TII')和/或(TIII')的至少两个尾部。在一些实施方案中，脂质包含式(TNG-II)或(TNG-III)的两个尾部基团，并且其中每个尾部基团可以相同或不同，

在一些实施方案中，脂质还包含不具有式(T)、(TI)、(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TI’)、(TII')和/或(TIII')的至少三个尾部。在一些实施方案中，脂质包含式(TNG-II)或(TNG-III)的三个尾部基团，并且其中每个尾部基团可以相同或不同，

在一些实施方案中，脂质的头部基团具有式(HA-I)的结构：

其中：

R₂₀和R₃₀各自独立地是H、C₁-C₅支链或非支链烷基或C₂-C₅支链或非支链烯基，所述烷基或所述烯基任选地被一个或多个杂原子间杂或被OH、SH、卤素或环烷基取代；或

R₂₀和R₃₀与相邻的N原子一起形成含有一个或多个杂原子的3至7元杂环或杂芳香族环，所述杂环或所述杂芳香族环任选地被一个或多个OH、SH、卤素、烷基或环烷基取代；

R₁和R₂中的每一者独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁；或R₁和R₂一起形成环；

R₁₀和R₁₁中的每一者独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基；或R₁₀和R₁₁一起形成杂环；

n是0、1、2、3或4；

Z不存在，是O、S或NR₁₂，其中R₁₂是H或C₁-C₇支链或非支链烷基；条件是当Z并非不存在时，相邻的R₁和R₂不能是OH、NR₁₀R₁₁、SH。

在一些实施方案中，R₂₀和R₃₀与相邻的N原子一起形成含有一个或多个杂原子的3至7元杂环或杂芳香族环，所述杂环或所述杂芳香族环任选地被一个或多个OH、SH、卤素、烷基或环烷基取代。

在一些实施方案中，可电离脂质的头部基团具有式(HA-IA)的结构：其中：

R₁和R₂中的每一者独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁；或R₁和R₂合在一起形成环；

R₁₀和R₁₁中的每一者独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基；或R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；

m是1、2、3、4、5、6、7或8；

n是0、1、2、3或4；

Z不存在，是O、S或NR₁₂，其中R₁₂是H或C₁-C₇支链或非支链烷基；条件是当Z并非不存在时，相邻的R₁和R₂不能是OH、NR₁₀R₁₁或SH；并且

表示将所述头部基团与所述尾部基团连接的键。

在一些实施方案中，可电离脂质的头部基团具有式(HA-III)的结构：其中Z不存在，是O、S或NR₁₂；并且R₁₂是H或C₁-C₇支链或非支链烷基。(HA-III)中的其他变量的定义与上文(HA-IA)中的所定义的那些相同。

在一些实施方案中，头部基团具有以下结构：其中：

Rc是H或烷基，任选地被OH取代；并且

m1是1、2或3。

在一些实施方案中，可电离脂质的头部基团具有式(HA-V)的结构：其中：

R₁是H、C₁-C₃烷基、OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁；

R₂是OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁；或R₁和R₂能够合在一起形成环；

R₁₀和R₁₁各自独立地是H或C₁-C₃烷基；或R₁₀和R₁₁能够合在一起形成杂环；

R₂₀和R₃₀各自独立地是H、C₁-C₅支链或非支链烷基、C₂-C₅支链或非支链烯基；或R₂₀和R₃₀能够合在一起形成环；并且

v和y中的每一者独立地是1、2、3或4。

在一些实施方案中，可电离脂质的头部基团具有式(HA-VI)的结构：(HA-VI)中的所有变量的定义与上文(HA-V)中的所定义的那些相同。

在一些实施方案中，在以上式(HA-V)或(HA-VI)中的任一个式中，R₂₀和R₃₀中的每一者独立地是C₁-C₃烷基。在一个实施方案中，R₂₀和R₃₀中的每一者独立地是甲基。

在一些实施方案中，可电离脂质的头部基团具有式(HB-I)的结构：

其中W是

其中

R₅是OH、SH、(CH₂)_sOH或NR₁₀R₁₁；

每个R₇和R₈独立地是H、C₁-C₃支链或非支链烷基、C₂-C₃支链或非支链烯基、卤素、(CH₂)_vOH、(CH₂)_vSH、(CH₂)_sN(CH₃)₂或NR₁₀R₁₁，其中每个R₁₀和R₁₁独立地是H或C₁-C₃烷基，或R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；或R₇和R₈合在一起形成环；

每个R₂₀独立地是H或C₁-C₃支链或非支链烷基；

R₁₄是杂环、NR₁₀R₁₁、C(O)NR₁₀R₁₁、NR₁₀C(O)NR₁₀R₁₁或NR₁₀C(S)NR₁₀R_11，其中每个R₁₀和R₁₁独立地是H、C₁-C₃烷基、C₃-C₇环烷基、C₃-C₇环烯基，所述烷基、所述环烷基、所述环烯基任选地被一个或多个NH和/或氧代基团取代，或者R₁₀和R₁₁合在一起形成杂环；

R₁₆是H、＝O、＝S或CN；

s、u和t中的每一者独立地是1、2、3、4或5；

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；

每个Y是二价杂环；

每个Z独立地不存在，是O、S或NR₁₂，其中R₁₂是H、C₁-C₇支链或非支链烷基或C₂-C₇支链或非支链烯基；

Q是O、S、CH₂或NR₁₃，其中每个R₁₃是H或C₁-C₅烷基；

V是支链或非支链C₂-C₁₀亚烷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基或C₂-C₁₀亚杂烷基，所述亚烷基、所述亚烯基、所述亚炔基或所述亚杂烷基任选地被一个或多个OH、SH和/或卤素基团取代；并且

T是–NHC(O)O-、–OC(O)NH-或二价杂环。

在一些实施方案中，在式(HB-I)中，W是其中：

每个R₆、R₇和R₈独立地是H或甲基；并且

u和t中的每一者独立地是1、2或3。

在一些实施方案中，在式(HB-I)中，W是其中：

R₁₆是H或＝O；

R₁₄是含氮5或6元杂环、NR₁₀R₁₁、C(O)NR₁₀R₁₁、NR₁₀C(O)NR₁₀R₁₁或NR₁₀C(S)NR₁₀R_11，其中每个R₁₀和R₁₁独立地是H或C₁-C₃烷基；并且

u和v中的每一者独立地是1、2或3。

在一些实施方案中，在式(HB-I)中，W是其中：

每个R₆独立地是H或甲基；

每个u独立地是1、2或3；并且

V是C₂-C₆亚烷基或C₂-C₆亚烯基。

在一些实施方案中，在式(HB-I)中，W是其中：

每个R₆独立地是H或甲基；

每个R₇独立地是H；

每个R₈是甲基；

每个u独立地是1、2或3；并且

V是C₂-C₆亚烷基或C₂-C₆亚烯基。

在一些实施方案中，在式(HB-I)中，W是其中：

每个u独立地是1、2或3；并且

T是二价含氮5元或6元杂环。

在一些实施方案中，在式(HB-I)中，W是

其中：

每个u独立地是1、2或3；

Q是O；

每个Z独立地是NR₁₂；并且

R₁₂是H或C₁-C₃烷基。

在一些实施方案中，所述头部基团具有以下结构：

其中u和t中的每一者独立地是1或2。

在一些实施方案中，可电离脂质的头部基团具有式(HC-I)的结构：

其中

是环状或杂环部分；

Y是烷基、羟基、羟烷基、

A不存在，是-O-、-N(R⁷)-、-O-亚烷基-、-亚烷基-O-、-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-、-N(R⁷)C(O)N(R⁷)-、-S-或-S-S-；

X和Z中的每一者独立地不存在，是-O-、-C(O)-、-N(R⁷)-、-O-亚烷基-、-亚烷基-O-、

-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-或-S-；

每个R⁷独立地是H、烷基、烯基、环烷基、羟基、烷氧基、羟烷基、烷基氨基、烷基氨基烷基或氨基烷基；

t是0、1、2或3；

t1是0至10的整数；并且

在一些实施方案中，头部基团具有下式的结构

在一些实施方案中，在以上式中，

A不存在，是-O-、-N(R⁷)-、-OC(O)-或-C(O)O-；

X不存在，是O-或–C(O)-；并且

Z是–O-、–C(O)O-或–OC(O)-。

在一些实施方案中，头部基团具有下式的结构

其中t1是0、1、2或3。

在一些实施方案中，W是羟基、经取代的或未经取代的羟烷基，或以下部分之一：

其中

每个Q独立地不存在，是-O-、-C(O)-、-C(S)-、-C(O)O-、-(CH₂)_q-C(R⁷)₂-、-C(O)N(R⁷)-、-C(S)N(R⁷)-或-N(R⁷)；

R⁶独立地是H、烷基、羟基、羟烷基、烷氧基、-O-亚烷基-O-烷基、-O-亚烷基-N(R⁷)₂、氨基、烷基氨基、氨基烷基、硫醇、硫代烷基或N⁺(R⁷)₃–亚烷基-Q-；

每个R⁸独立地是H、烷基、羟烷基、氨基、氨基烷基、烷基氨基、硫醇或硫醇烷基、杂环基、杂芳基，或两个R⁸与氮原子一起可以形成环，所述环任选地被一个或多个烷基、羟基、羟烷基、烷氧基、烷基氨基烷基、烷基氨基、氨基烷基取代；

q是0、1、2、3、4或5；并且

p是0、1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，W是以下中的一者：

OH、

在一些实施方案中，可电离脂质由式

其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体表示，其中

R₁各自独立地是H、C₁-C₃烷基、OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁；R₁和R₂可以合在一起形成环；R₁₀和R₁₁各自独立地是H、C₁-C₃烷基，并且R₁₀和R₁₁可以合在一起形成杂环；

R₂各自独立地是H、C₁-C₃烷基、OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁；R₁和R₂可以合在一起形成环；R₁₀和R₁₁各自独立地是H、C₁-C₃烷基，并且R₁₀和R₁₁可以合在一起形成杂环；

m是1、2、3、4、5、6、7或8；

n是0、1、2、3或4；

r各自独立地是0、1、2、3、4、5、6、7或8；

R₃各自独立地是H或C₃-C₁₀烷基；

R₄各自独立地是H或C₃-C₁₀烷基；条件是R₃和R₄中的至少一者不是H；

Z不存在，是O、S或NR₁₂；其中R₁₂是C₁-C₇烷基；

每个X独立地是X'、条件是式中的至少一个X是并且

X'是可生物降解部分。

在一些实施方案中，每个X是在一些实施方案中，X'是

-OCO-、-COO-、-NR⁷CO-、-CONR⁷-、-C(O-R₁₃)-O-(缩醛)、-COO(CH₂)_s-、-CONH(CH₂)_s-或

-C(O-R₁₃)-O-(CH₂)_s-；其中R⁷是H或C₁-C₃烷基；并且R₁₃是C₃-C₁₀烷基。

在一些实施方案中，式中的至少一个X是其中R⁷是H或甲基。在一个实施方案中，每个X是在一个实施方案中，每个X是其中R⁷是H或甲基。

在一些实施方案中，m＝3。在一些实施方案中，n＝0或1。在一些实施方案中，每个RR₁和R₂是H。在一些实施方案中，Z不存在。

在一些实施方案中，Z是S。在一些实施方案中，Z是O。在一些实施方案中，Z是NH。

在一些实施方案中，r是3。在一些实施方案中，r是4。

在可电离脂质化合物组iv)中，包含至少一个头部基团(例如，式(HA-I)、(HA-III)、(HA-V)、(HA-VI)、(HB-I)和(HC-I)的头部基团)和式(TI)或(T1')的至少一个尾部基团(例如，式(TII)、(TIII)、TIV、TV、TII'或TIII'的尾部基团)的上述可电离脂质的更多实施方案可以在2023年8月31日提交的PCT申请号PCT/US23/31669中找到，其内容以引用的方式整体并入本文。此外，2023年8月31日提交的PCT申请号PCT/US23/31669的式(LA-I)-(LA-VII)、(LB-1)-(LB-VII)、(LC-IA)-(LC-IC)、(LC-IIA)-(LC-IIC)和(LC-IIIA)-(LC-IIIE)的所有可电离脂质都适合用作本公开中的可电离脂质，并且以引用的方式整体并入本文。

本文所公开的某些示例性可电离脂质化合物在下表IV中阐述。

表IV.示例性可电离脂质化合物。

其他可电离脂质

在经修饰的脂质组合物中，可将多于一种可电离脂质用于可电离脂质组分：来自组i)-iv)中式化合物的一种或多种可电离脂质可单独使用或与来自组i)-iv)中式化合物的不同可电离脂质组合使用。

在一些实施方案中，可电离脂质不包括1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5(Moderna)和98N12-5。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含选自由1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5、SM-102(脂质H)和ALC-315组成的组的可电离脂质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含由下式III表示的可电离脂质：

其中R是C₈-C₁₄烷基。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的脂质膜包含至少35％的式I脂质，例如至少40％45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％80％、85％、90％或大于90％的式I脂质，例如35％-40％40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的式I脂质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的脂质膜包含至少35％的式II脂质，例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％80％、85％、90％或大于90％的式II脂质，例如35％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的式II脂质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的脂质膜包含至少35％的式III脂质，例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％80％、85％、90％或大于90％的式III脂质，例如35％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的式III脂质。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含至少0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％80％、85％、90％或大于90％的可电离脂质，例如1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的可电离脂质，例如约25％-75％的可电离脂质(例如，约25％-75％的可电离脂质)，均以mol％计。

本文描述的可电离脂质可以包括被一个或多个(例如，1个、2、3、4、5个或6个)脂质尾部取代的本文描述的胺核心。在一些实施方案中，本文描述的可电离脂质包括至少3个脂质尾部。脂质尾部可以是C₈-C₁₈烃(例如，C₆-C₁₈烷基或C₆-C₁₈烷酰基)。胺核心可以在氮原子处被一个或多个脂质尾部取代(例如，与氮原子连接的一个氢原子可以被脂质尾部置换)。

在一些实施方案中，胺核心具有以下结构：

经修饰的脂质组合物还可以含有阳离子脂质。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2016/118725中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。

在某些实施方案中，经修饰的脂质组合物及其制备和使用方法包括具有以下化合物结构的脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2016/118724中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。

以及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括具有式14,25-双十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的脂质及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2013/063468和WO 2016/205691中所描述的脂质，它们中的每一个以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物及其制备和使用方法包括下式的脂质：

或其药学上可接受的盐，其中R^L的每个实例独立地是任选取代的C6-C40烯基。

以及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2015/184256中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物及其制备和使用方法包括下式的脂质：

或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地是O或S；每个Y独立地是O或S；每个m独立地是0至20；每个n独立地是1至6；每个R_A独立地是氢、任选取代的C1-50烷基、任选取代的C2-50烯基、任选取代的C2-50炔基、任选取代的C3-10碳环基、任选取代的3-14元杂环基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个RB独立地是氢、任选取代的C1-50烷基、任选取代的C2-50烯基、任选取代的C2-50炔基、任选取代的C3-10碳环基、任选取代的3-14元杂环基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的5-14元杂芳基或卤素。

在某些实施方案中，经修饰的脂质组合物及其制备和使用方法包括具有以下化合物结构的脂质“靶23”：

以及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2016/004202中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物及其制备和使用方法包括具有以下化合物结构的脂质：

或其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如美国临时专利申请序列号62/758,179中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。

或其药学上可接受的盐，其中每个R¹和R²独立地是H或C1-C6脂肪族；每个m独立地是具有1至4的值的整数；每个A独立地是共价键或亚芳基；每个L¹独立地是酯、硫酯、二硫化物或酸酐基团；每个L²独立地是C2-C10脂肪族；每个X¹独立地是H或OH；并且每个R³独立地是C6-C20脂肪族。

或其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如J.McClellan、M.C.King,Cell 2010,141,210-217以及Whitehead等人,NatureCommunications(2014)5:4277中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。

在某些实施方案中，经修饰的脂质组合物的脂质及其制备和使用方法包括具有以下化合物结构的脂质：

以及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2015/199952中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。

以及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2017/004143中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。

以及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2017/075531中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。

或其药学上可接受的盐，其中L¹或L²中的一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-；并且L¹或L²中的另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-或直接键；G¹和G²各自独立地是未经取代的C₁-C₁₂亚烷基或C₁-C₁₂亚烯基；G³是C₁-C₂₄亚烷基、C₁-C₂₄亚烯基、C₃-C₈环亚烷基、C₃-C₈环亚烯基；R^a是H或C₁-C₁₂烷基；R¹和R²各自独立地是C₆-C₂₄烷基或C₆-C₂₄烯基；R³是H、OR⁵、CN、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或-NR⁵ C(＝O)R⁴；R⁴是C₁-C₁₂烷基；R⁵是H或C₁-C₆烷基；并且x是0、1或2。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2017/117528中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物及其制备和使用方法包括具有以下化合物结构的脂质：

以及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2017/049245中所描述的脂质，其以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物的脂质及其制备和使用方法包括下式之一的化合物：

以及其药学上可接受的盐。对于这四个式中的任一个，R₄独立地选自-(CH₂)_nQ和-(CH₂)_nCHQR；Q选自由-OR、-OH、-O(CH₂)_nN(R)₂、-OC(O)R、-CX₃、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(H)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环组成的组；并且n是1、2或3。

以及其药学上可接受的盐。

用于经修饰的脂质组合物中的其他合适的脂质及其制备和使用方法包括如国际专利公开WO 2017/173054和WO 2015/095340中所描述的脂质，它们中的每一个以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，经修饰的脂质组合物及其制备和使用方法包括具有以下化合物结构的脂质：

以及其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，经修饰的脂质组合物及其制备和使用方法包括具有的化合物结构的脂质及其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，本文描述的经修饰的脂质组合物可以包含如WO2016118724、WO2016118725、WO2016187531、WO2017176974、WO2018078053、WO2019027999、WO2019036030、WO2019089828、WO2019099501、WO2020072605、WO2020081938、WO2020118041、WO2020146805或WO2020219876中所描述的可电离脂质，可如其中所描述的配制，或者可包含如其中所描述的组合物或被该组合物所包含，这些文献中的每一个以引用的方式整体并入本文。

其他脂质和其他药剂

外源脂质可以是细胞渗透剂，可以能够增加经修饰的脂质组合物向细胞的多肽递送，和/或可以能够增加多肽的装载(例如，装载效率或装载能力)。另外的示例性外源脂质包括固醇和聚乙二醇化脂质。

经修饰的脂质组合物可以包含其他组分(例如脂质，例如固醇，例如胆固醇；或小分子)以进一步改变经修饰的脂质组合物的功能和结构特征。例如，经修饰的脂质组合物还可以包含增加经修饰的脂质组合物的稳定性(例如，在室温下稳定至少一天，和/或在4℃下稳定至少一周)的稳定分子。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物还包含固醇，例如谷固醇、谷甾烷醇、β-谷固醇、7α-羟基胆固醇、孕烯醇酮、胆固醇(例如，绵羊胆固醇或从植物分离的胆固醇)、豆固醇、菜油固醇、岩藻固醇或任何固醇的类似物(例如，糖苷、酯或肽)。在一些实例中，在步骤(b)之前将外源固醇添加到制剂中，例如在步骤(b)之前与结构脂质混合。外源固醇可以以制备物中总脂质和固醇的例如1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或大于90％(w/w)的量添加。

在一些实施方案中，固醇是胆固醇或谷固醇。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或大于60％的固醇(例如，胆固醇或谷固醇)，例如1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％或50％-60％的固醇。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35％-50％的固醇(例如，胆固醇或谷固醇)，例如约36％、38.5％、42.5％或46.5％的固醇。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约20％-40％的固醇。

在一些实施方案中，相对于未用固醇修饰的经修饰的脂质组合物，已用固醇修饰的经修饰的脂质组合物具有改变的稳定性(例如，增加的稳定性)。在一些方面，相对于未用固醇修饰的经修饰的脂质组合物，已用固醇修饰的经修饰的脂质组合物与靶细的膜的融合速率更大。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含外源脂质和外源固醇。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物还包含聚乙二醇化脂质。聚乙二醇(PEG)长度可以在1kDa至10kDa之间变化；在一些方面，使用长度为2kDa的PEG。在一些实施方案中，PEG化脂质是C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或大于50％的聚乙二醇化脂质(例如，C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k)，例如0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.5％、1.5％-2.5％、2.5％-3.5％、3.5％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％或30％-50％的聚乙二醇化脂质，均以mol％计。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含约0.1％-10％的聚乙二醇化脂质(例如，C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k)，例如约1％-3％的聚乙二醇化脂质，例如约1.5％或约2.5％的聚乙二醇化脂质，均以mol％计。

在一些实施方案中，相对于未用聚乙二醇化脂质修饰的经修饰的脂质组合物，已用聚乙二醇化脂质修饰的经修饰的脂质组合物具有改变的稳定性(例如，增加的稳定性)。在一些实施方案中，相对于未用聚乙二醇化脂质修饰的经修饰的脂质组合物，已用聚乙二醇化脂质修饰的经修饰的脂质组合物具有改变的粒度。在一些实施方案中，已用聚乙二醇化脂质修饰的经修饰的脂质组合物比未用聚乙二醇化脂质修饰的经修饰的脂质组合物更不容易被吞噬。PEG化脂质的添加还可以影响GI肠道中的稳定性且增强通过粘液的颗粒迁移。PEG可以用作连接靶向部分的方法。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含可电离脂质(例如，C12-200或MC3)以及固醇(例如，胆固醇或谷固醇)和聚乙二醇化脂质(例如，C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k)中的一种或两种。在实施方案中，经修饰的脂质组合物包含约5％-50％的天然来源的脂质(例如，约10％-20％的天然来源的脂质，例如约10％、12.5％、16％或20％的天然来源的脂质)；约30％-75％的可电离脂质(例如，约35％或约50％的可电离脂质)；约35％-50％的固醇(例如，约36％、38.5％、42.5％或46.5％的固醇)；和约0.1％-10％的聚乙二醇化脂质(例如，约1％-3％的聚乙二醇化脂质，例如约1.5％或约2.5％的聚乙二醇化脂质)，均以mol％计。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约5％-60％的天然来源的脂质(例如，约10％-20％、20％-30％、30％-40％,40％-50％或50％-60％的天然来源的脂质，例如约10％、12.5％、16％、20％、30％、40％、50％或60％的天然来源的脂质)；约25％-75％的可电离脂质(例如，约35％或约50％的可电离脂质)；约10％-50％的固醇(例如，约10％、12.5％、14％、16％、18％、20％、36％、38.5％、42.5％或46.5％的固醇)；和约0.1％-10％的聚乙二醇化脂质(例如，约0.5％-5％的聚乙二醇化脂质，例如约1％-3％的聚乙二醇化脂质，或约1.5％或约2.5％的聚乙二醇化脂质)。

在一些实施方案中，可电离脂质、结构脂质、固醇和聚乙二醇化脂质分别占经修饰的脂质组合物中脂质的约25％-75％、约20％-60％、约10％-45％和约0.5％-5％。

在一些实施方案中，可电离脂质、结构脂质、固醇和聚乙二醇化脂质分别占经修饰的脂质组合物中脂质的约30％-75％、约20％-50％、约10％-45％和约1％-5％。

在一些实施方案中，可电离脂质、结构脂质、固醇和聚乙二醇化脂质分别占经修饰的脂质组合物中脂质的约35％-75％、约20％-50％、约10％-45％和约1％-5％。

在一些实施方案中，可电离脂质、结构脂质、固醇和聚乙二醇化脂质以约35:50:12.5:2.5的摩尔比配制。

在一些实施方案中，可电离脂质、结构脂质、固醇和聚乙二醇化脂质以约35:50:11.5:3.5的摩尔比配制。

在一些实施方案中，可电离脂质、结构脂质、固醇和聚乙二醇化脂质以约35:20:42.5:2.5的摩尔比配制。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为22.5:75:0:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为35:30:32.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为35:16:46.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物可以包含摩尔比为35:(3+13):46.5:2.5的可电离脂质:(结构脂质1+结构脂质2):固醇:PEG-脂质(结构脂质1可以是本文描述的结构脂质；结构脂质2可以是本文描述的不同于结构脂质1的结构脂质，或者结构脂质2可以是适合于制备脂质纳米颗粒组合物的任何脂质)。

在一些实施方案中，已用可电离脂质(和/或阳离子脂质)和固醇和/或聚乙二醇化脂质修饰的经修饰的脂质组合物比未用可电离脂质(和/或阳离子脂质)和固醇和/或聚乙二醇化脂质修饰的经修饰的脂质组合物更有效地包封带负电荷的货物(例如，核酸)。经修饰的脂质组合物对于货物(例如，异源功能剂，诸如核酸，例如，RNA或DNA)可具有至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％,99％或大于99％的包封效率，例如其可具有5％-30％％、30％-50％、50％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、或95％-100％的包封效率。

对经修饰的脂质组合物的细胞摄取可以通过本领域已知的多种方法来测量。例如，经修饰的脂质组合物或其组分可以用标志物(例如，荧光标志物)标记，该标志物可以在分离的细胞中检测以确认摄取。

在一些实施方案中，本文提供的经修饰的脂质组合物包含两种或更多种不同的结构组分，例如源自两种或更多种不同天然来源的结构组分。在一些实施方案中，本文提供的经修饰的脂质组合物包含两种或更多种不同类型的修饰，例如不同类型和/或比率的可电离脂质、固醇和/或聚乙二醇化脂质。

在一些情况下，溶解脂质膜的有机溶剂是二甲基甲酰胺:甲醇(DMF:MeOH)。可替代地，有机溶剂或溶剂组合可以是例如乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1-丁醇、二甲基亚砜、乙腈:乙醇、乙腈:甲醇、丙酮:甲醇、甲基叔丁基醚:丙醇、四氢呋喃:甲醇、二甲基亚砜:甲醇或二甲基甲酰胺:甲醇。

水相可以是任何合适的溶液，例如柠檬酸盐缓冲液(例如，pH为约3.2的柠檬酸盐缓冲液)、水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。水相还可以包含异源功能剂(例如，农业剂或治疗剂)或小分子。

脂质溶液和水相可以以任何合适的比率在微流体装置中混合。在一些实例中，水相和脂质溶液以3:1体积比混合。

经修饰的脂质组合物可以任选地包括另外的药剂，例如细胞渗透剂、治疗剂、多核苷酸、多肽或小分子。经修饰的脂质组合物可以以多种方式携带或与另外的药剂缔合以使得能够将异源功能剂递送至靶细胞，例如通过包封异源功能剂、将异源功能剂掺入脂质双层结构中或将异源功能剂与脂质双层结构的表面缔合(例如，通过缀合)。异源功能剂可以在体内或体外掺入经修饰的脂质组合物中(例如，在组织培养中、在细胞培养中或合成掺入)。

ζ电位

包含可电离脂质(例如，C12-200或MC3)和任选的阳离子脂质(例如，DC-胆固醇或DOTAP)的经修饰的脂质组合物可具有例如在不存在货物时大于-30mV、在不存在货物时大于-20mV、大于-5mV、大于0mV或约30mV的ζ电位。在一些实例中，经修饰的脂质组合物具有负ζ电位，例如在不存在货物时小于0mV、小于-10mV、小于-20mV、小于-30mV、小于-40mV或小于-50mV的ζ电位。在一些实例中，经修饰的脂质组合物具有正ζ电位，例如在不存在货物时大于0mV、大于10mV、大于20mV、大于30mV、大于40mV或大于50mV的ζ电位。在一些实例中，经修饰的脂质组合物具有约0的ζ电位。

经修饰的脂质组合物的ζ电位可以使用本领域已知的任何方法测量。ζ电位通常间接测量，例如使用理论模型，由使用本领域中已知的方法和技术获得的数据(例如，电泳迁移率或动态电泳迁移率)计算。电泳迁移率通常使用微电泳、电泳光散射或可调电阻脉冲传感来测量。电泳光散射是基于动态光散射。通常，ζ电位可从动态光散射(DLS)测量结果，也称为光子相关光谱或准弹性光散射获得。

自然EV标志物

经修饰的脂质组合物中的结构组分(例如，结构脂质)及其制备和使用方法可具有一系列标志物，这些标志物标识所生产的结构组分。在一些实施方案中，结构组分是天然的。如本文所用，术语“天然EV标志物”是指与天然来源天然相关并掺入天然E之中或之上的组分，诸如天然蛋白质、天然核酸、天然小分子、天然脂质或它们的组合。

药剂的装载

经修饰的脂质组合物可以包含异源功能剂，例如细胞渗透剂和/或异源农业剂(例如，农药剂、施肥剂、除草剂、植物修饰剂)、异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或驱虫剂))，诸如本文描述的那些，

经修饰的脂质组合物可以通过多种方式携带或缔合此类药剂，以使得能够将药剂递送至目标生物体(例如，目标动物、植物、细菌或真菌)，例如通过包封药剂、将药剂掺入脂质双层结构中或将药剂与经修饰的脂质组合物的脂质双层结构的表面缔合(例如，通过缀合)。在一些情况下，异源功能剂(例如，细胞渗透剂)包括在由经修饰的脂质组合物调配物制成的调配物中，如本文所描述的。

可以通过本领域已知的允许经修饰的脂质组合物与药剂之间直接或间接缔合的任何方法将异源功能剂掺入或装载到经修饰的脂质组合物中或上。可以通过体内或体外(例如，在组织培养中或在细胞培养中)或体内和体外方法将药剂掺入经修饰的脂质组合物中。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物是在体外装载的。可以使用但不限于物理、化学和/或生物方法(例如，在组织培养中或在细胞培养中)将异源功能剂装载到经修饰的脂质组合物上或中(例如，可以被经修饰的脂质组合物包封)。例如，可以通过电穿孔、超声处理、被动扩散、搅拌、脂质提取或挤出中的一种或多种将药剂引入到经修饰的脂质组合物中。在一些情况下，使用微流体装置将药剂掺入到经修饰的脂质组合物中，例如，使用其中脂质以有机相提供、药剂以水相提供并且有机相和水相在微流体装置中组合以产生包含异源功能剂的经修饰的脂质组合物的方法。可以使用多种方法评估装载的经修饰的脂质组合物以确认装载的药剂的存在或水平，诸如HPLC(例如，评估小分子)、免疫印迹(例如，评估蛋白质)；和/或定量PCR(例如，评估核苷酸)。然而，本领域技术人员应当理解，将所关注异源功能剂装载到经修饰的脂质组合物中不限于上述方法。

在一些情况下，异源功能剂可以缀合至经修饰的脂质组合物，其中该药剂间接或直接连接或接合至经修饰的脂质组合物。例如，一种或多种药剂可以化学连接至经修饰的脂质组合物，使得一种或多种药剂直接连接(例如，通过共价键或离子键)至经修饰的脂质组合物的脂质双层。在一些情况下，多种药剂与经修饰的脂质组合物的缀合可以通过首先在合适的溶剂中将一种或多种药剂与合适的交联剂(例如，N-乙基碳二亚胺(“EDC”)，其通常用作羧基活化剂用于与伯胺进行酰胺键合并且还与磷酸基团反应)混合来实现。在足以使药剂附着于交联剂的温育期之后，然后可以将交联剂/药剂混合物与经修饰的脂质组合物组合，并且在另一个温育期之后，进行蔗糖梯度(例如，以及8％、30％、45％和60％蔗糖梯度)以将游离药剂和游离的经修饰的脂质组合物与缀合至经修饰的脂质组合物的药剂分离。作为将混合物与蔗糖梯度组合和伴随的离心步骤的一部分，然后将缀合至药剂的经修饰的脂质组合物视为蔗糖梯度中的条带，使得可以收集、洗涤所缀合的经修饰的脂质组合物并将其溶解在合适的溶液中以供使用。

在一些情况下，在递送经修饰的脂质组合物之前和之后，经修饰的脂质组合物与异源功能剂稳定地缔合。在其他情况下，经修饰的脂质组合物与药剂缔合，使得在递送经修饰的脂质组合物之后，药剂与经修饰的脂质组合物解离。

根据具体的药剂或用途，可以装载经修饰的脂质组合物或者经修饰的脂质组合物可以与各种浓度的异源功能剂一起配制。例如，在一些情况下，经修饰的脂质组合物被装载或配制为包含约0.001、0.01、0.1、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90或95(或约0.001至95之间的任何范围)或更多重量％的药剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物被装载或配制为包含约95、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.0、0.1、0.01、0.001(或约95至0.001之间的任何范围)或更少重量％的药剂。例如，经修饰的脂质组合物可以包含约0.001重量％至约0.01重量％、约0.01重量％至约0.1重量％、约0.1重量％至约1重量％、约1重量％至约5重量％、或约5重量％至约10重量％、约10重量％至约20重量％的药剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物可以装载或配制有约1、5、10、50、100、200或500、1,000、2,000(或约1至2,000之间的任何范围)或更多μg/ml的药剂。经修饰的脂质组合物可以装载或配制有约2,000、1,000、500、200、100、50、10、5、1(或约2,000至1之间的任何范围)或更少μg/ml的药剂。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物被装载或配制为包含至少0.001重量％、至少0.01重量％、至少0.1重量％、至少1.0重量％、至少2重量％、至少3重量％、至少4重量％、至少5重量％、至少6重量％、至少7重量％、至少8重量％、至少9重量％、至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％、至少60重量％、至少70重量％、至少80重量％、至少90重量％或至少95重量％的异源功能剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物可以装载或配制有至少1μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少200μg/ml、至少500μg/ml、至少1,000μg/ml、至少2,000μg/ml的药剂。

在一些情况下，通过将经修饰的脂质组合物悬浮在包含药剂或由其组成的溶液中(例如，通过剧烈混合)，将经修饰的脂质组合物与异源功能剂一起配制。药剂(例如，细胞渗透剂，例如，核酸、酶、去污剂、离子液体、氟离子液体或两性离子液体或可电离脂质)可以占溶液的例如小于1％或至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

调配物

农业调配物

本文描述的经修饰的脂质组合物可以配制成农业组合物。

为了便于施用、处理、运输、储存和有效活性，经修饰的脂质组合物可以与其他物质一起配制。经修饰的脂质组合物可以配制成例如饵剂、浓缩乳液、粉剂、可乳化浓缩物、熏蒸剂、凝胶、颗粒、微胶囊、种子处理剂、悬浮浓缩物、悬浮乳液、片剂、水溶性液体、水分散性颗粒或干流动剂、可湿性粉末和超低体积溶液。关于调配物类型的更多信息，参见“Catalogue of Pesticide Formulation Types and International Coding System”Technical Monographn°2,第5版,CropLife International(2002)。

经修饰的脂质组合物可以以由此类药剂的浓缩调配物制备的水性悬浮液或乳液形式施用。此类水溶性、水悬浮性或可乳化调配物是固体(通常称为可湿性粉末或水分散性颗粒)或液体(通常称为可乳化浓缩物或水性悬浮液)。可湿性粉末(其可被压制成水分散性颗粒)包含经修饰的脂质组合物、载剂和表面活性剂的紧密混合物。载剂通常选自凹凸棒石粘土、蒙脱石粘土、硅藻土或纯化硅酸盐。有效的表面活性剂(占可湿性粉末的约0.5％至约10％)存在于磺化木质素、缩合萘磺酸盐、萘磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐和非离子表面活性剂诸如烷基酚的环氧乙烷加合物中。

可乳化浓缩物可以包含合适浓度的经修饰的脂质组合物，诸如约50至约500克/升溶解在载剂中的液体，该载剂是水混溶性溶剂或水不混溶性有机溶剂和乳化剂的混合物。有用的有机溶剂包括芳烃，特别是二甲苯和石油馏分，特别是石油的高沸点萘和烯烃部分，诸如重芳烃石脑油。也可以使用其他有机溶剂，诸如萜烯溶剂，包括松香衍生物、脂族酮(诸如环己酮)和复合醇(诸如2-乙氧基乙醇)。用于可乳化浓缩物的合适乳化剂选自常规阴离子和非离子表面活性剂。

水性悬浮液包含以约5重量％至约50重量％范围内的浓度分散在水性载剂中的水不溶性经修饰的脂质组合物的悬浮液。悬浮液通过精细研磨组合物并将其剧烈混合到由水和表面活性剂组成的载剂中来制备。也可以添加诸如无机盐和合成或天然树胶的成分，以增加水性载剂的密度和粘度。

经修饰的脂质组合物也可以作为颗粒组合物施用，其特别适用于施用至土壤。颗粒组合物通常含有约0.5重量％至约10重量％的经修饰的脂质组合物，该经修饰的脂质组合分散在包含粘土或类似物质的载剂中。此类组合物通常通过将调配物溶解在合适的溶剂中并将其施用于已预先形成为合适的粒度(在约0.5至约3mm的范围内)的粒状载剂来制备。此类组合物也可以通过制备载剂和化合物的面团或糊状物并粉碎和干燥以获得所需的颗粒粒度来配制。

含有经修饰的脂质组合物的粉剂通过将粉末形式的经修饰的脂质组合物与合适的粉状农业载剂(诸如高岭土、磨碎的火山岩等)紧密混合来制备。粉剂可适当地包含约1％至约10％的包。、它们可以作为拌种施用，也可以通过吹尘机进行叶面施用。

同样实用的是以溶液的形式在适当的有机溶剂(通常是石油，诸如在农业化学中广泛使用的喷雾油)中施用本调配物。

经修饰的脂质组合物也可以气溶胶组合物的形式施用。在此类组合物中，包被溶解或分散在载剂中，该载剂是产生压力的推进剂混合物。气溶胶组合物被包装在容器中，混合物通过雾化阀从容器中喷出。

另一个实施方案是水包油乳液，其中该乳液包含油性球珠，这些油性球珠各自具有层状液晶涂层并分散在水相中，其中每个油性球珠包含至少一种农业活性化合物，并且单独地涂覆有单层或寡层，该单层或寡层包含：(1)至少一种非离子亲脂性表面活性剂，(2)至少一种非离子亲水性表面活性剂和(3)至少一种离子表面活性剂，其中球珠具有小于800纳米的平均粒径。2007年2月1日公开的美国专利公开20070027034中公开了关于该实施方案的更多信息。为了便于使用，该实施方案将被称为“OIWE”。

另外，通常，当上文公开的分子用于调配物中时，这种调配物还可以含有其他组分。这些组分包括但不限于(这是一个非详尽且非互斥的列表)润湿剂、扩散剂、粘合剂、渗透剂、缓冲剂、螯合剂、减漂剂、相容剂、消泡剂、清洁剂和乳化剂。随即描述了几种组分。

润湿剂是这样一种物质，当添加到液体中时，通过降低液体与其扩散的表面之间的界面张力来增加液体的扩散或渗透能力。润湿剂在农用化学调配物中用于两个主要功能：在加工和制造过程中增加粉末在水中的润湿速率，以制备用于可溶性液体的浓缩物或悬浮浓缩物；以及在产品与水在喷雾罐中混合期间，减少可湿性粉末的润湿时间并改善水向水分散性颗粒的渗透。用于可湿性粉末、悬浮浓缩物和水分散性颗粒调配物中的润湿剂的实例是：十二烷基硫酸钠；二辛基磺基琥珀酸钠；烷基酚乙氧基化物；和脂族醇乙氧基化物。

分散剂是吸附在颗粒表面上并有助于保持颗粒的分散状态并防止它们再聚集的物质。将分散剂添加到农用化学调配物中以促进制造期间的分散和悬浮，并确保颗粒在喷雾罐中再分散到水中。它们广泛用于可湿性粉末、悬浮浓缩物和水分散性颗粒。用作分散剂的表面活性剂具有强烈吸附到颗粒表面上并为颗粒再聚集提供带电或空间屏障的能力。最常用的表面活性剂是阴离子、非离子或两种类型的混合物。对于可湿性粉末调配物，最常见的分散剂是木质素磺酸钠。对于悬浮浓缩物，使用聚电解质(诸如萘磺酸钠甲醛缩合物)可以获得非常好的吸附和稳定效果。也使用三苯乙烯基苯酚乙氧基化磷酸酯。非离子表面活性剂诸如烷基芳基环氧乙烷缩合物和EO-PO嵌段共聚物有时与阴离子化合物组合作为悬浮浓缩物的分散剂。近年来，已经开发了新型的非常高分子量的聚合物表面活性剂作为分散剂。这些具有非常长的疏水性“主链”和形成“梳状”表面活性剂的“齿”的大量环氧乙烷链。这些高分子量聚合物可以使悬浮浓缩物具有非常好的长期稳定性，因为疏水主链在颗粒表面上具有许多锚定点。农用化学调配物中使用的分散剂的实例是：木质素磺酸钠；萘磺酸钠甲醛缩合物；三苯乙烯基苯酚乙氧基化磷酸酯；脂族醇乙氧基化物；烷基乙氧基化物；EO-PO(环氧乙烷-环氧丙烷)嵌段共聚物；和接枝共聚物。

乳化剂是使一种液相的液滴在另一种液相中的悬浮稳定的物质。如果没有乳化剂，两种液体将分离成两种不混溶的液相。最常用的乳化剂共混物含有具有十二个或更多环氧乙烷单元的烷基酚或脂族醇和十二烷基苯磺酸的油溶性钙盐。亲水-亲脂平衡(“HLB”)值范围为8至18通常将提供良好稳定的乳液。有时可以通过添加少量EO-PO嵌段共聚物表面活性剂来提高乳液稳定性。

增溶剂是在高于临界胶束浓度的浓度下在水中形成胶束的表面活性剂。然后，胶束能够溶解或增溶胶束疏水部分内的水不溶性物质。通常用于增溶的表面活性剂的类型有非离子表面活性剂、脱水山梨醇单油酸酯、脱水山梨醇单油酸酯乙氧基化物和油酸甲酯。

表面活性剂有时单独使用或与其他添加剂(诸如矿物油或植物油)一起用作喷雾罐混合物的佐剂，以改善经修饰的脂质组合物对靶标的生物学性能。用于生物增强的表面活性剂的类型通常取决于经修饰的脂质组合物的性质和作用模式。然而，它们通常是非离子表面活性剂，诸如：烷基乙氧基化物；线性脂肪醇乙氧基化物；脂族胺乙氧基化物。

农用调配物中的载剂或稀释剂是添加到经修饰的脂质组合物中以产生所需强度的产物的材料。载剂通常是具有高吸收能力的材料，而稀释剂通常是具有低吸收能力的材料。载剂和稀释剂用于配制粉剂、可湿性粉末、颗粒和水分散性颗粒。

有机溶剂主要用于配制可乳化浓缩物、水包油乳液、悬浮乳液和超低体积调配物，并且在较小程度上用于颗粒调配物。有时使用溶剂的混合物。第一类主要溶剂是脂族石蜡油，诸如煤油或精制石蜡。第二类主要溶剂(也是最常见的)包括芳香族溶剂诸如二甲苯和较高分子量级分的C9和C10芳香族溶剂。当调配物乳化到水中时，氯化烃可用作助溶剂以防止经修饰的脂质组合物结晶。有时使用醇作为助溶剂来增加溶剂溶解力。其他溶剂可以包括植物油、种子油以及植物油和种子油的酯。

增稠剂或胶凝剂主要用于配制悬浮浓缩物、乳液和悬浮乳液，以改变液体的流变性或流动性，并防止分散颗粒或液滴的分离和沉降。增稠剂、胶凝剂和防沉降剂通常分为两类，即水不溶性微粒和水溶性聚合物。可以使用粘土和二氧化硅来生产悬浮浓缩调配物。这些类型的材料的实例包括但不限于蒙脱石、膨润土、硅酸镁铝和凹凸棒石。水溶性多糖已被用作增稠-胶凝剂多年。最常用的多糖类型是种子和海藻的天然提取物或纤维素的合成衍生物。这些类型的材料的实例包括但不限于瓜尔胶；刺槐豆胶；角叉菜胶；藻酸盐；甲基纤维素；羧甲基纤维素钠(SCMC)；羟乙基纤维素(HEC)。其他类型的防沉降剂基于经修饰的淀粉、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇和聚环氧乙烷。另一种良好的防沉降剂是黄原胶。

微生物会导致配制产品腐败。因此，使用防腐剂来消除或减少它们的影响。此类试剂的实例包括但不限于：丙酸及其钠盐；山梨酸及其钠盐或钾盐；苯甲酸及其钠盐；对羟基苯甲酸钠盐；对羟基苯甲酸甲酯；和1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)。

表面活性剂的存在通常导致水基调配物在通过喷雾罐的生产和应用中的混合操作期间起泡。为了减少起泡倾向，通常在生产阶段或在装瓶前添加消泡剂。通常，有两种类型的消泡剂，即有机硅和非有机硅。有机硅通常是二甲基聚硅氧烷的水性乳液，而非有机硅消泡剂是水不溶性油，诸如辛醇和壬醇，或二氧化硅。在这两种情况下，消泡剂的功能都是从空气-水界面置换表面活性剂。

“绿色”试剂(例如，佐剂、表面活性剂、溶剂)可以减少作物保护调配物的总体环境足迹。绿色试剂是可生物降解的，并且通常源自天然和/或可持续来源，例如植物和动物来源。具体实例是：植物油、种子油以及它们的酯，以及烷氧基化烷基多葡糖苷。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物可以被冷冻干燥或冻干。参见美国专利号4,311,712。经修饰的脂质组合物随后可以在与水或另一种液体接触时重建。可以将其他组分添加到冻干或重建的经修饰的脂质组合物中，例如其他异源功能剂、农业上可接受的载剂或根据本文描述调配物的其他材料。

组合物的其他任选特征包括保护经修饰的脂质组合物免受UV和/或酸性条件影响的载剂或递送媒介物。在一些情况下，递送媒介物含有pH缓冲液。在一些情况下，组合物被配制为具有在约4.5至约9.0范围内的pH，包括例如约5.0至约8.0、约6.5至约7.5或约6.5至约7.0中任一者的pH范围。

关于农业调配物的更多信息，参见由D.A.Knowles编辑的“Chemistry andTechnology of Agrochemical Formulations”，版权(1998)归Kluwer AcademicPublishers所有。还参见A.S.Perry、I.Yamamoto、I.Ishaaya和R.Perry的“Insecticidesin Agriculture and Environment—Retrospects and Prospects”，版权(1998)归Springer-Verlag所有。

药物调配物

将经修饰的脂质组合物配制成药物组合物(即，经修饰的脂质组合物组合物)，例如用于施用于动物(例如，人)。药物组合物可以与药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂一起施用于动物(例如，人)。取决于施用模式和剂量，本文描述的方法的药物组合物将被调配成合适的药物组合物以允许容易递送。单剂量可以根据需要呈单位剂型。

经修饰的脂质组合物可以被配制用于例如口服施用、静脉内施用(例如，注射或输注)、肌内或皮下施用于动物。对于可注射调配物，本领域已知各种有效的药物载剂(参见例如，The Science and Practice of Pharmacy,第22版,(2012)和ASHP Handbook onInjectable Drugs,第18版,(2014))。

合适的药学上可接受的载剂和赋形剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性。可接受的载剂和赋形剂可以包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES和TAE；抗氧化剂，如抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂，如氯化六烃季铵、十八基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚和苯扎氯铵；蛋白质，如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖和免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸；以及碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和山梨糖醇。经修饰的脂质组合物可以根据常规药物实践来配制。调配物中化合物的浓度将根据多种因素而变化，包括待施用的活性剂(例如，经修饰的脂质组合物和核酸)的剂量和施用途径。

为了口服施用于动物，可以将经修饰的脂质组合物以口服调配物的形式制备。用于口服使用的调配物可以包括含有在具有无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物中的活性成分的片剂、囊片、胶囊、糖浆或口服液体剂型。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；粒化剂和崩解剂(例如包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、海藻酸盐或海藻酸)；粘合剂(例如蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶凝化淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和防粘剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。用于口服使用的调配物还可以作为可咀嚼片剂、非可咀嚼片剂、囊片、胶囊(例如，作为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合)以单位剂型提供。本文所公开的组合物还可以包括速释、延长释放或延迟释放调配物。

为了肠胃外施用于动物，可以将经修饰的脂质组合物配制为液体溶液或悬浮液的形式，并通过肠胃外途径(例如，皮下、静脉内或肌内)施用。药物组合物可以被调配用于注射或输注。用于肠胃外施用的药物组合物可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物来调配。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水或细胞培养基(例如，杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)、α改良伊格尔培养基(α-MEM)和F-12培养基)。调配方法在本领域中是已知的，参见例如Gibson(编辑)Pharmaceutical Preformulation and Formulation(第2版)Taylor&Francis Group,CRCPress(2009)。

异源功能剂

经修饰的脂质组合物还可以包含异源功能剂，诸如异源功能剂(例如，异源农业剂(例如，农药剂、施肥剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或驱虫剂))。例如，经修饰的脂质组合物可以包封异源功能剂。可替代地，异源功能剂可以嵌入在经修饰的脂质组合物的表面上或缀合至经修饰的脂质组合物的表面。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的异源功能剂。异源功能剂可以在制造过程中的任何步骤添加，以有效地将该药剂引入到经修饰的脂质组合物中。

在某些情况下，可以修饰异源功能剂(例如，异源农业剂(例如，农药剂、施肥剂、除草剂、植物修饰剂、异源核酸、异源多肽或异源小分子)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或驱虫剂))。例如，修饰可以是化学修饰，例如缀合至标志物(例如，荧光标志物或放射性标志物)。在其他实例中，修饰可以包括缀合或可操作连接至增强药剂的稳定性、递送、靶向、生物利用度或半衰期的部分(例如，脂质、聚糖、聚合物(例如，PEG)或阳离子部分)。

异源功能剂的实例概述如下。

异源农业剂

经修饰的脂质组合物可以包含异源农业剂(例如，影响植物或与植物相关的生物体并且可以装载到经修饰的脂质组合物中的药剂)，诸如农药剂、除草剂、施肥剂或植物修饰剂。

例如，在一些情况下，经修饰的脂质组合物可以包含农药剂。农药剂可以是抗真菌剂、抗细菌剂、杀虫剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀病毒剂或它们的组合。农药剂可以是化学药剂，诸如本领域所熟知的那些。可替代地或另外地，农药剂可以是肽、多肽、核酸、多核苷酸或小分子。农药剂可以是可以降低多种植物害虫的适应性的药剂，或者可以是针对一种或多种特定目标植物害虫(例如，特定种类或属的植物害虫)的药剂。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物可以包含一种或多种异源施肥剂。异源施肥剂的实例包括植物营养素或植物生长调节剂，诸如本领域所熟知的那些。可替代地或另外地，施肥剂可以是可以提高植物共生体适应性的肽、多肽、核酸或多核苷酸。施肥剂可以是可以提高多种植物或植物共生体的适应性的药剂，或者可以是针对一种或多种特定目标植物或植物共生体(例如，特定种类或属的植物或植物共生体)的药剂。

在其他情况下，经修饰的脂质组合物可以包含一种或多种异源植物修饰剂。在一些情况下，植物修饰剂可以包括肽或核酸。

抗细菌剂

本文描述的经修饰的脂质组合物还可以包含抗细菌剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的抗细菌剂。例如，抗细菌剂可以降低天然植物害虫(例如，天然植物病原体)的适应性(例如，减少天然植物害虫的生长或杀死天然植物害虫)。可以将包含抗生素的经修饰的脂质组合物与目标害虫或被其侵染的植物接触，接触量和时间足以：(a)达到目标害虫内部或上的抗生素浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)降低目标害虫的适应性。抗细菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。

如本文所用，术语“抗细菌剂”是指杀死或抑制细菌(诸如植物病原菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或传播的材料，并且包括杀菌剂(例如，消毒剂化合物、防腐剂化合物或抗生素)或抑菌剂(例如，化合物或抗生素)。杀菌抗生素杀死细菌，而抑菌抗生素只是减缓它们的生长或繁殖。

杀菌剂可以包括消毒剂、防腐剂或抗生素。最常用的消毒剂可以包括：活性氯(即，次氯酸盐(例如，次氯酸钠)、氯胺、二氯异氰尿酸酯和三氯异氰尿酸酯、湿氯、二氧化氯等)、活性氧(过氧化物，诸如过乙酸、过硫酸钾、过硼酸钠、过碳酸钠和过水合脲)、碘(碘聚维酮(聚维酮碘(povidone-iodine)、聚维酮碘(Betadine))、卢戈氏溶液、碘酊、碘化非离子表面活性剂)、浓醇(主要是乙醇、1-丙醇(也称为正丙醇和2-丙醇，称为异丙醇)以及它们的混合物；此外，使用2-苯氧乙醇以及1-苯氧丙醇和2-苯氧丙醇)、酚类物质(诸如苯酚(也称为石炭酸)、甲酚(与液体钾皂组合称为来苏尔)、卤代(氯化、溴代)酚，诸如六氯酚、三氯生、三氯酚、三溴酚、五氯酚、二溴酚以及它们的盐)、阳离子表面活性剂(诸如一些季铵阳离子(诸如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵或氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、十六烷基吡啶氯化铵、苄索氯铵)等)、非季铵盐化合物(诸如氯己定、葡糖鱼精蛋白、奥替尼啶二盐酸盐等)、强氧化剂(诸如臭氧和高锰酸盐溶液)；重金属及其盐(诸如胶体银、硝酸银、氯化汞、苯基汞盐、硫酸铜、氧化铜-氯化物、氢氧化铜、辛酸铜、氯氧硫酸铜、硫酸铜、五水硫酸铜等)。重金属及其盐是毒性最大、对环境最有害的杀菌剂，因此，它们的使用受到强烈禁止或取消；此外，适当浓缩的强酸(磷酸、硝酸、硫酸、氨基硫酸、甲苯磺酸)和碱(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙)的使用也受到强烈禁止或取消。

作为防腐剂(即，可用于人或动物体、皮肤、粘膜、伤口等的杀菌剂)，在适当的条件(主要是浓度、pH、温度和对人/动物的毒性)下，可以使用少量上述消毒剂。其中，重要的是：适当稀释的氯制剂(即，达奎氏溶液、0.5％次氯酸钠或次氯酸钾溶液(pH调节至pH 7-8)，或0.5％-1％苯磺氯酰胺钠(氯胺B)溶液)，一些碘制剂，诸如各种盖仑制剂(软膏、溶液、创可贴)中的碘聚维酮，过去还有卢戈氏溶液，过氧化物如过水合脲溶液和pH缓冲的0.1％-0.25％过乙酸溶液，含或不含防腐添加剂的醇，主要用于皮肤消毒，弱有机酸，诸如山梨酸、苯甲酸、乳酸和水杨酸，一些酚类化合物，诸如六氯酚、三氯生和二溴，以及阳离子活性化合物，诸如0.05％-0.5％苯扎氯铵、0.5％-4％氯己定、0.1％-2％奥替尼定溶液。

经修饰的脂质组合物可以包含抗生素。可以使用本领域已知的任何抗生素。抗生素通常根据其作用机制、化学结构或活性范围进行分类。

本文描述的抗生素可以针对任何天然功能或生长过程，并且可以是抑菌的(例如，减缓或防止天然生长)或杀菌的(例如，杀死细菌)。在一些情况下，抗生素是杀菌抗生素。在一些情况下，杀菌抗生素是针对天然细胞壁的抗生素(例如，青霉素和头孢菌素)；针对细胞膜的抗生素(例如，多粘菌素)；或抑制必需天然酶的抗生素(例如，利福霉素、利帕霉素(lipiarmycin)、喹诺酮类和磺胺类)。在一些情况下，杀菌抗生素是氨基糖苷类(例如，春雷霉素)。在一些情况下，抗生素是抑菌抗生素。在一些情况下，抑菌抗生素针对蛋白质合成(例如，大环内酯类、林可酰胺类和四环素类)。可用于本文的其他类别的抗生素包括环状脂肽(诸如达托霉素)、甘氨酰环素(诸如替加环素)、噁唑烷酮(诸如利奈唑胺)或利帕霉素(诸如非达霉素)。抗生素的实例包括利福平、环丙沙星、多西环素、氨苄青霉素和多粘菌素B。本文描述的抗生素可以具有任何水平的靶标特异性(例如，窄谱或广谱)。在一些情况下，抗生素是窄谱抗生素，因此针对特定类型的细菌，诸如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。可替代地，抗生素可以是针对多种细菌的广谱抗生素。

抗生素的其他非限制性实例见于WO 2021/041301的表1中，该文献以引用的方式整体并入本文。本领域技术人员将理解，组合物中每种抗生素的合适浓度取决于诸如抗生素的功效、稳定性、不同抗生素的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

抗真菌剂

经修饰的脂质组合物还可以包含抗真菌剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的抗真菌剂。例如，抗真菌剂可以降低真菌植物害虫的适应性(例如，减少真菌植物害虫的生长或杀死真菌植物害虫)。可以将包含抗真菌剂的经修饰的脂质组合物与目标真菌害虫或被其侵染的植物接触，接触量和时间足以：(a)达到目标真菌内部或上的抗生素浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)降低目标真菌的适应性。抗真菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。

如本文所用，术语“杀真菌剂”或“抗真菌剂”是指杀死或抑制真菌(诸如植物病原真菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或传播的物质。许多不同类型的抗真菌剂已经实现商业化生产。抗真菌剂的非限制性实例包括：嘧菌酯、代森锰锌、丙硫菌唑、灭菌丹、戊唑醇、苯醚甲环唑、克菌丹、乙嘧酚磺酸酯或三乙磷酸铝。其他示例性杀真菌剂包括但不限于嗜球果伞菌素、嘧菌酯、醚菌酯、烯肟菌酯、氟嘧菌酯、醚菌酯、苯氧菌酯、啶氧菌酯、唑菌胺、肟菌酯、肟醚菌酯、甲酰胺、甲酰苯胺、苯霜灵、苯霜灵-M、苯菌胺、萎锈灵、甲苯菌胺、灭菌胺、芬呋酰胺、环酰菌胺、氟酰胺、呋霜灵、呋卡巴尼、呋菌脒、甲霜灵、甲霜灵-M(甲芬诺沙姆)、甲呋菌胺、甲砜菌胺、呋菌胺、恶霜灵、氧化萎锈灵、吡噻菌胺、吡菌胺、水杨酰苯胺、叶枯酞、噻氟唑胺、噻菌胺、N-联苯酰胺、联苯胺、啶酰菌胺、羧酸吗啉、烯酰吗啉、氟吗啉、苯甲酰胺、氟美托弗、氟吡菌胺(吡可苯甲酰胺)、苯酰菌胺、羧酰胺、卡普罗酰胺、双氯氰菊酯、双炔炔丙基酰胺、硅噻菌胺、唑类、三唑类、双苯三唑醇、糠菌唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、烯唑醇、恩唑醇、氧环唑、苯布唑醇、氟硅唑、氟喹唑、粉唑醇、己唑醇、亚胺唑、种菌唑、叶菌唑、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、丙硫菌唑、硅唑、戊唑醇、四唑醇、三唑酮、戊叉唑、咪唑类、氰霜唑、抑霉唑、稻瘟酯、丙氯灵、氟菌唑、苯并咪唑、苯菌灵、多菌灵、麦穗宁、噻菌灵、噻唑菌胺、土唑啉、恶霉灵、含氮杂环化合物、吡啶类、氟啶胺、啶斑肟、嘧啶类、布吡啶酯、嘧菌环胺、嘧菌腙、苯嘧啶醇、嘧菌酯、嘧啶醇、嘧霉胺、哌嗪类、嗪氨灵、吡咯类、氟菌腈、拌种咯、吗啉类、醛吗啉、十二环吗啉、芬普比洛、十三环吗啉、二甲酰亚胺、异菌脲、腐霉利、乙烯菌核利、S-甲基苯并唑、敌菌灵、克菌丹、敌菌丹、双氯美嗪、芬诺沙尼、福尔培、苯丙啶、法莫沙酮、苯菌胺、辛噻酮、烯丙苯唑、丙氧喹、咯喹酮、喹氧芬、三环唑、氨基甲酸酯类、二硫代氨基甲酸酯类、福美铁、代森锰锌、代森联、威百亩、丙森锌、福美双、代森锌、福美锌、乙霉威、氟苯噻菌胺、异丙菌胺、霜霉威、胍类、多果定、双胍辛酯、双胍辛胺、春雷霉素、多抗霉素、链霉素、井冈霉素A、有机金属化合物、三苯锡盐、含硫杂环化合物、稻瘟灵、二噻酮、有机磷化合物、敌瘟磷、三乙磷、三乙磷铝、异稻瘟净、吡唑磷、甲基立枯磷、有机氯化合物、甲基硫菌灵、百菌清、抑菌灵、甲苯抑菌灵、磺菌胺、苯酞、六氯苯、戊菌隆、五氯硝基苯、硝基苯基衍生物、乐杀螨、敌螨普、敌螨通、螺菌胺、环氟菌胺、霜脲氰、苯菌酮、N-2-氰基苯基-3,4-二氯异噻唑-5-甲酰胺(异噻菌胺)、N-(3',4',5'-三氟联苯-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-甲酰胺、3-[5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基异噁唑烷-3-基]-吡啶、N-(3',4'-二氯-4-氟联苯-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-e-4-甲酰胺、5-氯-7-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(2,4,6-三氟苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶、2-丁氧基-6-碘-3-丙基色满-4-酮、N,N-二甲基-3-(3-溴-6-氟-2-甲基吲哚-1-磺酰基)-[1,2,4]三唑-1-磺酰胺、甲基-(2-氯-5-[1-(3-甲基苄氧基亚氨基)-乙基]苄基)氨基甲酸酯、甲基-(2-氯-5-[1-(6-甲基吡啶-2-基甲氧基亚氨基)乙基]苄基)氨基甲酸酯、3-(4-氯苯基)-3-(2-异丙氧基羰基氨基-3-甲基丁酰基-氨基)丙酸甲酯、N-(1-(1-(4-氰基苯基)乙磺酰基)丁-2-基)氨基甲酸4-氟苯基酯、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-甲磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-乙烷-磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(4'-溴联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4'-三氟甲基联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4'-氯-3'-氟联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺或2-(邻-((2,5-二甲基苯氧基亚甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸甲酯。本领域技术人员将理解，组合物中每种抗真菌剂的合适浓度取决于诸如抗真菌剂的功效、稳定性、不同抗真菌剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

杀虫剂

经修饰的脂质组合物还可以包含杀虫剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的杀虫剂。例如，杀虫剂可以降低昆虫植物害虫的适应性(例如，减少昆虫植物害虫的生长或杀死昆虫植物害虫)。可以将包含杀虫剂的经修饰的脂质组合物与目标昆虫害虫或被其侵染的植物接触，接触量和时间足以：(a)达到目标昆虫内部或上的杀虫剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)降低目标昆虫的适应性。杀虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。

如本文所用，术语“杀虫剂(insecticide)”或“杀虫剂(insecticidal agent)”是指杀死或抑制昆虫(诸如农业昆虫害虫)的生长、增殖、繁殖或传播的物质。杀虫剂的非限制性实例示于WO 2021/041301的表2中，该文献以引用的方式整体并入本文。合适的杀虫剂的其他非限制性实例包括生物制剂、激素或信息素，诸如印楝素、芽孢杆菌属(Bacillus)种、白僵菌属(Beauveria)种、codlemone、绿僵菌属(Metarrhizium)种、拟青霉属(Paecilomyces)种、苏云金菌(thuringiensis)和轮枝菌属(Verticillium)种，以及具有未知或未指定作用机制的活性化合物，诸如熏蒸剂(诸如磷化铝、甲基溴和硫酰氟)和选择性摄食抑制剂(诸如冰晶石、氟啶虫酰胺和吡蚜酮)。本领域技术人员将理解，组合物中每种杀虫剂的合适浓度取决于诸如杀虫剂的功效、稳定性、不同杀虫剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

杀线虫剂

经修饰的脂质组合物还可以包含杀线虫剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的杀线虫剂。例如，杀线虫剂可以降低线虫植物害虫的适应性(例如，减少线虫植物害虫的生长或杀死线虫植物害虫)。可以将包含杀线虫剂的经修饰的脂质组合物与目标线虫害虫或被其侵染的植物接触，接触量和时间足以：(a)达到目标线虫内部或上的杀线虫剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)降低目标线虫的适应性。杀线虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。

如本文所用，术语“杀线虫剂(nematicide)”或“杀线虫剂(nematicidal agent)”是指杀死或抑制线虫(诸如农业线虫害虫)的生长、增殖、繁殖或传播的物质。杀线虫剂的非限制性实例示于WO 2021/041301的表3中，该文献以引用的方式整体并入本文。本领域技术人员将理解，组合物中每种杀线虫剂的合适浓度取决于诸如杀线虫剂的功效、稳定性、不同杀线虫剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

杀软体动物剂

经修饰的脂质组合物还可以包含杀软体动物剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的杀软体动物剂。例如，杀软体动物剂可以降低软体动物植物害虫的适应性(例如，减少软体动物植物害虫的生长或杀死软体动物植物害虫)。可以将包含杀软体动物剂的经修饰的脂质组合物与目标软体动物害虫或被其侵染的植物接触，接触量和时间足以：(a)达到目标软体动物内部或上的杀软体动物剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)降低目标软体动物的适应性。杀软体动物剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。

如本文所用，术语“杀软体动物剂(molluscicide)”或“杀软体动物剂(molluscicidal agent)”是指杀死或抑制软体动物(诸如农业软体动物害虫)的生长、增殖、繁殖或传播的物质。许多化学物质可用作杀软体动物剂，包括金属盐，诸如磷酸铁(III)、硫酸铝和EDTA铁钠[3][4]、四聚乙醛、甲硫威或乙酰胆碱酯酶抑制剂。本领域技术人员将理解，组合物中每种杀软体动物剂的合适浓度取决于诸如杀软体动物剂的功效、稳定性、不同杀软体动物剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

杀病毒剂

经修饰的脂质组合物还可以包含杀病毒剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的杀病毒剂。例如，杀病毒剂可以降低病毒植物病原体的适应性(例如，减少或消除病毒植物病原体)。可以将包含如本文所描述的杀病毒剂的经修饰的脂质组合物与目标病毒或被其侵染的植物接触，接触量和时间足以：(a)达到杀病毒剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)减少或消除目标病毒。本文描述的杀病毒剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。

如本文所用，术语“杀病毒剂”或“抗病毒剂”是指杀死或抑制病毒(诸如农业病毒病原体)的生长、增殖、繁殖、发育或传播的物质。多种药剂可用作杀病毒剂，包括化学物质或生物药剂(例如，核酸，例如，dsRNA)。本领域技术人员将理解，组合物中每种杀病毒剂的合适浓度取决于诸如杀病毒剂的功效、稳定性、不同杀病毒剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

除草剂

经修饰的脂质组合物还可以包含一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)除草剂。例如，除草剂可以降低杂草的适应性(例如，减少或消除杂草)。可以将包含除草剂的经修饰的脂质组合物与目标杂草接触，接触量和时间足以：(a)达到植物上的除草剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)降低杂草的适应性。除草剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。

如本文所用，术语“除草剂”是指杀死或抑制杂草的生长、增殖、繁殖或传播的物质。许多化学物质可用作除草剂，包括草铵膦、丙酯草醚、苯嗪草酮、吡草胺、二甲戊灵、氟噻草胺、吡氟酰草胺、异恶草酮、烟嘧磺隆、硝磺草酮、唑啉草酯、磺草酮、丙磺威、甲磺草胺、治草醚、喹草酸、野麦畏、特丁津、莠去津、乙氧氟草醚、敌草隆、氟乐灵或绿草隆。除草剂的其他实例包括但不限于美国专利第7,314,849号、美国专利第7,300,907号和美国专利第7,642,220号中公开的通用结构的苯甲酸除草剂(诸如麦草畏酯)、苯氧基链烷酸除草剂(诸如2,4-D、MCPA和2,4-DB酯)、芳氧基苯氧基丙酸除草剂(诸如炔草酯、氰氟草酯、噁唑禾草灵、吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵和喹禾灵酯)、吡啶羧酸除草剂(诸如氨基吡啶酸、毒莠定和二氯吡啶酸酯)、嘧啶羧酸除草剂(诸如氨基环吡草胺酯)、吡啶氧基链烷酸除草剂(诸如氟草定和绿草定酯)和羟基苄腈除草剂(诸如溴苯腈和碘苯腈酯、芳基吡啶羧酸的酯和芳基嘧啶羧酸的酯)，这些专利各自以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，除草剂可选自由以下各项组成的组：2,4-D、2,4-DB、乙草胺、三氟羧草醚、甲草胺、莠灭净、草胺强、磺草胺、莠去津、阿扎非尼丁、苯磺隆、苄嘧磺隆、苯磺草胺、苯达松、除草定、溴苯腈、丁草酯、唑草酮、草灭平、氯嘧磺隆、氯普罗汉酮、氯磺隆、烯草酮、异噁草酮、二氯吡啶酸、氯磺草胺、氰草津、环草酯、DCPA、敌敌畏、敌草腈、禾草灵、双氯磺草胺、敌草快、二氟苯吡、精噻吩草胺、敌草快、敌草隆、DSMA、茵多索、EPTC、乙氟灵、胺苯磺隆、乙氧氟草醚、噁唑禾草灵、精氟禾草灵、氟酮磺草酮、氟噻草胺、氟灭磺草胺、氟氯酸、氟啶恶嗪、氟草隆、氟草烟、氟噻醋、氟磺胺草醚、甲磺隆、草铵膦、草甘膦、卤磺隆、氟禾灵、环嗪酮、咪草咪、甲咪草烟、咪草烟、灭草喹、咪草烟、异噁唑草胺、异噁唑氟草醚、乳氟禾草灵、利谷隆、MCPA、MCPB、甲基磺草酮、甲唑、异丙甲草胺、甲草酮、甲磺隆、禾草敌、MSMA、敌草胺、抑草灵、烟嘧磺隆、达草灭、安草灵、恶草酮、氧嘧磺隆、乙氧氟草醚、百草枯、草枯酸、壬酸、二甲戊灵、苯敌草安、毒莠定、氟嘧磺隆、丙草胺、扑草净、丙草胺、毒草胺、敌稗、丙磺隆、吡唑酮、哒草酯、嘧硫苯甲醚、二氯喹酸、喹禾灵、环磺隆、烯禾定、西杜隆、西玛津、磺胺草唑、磺胺磺隆、磺胺嘧啶、丁噻隆、特巴西定、噻唑吡坦、噻吩磺隆、硫苯威、草啶、三唑草酯、苯磺隆、苯磺隆、绿草定、氟乐灵、氟磺隆、灭草灵。本领域技术人员将理解，组合物中每种除草剂的合适浓度取决于诸如除草剂的功效、稳定性、不同除草剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

驱避剂

经修饰的脂质组合物还可以包含驱避剂。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的驱避剂。例如，驱避剂可以驱避本文描述的任何害虫(例如，昆虫、线虫或软体动物)；微生物(例如，植物病原体或内生菌，诸如细菌、真菌或病毒)；或杂草。可以将包含驱避剂的经修饰的脂质组合物与目标植物或被其侵染的植物接触，接触量和时间足以：(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)相对于未处理的植物降低植物上害虫的水平。驱避剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。

在一些情况下，驱避剂是驱虫剂。众所周知的驱虫剂的一些实例包括：苯偶酰；苯甲酸苄酯；2,3,4,5-双(丁基-2-烯)四氢糠醛(MGK驱避剂11)；丁氧基聚丙二醇；正丁基乙酰苯胺；正丁基-6,6-二甲基-5,6-二氢-1,4-吡喃酮-2-甲酸酯(Indalone)；己二酸二丁酯；邻苯二甲酸二丁酯；琥珀酸二正丁酯(Tabatrex)；N,N-二乙基-间甲苯酰胺(DEET)；碳酸二甲酯(endo,endo)-二甲基双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸酯)；邻苯二甲酸二甲酯；2-乙基-2-丁基-1,3-丙二醇；2-乙基-1,3-己二醇(Rutgers 612)；二-正丙基异辛可部酯(MGK驱避剂326)；2-苯基环己醇；对甲烷-3,8-二醇和N,N-二乙基琥珀酰胺酸正丙酯。其他驱避剂包括香茅油、邻苯二甲酸二甲酯、正丁基异亚丙基丙酮草酸酯和2-乙基己二醇-1,3(参见Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology,第2版,第11卷:724-728；以及TheCondensed Chemical Dictionary,第8版,第756页)。

驱虫剂可以是合成的或非合成的驱虫剂。合成驱虫剂的实例包括邻氨基苯甲酸甲酯和其他基于邻氨基苯甲酸酯的驱虫剂、苯甲醛、避蚊胺(DEET，N,N-二乙基-间甲苯酰胺)、碳酸二甲酯、邻苯二甲酸二甲酯、埃卡瑞丁(即，派卡瑞丁、Bayrepel和KBR 3023)、避虫酮(例如，如在“6-2-2”混合物中使用的(60％邻苯二甲酸二甲酯、20％避虫酮、20％乙基己二醇)、IR3535(3-[正丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸、乙酯)、甲氧苄氟菊酯、氯菊酯、SS220或三环癸烯基烯丙基醚)。天然驱虫剂的实例包括紫珠(紫珠属(Callicarpa))叶、桦树皮、桃金娘(Myrica Gale)、猫薄荷油(例如，荆芥内酯)、香茅油、柠檬桉精油(Corymbia citriodora；例如，对薄荷烷-3,8-二醇(PMD))、印楝油、柠檬草、来自互叶白千层叶的茶树油、烟草或它们的提取物。

施肥剂

经修饰的脂质组合物还可以包含异源施肥剂。在一些情况下，异源施肥剂与经修饰的脂质组合物缔合。例如，经修饰的脂质组合物可以包封异源施肥剂。另外地或可替代地，异源施肥剂可以嵌入在经修饰的脂质组合物的表面上或缀合至经修饰的脂质组合物的表面。

异源施肥剂的实例包括植物营养素或植物生长调节剂，诸如本领域所熟知的那些。可替代地或另外地，施肥剂可以是可以提高植物共生体适应性的肽、多肽、核酸或多核苷酸。施肥剂可以是可以提高多种植物或植物共生体的适应性的药剂，或者可以是针对一种或多种特定目标植物或植物共生体(例如，特定种类或属的植物或植物共生体)的药剂。

在一些情况下，异源施肥剂可以被修饰。例如，修饰可以是化学修饰，例如缀合至标志物(例如，荧光标志物或放射性标志物)。在其他实例中，修饰可以包括缀合或可操作连接至增强药剂的稳定性、递送、靶向、生物利用度或半衰期的部分(例如，脂质、聚糖、聚合物(例如，PEG)、阳离子部分)。

在一些情况下，异源施肥剂包含施用于土壤或植物组织以提供植物生长所必需的一种或多种植物营养素的任何天然或合成来源的材料。植物营养素可以包括常量营养素、微量营养素或它们的组合。植物常量营养素包括氮、磷、钾、钙、镁和/或硫。植物微量营养素包括铜、铁、锰、钼、锌、硼、硅、钴和/或钒。植物营养肥料的实例包括氮肥，包括但不限于尿素、硝酸铵、硫酸铵、非压力氮溶液、氨水、无水氨、硫代硫酸铵、硫包衣尿素、脲醛、IBDU、聚合物包衣尿素、硝酸钙、脲醛或亚甲基脲、磷肥(诸如磷酸二铵、磷酸一铵、聚磷酸铵、浓过磷酸盐铵和三过磷酸盐)或钾肥(诸如氯化钾、硫酸钾、硫酸钾镁、硝酸钾)。此类组合物可以作为游离盐或离子存在于组合物中。肥料可以通过一种或多种其组分(诸如氮、磷或钾)的含量来指定。肥料中这些元素的含量可以由N-P-K值表示(其中N＝氮含量(重量百分比)，P＝磷含量(重量百分比)，并且K＝钾含量(重量百分比))。

在另一方面，无机肥料由非生物材料制成，包括例如硝酸铵、硫酸铵、尿素、氯化钾、钾碱、磷酸铵、无水氨和其他磷酸盐。无机肥料很容易在市场上获得，并且含有植物可以立即利用的可溶性形式的营养素。无机肥料通常价格低廉，所需元素的单位成本较低。本领域技术人员将理解，可以计算施肥剂中给定元素的确切量并将其施用于植物或土壤。

肥料还可以分类为有机肥料或无机肥料。有机肥料包括具有以碳为主链的分子骨架的肥料，诸如在源自生物物质的组合物中。有机肥料是由来自生物的材料制成的。动物粪便、堆肥、骨粉、羽毛粉和血粉是常见有机肥料的实例。在另一方面，有机肥料通常不能立即被植物利用，并且需要土壤微生物将肥料组分分解成更简单的结构，然后才能被植物使用。此外，有机肥料不仅可以像普通无机肥料一样引发植物生长反应，而且天然有机肥料还可以刺激土壤微生物种群的生长和活动。增加土壤微生物种群(例如，植物共生体)可能对土壤的物理和化学性质产生显著的有益影响，以及提高抗病虫害能力。

在一个方面，可以将包含植物营养素的经修饰的脂质组合物与植物接触，接触量和时间足以：(a)达到植物内部或上的植物营养素浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)相对于未处理的植物增加植物的适应性。

在另一方面，可以将包含植物营养素的经修饰的脂质组合物与植物共生体接触，接触量和时间足以：(a)达到植物共生体(例如，细菌或真菌内共生体)内部或上的植物营养素浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)相对于未处理的植物共生体增加植物共生体的适应性。

异源施肥剂可以包括植物生长调节剂。示例性植物生长调节剂包括生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸。在一些情况下，植物生长调节剂是脱落酸、氯酰胺、嘧啶醇、6-苄氨基嘌呤、油菜素内酯、仲丁灵、矮壮素(氯化矮壮素)、氯化胆碱、环丙酰草胺、丁酰肼、敌草酸、噻节因、2,6-二甲基嘌呤、乙烯利、氟节胺、氟嘧醇、氟噻草胺、氯吡脲、赤霉酸、抗倒胺、吲哚-3-乙酸、马来酰肼、氟草胺、甲哌鎓(甲哌鎓氯化物)、萘乙酸、N-6-苄基腺嘌呤、多效唑、调环酸(调环酸钙)、丙氢茉莉酮、噻苯隆、三戊醇、三丁基磷酸三硫酯、2,3,5-三碘苯甲酸、抗倒酯和烯效唑。可以掺入种子包衣组合物的其他植物生长调节剂在US2012/0108431中进行了描述，该文献以引用的方式整体并入。

植物修饰剂

本文描述的经修饰的脂质组合物包含一种或多种异源植物修饰剂。例如，经修饰的脂质组合物可以包封异源植物修饰剂。可替代地或另外地，异源植物修饰剂可以嵌入在经修饰的脂质组合物的表面上或缀合至经修饰的脂质组合物的表面。

在一些情况下，植物修饰剂可以包括肽或核酸。植物修饰剂可以是提高多种植物适应性的药剂，或者可以是针对一种或多种特定植物(例如，特定种类或属的植物)的药剂。另外，在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的植物修饰剂。

此外，在一些情况下，可以对异源植物修饰剂(例如，包含核酸分子或肽的药剂)进行修饰。例如，修饰可以是化学修饰，例如缀合至标志物(例如，荧光标志物或放射性标志物)。在其他实例中，修饰可以包括缀合或可操作连接至增强药剂的稳定性、递送、靶向、生物利用度或半衰期的部分(例如，脂质、聚糖、聚合物(例如，PEG)、阳离子部分)。

多肽

经修饰的脂质组合物可以包含多肽。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含多肽或其功能片段或衍生物。

多肽的实例包括酶(例如，代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNAse、DNAse或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN或锌指)、核糖蛋白、蛋白质适体或分子伴侣。

多肽可以包括天然存在的多肽或重组产生的变体。在一些情况下，多肽可以是功能性片段或其变体(例如，酶活性片段或其变体)。例如，多肽可以是本文描述的任何多肽的功能活性变体，其与本文描述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，例如在指定区域或整个序列上。在一些情况下，多肽可以与所关注蛋白质具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更高)同一性。

多肽可以配制在经修饰的脂质组合物中。本文公开的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的多肽，诸如至少约1个多肽、2、3、4、5、10、15、20或更多个多肽中的任一个。组合物中每种多肽的合适浓度取决于诸如多肽的功效、稳定性、组合物中不同多肽的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中的每种多肽为约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中的每种多肽为约0.1ng/g至约100mg/g。

制备多肽的方法是本领域的常规方法。一般参见Smales和James(编辑),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press(2005)；and Crommelin,Sindelar&Meibohm(编辑),PharmaceuticalBiotechnology:Fundamentals and Applications,Springer(2013)。

产生多肽的方法涉及在植物细胞中表达，尽管重组蛋白也可以在适当启动子的控制下使用昆虫细胞、酵母、细菌、哺乳动物细胞或其他细胞来产生。哺乳动物表达载体可以包括非转录元件，诸如复制起点、合适的启动子和增强子以及其他5'或3'侧接非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，诸如必要的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及终止序列。源自SV40病毒基因组，例如SV40起源、早期启动子、增强子、剪接和多腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供表达异源DNA序列所需的其他基因元件。用于天然、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当克隆和表达载体在Green&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第四版),Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)中进行了描述。

可以采用各种哺乳动物细胞培养系统来表达和制造重组多肽剂。哺乳动物表达系统的实例包括CHO细胞、COS细胞、HeLA和BHK细胞系。用于生产蛋白质治疗剂的宿主细胞培养方法在例如Zhou和Kantardjieff(编辑),Mammalian Cell Cultures for BiologicsManufacturing(Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology),Springer(2014)中进行了描述。蛋白质的纯化在Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization,Humana Press(2013)以及Cutler,ProteinPurification Protocols(Methods in Molecular Biology),Humana Press(2010)中进行了描述。蛋白质治疗剂的调配物在Meyer(编辑),Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approaches to formulation in the Laboratory,Manufacturing,and theClinic,Woodhead Publishing Series(2012)中进行了描述。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含抗体或其抗原结合片段。例如，本文描述的药剂可以是阻断或增强组分的活性和/或功能的抗体。抗体可以充当多肽(例如，酶或细胞受体)的拮抗剂或激动剂。针对靶抗原的抗体的制备和使用是本领域已知的。参见例如Zhiqiang An(编辑),Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic,第1版,Wiley,2009以及Greenfield(编辑),Antibodies:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory Press,2013，了解制备重组抗体的方法，包括抗体工程、简并寡核苷酸的使用、5'-RACE、噬菌体展示和诱变；抗体测试和表征；抗体药代动力学和药效动力学；抗体纯化和储存；以及筛选和标记技术。

核酸

在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含核酸(多核苷酸或多核糖核苷酸)。许多核酸可用于本文描述的经修饰的脂质组合物和方法中。经修饰的脂质组合物可以包含任何数量或类型(例如，类别)的异源核酸(例如，DNA分子(例如，质粒)或RNA分子，例如mRNA、circRNA、向导RNA(gRNA)或抑制性RNA分子或其前体(例如，siRNA、shRNA或miRNA或这些中任一种的前体)，或杂合DNA-RNA分子)，诸如至少约1类核酸或核酸变体，或2、3、4、5、10、15、20或更多类核酸或核酸变体。组合物中每种核酸的合适浓度取决于诸如核酸的功效、稳定性、组合物中不同核酸的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。本文有用的核酸的实例包括DNA分子(例如，质粒)、mRNA、circRNA、siRNA、Dicer底物小干扰RNA(dsiRNA)、反义RNA、短干扰RNA(siRNA)或siRNA前体(例如，分子间或分子内杂交以形成具有至少约20个连续碱基对的至少部分双链RNA的一条或多条RNA链)、短发夹(shRNA)、微小RNA(miRNA)或miRNA前体、不对称干扰RNA(aiRNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代、锁核酸(LNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶、脱氧核酶(DNAzyme)、核酶(DNA、RNA)、环状RNA(circRNA)、向导RNA(gRNA)或编码这些RNA中的任一种的DNA分子。

编码肽的核酸

在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含编码多肽的核酸。编码多肽的核酸的长度可为约10至约50,000个核苷酸(nt)、约25至约100个nt、约50至约150个nt、约100至约200个nt、约150至约250个nt、约200至约300个nt、约250至约350个nt、约300至约500个nt、约10至约1000个nt、约50至约1000个nt、约100至约1000个nt、约1000至约2000个nt、约2000至约3000个nt、约3000至约4000个nt、约4000至约5000个nt、约5000至约6000个nt、约6000至约7000个nt、约7000至约8000个nt、约8000至约9000个nt、约9000至约10,000个nt、约10,000至约15,000个nt、约10,000至约20,000个nt、约10,000至约25,000个nt、约10,000至约30,000个nt、约10,000至约40,000个nt、约10,000至约45,000个nt、约10,000至约50,000个nt或它们之间的任何范围。

经修饰的脂质组合物还可以包含所关注核酸序列的活性变体。在一些情况下，核酸的变体与所关注核酸的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，例如在指定区域或整个序列上。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含由核酸变体编码的活性多肽。在一些情况下，由核酸变体编码的活性多肽与所关注多肽的序列或天然来源的多肽序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，例如在指定区域或整个氨基酸序列上。

用于表达编码蛋白质的核酸的某些方法可以涉及在适当启动子的控制下在细胞中表达，这些细胞包括昆虫、酵母、植物、细菌或其他细胞。表达载体可以包括非转录元件，如复制起点、合适的启动子和增强子以及其他5'或3'侧接非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点和终止序列。源自SV40病毒基因组，例如SV40起源、早期启动子、增强子、剪接和多腺苷酸化位点的DNA序列可以用于提供表达异源DNA序列所需的其他基因元件。用于天然、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当克隆和表达载体在Green等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012中进行了描述。

使用重组方法的遗传修饰通常在本领域中是已知的。可以使用本领域中已知的重组方法，如使用标准技术通过从表达所述基因的细胞中筛选文库、通过从已知包括所述基因的载体衍生所述基因或通过从含有所述基因的细胞和组织直接分离来获得编码期望基因的核酸序列。可替代地，所关注基因可以合成地而非克隆产生。

天然或合成核酸的表达通常是通过将编码所关注基因的核酸与启动子可操作地连接，并且将构建体掺入到表达载体中来实现。表达载体可以适于在细菌中复制和表达。表达载体也可以适于在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有可用于表达期望的核酸序列的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。

另外的启动子元件(例如，增强子)调节转录起始的频率。通常，这些启动子元件位于起始位点上游30-110碱基对(bp)的区中，但最近已显示许多启动子也含有位于起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间距在活性开始下降之前可以增加到相隔50bp。取决于启动子，似乎个别元件可以协同或独立地起作用以激活转录。

合适的启动子的一个实例是即刻早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，还可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于，猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)启动子，以及人基因启动子，如但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。

可替代地，启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够在需要表达时开启与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不需要表达时关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

待引入的表达载体还可以含有可选标志物基因或报告因子基因中的任一者或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选标志物可以被携带在单独的DNA片段上且用于共转染程序。可选标志物和报告因子基因两者可以侧接有适当的调控序列以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选标志物包括例如抗生素抗性基因，如neo等。

报告因子基因可以用于鉴定潜在转化的细胞以及用于评价调控序列的功能。一般来说，报告因子基因是不存在于接受者来源中或不由接受者来源表达并且编码通过一些易于检测的特性(例如，酶活性)来体现其表达的多肽的基因。在DNA已被引入到接受者细胞之后的合适时间分析报告因子基因的表达。合适的报告因子基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,FEBS Letters 479:79-82,2000)。合适的表达系统是熟知的，并且可以使用已知技术制备或商购获得。一般来说，具有显示报告因子基因的最高表达水平的最小5'侧接区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告因子基因连接并且用于评估药剂调节经启动子驱动的转录的能力。

在一些情况下，生物体可以被遗传修饰以改变一种或多种蛋白质的表达。所述一种或多种蛋白质的表达可以被修饰持续特定时间(例如，生物体的发育或分化状态)。在一种情况下，本发明包括改变一种或多种蛋白质(例如，影响活性、结构或功能的蛋白质)的表达的组合物。一种或多种蛋白质的表达可以被局限于特定位置或广泛分布于整个生物体中。

mRNA

经修饰的脂质组合物可以包含mRNA分子，例如编码多肽的mRNA分子。mRNA分子可以是合成的和修饰的，例如化学上地。mRNA分子可以在体外化学合成或转录。mRNA分子可以置于质粒上，例如病毒载体、天然载体或真核表达载体。在一些实例中，mRNA分子可以通过转染、电穿孔或转导(例如，腺病毒或慢病毒转导)递送到细胞。

在一些情况下，本文描述的经修饰的所关注RNA药剂具有经修饰的核苷或核苷酸。此类修饰是已知的，并且描述于例如WO 2012/019168中。另外的修饰描述于例如WO 2015/038892、WO 2015/038892、WO 2015/089511、WO 2015/196130、WO 2015/196118和WO 2015/196128 A2中，所述文献以引用的方式整体并入本文。

在一些情况下，编码所关注多肽的经修饰的RNA具有一个或多个末端修饰，例如5'帽结构和/或poly-A尾部(例如，长度介于100-200个核苷酸之间)。5'帽结构可以选自由以下组成的组：CapO、Capl、ARCA、肌苷、Nl-甲基-鸟苷、2'氟代-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。在一些情况下，经修饰的RNA还含有包括至少一个Kozak序列的5'UTR和3'UTR。此类修饰是已知的并且描述于例如WO 2012/135805和WO2013/052523中，所述文献以引用的方式整体并入本文。另外的末端修饰描述于例如WO2014/164253和WO 2016/011306、WO 2012/045075和WO 2014/093924中，所述文献以引用的方式整体并入本文。用于合成可以包括至少一个化学修饰的加帽RNA分子(例如，经修饰的mRNA)的嵌合酶描述于WO 2014/028429中，所述文献以引用的方式整体并入本文。

在一些情况下，经修饰的mRNA可以被环化或多联体化，以生成翻译感受态分子，以帮助poly-A结合蛋白与5'端结合蛋白之间的相互作用。环化或连环化的机制可以通过至少3种不同途径进行：1)化学催化；2)酶催化；和3)核酶催化。新形成的5'-/3'-连接可以是分子内或分子间的。此类修饰描述于例如WO 2013/151736中。

制备和纯化经修饰的RNA的方法在本领域中是已知和公开的。例如，经修饰的RNA仅使用体外转录(IVT)酶合成来制备。制备IVT多核苷酸的方法是本领域已知的，并且在WO2013/151666、WO 2013/151668、WO 2013/151663、WO 2013/151669、WO 2013/151670、WO2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151671、WO 2013/151672、WO 2013/151667和WO2013/151736中进行了描述。纯化方法包括通过以下纯化包括polyA尾部的RNA转录物：在使得RNA转录物与和多个胸苷或其衍生物和/或多个尿嘧啶或其衍生物(polyT/U)连接的表面结合的条件下使样品与所述表面接触，以及从所述表面洗脱经纯化的RNA转录物(WO 2014/152031)；使用离子(例如，阴离子)交换色谱法，所述离子交换色谱法允许通过可扩展的方法分离长度为至多10,000个核苷酸的较长RNA(WO 2014/144767)；以及使经修饰的mRNA样品经受DNAse处理(WO 2014/152030)。

经修饰的RNA的调配物是已知的，并且描述于例如WO 2013/090648中。例如，调配物可以是但不限于纳米颗粒、聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)微球、类脂质、脂质复合体、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括单糖)、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白密封剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除的脂质纳米颗粒以及它们的组合。

编码人类疾病、抗体、病毒和多种体内环境领域中的多肽的经修饰的RNA是已知的，并且公开于例如国际公开号WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO 2013/151663、WO2013/151669、WO 2013/151670、WO2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151736的表6；国际公开号WO 2013/151672的表6和表7；国际公开号WO 2013/151671的表6、表178和表179；国际公开号WO 2013/151667的表6、表185和表186中。前述任一者可以合成为IVT多核苷酸、嵌合多核苷酸或环状多核苷酸，并且各自可以包括一个或多个经修饰的核苷酸或末端修饰。

环状多核糖核苷酸

经修饰的脂质组合物可以包含环状多核糖核苷酸，该环状多核糖核苷酸包含编码多肽的一个或多个表达序列。

多核糖核苷酸可以包含可操作地连接至编码多肽的表达序列的IRES(内部核糖体进入位点)。环状多核糖核苷酸可以包含剪接接头，例如连接5'外显子片段和3'外显子片段。环状多核糖核苷酸可以包含本文描述的元件中的任何一种或多种。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸包括如国际专利公开号WO2019/118919、WO 2020/023655、WO 2020/180751、WO 2020/180752、WO 2020/181013、WO 2020/198403、WO 2020/257730、WO 2020/257727、WO 2020/252436中公开的任何特征或特征的任何组合，这些专利中的每一个以引用的方式整体并入本文。

在一些实施方案中，环状多核苷酸还包含多核糖核苷酸货物。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含表达(或编码)序列、非编码序列或表达(编码)序列和非编码序列的组合。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含编码多肽的表达(编码)序列。在一些实施方案中，多核糖核苷酸包含可操作地连接至编码多肽的表达序列的IRES。在一些实施方案中，IRES位于表达序列的上游。在一些实施方案中，IRES位于表达序列的下游。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸还包括IRES与3'外显子片段或5'外显子片段之间的间隔区。间隔区可以是例如长度为至少5(例如，至少10、至少15、至少20)个核糖核苷酸。间隔区可以是例如5至500(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500)个核糖核苷酸。在一些实施方案中，间隔区包含polyA序列。在一些实施方案中，间隔区包含polyA-C序列。在一些实施方案中，间隔区包含polyA-G序列。在一些实施方案中，间隔区包含polyA-T序列。在一些实施方案中，间隔区包含随机序列。在一些实施方案中，第一退火区域和第二退火区域连接，从而形成环状多核糖核苷酸。

在一些实施方案中，环状RNA是由本文描述的脱氧核糖核苷酸模板或线性RNA产生的。在一些实施方案中，环状RNA是通过本文描述的任何方法产生的。

在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸是至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。

在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸是500个核苷酸至20,000个核苷酸、1,000个核苷酸至20,000个核苷酸、2,000个核苷酸至20,000个核苷酸或5,000个核苷酸至20,000个核苷酸。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸是500个核苷酸至10,000个核苷酸、1,000个核苷酸至10,000个核苷酸、2,000个核苷酸至10,000个核苷酸或5,000个核苷酸至10,000个核苷酸。

由于其环化，环状多核糖核苷酸可以包括将其与线性RNA区分开来的某些特征。例如，与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸可能不太容易被核酸外切酶降解。因此，环状多核糖核苷酸可以比线性RNA更稳定，尤其是当在核酸外切酶的存在下温育时。与线性RNA相比，环状多核糖核苷酸增加的稳定性使得环状多核糖核苷酸更可用作细胞转化试剂来产生多肽，并且可以比线性RNA更容易储存且储存时间更长。用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性可以使用本领域中确定RNA降解是否已经发生的标准方法(例如，通过凝胶电泳)来测试。此外，与线性RNA不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶(诸如小牛肠磷酸酶)一起温育时，环状多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。

本文描述的环状多核糖核苷酸及其组合物或药物组合物可用于治疗和兽医给药方法中，以在向多个细胞提供至少两个剂量的环状多核糖核苷酸后在多个细胞中产生一定水平的环状多核糖核苷酸、一定水平的靶标结合或一定水平的蛋白质。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸在哺乳动物(例如，人)中是非免疫原性的。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸能够在来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞)、人类细胞、培养细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤细胞、转移细胞)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成体细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞或它们的任何组合中复制或在其中复制。在一些实施方案中，本公开包括包含本文描述的环状多核糖核苷酸的细胞，其中该细胞是来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞)、人类细胞、培养细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤细胞、转移细胞)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成体细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞或它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞被修饰以包含环状多核糖核苷酸。

在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸包含用于表达产物的序列。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸包含用于结合靶标的结合位点。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸经由本文描述的任何给药方案提供给多个细胞。在一些实施方案中，如本文所描述的环状多核糖核苷酸在受试者中诱导反应或反应水平。在一些实施方案中，由环状多核糖核苷酸中包含的序列编码的表达产物在多个细胞中的一个或多个细胞中表达。

在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸具有至少与线性对应物(例如，线性表达序列或线性多核糖核苷酸)相同的半衰期。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸的半衰期比线性对应物的半衰期有所增加。在一些实施方案中，半衰期增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持久性为至少约1小时，例如至少2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、6个月或更长时间。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持久性为约1小时至约60天，例如约1小时、2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸在细胞分裂时在细胞中具有一定半衰期或持久性。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸在分裂后的细胞中具有一定半衰期或持久性。在某些实施方案中，环状多核糖核苷酸在分裂细胞中的半衰期或持久性为至少约10分钟，例如至少约1小时，例如至少2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、6个月或更长时间。在某些实施方案中，环状多核糖核苷酸在分裂细胞中的半衰期或持久性为约10分钟至约60天，例如约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天。

在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸调节细胞功能，例如瞬时或长期调节。在某些实施方案中，细胞功能被稳定地改变，诸如持续至少约10分钟，例如至少约1小时，例如至少2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、3个月、6个月或更长时间的调节。在某些实施方案中，细胞功能被稳定地改变，诸如持续约1小时至约60天，例如约1小时至约30天，例如至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天或60天的调节。

抑制性RNA

在一些情况下，经修饰的脂质组合物包括例如经由RNA干扰(RNAi)途径起作用的抑制性RNA分子。在一些情况下，抑制性RNA分子降低基因表达水平和/或降低蛋白质水平。在一些情况下，抑制性RNA分子抑制基因的表达。例如，抑制性RNA分子可以包括短干扰RNA或其前体、短发夹RNA和/或针对基因的微小RNA或其前体。某些RNA分子可以通过RNA干扰(RNAi)的生物学过程抑制基因表达。RNAi分子包括RNA或RNA样结构，所述结构通常含有15-50个碱基对(如约18-25个碱基对)并且具有与细胞内的经表达的靶基因中的编码序列相同(或互补)或几乎相同(或基本上互补)的核碱基序列。RNAi分子包括但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体、dicer底物和多价RNA干扰(美国专利号8,084,599、8,349,809、8,513,207和9,200,276)。shRNA是包含发夹转角的RNA分子，其通过RNAi降低靶基因的表达。shRNA可以质粒(例如，病毒或天然载体)的形式递送至细胞，例如通过转染、电穿孔或转导)。微小RNA是通常长度为约21或22个核苷酸的非编码RNA分子。miRNA与mRNA分子上的靶位点结合并沉默mRNA，例如通过引起mRNA的切割、mRNA的不稳定或mRNA的翻译抑制。在一些情况下，抑制性RNA分子降低功能负调节因子的水平和/或活性。在其他情况下，抑制剂RNA分子降低功能正调节因子的抑制剂的水平和/或活性。抑制性RNA分子可以在体外化学合成或转录。

在一些情况下，核酸是DNA、RNA或PNA。在一些情况下，RNA是抑制性RNA。在一些情况下，抑制性RNA抑制基因表达。在一些情况下，核酸是增加酶(例如，代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNAse、DNAse或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN或锌指)、核糖蛋白、蛋白质适体或分子伴侣的表达的mRNA、经修饰的mRNA或DNA分子。在一些情况下，核酸是增加酶(例如，代谢酶、重组酶、解旋酶、整合酶、RNAse酶、DNAse酶或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN或锌指)、核糖蛋白、蛋白质适体或分子伴侣的表达的mRNA、经修饰的mRNA或DNA分子。在一些方面，核酸编码酶、成孔蛋白、信号配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白、核糖蛋白、蛋白质适体或分子伴侣。在一些情况下，表达的增加是相对于参考水平(例如，未治疗的受试者中的表达)约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％的表达增加。在一些情况下，表达的增加是相对于参考水平(例如，未治疗的受试者中的表达)约2倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约25倍、约50倍、约75倍或约100倍或更多的表达增加。

在一些情况下，核酸是反义RNA、dsiRNA、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、PNA、吗啉代、LNA、piRNA、核酶、DNAzyme、适体(DNA、RNA)、circRNA、gRNA或DNA分子(例如，质粒)，其作用是降低例如酶(代谢酶、重组酶、解旋酶、整合酶、RNAse酶、DNAse酶、聚合酶、泛素化蛋白、超氧化物管理酶或能量产生酶)、转录因子、分泌蛋白、结构因子(肌动蛋白、驱动蛋白或微管蛋白)、核糖蛋白、蛋白质适体、分子伴侣、受体、信号配体或转运蛋白的表达。在一些情况下，表达的降低是相对于参考水平(例如，未治疗的受试者中的表达)约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％的表达降低。在一些情况下，表达的降低是相对于参考水平(例如，未治疗的受试者中的表达)约2倍、约4倍、约5倍、约10倍、约20倍、约25倍、约50倍、约75倍或约100倍或更多的表达降低。

RNAi分子包括与靶基因的全部或片段基本上互补或完全互补的序列。RNAi分子可以互补内含子与外显子之间的边界处的序列，以防止特定基因的新产生的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。与特定基因互补的RNAi分子可以与靶基因的mRNA杂交并阻止其翻译。反义分子可以是DNA、RNA或其衍生物或杂交体。此类衍生分子的实例包括但不限于肽核酸(PNA)和基于硫代磷酸酯的分子，诸如脱氧核糖核酸胍(DNG)或核糖核酸胍(RNG)。

RNAi分子可以以体外合成的即用型RNA的形式或以转染到将在转录后产生RNAi分子的细胞中的有义和反义RNA序列(或编码有义和反义RNA序列的DNA)的形式提供。RNA分子与例如靶mRNA的杂交导致杂交复合物被RNAse H降解和/或抑制翻译复合物的形成。两者都导致无法产生原始基因的产物。

与所关注转录物杂交的RNAi分子的长度可以是约10个核苷酸、约15或30个核苷酸、或约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个核苷酸。在实施方案中，RNAi分子与所关注转录物杂交以形成至少约17个碱基对的完美或接近完美的双链区；在实施方案中，双链区包括至少约10个连续碱基对。反义序列与靶向转录物的同一性程度可以是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

RNAi分子还可以包括突出端，即通常未配对的突出核苷酸，其不直接参与通常由本文定义的有义链和反义链对的核心序列形成的双螺旋结构。RNAi分子可以在有义链和反义链中的每一条上独立地含有约1-5个碱基的3'和/或5'突出端。在一些情况下，有义链和反义链均含有3'和5'突出端。在一些情况下，一条链碱基的一个或多个3'突出端核苷酸与另一条链的一个或多个5'突出端核苷酸配对。在其他情况下，一条链碱基的一个或多个3'突出端核苷酸不与另一条链的一个或多个5'突出端核苷酸配对。RNAi分子的有义链和反义链可以含有或可以不含有相同数量的核苷酸碱基。反义链和有义链可以形成双链体，其中5'端仅具有平端，3'端仅具有平端，5'端和3'端均为平端，或者5'端和3'端均不为平端。在另一种情况下，突出端中的一个或多个核苷酸含有硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、脱氧核苷酸倒置(3'至3'连接)核苷酸，或者是经修饰的核糖核苷酸或脱氧核苷酸。

小干扰RNA(siRNA)分子包含与靶mRNA的约15至约25个连续核苷酸相同的核苷酸序列。在一些情况下，siRNA序列以二核苷酸AA开始，包括约30％-70％(约30％-60％、约40％-60％、或约45％-55％)的GC含量，并且与基因组中除要引入的靶标之外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性，例如如通过标准BLAST搜索所确定的。

siRNA和shRNA类似于内源性微小RNA(miRNA)基因加工途径中的中间体(Bartel,Cell 116:281-297,2004)。在一些情况下，siRNA可以起到miRNA的作用，反之亦然(Zeng等人,Mol.Cell 9:1327-1333,2002；Doench等人,Genes Dev.17:438-442,2003)。外源siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人,Nat.Methods3:199-204,2006)。3'UTR内的多个靶位点产生更强的下调作用(Doench等人,Genes Dev.17:438-442,2003)。

已知的有效siRNA序列和同源结合位点在相关文献中也有很好的体现。RNAi分子易于通过本领域已知的技术设计和生产。此外，存在增加发现有效和特异性序列基序的机会的计算工具(Pei等人,Nat.Methods3(9):670-676,2006；Reynolds等人,Nat.Biotechnol.22(3):326-330,2004；Khvorova等人,Nat.Struct.Biol.10(9):708-712,2003；Schwarz等人,Cell 115(2):199-208,2003；Ui-Tei等人,Nucleic Acids Res.32(3):936-948,2004；Heale等人,Nucleic Acids Res.33(3):e30,2005；Chalk等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.319(1):264-274,2004；以及Amarzguioui等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.316(4):1050-1058,2004)。

RNAi分子调节由基因编码的RNA的表达。由于多个基因可以彼此共享一定程度的序列同源性，因此在一些情况下，RNAi分子可以被设计成靶向具有足够序列同源性的一类基因。在一些情况下，RNAi分子可以含有与不同基因靶标之间共有的序列或对特定基因靶标特有的序列具有互补性的序列。在一些情况下，RNAi分子可以被设计成靶向在几个基因之间具有同源性的RNA序列的保守区域，从而靶向基因家族中的几个基因(例如，不同的基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在一些情况下，RNAi分子可以被设计成靶向对单个基因的特定RNA序列特有的序列。

抑制性RNA分子可以被修饰，例如以含有经修饰的核苷酸，例如2'-氟、2'-邻甲基、2'-脱氧、解锁核酸、2'-羟基、硫代磷酸酯、2'-硫尿苷、4'-硫尿苷、2'-脱氧尿苷。不受理论束缚，据信此类修饰可增加核酸酶抗性和/或血清稳定性，或降低免疫原性。

在一些情况下，RNAi分子或其前体经由生理上不稳定的键或接头连接至递送聚合物。选择生理不稳定的接头，使得它在某些生理条件下存在时经历化学转变(例如，裂解)(例如，二硫键在细胞质的还原环境中裂解)。通过裂解生理上不稳定的键而从聚合物中释放分子促进了分子与适当的细胞组分的相互作用以获得活性。

RNAi分子-聚合物缀合物可以通过将分子共价连接至聚合物来形成。聚合或修饰聚合物，使得它含有反应性基团A。还聚合或修饰RNAi分子，使得它含有反应性基团B。选择反应性基团A和B，使得它们可以使用本领域已知的方法通过可逆共价键连接。

RNAi分子与聚合物的缀合可以在过量聚合物的存在下进行。由于RNAi分子和聚合物在缀合期间可以具有相反的电荷，因此过量聚合物的存在可以减少或消除缀合物的聚集。可替代地，可以使用过量的载剂聚合物，诸如聚阳离子。在施用缀合物之前，可以从缀合聚合物中除去过量的聚合物。可替代地，过量的聚合物可以与缀合物共同施用。

基于非编码RNA(诸如核酶、RNAse P、siRNA和miRNA)的抑制剂的制备和使用也是本领域已知的，例如，如Sioud,RNA Therapeutics:Function,Design,and Delivery(Methods in Molecular Biology).Humana Press(2010)中所描述的。

基因编辑

经修饰的脂质组合物可以包含基因编辑系统的组分。例如，药剂可以在基因中引入改变(例如，插入、缺失(例如，敲除)、易位、倒位、单点突变或其他突变)。示例性基因编辑系统包括锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)和簇状调节间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。基于ZFN、TALEN和CRISPR的方法描述于例如Gaj等人,Trends Biotechnol.31(7):397-405,2013中。

关于基因编辑系统的组分和方法的其他描述可以在国际专利申请公开号WO2021/041301中找到，该文里以引用的方式整体并入本文。

异源治疗剂

经修饰的脂质组合物可以包含治疗剂(例如，影响动物(例如，哺乳动物，例如，人)、动物病原体或其病原体载体的药剂，并且可以装载到经修饰的脂质组合物中)，诸如治疗性肽、治疗性核酸(例如，治疗性RNA)、治疗性小分子或病原体控制剂(例如，抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或驱虫剂)。装载有此类药剂的经修饰的脂质组合物可以与药学上可接受的载剂一起配制，用于递送至动物、动物病原体或其病原体载体。

抗细菌剂

经修饰的脂质组合物还可以包含抗细菌剂。例如，可以将包含抗生素的经修饰的脂质组合物施用于动物，施用量和时间足以：达到动物体内或身上抗生素浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；和/或治疗或预防动物的天然感染。抗细菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的抗细菌剂。

示例性杀菌剂包括上文在“异源农业剂”部分中关于抗菌剂

已经讨论过的那些。

适用于治疗动物的抗细菌剂的实例包括青霉素类(阿莫西林、氨苄西林、巴坎西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯唑西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、Crysticillin 300A.S.、Pentids、Permapen、Pfizerpen、Pfizerpen-AS、Wycillin、青霉素V、哌拉西林、匹伐西林、匹美西林、替卡西林)、头孢菌素类(头孢乙酰苄(cephacetrile)、头孢羟氨苄(cefadroxyl)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢甘氨酸(cephaloglycin)、头孢洛铵(cephalonium)、头孢噻啶(cephaloradine)、头孢噻吩(cephalotin)、头孢匹林(cephapirin)、头孢曲嗪、头孢氟拉、头孢西酮、头孢唑啉(cephazolin)、头孢拉定(cephradine)、头孢沙定、头孢替唑、头孢克洛、头孢孟多、头孢美唑、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢丙烯(cefproxil)、头孢呋辛、头孢唑南、头孢卡培、头孢达肟、头孢地尼、头孢地托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢噻肟、头孢吡咪、头孢泊肟、头孢特仑、头孢布烯、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克啶、头孢吡肟、头孢氟普南、头孢塞利、头孢唑仑、头孢匹罗、头孢喹诺、头孢比普罗、头孢他罗林、头孢氯美嗪、头孢洛仑、头孢帕罗、头孢卡奈、头孢曲洛、头孢哌酮、头孢曲唑、头孢维曲、头孢替林、头孢美啶、头孢维星、头孢唑啉、头孢舒胺、头孢呋西汀、头孢噻吩、复方制剂、头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦)、单环内酰胺类(氨曲南)、卡巴培南类(亚胺培南、亚胺培南/西司他丁、多利培南、厄他培南、美罗培南、美罗培南/法硼巴坦)、大环内酯类(阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、地红霉素、罗红霉素、泰利霉素)、林可酰胺类(克林霉素、林可霉素)、链阳霉素类(普那霉素、奎奴普丁/达福普汀)、氨基糖苷类(阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素)、喹诺酮类(氟甲喹、萘啶酸、奥索利酸、吡罗米酸、吡哌酸、罗索沙星、第二代、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、萘氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、芦氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、格帕沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、司帕沙星、替马沙星、托舒沙星、贝西沙星、德拉沙星、克林沙星、吉米沙星、普卢利沙星、西他沙星、曲伐沙星)、磺胺类药物(磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑)、四环素类药物(地美环素、强力霉素、米诺环素、土霉素、四环素、替加环素)、其他(脂肽、氟喹诺酮、脂糖肽、头孢菌素、大环内酯类、氯霉素、甲硝唑、替硝唑、呋喃妥因、糖肽、万古霉素、替考拉宁、脂糖肽、特拉万星、噁唑烷酮、利奈唑胺、环丝氨酸2、利福霉素、利福平、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐、多肽、杆菌肽、多粘菌素B、结核放线菌素、紫霉素、卷曲霉素)。

本领域技术人员将理解，组合物中每种抗生素的合适浓度取决于诸如抗生素的功效、稳定性、不同抗生素的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

抗真菌剂

本文描述的经修饰的脂质组合物还可以包含抗真菌剂。例如，可以将包含抗真菌剂的经修饰的脂质组合物施用于动物，施用量和时间足以：达到动物体内或身上抗真菌剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；和/或治疗或预防动物的真菌感染。本文描述的抗真菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的抗真菌剂。

如本文所用，术语“杀真菌剂”或“抗真菌剂”是指杀死或抑制真菌(诸如对动物致病的真菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或传播的物质。许多不同类型的抗真菌剂已经实现商业化生产。抗真菌剂的非限制性实例包括：烯丙胺类(阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬)、咪唑类((联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、酮康唑、异康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑)；三唑类(阿巴康唑、艾氟康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑)、噻唑类(阿巴芬净)、多烯类(两性霉素B、制霉菌素、纳他霉素、曲霉素)、棘白菌素类(阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净)，其他(托萘酯、氟胞嘧啶、布替萘芬、灰黄霉素、环吡咯酮、硫化硒、他伐硼罗)。本领域技术人员将理解，组合物中每种抗真菌剂的合适浓度取决于诸如抗真菌剂的功效、稳定性、不同抗真菌剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

杀虫剂

经修饰的脂质组合物还可以包含杀虫剂。例如，杀虫剂可以降低动物病原体的昆虫载体的适应性(例如，减少动物病原体的昆虫载体的生长或杀死动物病原体的昆虫载体)。可以将包含杀虫剂的经修饰的脂质组合物与昆虫接触，接触量和时间足以：(a)达到昆虫内部或上的杀虫剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)降低昆虫的适应性。在一些情况下，杀虫剂可以降低寄生昆虫的适应性(例如，减少寄生昆虫的生长或杀死寄生昆虫)。可以将包含杀虫剂的经修饰的脂质组合物与寄生昆虫或被其感染的动物接触，接触量和时间足以：(a)达到寄生昆虫内部或上的杀虫剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)降低寄生昆虫的适应性。本文描述的杀虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的杀虫剂。

如本文所用，术语“杀虫剂(insecticide)”或“杀虫剂(insecticidal agent)”是指杀死或抑制昆虫(诸如动物病原体的昆虫载体或寄生昆虫)的生长、增殖、繁殖或传播的物质。杀虫剂的非限制性实例示于WO 2021/041301的表4中，该文献以引用的方式整体并入本文。合适的杀虫剂的另外的非限制性实例包括上文在“异源农业剂”部分中关于杀虫剂已经讨论过的那些。本领域技术人员将理解，组合物中每种杀虫剂的合适浓度取决于诸如杀虫剂的功效、稳定性、不同杀虫剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

杀线虫剂

经修饰的脂质组合物还可以包含杀线虫剂作为治疗剂。用作治疗剂的杀线虫剂的非限制性实例包括上文在“异源农业剂”部分中关于杀线虫剂已经讨论过的那些。

抗寄生虫剂

经修饰的脂质组合物还可以包含抗寄生虫剂。例如，抗寄生虫剂可以降低寄生原生动物的适应性(例如，降低寄生原生动物的生长或杀死寄生原生动物)。可以将包含如本文所描述的抗寄生虫剂的经修饰的脂质组合物与原生动物接触，接触量和时间足以：(a)达到原生动物或被其感染的动物内部或上的抗寄生虫剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；以及(b)降低原生动物的适应性。这可用于治疗或预防动物体内的寄生虫。例如，可以将包含如本文所描述的抗寄生虫剂的经修饰的脂质组合物施用于动物，施用量和时间足以：达到动物体内或身上抗寄生虫剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；和/或治疗或预防动物体内的寄生虫(例如，寄生线虫、寄生昆虫或原生动物)感染。本文描述的抗寄生虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与其经修饰的脂质组合物缔合。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的抗寄生虫剂。

如本文所用，术语“抗寄生虫剂(antiparasitic)”或“抗寄生虫剂(antiparasiticagent)”是指杀死或抑制寄生虫(诸如寄生原生动物、寄生线虫或寄生昆虫)的生长、增殖、繁殖或传播的物质。抗寄生虫剂的实例包括驱虫药(苯海拉明、乙胺嗪、伊维菌素、氯硝柳胺、哌嗪、吡喹酮、噻嘧啶、吡维溴铵、苯并咪唑、阿苯达唑、氟苯达唑、甲苯达唑、噻苯达唑、左旋咪唑、硝唑尼特、莫诺潘太尔、艾莫德普斯、螺吲哚)、杀疥剂(苯甲酸苄酯、苯甲酸苄酯/双硫仑、林丹、马拉硫磷、氯菊酯)、杀虱剂(胡椒基丁醚/除虫菊酯、多杀菌素、莫昔克丁)、杀疥剂(克罗米通)、抗绦虫病药(氯硝柳胺、普拉喹酮、阿苯达唑)、抗阿米巴药(利福平、两性霉素B)；或抗原虫药(美拉胂醇、依氟鸟氨酸、甲硝唑、替硝唑、米替福新、青蒿素)。在某些情况下，抗寄生虫剂可用于治疗或预防牲畜感染，例如左旋咪唑、芬苯达唑、奥芬达唑、阿苯达唑、莫西菌素、依普利诺菌素、多拉菌素、伊维菌素或氯舒隆。本领域技术人员将理解，组合物中每种抗寄生虫剂的合适浓度取决于诸如抗寄生虫剂的功效、稳定性、不同抗寄生虫剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

抗病毒剂

经修饰的脂质组合物还可以包含抗病毒剂。可以将包含抗病毒剂的经修饰的脂质组合物施用于动物，施用量和时间足以：达到动物体内或身上抗病毒剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；和/或治疗或预防动物的病毒感染。本文描述的抗病毒剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的抗病毒剂。

如本文所用，术语“抗病毒剂”或“杀病毒剂”是指杀死或抑制病毒(诸如感染动物的病毒病原体)的生长、增殖、繁殖、发育或传播的物质。多种药剂可用作抗病毒剂，包括化学物质或生物药剂(例如，核酸，例如，dsRNA)。可用于本文的抗病毒剂的实例包括阿巴卡韦、阿昔洛韦(阿昔洛韦)、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦(阿吉拉塞)、安普利近、阿比多尔、阿扎那韦、阿特里普拉、巴拉韦、西多福韦、可比韦、度鲁特韦、达芦那韦、地拉韦啶、地达诺辛、二十二烷醇、依度尿定、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦肽、恩替卡韦、依可利弗、泛昔洛韦、福米韦生、福沙那韦、膦甲酸、膦甲酸钠、融合抑制剂、更昔洛韦、伊巴他滨、伊莫诺韦、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、干扰素III型、干扰素II型、干扰素I型、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦利德、马拉维若、吗啉胍、甲沙宗、奈非那韦、奈韦拉平、奈吉沙韦、硝唑尼特、核苷类似物、诺韦、奥司他韦(达菲)、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普来可那利、鬼臼毒素、雷替拉韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、吡拉米定、沙奎那韦、索非布韦、司他夫定、协同增强剂(抗逆转录病毒)、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦酯、替拉那韦、曲氟尿苷、三唑吡坦、曲金刚烷胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦(Valtrex)、缬更昔洛韦、维克里韦若、阿糖腺苷、维拉米定、扎西他滨、扎那米韦(Relenza)或齐多夫定。本领域技术人员将理解，组合物中每种抗病毒剂的合适浓度取决于诸如抗病毒剂的功效、稳定性、不同抗病毒剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。

驱避剂

经修饰的脂质组合物还可以包含驱避剂。例如，驱避剂可以驱避动物病原体(诸如昆虫)的载体。本文描述的驱避剂可以配制在用于本文描述的任何方法的经修饰的脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与经修饰的脂质组合物缔合。在一些情况下，经修饰的脂质组合物包含两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10种)不同的驱避剂。

例如，可以将包含如本文所描述的驱避剂的经修饰的脂质组合物与昆虫载体或载体的栖息地接触，接触量和时间足以：(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；和/或(b)相对于对照降低动物附近或附近动物身上的昆虫水平。可替代地，可以将包含如本文所描述的驱避剂的经修饰的脂质组合物与动物接触，接触量和时间足以：(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如，预定水平或阈值水平)；和/或(b)相对于未治疗的动物降低动物附近或动物身上的昆虫水平。

众所周知的驱虫剂的一些实例包括：苯偶酰；苯甲酸苄酯；2,3,4,5-双(丁基-2-烯)四氢糠醛(MGK驱避剂11)；丁氧基聚丙二醇；正丁基乙酰苯胺；正丁基-6,6-二甲基-5,6-二氢-1,4-吡喃酮-2-甲酸酯(Indalone)；己二酸二丁酯；邻苯二甲酸二丁酯；琥珀酸二正丁酯(Tabatrex)；N,N-二乙基-间甲苯酰胺(DEET)；碳酸二甲酯(endo,endo)-二甲基双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸酯)；邻苯二甲酸二甲酯；2-乙基-2-丁基-1,3-丙二醇；2-乙基-1,3-己二醇(Rutgers612)；二-正丙基异辛可部酯(MGK驱避剂326)；2-苯基环己醇；对甲烷-3,8-二醇和N,N-二乙基琥珀酰胺酸正丙酯。其他驱避剂包括香茅油、邻苯二甲酸二甲酯、正丁基异亚丙基丙酮草酸酯和2-乙基己二醇-1,3(参见Kirk-Othmer Encyclopedia ofChemical Technology,第2版,第11卷:724-728；以及The Condensed ChemicalDictionary,第8版,第756页)。

在一些情况下，驱避剂是驱虫剂，包括合成或非合成的驱虫剂。合成驱虫剂的实例包括邻氨基苯甲酸甲酯和其他基于邻氨基苯甲酸酯的驱虫剂、苯甲醛、避蚊胺(DEET，N,N-二乙基-间甲苯酰胺)、碳酸二甲酯、邻苯二甲酸二甲酯、埃卡瑞丁(即，派卡瑞丁、Bayrepel和KBR 3023)、避虫酮(例如，如在“6-2-2”混合物中使用的(60％邻苯二甲酸二甲酯、20％避虫酮、20％乙基己二醇)、IR3535(3-[正丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸、乙酯)、甲氧苄氟菊酯、氯菊酯、SS220或三环癸烯基烯丙基醚)。天然驱虫剂的实例包括紫珠(紫珠属(Callicarpa))叶、桦树皮、桃金娘(Myrica Gale)、猫薄荷油(例如，荆芥内酯)、香茅油、柠檬桉精油(Corymbia citriodora；例如，对薄荷烷-3,8-二醇(PMD))、印楝油、柠檬草、来自互叶白千层叶的茶树油、烟草或它们的提取物。

经修饰的脂质组合物的用途

经修饰的脂质组合物可用于多种农业或治疗应用。使用经修饰的脂质组合物的方法的实例在下文进一步描述。

向植物的递送

本文提供了将经修饰的脂质组合物递送至植物的方法，例如通过使植物或其部分(例如，植物的叶、种子、花粉、根、果实、芽、花、细胞、原生质体或组织(例如，分生组织))与经修饰的脂质组合物接触。在一些情况下，可以用不包含异源功能剂的经修饰的脂质组合物来处理植物。在其他情况下，经修饰的脂质组合物包含异源功能剂，例如农药剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀病毒剂、除草剂)、害虫防治剂(例如，驱避剂)、施肥剂或植物修饰剂。

在一些实施方案中，本文提供了一种提高植物的适应性的方法，该方法包括将经修饰的脂质组合物递送至植物，例如通过使植物或其部分(例如，植物的叶、种子、花粉、根、果实、芽、花、细胞、原生质体或组织(例如，分生组织))与本文描述的经修饰的脂质组合物(例如，以有效量和持续时间)接触，以提高植物相对于未处理的植物(例如，尚未递送经修饰的脂质组合物的植物)的适应性。

作为递送经修饰的脂质组合物的结果，植物的适应性的增加可以以多种方式表现出来，例如，从而导致植物的更好产量，例如，提高产量、提高植物的活力(例如，提高对非生物或生物胁迫的耐受性或提高对害虫的抗性)或提高从植物收获的产品的质量。植物产量的提高涉及植物的产品产量(例如，如通过植物生物量、籽粒、种子或果实产量、蛋白质含量、碳水化合物或油含量或叶面积所测量的)比在相同条件下但不施用本发明组合物或与施用常规农业剂相比产生的植物的相同产品的产量增加可测量的量。

作为递送经修饰的脂质组合物的结果，植物的适应性的增加也可以通过其他方法来测量，诸如活力等级、立地(每单位面积的植物数量)、植物高度、茎围、茎长、叶数、叶大小、植物冠层、视觉外观(诸如更绿的叶色)、根等级、出苗、蛋白质含量、分蘖增加、叶更大、叶更多、枯死的基生叶更少、分蘖更强、所需肥料更少、所需种子更少、分蘖产量更高、开花更早、谷粒或种子早熟、植物倒地(倒伏)更少、枝条生长增加、发芽更早或这些因素的任何组合的增加或改善，比在相同条件下但不施用本发明组合物或与施用常规农业剂相比产生的植物的相同因素增加可测量或显著的量。

在经修饰的脂质组合物中包含除草剂的情况下，本文提供了降低杂草的适应性或杀死杂草的方法。在此类情况下，与未处理的杂草(例如，未施用经修饰的脂质组合物的杂草)相比，该方法可有效地降低杂草的适应性约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。例如，该方法可以有效杀死杂草，从而与未处理的杂草相比将杂草的群体减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在一些情况下，该方法基本上消除了杂草。

可以根据本发明方法递送经修饰的脂质组合物(即“处理”)的植物包括整个植物及其部分，包括但不限于芽营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳、子叶和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如，分生组织、维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)以及它们的后代。植物部分还可以指植物的部分，诸如芽、根、茎、种子、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞片、枝、叶柄、节间、树皮、柔毛、分蘖、根茎、复叶、叶片、花粉、雄蕊等。

可以根据经修饰的脂质组合物处理的植物和杂草类型的实例可以在WO 2021/041301中找到，该文献以引用的方式整体并入本文。

递送至植物害虫

本文提供了将经修饰的脂质组合物递送至植物害虫的方法，例如通过使植物害虫与经修饰的脂质组合物接触。在一些情况下，可以用不包含异源功能剂的经修饰的脂质组合物来处理植物害虫。在其他情况下，经修饰的脂质组合物包含异源功能剂，例如农药剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀病毒剂或除草剂)或害虫防治剂(例如，驱避剂)。例如，该方法可用于降低害虫的适应性，例如通过递送经修饰的脂质组合物来预防或治疗害虫侵扰。

在一些实施方案中，本文提供了一种降低害虫的适应性的方法，该方法包括向害虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物(例如，以有效量和有效持续时间)，以相对于未处理的害虫(例如，尚未递送经修饰的脂质组合物的害虫)降低害虫的适应性。

在一些实施方案中，本文提供了一种减少(例如，治疗)患有真菌感染的植物中的真菌感染的方法，其中该方法包括向植物害虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物。在一些实施方案中，本文提供了一种减少(例如，治疗)患有真菌感染的植物中的真菌感染的方法，其中该方法包括向植物害虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物，并且其中经修饰的脂质组合物包含抗真菌剂。

在一些实施方案中，本文提供了一种减少(例如，治疗)患有天然感染的植物中的天然感染的方法，其中该方法包括向植物害虫害虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物。

在一些实施方案中，本文提供了一种减少(例如，治疗)患有天然感染的植物中的天然感染的方法，其中该方法包括向植物害虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物，并且其中经修饰的脂质组合物包含抗细菌剂。

在一些实施方案中，本文提供了一种降低昆虫植物害虫的适应性的方法，其中该方法包括向昆虫植物害虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物。

在一些实施方案中，本文提供了一种降低昆虫植物害虫的适应性的方法，其中该方法包括向昆虫植物害虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物，并且其中经修饰的脂质组合物包含杀虫剂。

在一些实施方案中，本文提供了一种降低线虫植物害虫的适应性的方法，其中该方法包括向线虫植物害虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物。

在一些实施方案中，本文提供了一种降低线虫植物害虫的适应性的方法，其中该方法包括向线虫植物害虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物，并且其中经修饰的脂质组合物包含杀线虫剂。

在一些实施方案中，本文提供了一种降低杂草的适应性的方法，其中该方法包括向杂草递送本文描述的经修饰的脂质组合物。

在一些实施方案中，本文提供了一种降低杂草的适应性的方法，其中该方法包括向杂草递送本文描述的经修饰的脂质组合物，并且其中经修饰的脂质组合物包含除草剂(例如草铵膦)。

合适的抗细菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、除草剂包括上文已经描述的那些。

作为递送经修饰的脂质组合物的结果的害虫适应性的降低可能以多种方式表现出来。在一些情况下，作为递送经修饰的脂质组合物的结果的害虫适应性的降低可能表现为害虫的生理机能的恶化或衰退(例如，健康状况或存活率降低)。在一些情况下，生物体的适应性可以通过一个或多个参数来测量，这些参数包括但不限于繁殖率、生育力、寿命、活力、移动性、繁殖力、害虫发育、体重、代谢率或活性，或与未施用经修饰的脂质组合物的害虫相比的存活率。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的害虫相比，害虫适应性的降低可能表现为害虫体内一种或多种营养素(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸或多肽)的产生减少。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的害虫相比，害虫适应性的降低可能表现为害虫对农药或化感剂的敏感性增加，和/或害虫对农药剂的抗性降低。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的害虫相比，本文提供的方法或组合物可有效降低害虫对寄生虫或病原体(例如，真菌、天然或病毒病原体或寄生虫)的抗性。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的害虫相比，本文提供的方法或组合物可有效降低害虫携带或传播植物病原体(例如，植物病毒(例如，TYLCV)或植物细菌(例如，农杆菌属(Agrobacterium)种)的能力。

递送至植物共生体

本文提供了将本文公开的经修饰的脂质组合物递送至植物共生体的方法。包括通过使共生体与经修饰的脂质组合物接触来将经修饰的脂质组合物递送至共生体(例如，天然内共生体、真菌内共生体或昆虫)的方法。这些方法可用于增加植物共生体(例如，有益于植物适应性的共生体)的适应性。在一些情况下，可以用不包含异源功能剂的经修饰的脂质组合物来处理植物共生体。在其他情况下，经修饰的脂质组合物包含异源功能剂，例如施肥剂。

因此，这些方法可用于增加植物共生体的适应性。在一个方面，本文提供了一种增加共生体的适应性的方法，该方法包括向共生体递送本文描述的经修饰的脂质组合物(例如，以有效量和有效持续时间)，以相对于未处理的共生体(例如，尚未递送经修饰的脂质组合物的共生体)增加共生体的适应性。

在一些实施方案中，本文提供了一种增加真菌(例如，植物的真菌内共生体)的适应性的方法，其中该方法包括向内共生体递送本文描述的经修饰的脂质组合物。

在一些实施方案中，本文提供了一种增加细菌(例如，植物的天然内共生体)的适应性的方法，其中该方法包括向细菌递送本文描述的经修饰的脂质组合物。

在一些实施方案中，本文提供了一种增加昆虫(例如，植物的昆虫共生体)的适应性的方法，其中该方法包括向昆虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物。

在一些情况下，共生体适应性的增加可以表现为作为施用经修饰的脂质组合物的结果的共生体的生理机能的改善(例如，健康状况或存活率改善)。在一些情况下，生物体的适应性可以通过一个或多个参数来测量，这些参数包括但不限于繁殖率、寿命、移动性、繁殖力、体重、代谢率或活性，或与未递送经修饰的脂质组合物的共生体相比的存活率。例如，与未施用经修饰的脂质组合物的共生体生物体相比，本文提供的方法或组合物可有效改善共生体的总体健康状况或改善共生体的总体存活率。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性的增加可能表现为由共生体进行的所需活动(例如，授粉、捕食害虫、种子传播或废物或有机材料的分解)的频率或效率的增加。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性的增加可能表现为共生体体内一种或多种营养素(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸或多肽)的产生增加。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性的增加可能表现为共生体对农药剂的敏感性降低，和/或共生体对农药剂的抗性增加。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性的增加可能表现为共生体对化感剂的敏感性降低，和/或共生体对化感剂的抗性增加。在一些情况下，化感剂是咖啡因、天然胱抑素N、单萜、二萜酸或酚类化合物。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可以通过增加共生体将化感剂代谢或降解为可用底物的能力来降低共生体对化感剂的敏感性。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的共生体生物体相比，本文提供的方法或组合物可有效增加共生体对寄生虫或病原体(例如，真菌、天然或病毒病原体；或寄生螨(例如，蜜蜂中的瓦螨))的抗性。

在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性的增加可能表现为其他适应性优势，诸如对某些环境因素的耐受性的改善(例如，高温或低温耐受性)、在某些栖息地中存活的能力的改善或维持某种饮食的能力的改善(例如，与玉米相比代谢天然食物的能力的改善)。

共生体适应性可以使用本领域中的任何标准方法来评估。在一些情况下，共生体适应性可以通过评估单个共生体来评估。可替代地，共生体适应性可以通过评估共生体群体来评估。例如，共生体适应性的增加可能表现为与其他昆虫成功竞争的增加，从而导致共生体群体大小的增加。

递送至动物病原体

本文提供了将本文描述的经修饰的脂质组合物递送至动物(例如人)病原体的方法，通过使病原体与经修饰的脂质组合物接触。如本文所使用的，术语“病原体”是指通过例如以下在动物中引起疾病或疾病症状的生物体，如微生物体或无脊椎动物：(i)直接感染动物，(ii)通过产生在动物中引起疾病或疾病症状的药剂(例如，产生致病毒素的细菌等)，和/或(iii)在动物中引发免疫(例如，炎性反应)(例如，叮咬昆虫，例如，臭虫)。如本文所用，病原体包括但不限于细菌、原生动物、寄生虫、真菌、线虫、昆虫、类病毒和病毒或其任何组合，其中每种病原体能够通过自身或与另一种病原体协同引发动物(诸如人)的疾病或症状。

在一些情况下，可以用不包含异源功能剂的经修饰的脂质组合物来处理动物(例如，人)病原体。在其他情况下，经修饰的脂质组合物包含异源功能剂，例如异源治疗剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或驱避剂)。这些方法可用于降低动物病原体的适应性，例如通过递送经修饰的脂质组合物来预防或治疗病原体感染或控制病原体传播。

可以根据本文描述的方法靶向的病原体的实例包括细菌(例如，链球菌属(Streptococcus)种、肺炎球菌属(Pneumococcus)种、假单胞菌属(Pseudomonas)种、志贺氏菌属(Shigella)种、沙门氏菌属(Salmonella)种、弯曲杆菌属(Campylobacter)种或埃希氏菌属(Escherichia)种)、真菌(酵母菌属(Saccharomyces)种或念珠菌属(Candida)种)、寄生昆虫(例如，臭虫属(Cimex)种)、寄生线虫(例如，Heligmosomoides种)或寄生原生动物(例如，滴虫属(Trichomoniasis)种)。

例如，本文提供了一种降低病原体的适应性的方法，该方法包括向病原体递送本文描述的经修饰的脂质组合物，其中该方法相对于未处理的病原体降低了病原体的适应性。在一些实施方案中，该方法包括将组合物递送至病原体生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个栖息地。在本文描述方法的一些情况下，组合物作为病原体可食用组合物递送，以供病原体摄取。在本文描述方法的一些情况下，组合物以液体、固体、气溶胶、糊剂、凝胶或气体的形式递送(例如，递送至病原体)。

本文还提供了一种降低寄生昆虫的适应性的方法，其中该方法包括向寄生昆虫递送经修饰的脂质组合物。在一些情况下，该方法包括向寄生昆虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物，其中经修饰的脂质组合物包含杀虫剂。例如，寄生昆虫可以是臭虫。本文提供了寄生昆虫的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的寄生昆虫，该方法降低了寄生昆虫的适应性

本文还提供了一种降低寄生线虫的适应性的方法，其中该方法包括向寄生线虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物。在一些情况下，该方法包括向寄生线虫递送本文描述的经修饰的脂质组合物，其中经修饰的脂质组合物包含杀线虫剂。例如，寄生线虫是多回螺旋线虫(Heligmosomoides polygyrus)。本文提供了寄生线虫的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的寄生线虫，该方法降低了寄生线虫的适应性。

本文还提供了一种降低寄生原生动物的适应性的方法，其中该方法包括向寄生原生动物递送本文描述的经修饰的脂质组合物。在一些情况下，该方法包括向寄生原生动物递送本文描述的经修饰的脂质组合物，其中经修饰的脂质组合物包含抗寄生虫剂。例如，寄生原生动物可以是阴道毛滴虫(T.vaginalis)。本文提供了寄生原生动物的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的寄生原生动物，该方法降低了寄生原生动物的适应性。

作为递送经修饰的脂质组合物的结果的病原体适应性的降低可能以多种方式表现出来。在一些情况下，作为递送经修饰的脂质组合物的结果的病原体适应性的降低可能表现为病原体的生理机能的恶化或衰退(例如，健康状况或存活率降低)。在一些情况下，生物体的适应性可以通过一个或多个参数来测量，这些参数包括但不限于繁殖率、生育力、寿命、活力、移动性、繁殖力、病原体发育、体重、代谢率或活性，或与未施用经修饰的脂质组合物的病原体相比的存活率。例如，本文提供的方法或组合物可有效降低病原体的总体健康状况或降低病原体的总体存活率。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受经修饰的脂质组合物的病原体中发现的水平)相比，病原体的存活率降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些情况下，与未施用经修饰的脂质组合物的病原体相比，这些方法和组合物有效降低病原体繁殖(例如，繁殖率、生育力)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受经修饰的脂质组合物的病原体中发现的水平)，这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿命、繁殖力或代谢率)降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。

在一些情况下，与未递送经修饰的脂质组合物的病原体相比，害虫适应性的降低可能表现为病原体对抗病原体剂的敏感性增加，和/或病原体对抗病原体剂的抗性降低。

在一些情况下，与未递送经修饰的脂质组合物的病原体相比，病原体适应性的降低可能表现为其他适应性缺点，诸如对某些环境因素的耐受性的降低(例如，高温或低温耐受性)、在某些栖息地中存活的能力的降低或维持某种饮食的能力的降低。

病原体适应性可以使用本领域中的任何标准方法来评估。在一些情况下，害虫适应性可以通过评估单个病原体来评估。可替代地，害虫适应性可以通过评估病原体群体来评估。例如，病原体适应性的降低可能表现为与其他病原体成功竞争的降低，从而导致病原体群体大小的减小。

本文描述的经修饰的脂质组合物和相关方法可用于降低动物病原体的适应性，从而治疗或预防动物感染。

递送至病原体载体

本文提供了将本文描述的经修饰的脂质组合物递送至病原体载体(诸如本文公开的病原体载体)的方法，通过使病原体载体与经修饰的脂质组合物接触。如本文所用，术语“载体”是指可以将动物病原体从宿主携带或传播至动物的昆虫。示例性载体包括昆虫，诸如具有刺吸式口器的昆虫，如在半翅目和一些膜翅目和双翅目中发现的昆虫，诸如蚊子、蜜蜂、黄蜂、蠓、虱子、采采蝇、跳蚤和蚂蚁，以及蛛形纲的成员，诸如蜱虫和螨虫。

在一些情况下，可以用不包含异源功能剂的经修饰的脂质组合物来处理动物(例如，人)病原体的载体。在其他情况下，经修饰的脂质组合物包含异源功能剂，例如异源治疗剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或驱避剂)。这些方法可用于降低病原体载体的适应性，例如通过递送经修饰的脂质组合物来控制病原体传播。可以根据本发明方法靶向的病原体载体的实例包括昆虫，诸如本文描述的那些。

例如，本文提供了一种降低动物病原体载体的适应性的方法，该方法包括向载体递送有效量的本文描述的经修饰的脂质组合物，其中该方法相对于未处理的载体降低了载体的适应性。在一些情况下，该方法包括将组合物递送至载体生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个栖息地。在一些情况下，组合物作为可食用组合物递送，以供载体摄取。在一些情况下，载体是昆虫。在一些情况下，昆虫是蚊子、蜱虫、螨虫或虱子。在一些情况下，组合物以液体、固体、气溶胶、糊剂、凝胶或气体的形式递送(例如，递送至病原体载体)。

例如，本文提供了一种降低动物病原体的昆虫载体的适应性的方法，其中该方法包括向载体递送本文描述的经修饰的脂质组合物。在一些情况下，该方法包括向载体递送经修饰的脂质组合物，其中经修饰的脂质组合物包含杀虫剂。例如，昆虫载体可以是蚊子、蜱虫、螨虫或虱子。本文提供了病原体载体的其他非限制性实例。在一些情况下，相对于未处理的载体，该方法降低了寄生载体的适应性。

在一些情况下，作为施用组合物的结果的载体适应性的降低可能表现为载体的生理机能的恶化或衰退(例如，健康状况或存活率降低)。在一些情况下，生物体的适应性可以通过一个或多个参数来测量，这些参数包括但不限于繁殖率、寿命、移动性、繁殖力、体重、代谢率或活性，或与未递送组合物的载体生物体相比的存活率。例如，本文提供的方法或组合物可有效降低载体的总体健康状况或降低载体的总体存活率。在一些情况下，载体的存活率的降低相对于参考水平(例如，在未接受组合物的载体中发现的水平)高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些情况下，与未递送组合物的载体生物体相比，该方法和组合物有效降低了载体繁殖(例如，繁殖率)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未递送组合物的载体中发现的水平)，该方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿命、繁殖力或代谢率)降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。

在一些情况下，与未递送组合物的载体生物体相比，载体适应性的降低可能表现为载体对农药剂的敏感性增加，和/或载体对农药剂的抗性降低。在一些情况下，与未递送组合物的载体相比，本文提供的方法或组合物可以通过降低载体将农药剂代谢或降解为可用底物的能力来增加载体对农药剂的敏感性。

在一些情况下，与未递送组合物的载体生物体相比，载体适应性的降低可能表现为其他适应性缺点，诸如对某些环境因素的耐受性的降低(例如，高温或低温耐受性)、在某些栖息地中存活的能力的降低或维持某种饮食的能力的降低。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可以以本文描述的任何多种方式有效降低载体适应性。此外，组合物可以降低任何数量的载体纲、目、科、属或种(例如，1个载体种、2、3、4、5、6、7、8、9,10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500个或更多个载体种)的载体适应性。在一些情况下，组合物作用于单个载体纲、目、科、属或种。

载体适应性可以使用本领域中的任何标准方法来评估。在一些情况下，载体适应性可以通过评估单个载体来评估。可替代地，载体适应性可以通过评估载体群体来评估。例如，载体适应性的降低可能表现为与其他载体成功竞争的降低，从而导致载体群体大小的减小。

通过降低携带动物病原体的载体的适应性，本文提供的组合物有效减少载体传播疾病的传播。可以使用本文描述的任何调配物和递送方法以有效减少疾病传播(例如，减少载体之间的垂直或水平传播和/或减少向动物的传播)的量和持续时间将组合物递送至昆虫。例如，与未递送组合物的载体生物体相比，本文描述的组合物可以将载体传播的病原体的垂直或水平传播降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。又如，与未递送组合物的载体生物体相比，本文描述的组合物可以将昆虫载体的载体能力降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。

递送至动物

本文提供了将本文描述的经修饰的脂质组合物递送至动物细胞、组织或受试者(例如，哺乳动物，例如，人)的方法，例如通过使动物细胞、组织、受试者或其一部分与经修饰的脂质组合物接触。在一些情况下，可以用不包含异源功能剂的经修饰的脂质组合物来治疗动物。在其他情况下，经修饰的脂质组合物包含异源功能剂，例如异源治疗剂(例如，治疗性蛋白质或肽核酸或小分子、抗细菌剂、抗真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或驱避剂)。

在一个方面，本文提供了一种增加动物(例如，人)的适应性的方法，该方法包括向动物递送本文描述的经修饰的脂质组合物(例如，以有效量和持续时间)，以相对于未治疗的动物(例如，尚未递送经修饰的脂质组合物的动物)增加动物的适应性。

作为递送经修饰的脂质组合物的结果的动物的适应性的增加可以通过评估动物适应性(例如，哺乳动物的适应性，例如，人的适应性(例如，健康状况))的任何方法来确定。

本文提供了一种改变或增加动物(例如，人)的适应性的方法，该方法包括向动物递送有效量的本文描述的经修饰的脂质组合物，其中该方法改变动物，从而相对于未治疗的动物在动物中引入或增加有益性状(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。具体地，相对于未治疗的动物，该方法可以增加动物(例如，哺乳动物，例如，人)的适应性(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。

在另一方面，本文提供了一种增加动物(例如，人)的适应性的方法，该方法包括使动物的细胞与有效量的本文描述的经修饰的脂质组合物接触，其中该方法相对于未治疗的动物增加了动物(例如，哺乳动物，例如，人)的适应性(例如，增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。

在某些情况下，动物是哺乳动物，例如人。在某些情况下，动物是牲畜动物或兽医动物。在某些情况下，动物是老鼠。

施用方法

可以以允许将组合物递送或施用至植物的任何合适的方式将本文描述的植物暴露于本文描述的经修饰的脂质组合物。经修饰的脂质组合物可以单独递送或与其他活性物质(例如，施肥剂)或非活性物质组合递送，并且可以通过例如喷洒、注射(例如，显微注射)、穿过植物、倾倒、浸渍以浓缩液体、凝胶、溶液、悬浮液、喷雾剂、粉末、丸粒、团块、砖块等的形式施用，被配制以递送有效浓度的经修饰的脂质组合物。用于施用本文描述的组合物的量和位置通常由植物的栖息地、植物可以被经修饰的脂质组合物靶向的生命周期阶段、要进行施用的部位以及经修饰的脂质组合物的物理和功能特征来确定。

在一些情况下，通过例如背负式喷洒、空中喷洒、作物喷洒/除尘等将组合物直接喷洒到植物例如作物上。在将经修饰的脂质组合物递送至植物的情况下，接受经修饰的脂质组合物的植物可以处于植物生长的任何阶段。例如，配制的经修饰的脂质组合物可以在植物生长的早期阶段作为种子包衣或根部处理施用，或者在作物周期的后期作为全植物处理施用。在一些情况下，经修饰的脂质组合物可以作为局部药剂施用于植物。

此外，经修饰的脂质组合物可以作为被植物组织吸收和分布的系统性药剂施用(例如，在植物生长的土壤中，或在用于浇灌植物的水中)。在一些情况下，植物或食用生物体可以通过基因转化来表达经修饰的脂质组合物。

延迟或连续释放也可以通过以下方式来实现：用可溶解或可生物侵蚀的包衣层(诸如明胶)包衣经修饰的脂质组合物或具有经修饰的脂质组合物的组合物，该包衣在使用环境中溶解或侵蚀，然后使经修饰的脂质组合物可用，或者通过将药剂分散在可溶解或可侵蚀的基质中。可以有利地采用此类连续释放和/或分配装置来持续维持本文描述的一种或多种经修饰的脂质组合物的有效浓度。

在一些情况下，将经修饰的脂质组合物递送至植物的一部分，例如叶、种子、花粉、根、果实、芽或花，或其组织、细胞或原生质体。在一些情况下，将经修饰的脂质组合物递送至植物的细胞。在一些情况下，将经修饰的脂质组合物递送至植物的原生质体。在一些情况下，将经修饰的脂质组合物递送至植物的组织。例如，可以将组合物递送至植物的分生组织(例如，顶端分生组织、侧向分生组织或居间分生组织)。在一些情况下，将组合物递送至植物的永久组织(例如，简单组织(例如，薄壁组织、厚角组织或厚壁组织)或复杂永久组织(例如，木质部或韧皮部))。在一些情况下，将组合物递送至植物胚胎。

在一些情况下，经修饰的脂质组合物可以以每公顷经修饰的脂质组合物的量(g/ha或kg/ha)或每公顷活性成分(例如，具有或不具有异源功能剂的经修饰的脂质组合物)的量或酸当量(kg a.i./ha或g a.i./ha)推荐用于田间施用。在一些情况下，可能需要将本发明组合物中较低量的异源功能剂施用于土壤、植物培养基、种子、植物组织或植物，以实现与在缺乏经修饰的脂质组合物的组合物中施用异源功能剂相同的结果。例如，异源功能剂的量可以是在未经修饰的脂质组合物中施用的相同异源功能剂的约1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/15、1/20、1/30、1/50或1/100(或约1/100至约1/2之间的任何范围，例如约1/10至1/2；约1/15至1/5、约1/20至1/10；约1/50至1/10)的水平施用，例如直接施用相同异源功能剂而不施用经修饰的脂质组合物。经修饰的脂质组合物可以以每公顷的多种量施用，例如约0.0001、0.001、0.005、0.01、0.1、1、2、10、100、1,000、2,000、5,000(或约0.0001至5,000之间的任何范围)kg/ha。例如，约0.0001至约0.01、约0.01至约10、约10至约1,000、约1,000至约5,000kg/ha。

治疗方法

本文描述的经修饰的脂质组合物也可用于多种治疗方法。例如，这些方法和组合物可用于预防或治疗动物(例如，人)的病原体感染。如本文所用，术语“治疗”是指出于预防性和/或治疗性目的向动物施用药物组合物。“预防感染”是指对尚未患病但易患特定疾病或处于特定疾病风险中的动物进行预防性治疗。“治疗感染”是指对已经患有疾病的动物施用治疗，以改善或稳定动物的状况。本发明方法涉及将本文描述的经修饰的脂质组合物递送至动物，诸如人。

例如，本文提供了一种治疗患有真菌感染的动物的方法，其中该方法包括向动物施用有效量的经修饰的脂质组合物。在一些情况下，该方法包括向动物施用有效量的本文描述的经修饰的脂质组合物，其中经修饰的脂质组合物包含抗真菌剂。在一些情况下，抗真菌剂是抑制引起真菌感染的真菌中的基因表达的核酸。

在另一方面，本文提供了一种治疗患有天然感染的动物的方法，其中该方法包括向动物施用有效量的经修饰的脂质组合物。在一些情况下，该方法包括向动物施用有效量的本文描述的经修饰的脂质组合物，并且其中经修饰的脂质组合物包含抗细菌剂。在一些情况下，该方法减少或基本上消除了天然感染。在一些情况下，动物是人、兽医动物或牲畜动物。

本发明方法可用于治疗动物的感染(例如，由动物病原体引起的感染)，这是指对已经患有疾病的动物施用治疗以改善或稳定动物的状况。这可以涉及相对于起始量减少一种或多种病原体在动物体内、在动物身上或在动物周围的定殖(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)和/或使个体受益(例如，减少足以缓解症状的量的定殖)。在此类情况下，治疗后的感染可能表现为症状的减少(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些情况下，治疗后的感染有效地增加个体的生存可能性(例如，生存可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)或增加群体的总体生存期(例如，生存可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。例如，组合物和方法可以有效地“基本上消除”感染，这是指感染的减少量足以持续缓解动物的症状(例如，持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。

本发明方法可用于预防感染(例如，由动物病原体引起的感染)，其是指预防一种或多种病原体在动物体内、在动物身上或在动物周围的定殖增加(例如，相对于未治疗的动物增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)，其量足以维持初始病原体群体(例如，大约在健康个体中发现的量)，预防感染的发生和/或预防与感染相关的症状或疾患。例如，个体可以在准备进行侵入性医疗程序(例如，准备手术，诸如接受移植、干细胞疗法、移植物、假体、接受长期或频繁静脉内导管插入术或在重症监护室中接受治疗)时、在免疫功能低下的个体(例如，患有癌症、患有HIV/AIDS或服用免疫抑制剂的个体)中或在经历长期抗生素疗法的个体中接受预防性治疗以预防真菌感染。

可以将经修饰的脂质组合物配制用于施用或通过任何合适的方法施用，包括例如静脉内、肌内、皮下、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肿瘤内、腹膜、结膜下、囊内、粘膜、心包内、脐内、眼内、眶内、口服、局部、透皮、玻璃体内(例如，通过玻璃体内注射)、通过滴眼液、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接浸浴靶细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗、在乳膏中或在脂质组合物中。本文描述的方法中使用的组合物也可以全身或局部施用。施用方法可以根据多种因素(例如，所施用的化合物或组合物以及所治疗的疾患、疾病或病症的严重程度)而变化。在一些情况下，经修饰的脂质组合物通过静脉内、肌内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内或鼻内施用。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分地取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了多种给药方案，包括但不限于在不同时间点的单次或多次施用、推注施用和脉冲输注。

对于本文描述的感染的预防或治疗(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、是出于预防还是治疗目的施用、先前的治疗、患者的临床病史和对经修饰的脂质组合物的反应。经修饰的脂质组合物可以例如一次性或在一系列治疗中施用于患者。对于在几天或更长时间内的重复施用，根据疾患，治疗通常将持续到对疾病症状的所需抑制发生或感染不再可检测到为止。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每两周(例如，使得患者接受例如约两至约二十个剂量的经修饰的脂质组合物)。可以施用初始较高装载剂量，随后施用一个或多个较低剂量。然而，其他剂量方案也可能有用。这种疗法的进展很容易通过常规技术和测定来监测。

在一些情况下，向个体(例如，人)施用的经修饰的脂质组合物的量可以在个体体重的约0.01mg/kg至约5g/kg(例如，约0.01mg/kg-0.1mg/kg、约0.1mg/kg-1mg/kg、约1mg/kg-10mg/kg、约10mg/kg-100mg/kg、约100mg/kg-1g/kg或约1g/kg-5g/kg)的范围内。在一些情况下，向个体(例如，人)施用的经修饰的脂质组合物的量为个体体重的至少0.01mg/kg(例如，至少0.01mg/kg、至少0.1mg/kg、至少1mg/kg、至少10mg/kg、至少100mg/kg、至少1g/kg或至少5g/kg)。该剂量可以作为单剂量或作为多剂量(例如，2、3、4、5、6、7或超过7个剂量)施用。在一些情况下，向动物施用的经修饰的脂质组合物可以单独施用或与另外的治疗剂组合施用。与单一治疗相比，在组合治疗中施用的抗体的剂量可以减少。这种疗法的进展很容易通过常规技术来监测。

试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括装有本文描述的经修饰的脂质组合物的容器。试剂盒还可以包括用于根据本发明的方法将经修饰的脂质组合物施用或递送至植物的指导材料。本领域技术人员应当理解，在本发明的方法中应用经修饰的脂质组合物的说明书可以是任何形式的说明书。此类说明包括但不限于书面说明材料(诸如标签、小册子、活页)、口头指导材料(诸如录音带或CD)或视频说明(诸如录像带或DVD)。

用于病毒感染的核酸疫苗

当组合物包含抗原性多肽以对抗各种病毒感染时，经修饰的脂质组合物可用作核酸疫苗组合物。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗调配物包含编码一种或多种抗原性多肽以对抗各种病毒感染的一种或多种多核苷酸(例如，mRNA)。一种或多种多核苷酸(例如，mRNA)编码源自引起感染性疾病、病症或疾患的感染因子(例如，由RNA病毒引起的病毒感染)的一种或多种抗原性多肽。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码如下文所描述的各种病毒类型和毒株的一种或多种野生型或工程化抗原(或针对抗原的抗体)。

病毒感染.

经修饰的脂质组合物/核酸疫苗可适用于对抗与病毒感染相关的感染性疾病、病症或疾患，包括但不限于急性发热性咽炎、咽结膜热、流行性角膜结膜炎、婴儿胃肠炎、柯萨奇感染、传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、原发性HSV-1感染(例如，儿童牙龈口炎、成人扁桃体炎和咽炎、角膜结膜炎)、潜伏性HSV-1感染(例如，唇疱疹和唇疱疹)、原发性HSV-2感染、潜伏性HSV-2感染、无菌性脑膜炎、传染性单核细胞增多症、巨细胞包涵体病、卡波西肉瘤、多中心castleman病、原发性渗出性淋巴瘤、AIDS、流感、莱氏综合征、麻疹、感染后脑脊髓炎、腮腺炎、增生性上皮病变(例如，寻常疣、扁平疣、跖疣和肛门生殖器疣、喉乳头状瘤、疣状表皮发育不良)、宫颈癌、鳞状细胞癌、哮吼、肺炎、细支气管炎、普通感冒、脊髓灰质炎、狂犬病、细支气管炎、肺炎、流感样综合征、伴有肺炎的严重细支气管炎、德国麻疹、先天性风疹、水痘和带状疱疹。

示例性病毒感染剂包括但不限于选自由以下各项组成的组的病毒株：腺病毒；1型单纯疱疹；2型单纯疱疹；脑炎病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；人巨细胞病毒；8型人疱疹病毒；人乳头瘤病毒；BK病毒；JC病毒；天花；脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒；人博卡病毒；细小病毒B19；人星状病毒；诺沃克病毒；柯萨奇病毒；甲型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；严重急性呼吸综合征病毒；丙型肝炎病毒；黄热病病毒；登革热病毒；西尼罗河病毒；风疹病毒；戊型肝炎病毒；人类免疫缺陷病毒(HIV)；甲型或乙型流感病毒；瓜纳里托病毒；胡宁病毒；拉沙病毒；马丘波病毒；萨比亚病毒；克里米亚-刚果出血热病毒；埃博拉病毒；马尔堡病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；呼吸道合胞病毒；人偏肺病毒；亨德拉病毒；尼帕病毒；狂犬病病毒；丁型肝炎；轮状病毒；环状病毒；科罗拉多蜱热病毒；汉坦病毒、中东呼吸道冠状病毒；基孔肯雅热病毒或版纳病毒。

感染因子可以是选自下表中的病毒的病毒株。

其他合适的病毒感染和病毒感染剂在美国专利申请公开号US2019/0015501和美国专利第11,007,260号中，这两个专利以引用的方式整体并入。

蚊媒病毒

登革热.在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码登革热病毒(黄病毒)的毒株。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)编码E蛋白结构域III(DENV1-4串联mRNA)、E蛋白结构域I/II铰链区(DENV1-4单个mRNA)、prM蛋白(DENV1-4串联或单个mRNA)和C蛋白(DENV1-4串联或单个mRNA)。

基孔肯雅热病毒.在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码基孔肯雅热病毒的毒株。在一些实施方案中，抗原性多肽编码选自由C、E1、E2、E3、6K和C-E3-E2-6K-E1组成的组的基孔肯雅热包膜和/或衣壳抗原性多肽。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码选自以下毒株和分离株的基孔肯雅热多肽：TA53、SA76、UG82、37997、IND-06、Ross、S27、M-713424、E1-A226V、E1-T98、IND-63-WB1、Gibbs 63-263、TH35、1-634029、AF15561、IND-73-MH5、653496、C0392-95、P0731460、MY0211MR/06/BP、SV0444-95、K0146-95、TSI-GSD-218-VR1、TSI-GSD-218、M127、M125、6441-88、MY003IMR/06/BP、MY0021MR/06/BP、TR206/H804187、MY/06/37348、MY/06/37350、NC/2011-568、1455-75、RSU1、0706aTw、InDRE51CHIK、PR-S4、AMA2798/H804298、Hu/85/NR/001、PhH15483、0706aTw、0802aTw、MY019IMR/06/BP、PR-S6、PER160/H803609、99659、JKT23574、0811aTw、CHIK/SBY6/10、2001908323-BDG E1、2001907981-BDG E1、2004904899-BDG E1、2004904879-BDG E1、2003902452-BDG E1、DH130003、0804aTw、2002918310-BDG E1、JC2012、chik-sy、3807、3462、Yap 13-2148、PR-S5、0802aTw、MY019IMR/06/Bp、0706aTw、PhH15483、Hu/85/NR/001、CHIKV-13-112A、InDRE4CHIK、0806aTw、0712aTw、3412-78、Yap 13-2039、LEIV-CHIKV/Moscow/1、DH130003和20039。

寨卡病毒.在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码寨卡病毒(黄病毒)的毒株。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码来自选自由MR 766、SPH2015和ACD75819组成的组的ZIKV血清型的ZIKV多肽。

委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒.在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码VEE病毒的毒株。

经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)可以编码其他类型的病毒和蚊媒病毒的毒株或其片段，如美国专利第11,007,260号中所描述的，该专利以引用的方式整体并入本文。

流感

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码流感病毒的毒株。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码甲型流感或乙型流感或它们的组合的毒株。在一些实施方案中，甲型流感或乙型流感的毒株与鸟、猪、马、狗、人或非人灵长类动物相关。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码血凝素蛋白或其片段。在一些实施方案中，血凝素蛋白是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18或其片段。在一些实施方案中，血凝素蛋白不包含头部结构域(HA1)。在一些实施方案中，血凝素蛋白包含头部结构域(HA1)的一部分。在一些实施方案中，血凝素蛋白不包含胞质结构域。在一些实施方案中，血凝素蛋白包含胞质结构域的一部分。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码截短的血凝素蛋白。在一些实施方案中，截短的血凝素蛋白包含跨膜结构域的一部分。在一些实施方案中，病毒选自由H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H10N8组成的组。

经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)可以编码其他类型的病毒和流感病毒的毒株或其片段，如美国专利申请公开号2019/0015501中所描述的，该专利以引用的方式整体并入本文。

冠状病毒

β冠状病毒.在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包含β冠状病毒(BetaCoV)的刺突蛋白(S)或其片段或亚基的肽/蛋白质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)包含编码包含β冠状病毒(BetaCoV)的刺突蛋白(S)或其片段或亚基的肽/蛋白质的开放阅读框。

经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)可以编码不同类型的β冠状病毒和β冠状病毒的毒株或其片段，如美国专利第10,933,127号中所描述的，该专利以引用的方式整体并入本文。

中东呼吸综合征冠状病毒.在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包含MERS冠状病毒的刺突蛋白(S)、刺突S1片段(S1)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和/或核衣壳蛋白(N)或这些蛋白质中任一种的片段或变体的肽/蛋白质。

经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)可以编码MERS冠状病毒的毒株或其片段，如美国专利申请公开号US2019/0351048中所描述的，该专利以引用的方式整体并入本文。

SARS-CoV-2

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码SARS-CoV-2的一种或多种野生型或工程化抗原(或针对抗原的抗体)。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)的开放阅读框编码SARS-CoV-2的一种或多种野生型或工程化抗原(或针对抗原的抗体)。在一些实施方案中，开放阅读框是密码子优化的。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包含SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白(S)、膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白和/或核衣壳(NC)蛋白或其片段或变体的肽/蛋白质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包含SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白(S)或其片段或变体的肽/蛋白质。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包含SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白(S)的至少一个或两个结构域并且少于全长刺突蛋白的肽/蛋白质。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)包含编码具有双脯氨酸稳定突变的SARS-CoV-2刺突(S)的开放阅读框(ORF)。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码选自由以下各项组成的组的SARS-CoV-2病毒的毒株或变体：

α(谱系B.1.1.7、Q.1-Q.8)，

β(谱系B.1.351、B.1.351.2、B.1.351.3)，

δ

γ(谱系P.1、P.1.1、P.1.2)

ε(谱系B.1.427、B.1.429)

η(谱系B.1.525)

ι(谱系B.1.526)

κ(谱系B.1.617.1)

B.1.617.3

λ(谱系C.37)

μ(谱系B.1.621、B.1.621.1)

ζ(谱系P.2)。

ο

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码SARS-CoV-2刺突(S)和/或RBD或其片段。在一些实施方案中，S抗原和/或其RBD抗原片段包含RBD内选自由以下各项组成的组的一个或多个突变：K417N或K417T、N439N、N440K、G446V、L452R、Y453F、S477G或S477N、E484Q或E484K、F490S、N501S或N501Y、D614G、Q677P或Q677H、P681H或P681R。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码SARS-CoV-2刺突(S)和/或RBD或其片段。在一些实施方案中，S抗原包含稳定刺突三聚体的突变，包括例如K986P和V987P突变(S-2P变体)和其他脯氨酸取代，特别是F817P、A892P、A899P和A942P，它们可以组合在一起以获得多脯氨酸变体，特别是六脯氨酸变体(HexaPro)。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码SARS-CoV-2刺突(S)和/或RBD或其片段。在一些实施方案中，S抗原包含选自由以下各项组成的组的一个或多个突变：取代L18F、T20N、P26S、D80A、D138Y、R190S、D215G、A570D、D614G、H655Y、P681H、A701V、T716I、S982A、T1027I、D1118H和V1176F；以及缺失δ69-70、δ144、δ242-244和δ246-252。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码SARS-CoV-2刺突(S)和/或RBD或其片段。在一些实施方案中，S抗原或其RBD抗原片段包含以下突变：N501Y；E484K和N501Y；K417T或K417N、E484K和N501Y；K417N、N439N、Y453F、S477N、E484K、F490S和N501Y；K417N、N439N、L452R、S477N、E484K、F490S和N501Y。

其他突变可以在WO 2021/154763A1中找到，该文献以引用的方式整体并入。

多核苷酸的元件

本文描述的多核苷酸(例如，线性或环状多核糖核苷酸)可以包含本文描述的元件中的任何一种或多种以及编码多肽的表达序列。

在一些实施方案中，多核苷酸可以是mRNA、siRNA或siRNA前体、微小RNA(miRNA)或miRNA前体、质粒、Dicer底物小干扰RNA(dsiRNA)、短发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代、锁核酸(LNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶、脱氧核酶(DNAzyme)、适体、环状RNA(circRNA)、向导RNA(gRNA)或编码这些RNA中的任一种的DNA分子。在一个实施方案中，多核苷酸是mRNA。

由本公开内容的核酸编码的变体抗原/多肽可以含有赋予许多所需特性中的任一种的氨基酸变化，例如增强它们的免疫原性、增强它们的表达和/或改善它们在受试者中的稳定性或PK/PD特性。变体抗原/多肽可以使用常规诱变技术来制备，并进行适当的测定以确定它们是否具有所需特性。确定表达水平和免疫原性的测定法是本领域所熟知的，并且在实施例部分中列出了示例性的此类测定法。类似地，蛋白质变体的PK/PD特性可以使用本领域公认的技术来测量，例如，通过确定接种疫苗的受试者随时间的抗原表达和/或通过观察诱导的免疫反应的持久性。由变体核酸编码的蛋白质的稳定性可以通过测定热稳定性或尿素变性后的稳定性来测量，或者可以使用计算机预测来测量。用于此类实验和计算机模拟测定的方法是本领域已知的。

术语“同一性”是指如通过比较两个或更多个多肽(例如抗原)或多核苷酸(核酸)的序列所确定的序列之间的关系。同一性还指代序列之间的序列相关性程度，如通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基的串之间的匹配数量所确定的。同一性测量两个或更多个序列中较小序列之间的相同匹配的百分比，其中间隙比对(如果有的话)通过特定数学模型或计算机程序(例如“算法”)解决。相关抗原或核酸的同一性可以通过已知方法容易地计算。应用于多肽或多核苷酸序列的“同一性百分比(％)”被定义为在比对氨基酸序列和核酸序列与第二序列并在需要时引入间隙以实现最大同一性百分比之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基相同的残基(氨基酸残基或核酸残基)的百分比。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是熟知的。应当理解，同一性取决于同一性百分比的计算，但由于计算中引入的间隙和罚分，其值可能不同。通常，特定多核苷酸或多肽(例如，抗原)的变体与该特定参考多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性，如通过本文描述和本领域技术人员已知的序列比对程序和参数所确定的。此类用于比对的工具包括BLAST套件(Stephen F.Altschul等人(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database searchprograms”,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)的工具。另一种流行的局部比对技术是基于Smith-Waterman算法(Smith,T.F.和Waterman,M.S.(1981)“Identification of commonmolecular subsequences.”J.Mol.Biol.147:195-197)。基于动态编程的通用全局比对技术是Needleman-Wunsch算法(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)“A general methodapplicable to the search for similarities in the amino acid sequences of twoproteins.”J.Mol.Biol.48:443-453)。最近，已经开发了快速最佳全局序列比对算法(FOGSAA)，据称其比包括尼德曼-翁施算法在内的其他最佳全局比对算法方法更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。

因此，编码相对于参考序列、特别是本文公开的多肽(例如，抗原)序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如，如一种或多种赖氨酸等序列标签或氨基酸，可以被添加到肽序列中(例如，在N末端或C末端处)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可以用于增加肽溶解度或允许生物素化。可替代地，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基酸末端区的氨基酸残基可以任选地缺失，从而提供截短的序列。某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可以可替代地取决于序列的使用而缺失，例如作为可溶或与固相载体连接的较大序列的一部分的序列的表达。在一些实施方案中，用于(或编码)信号序列、终止序列、跨膜结构域、接头、多聚化结构域(如，折叠区)等的序列可以被实现相同或类似功能的替代性序列取代。在一些实施方案中，可以例如通过引入较大的氨基酸来填充蛋白质核心中的空腔以改善稳定性。在其他实施方案中，埋入的氢键网络可以被疏水驻留物置换以改善稳定性。在又其他实施方案中，糖基化位点可以被去除并被适当残基置换。这类序列是本领域技术人员容易鉴定的。还应当理解，本文提供的一些序列含有序列标签或末端肽序列(例如，在N末端或C末端处)，其可以例如在用于制备RNA(例如，mRNA)疫苗之前缺失。

如本领域技术人员所认识到的，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也被认为在感兴趣的冠状病毒抗原的范围内。例如，本文提供了参考蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参考抗原序列短至少一个氨基酸残基但在其他方面相同的多肽序列)，条件是该片段是免疫原性的并且赋予对冠状病毒的保护性免疫反应。除了与参考蛋白质相同但被截短的变体之外，在一些实施方案中，抗原包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个突变，如本文提供或引用的任何序列中所示。抗原/抗原性多肽的长度范围可为约4、6或8个氨基酸至全长蛋白质。

多核糖核苷酸货物

本文描述的多核糖核苷酸货物包括包含至少一个多核糖核苷酸的任何序列。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含表达序列、非编码序列或表达序列和非编码序列。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含编码多肽的表达序列。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含可操作地连接至编码多肽的表达序列的IRES。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含编码对受试者具有生物学效应的多肽的表达序列。

多核糖核苷酸货物可以例如包含至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸或至少约20,000个核苷酸。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含1-20,000个核苷酸、1-10,000个核苷酸、1-5,000个核苷酸、100-20,000个核苷酸、100-10,000个核苷酸、100-5,000个核苷酸、500-20,000个核苷酸、500-10,000个核苷酸、500-5,000个核苷酸、1,000-20,000个核苷酸、1,000-10,000个核苷酸或1,000-5,000个核苷酸。

在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含一个或多个表达(或编码)序列，其中每个表达(或编码)序列编码一个多肽。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含一个或多个非编码序列。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物完全由非编码序列组成。在一些实施方案中，多核糖核苷酸货物包含表达(或编码)和非编码序列的组合。

在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括如国际专利公开号WO2019/118919中公开的任何特征或特征的任何组合，该专利以引用的方式整体并入本文。

表达序列

在一些实施方案中，本文描述的多核糖核苷酸(例如，环状多核糖核苷酸的多核糖核苷酸货物)包含一个或多个表达(或编码)序列，其中每个表达序列编码肽或多肽。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个表达(或编码)序列。

此类肽可以包括但不限于小肽、肽模拟物(例如，肽)、氨基酸和氨基酸类似物。

此类肽可具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量以及此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。

每个编码的多肽可以是直链或支链的。在各种实施方案中，多肽的长度为约5至约40,000个氨基酸、约15至约35,000个氨基酸、约20至约30,000个氨基酸、约25至约25,000个氨基酸、约50至约20,000个氨基酸、约100至约15,000个氨基酸、约200至约10,000个氨基酸、约500至约5,000个氨基酸、约1,000至约2,500个氨基酸或它们之间的任何范围。在一些实施方案中，多肽的长度少于约40,000个氨基酸、少于约35,000个氨基酸、少于约30,000个氨基酸、少于约25,000个氨基酸、少于约20,000个氨基酸、少于约15,000个氨基酸、少于约10,000个氨基酸、少于约9,000个氨基酸、少于约8,000个氨基酸、少于约7,000个氨基酸、少于约6,000个氨基酸、少于约5,000个氨基酸、少于约4,000个氨基酸、少于约3,000个氨基酸、少于约2,500个氨基酸、少于约2,000个氨基酸、少于约1,500个氨基酸、少于约1,000个氨基酸、少于约900个氨基酸、少于约800个氨基酸、少于约700个氨基酸、少于约600个氨基酸、少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸或更少可能是有用的。

在一些实施方案中，多肽是或包括参考多肽的功能片段或变体。例如，多肽可以是本文描述的任何多肽的功能活性变体，其与本文描述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，例如在指定区域或整个序列上。在一些情况下，多肽可以与所关注蛋白质具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更高)同一性。

在一些实施方案中，多核苷酸货物包含编码信号肽的序列。已经描述了许多信号肽序列，例如，Tat(双精氨酸易位)信号序列通常是含有共有序列SRRxFLK“双精氨酸”基序的N末端肽序列，其用于将含有这种Tat信号肽的折叠蛋白质易位穿过脂质双层。还参见例如可在www[dot]signalpeptide[dot]de上公开获得的信号肽数据库。信号肽也可用于将蛋白质引导至特定细胞器；参见例如Spdb信号肽数据库中公开的实验确定和计算预测的信号肽，该数据库可在proline[dot]bic[dot]nus[dot]edu[dot]sg/spdb处公开获得。

在一些实施方案中，表达(或编码)序列包括polyA序列(例如，在表达序列的3'端)。在一些实施方案中，poly-A序列的长度大于10个核苷酸。在一个实施方案中，poly-A序列的长度大于15个核苷酸(例如，至少或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500和3,000个核苷酸)。在一些实施方案中，poly-A序列是根据国际专利公开号WO2019/118919A1的[0202]-[0204]中的polyA序列的描述设计的，该专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，表达序列缺乏polyA序列(例如，在表达序列的3'端)。

在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸包括polyA、缺乏polyA或具有经修饰的polyA以调节环状多核糖核苷酸的一种或多种特征。在一些实施方案中，缺乏polyA或具有经修饰的polyA的环状多核糖核苷酸改善一种或多种功能特征，例如免疫原性(例如，免疫或炎性反应的一种或多种标志物的水平)、半衰期和/或表达效率。

多肽可以大量产生。因此，多肽可以是可以产生的任何蛋白质分子。多肽可以是可以从细胞分泌或定位到细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。一些多肽包括但不限于病毒包膜蛋白的至少一部分、代谢调节酶(例如，调节脂质或类固醇产生的酶)、抗原、细胞因子、毒素、其缺失与疾病相关的酶、以及在动物体内直到被切割才具有活性的多肽(例如，在动物的肠道中)和激素。

在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸包含编码蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的表达序列。在一些实施方案中，可由本文公开的环状多核糖核苷酸表达的治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合、货物受体活性、催化活性、分子载剂活性、分子功能调节剂、分子转导剂活性、营养素储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节剂活性、翻译调节剂活性或转运蛋白活性。治疗性蛋白质的一些实例可以包括但不限于酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、蛋白质疫苗、抗原(例如，肿瘤抗原、病毒、细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如，癌症)、细胞重编程/反式分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应物(例如，影响对免疫反应/信号的易感性)、调节性死亡效应蛋白(例如，凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如，癌蛋白的抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、DNA或蛋白质修饰酶、DNA插入剂、外排泵抑制剂、核受体激活剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶的竞争性抑制剂、蛋白质合成效应物或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体以及CRISPR系统或其组分。

在一些实施方案中，可由本文公开的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括人蛋白质，例如受体结合蛋白、激素、生长因子、生长因子受体调节剂和再生蛋白(例如，涉及增殖和分化的蛋白质，例如用于伤口愈合的治疗性蛋白质)。在一些实施方案中，可由本文公开的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括EGF(上皮生长因子)。在一些实施方案中，可由本文公开的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括酶，例如氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、ATP非依赖性酶和去饱和酶。在一些实施方案中，可由本文公开的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括细胞内蛋白质或胞质蛋白质。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸表达荧光素酶(nLuc)。在一些实施方案中，可由本文公开的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括分泌蛋白，例如分泌酶。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达分泌蛋白，该分泌蛋白可以在血液中具有短半衰期治疗剂，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白质，或者具有分泌信号肽的蛋白质。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸表达高斯荧光素酶(gLuc)。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达非人蛋白质，例如荧光蛋白、能量转移受体或蛋白标签如Flag、Myc或His。在一些实施方案中，可由环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括GFP。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸表达带标签的蛋白质，例如含有蛋白质标签的融合蛋白或工程化蛋白质，例如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Fc标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、AviTag、钙调蛋白标签、聚谷氨酸标签；E-标签、FLAG-标签)、HA-标签、His-标签、Myc-标签、NE-标签、S-标签、SBP-标签、软标签1、Softag 3、Spot-标签、Strep-标签；TC标签、Ty标签、V5标签；VSV-标签；或Xpress标签。

在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸编码抗体(例如，抗体片段或其部分)的表达。在一些实施方案中，由环状多核糖核苷酸表达的抗体可以是任何同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一部分，诸如轻链、重链、Fc片段、CDR(互补决定区)、Fv片段或Fab片段、其另外的部分。在一些实施方案中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包含多于一个表达序列，每个表达序列表达抗体的一部分，并且这些表达序列的总和可以构成抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包含编码抗体的重链的一个表达序列和编码抗体的轻链的另一个表达序列。在一些情况下，当环状多核糖核苷酸在细胞或无细胞环境中表达时，轻链和重链可以经历适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。

内部核糖体进入位点

在一些实施方案中，本文描述的多核糖核苷酸(例如，环状或线性多核糖核苷酸)包括一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)元件。在一些实施方案中，IRES可操作地连接至一个或多个表达序列(例如，每个IRES可操作地连接至一个或多个表达序列，其中每个表达序列任选地编码多肽)。在一些实施方案中，IRES位于异源启动子与编码序列的5'端之间。

包含在多核糖核苷酸中的合适的IRES元件包括能够接合真核核糖体的RNA序列。在一些实施方案中，IRES元件为至少约5个nt、至少约8个nt、至少约9个nt、至少约10个nt、至少约15个nt、至少约20个nt、至少约25个nt、至少约30个nt、至少约40个nt、至少约50个nt、至少约100个nt、至少约200个nt、至少约250个nt、至少约350个nt或至少约500个nt。

在一些实施方案中，IRES元件源自生物体的DNA，包括但不限于病毒、哺乳动物或果蝇。这种病毒DNA可以源自但不限于小核糖核酸病毒互补DNA(cDNA)、脑心肌炎病毒(EMCV)cDNA和脊髓灰质炎病毒cDNA。在一个实施方案中，IRES元件所源自的果蝇DNA包括但不限于来自黑腹果蝇的触角足基因。

在一些实施方案中，IRES序列是以下病毒的IRES序列：桃拉综合征病毒、锥蝽病毒、泰勒氏脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管病毒、网状内皮组织增生症病毒、人脊髓灰质炎病毒1、Plautia stall肠病毒、克什米尔蜂病毒、人鼻病毒2(HRV-2)、Homalodisca coagulata病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、Homalodisca coagulata病毒-1、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB肝炎病毒、口蹄疫病毒、人肠道病毒71型、马鼻炎病毒、茶尺蠖核型微小RNA样病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、果蝇C病毒、十字花科烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇收割者、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、唾液病毒、Cosavirus、副肠孤病毒、无毛果蝇、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、人c-src、人FGF-1、猿猴小核糖核酸病毒、芜菁皱纹病毒、爱知病毒、克罗希病毒、埃可病毒11、eIF4G的适体、柯萨奇病毒B3(CVB3)或柯萨奇病毒A(CVB1/2)。在另一个实施方案中，IRES是柯萨奇病毒B3(CVB3)的IRES序列。在另一个实施方案中，IRES是脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES序列。在另一个实施方案中，IRES是泰勒脑脊髓炎病毒的IRES序列。

与野生型IRES序列相比，IRES序列可以具有经修饰的序列。在一些实施方案中，当野生型IRES的最后一个核苷酸不是胞嘧啶核酸残基时，野生型IRES序列的最后一个核苷酸可以被修饰，使得其成为胞嘧啶残基。例如，IRES序列可以是CVB3 IRES序列，其中末端腺苷残基被修饰为胞嘧啶残基。

在一些实施方案中，IRES序列是肠道病毒71(EV17)IRES。在一些实施方案中，EV17IRES序列的末端鸟苷残基被修饰为胞嘧啶残基。

在一些实施方案中，多核糖核苷酸包括侧接至少一个(例如，2、3、4、5个或更多个)表达序列的至少一个IRES。在一些实施方案中，IRES侧接至少一个(例如，2、3、4、5个或更多个)表达序列的两侧。在一些实施方案中，多核糖核苷酸在每个表达序列的一侧或两侧包括一个或多个IRES序列，从而导致所得肽和/或多肽的分离。例如，本文描述的多核糖核苷酸可以包括可操作地连接至第一表达序列的第一IRES和可操作地连接至第二表达序列的第二IRES。

在一些实施方案中，本文描述的多核糖核苷酸包括IRES(例如，可操作地连接至编码区的IRES)。例如，多核糖核苷酸可以包括如Chen等人Mol.Cell 81(20):4300-4318,2021；Jopling等人Oncogene20:2664-2670,2001；Baranick等人PNAS105(12):4733-4738,2008；Lang等人Molecular Biology of the Cell 13(5):1792-1801,2002；Dorokhov等人PNAS 99(8):5301-5306,2002；Wang等人Nucleic Acids Research 33(7):2248-2258,2005；Petz等人Nucleic Acids Research 35(8):2473-2482,2007,Chen等人Science 268:415-417,1995；Fan等人Nature Communication 13(1):3751-3765,2022和国际公开号WO2021/263124中所描述的任何IRES，这些文献中的每一个以引用的方式整体并入本文。

稳定元件

除了其他结构特征，如5'帽结构或3'-poly(A)尾之外，天然存在的真核mRNA分子还可以含有稳定元件，包括但不限于在其5'端处的非翻译区(UTR)(5'UTR)和/或其3'端处的非翻译区(3'UTR)。5'UTR和3'UTR两者通常都从基因组DNA转录，并且是早熟mRNA的元件。在mRNA处理期间，成熟mRNA的特征性结构特征，如5'-帽和3'-poly(A)尾通常被添加到经转录的(早熟)mRNA中。

在一些实施方案中，多核苷酸具有编码具有至少一种修饰、至少一个5'末端帽的至少一种抗原性多肽的开放阅读框，并且被配制在脂质纳米颗粒内。根据制造商方案，可以在体外转录反应期间使用以下化学RNA帽类似物同时完成多核苷酸的5'-加帽，以生成5'-鸟苷帽结构：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G[ARCA帽]；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G(New England BioLabs,Ipswich,MA)。可以在转录后使用牛痘病毒加帽酶完成经修饰的RNA的5'加帽以产生“Cap 0”结构：m7G(5')ppp(5')G(NewEngland BioLabs,Ipswich,MA)。Cap 1结构可以使用牛痘病毒加帽酶及2'-0甲基转移酶两者产生，以产生m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基。Cap 2结构可以用帽1结构，紧接着使用2'-0-甲基转移酶对5'倒数第三核苷酸进行2'-O甲基化来产生。Cap 3结构可以用Cap 2结构，紧接着使用2'-O-甲基转移酶对5'倒数第四核苷酸进行2'-O-甲基化来产生。酶可以源自重组来源。

3'-poly(A)尾通常是添加到经转录的mRNA的3'端的腺嘌呤核苷酸的延伸段。在一些情况下，其可以包含至多约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，3'-poly(A)尾的长度可以是与个别mRNA的稳定性有关的基本元件。

在一些实施方案中，多核苷酸包括稳定元件。稳定元件可以包括例如组蛋白茎环。已鉴定出茎环结合蛋白(SLBP)，其是32kDa蛋白。其与细胞核和细胞质中组蛋白消息的3'端处的组蛋白茎环相关。其表达水平受细胞周期调节；当组蛋白mRNA水平也升高时，其在S期期间达到峰值。已显示所述蛋白质对于U7 snRNP对组蛋白前体mRNA的高效3'端加工是必需的。在加工后，SLBP仍然与茎环相关，并且然后刺激成熟组蛋白mRNA翻译成细胞质中的组蛋白。SLBP的RNA结合结构域在后生动物及原生动物中是保守的；其与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。最小结合位点包括相对于茎环位于5'的至少三个核苷酸以及位于3'的两个核苷酸。

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)包括编码区、至少一个组蛋白茎环以及任选地poly(A)序列或多腺苷酸化信号。poly(A)序列或多腺苷酸化信号通常应增强编码的蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，经编码的蛋白质不是组蛋白、报告蛋白(例如，荧光素酶、GFP、EGFP、b-半乳糖苷酶、EGFP)或标志物或选择蛋白(例如，α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)包括poly(A)序列或多腺苷酸化信号和至少一个组蛋白茎环的组合，即使两者在自然界中都代表替代性机制，也起到协同作用以将蛋白质表达增加到超过用任一个别元件观察到的水平。poly(A)和至少一个组蛋白茎环的组合的协同效应不取决于元件的顺序或poly(A)序列的长度。在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)不包括组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包括位于天然存在的茎环的3'的具有大约15至20个核苷酸的嘌呤富集多核苷酸延伸段，其表示U7 snRNA的结合位点，所述多核苷酸延伸段参与将组蛋白前mRNA加工成成熟组蛋白mRNA。在一些实施方案中，核酸不包括内含子。

多核苷酸(例如，mRNA)可以含有或可以不含增强子和/或启动子序列，所述增强子和/或启动子序列可以是经修饰的或未经修饰的，或者其可以经激活或灭活。在一些实施方案中，组蛋白茎环通常源自组蛋白基因，并且包括通过由形成结构的环的短序列组成的间隔子分隔开的两个相邻的部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对。未配对环区通常不能与茎环元件中的任一个进行碱基配对。这更常发生在RNA中，许多RNA二级结构的关键组分也是如此，但也可能存在于单链DNA中。茎环结构的稳定性通常取决于配对区的长度、错配或凸起数量和碱基组成。在一些实施方案中，可以产生摆动碱基配对(非沃森-克里克碱基配对)。在一些实施方案中，至少一个组蛋白茎环序列包含15至45个核苷酸的长度。

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)去除了一个或多个富集AU的序列。有时被称为AURES的这些序列是在3'UTR中发现的不稳定序列。可以从RNA疫苗中去除AURES。可替代地，AURES可以保留在RNA疫苗中。

信号肽

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)具有编码与冠状病毒抗原融合的信号肽的ORF。包含在N末端具有15至60个氨基酸的蛋白质的信号肽通常是在分泌途径上跨膜易位所必需的，并且因此普遍控制真核生物中的和原核生物中的大多数蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导到粗内质网(ER)膜，并引发生长的肽链转运穿过所述膜以进行处理。内质网处理产生成熟蛋白质，其中信号肽通常通过宿主细胞的ER驻留信号肽酶从前体蛋白质中裂解，或其保持未裂解并充当膜锚定物。信号肽还可以促进蛋白质靶向细胞膜。信号肽的长度可以是15至60个氨基酸。例如，信号肽可以具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的长度。在一些实施方案中，信号肽具有20-60、25-60、30-60、35-60、40-60、45-60、50-60、55-60、15-55、20-55、25-55、30-55、35-55、40-55、45-55、50-55、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、40-50、45-50、15-45、20-45、25-45、30-45、35-45、40-45、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、15-35、20-35、25-35、30-35、15-30、20-30、25-30、15-25,20-25或15-20个氨基酸的长度。

来自异源基因的信号肽(其调节自然界中除冠状病毒抗原之外的基因的表达)在本领域中是已知的，并且然后可以测试期望特性，然后并入本公开的核酸中。在一些实施方案中，信号肽可以包含WO 2021/154763中所描述的信号肽，所述文献以引用的方式整体并入。

融合蛋白

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)编码抗原融合蛋白。因此，一种或多种经编码的抗原可以包括连接在一起的两种或更多种蛋白质(例如，蛋白质和/或蛋白质片段)。可替代地，与蛋白质抗原融合的蛋白质不会促进对自身的强烈免疫反应，而是促进对冠状病毒抗原的强烈免疫反应。在一些实施方案中，抗原融合蛋白保留来自每种原始蛋白的功能特性。

支架部分

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含与支架部分连接的冠状病毒抗原。在一些实施方案中，此类支架部分对由本公开的核酸编码的抗原赋予期望特性。例如，支架蛋白可以例如通过改变抗原的结构、改变抗原的摄取和处理和/或引起抗原与结合配偶体结合来改善抗原的免疫原性。

在一些实施方案中，支架部分是可以自组装成蛋白质纳米颗粒的蛋白质，所述蛋白质纳米颗粒是高度对称的、稳定的并且结构组织良好，直径为10至150nm，这是与免疫系统的各种细胞最佳相互作用的非常合适的尺寸范围。在一些实施方案中，病毒蛋白或病毒样颗粒可用于形成稳定的纳米颗粒结构。此类病毒蛋白的实例是本领域已知的。例如，在一些实施方案中，支架部分是乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。HBsAg形成平均直径为-22nm并且缺乏核酸的球形颗粒，因此是非感染性的(Lopez-Sagaseta,J.等人Computational andStructural Biotechnology Journal 14(2016)58-68)。在一些实施方案中，支架部分是自组装成直径为24-31nm的颗粒的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)，其类似于从HBV感染的人肝脏获得的病毒核心。产生的HBcAg自组装成直径为300A和360A的两类不同尺寸的纳米颗粒，对应于180或240个原体。在一些实施方案中，冠状病毒抗原与HBsAG或HBcAG融合以促进展示冠状病毒抗原的纳米颗粒的自组装。

在一些实施方案中，可以使用天然蛋白质平台。这些自组装蛋白的非限制性实例包括铁蛋白、二氧四氢蝶啶(lumazine)和包封蛋白(encapsulin)。

铁蛋白是其主要功能是胞内铁存储的蛋白质。铁蛋白由24个亚基组成，每个由四个α螺旋束构成，其以八面体对称的四级结构进行自组装(Cho K.J.等人J Mol Biol.2009；390:83-98)。铁蛋白的若干高分辨率结构已被确定，从而证实幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)铁蛋白由24个相同的原聚体制成，而在动物体内，具有可以单独组装或以不同比例组合成具有24个亚基的颗粒的铁蛋白轻链和重链(Granier T.等人J Biol InorgChem.2003；8:105-111；Fawson D.M.等人Nature.1991；349:541-544)。铁蛋白自组装成具有稳健的热稳定性和化学稳定性的纳米颗粒。因此，铁蛋白纳米颗粒非常适合携带和暴露抗原。

富马嗪合酶(fumazine synthase，FS)也非常适合作为用于抗原展示的纳米颗粒平台。负责核黄素的生物合成中的倒数第二个催化步骤的FS是存在于包括古细菌、细菌、真菌、植物和真细菌在内的广泛多种生物体中的酶(Weber S.E.Flavins andFlavoproteins.Methods and Protocols,Series:Methods in MolecularBiology.2014)。FS单体的长度是150个氨基酸，并且由β片以及侧接其侧面的串联α螺旋组成。已经报道了FS的许多不同的季铵结构，从而说明了其形态多样性：从同源五聚体直至形成150A直径的衣壳的12个五聚体的对称组装体。甚至已经描述具有大于100个亚基的FS笼(Zhang X.等人J Mol Biol.2006；362:753-770)。

从嗜热海栖热袍菌(Thermotoga maritima)中分离的新型蛋白质笼纳米颗粒，包封蛋白也可以被用作在自组装纳米颗粒的表面上呈递抗原的平台。包封蛋白由相同的31kDa单体的60个拷贝组装而成，具有薄的二十面体T＝1对称笼结构，其中内径和外径分别为20nm和24nm(Sutter M.等人Nat Struct Mol Biol.2008,15:939-947)。尽管尚未明确理解海栖热袍菌(T.maritima)中包封蛋白的确切功能，但其晶体结构最近已被解析，并且其功能被推定为封装蛋白质(如DyP(染料脱色过氧化物酶)和Flp(铁蛋白样蛋白质))的细胞室，所述包封蛋白参与氧化应激反应(Rahmanpour R.等人FEBS J.2013,280:2097-2104)。

在一些实施方案中，多核苷酸编码与折叠子结构域融合的冠状病毒抗原(例如，SARS-CoV-2S蛋白)。折叠结构域可以例如从噬菌体T4纤维蛋白获得(参见例如，Tao Y等人Structure.1997Jun 15；5(6):789-98)。

接头和可切割肽

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)编码多于一种多肽，在本文中称为融合蛋白。在一些实施方案中，mRNA进一步编码位于融合蛋白的至少一个或每个结构域之间的接头。接头可以是例如可裂解接头或蛋白酶敏感接头。在一些实施方案中，接头选自由以下组成的组：F2A接头、P2A接头、T2A接头、E2A接头和其组合。被称为2A肽的此自裂解肽接头家族已在本领域中有所描述(参见例如，Kim,J.H.等人(2011)PLoS ONE 6:el8556)。在一些实施方案中，接头是F2A接头。在一些实施方案中，融合蛋白含有三个具有插入接头的结构域，具有以下结构：结构域-接头-结构域-接头-结构域。

本领域中已知的可裂解接头可以结合本公开使用。示例性此类接头包括F2A接头、T2A接头、P2A接头、E2A接头(参见例如，WO2017/127750，所述文献以引用的方式整体并入本文)。技术人员将理解，其他本领域公认的接头可以适用于本公开的构建体(例如，由本公开的核酸编码)。本领域技术人员同样将理解，其他多顺反子构建体(在同一分子内单独编码多于一种抗原/多肽的mRNA)可能适合于如本文所提供进行使用。

序列优化

在一些实施方案中，编码本公开的抗原的ORF是密码子优化的。密码子优化方法在本领域中是已知的。例如，本文所提供的任何一个或多个序列的ORF可以是经密码子优化的。在一些实施方案中，密码子优化可以用于匹配靶生物体和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏置GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运行最小化；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加经编码蛋白中的翻译后修饰位点(例如，糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白质结构域；插入或缺失限制位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调整翻译速率以允许蛋白质的各个结构域正确折叠；或者减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域中已知的—非限制性实例包括来自GeneArt(LifeTechnologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专有方法的服务。在一些实施方案中，使用优化算法优化开放阅读框(ORF)序列。

在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列ORF(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于90％序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于85％序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于80％序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于75％序列同一性。

在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有65％至85％(例如，约67％至约85％或约67％至约80％)序列同一性。在一些实施方案中，经密码子优化的序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有65％至75％或约80％序列同一性。

在一些实施方案中，密码子优化的序列编码的抗原与由非密码子优化的序列编码的冠状病毒抗原一样具有免疫原性或比其具有更高的免疫原性(例如，高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)。当转染到哺乳动物宿主细胞中时，经修饰的mRNA具有12-18小时或大于18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时的稳定性，并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。

在一些实施方案中，经密码子优化的RNA可以是其中G/C水平增强的RNA。核酸分子(例如，mRNA)的G/C含量可以影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA在功能上可能比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。作为实例，WO02/098443公开了含有通过翻译区中的序列修饰进行稳定的mRNA的药物组合物。由于遗传密码子的简并性，这些修饰通过用现有密码子代替促进更大RNA稳定性的密码子而不改变所得氨基酸来起作用。所述方法限于RNA的编码区。

未经化学修饰的核苷酸

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)未被化学修饰并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，如存在于经转录的RNA中的核苷残基(例如，A、G、C或U)。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，如存在于DNA中的脱氧核糖核苷(例如，dA、dG、dC或dT)。

化学修饰

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)包含具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的RNA，其中所述核酸包含可以是标准的(未经修饰的)或如本领域中已知的经修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)的核苷酸和核苷包含经修饰的核苷酸或核苷。此类经修饰的核苷酸和核苷可以是天然存在的经修饰的核苷酸和核苷，或非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷。此类修饰可以包括如本领域中公认的在核苷酸和/或核苷的糖、骨架或核碱基部分处的修饰。

多核苷酸(例如，mRNA)的核酸可以包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或其任何组合。

在一些实施方案中，多核苷酸的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，如mRNA核酸)包含各种(多于一种)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。在一些实施方案中，核酸的特定区含有一种、两种或更多种(任选地不同)类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。

在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，被引入到细胞或生物体的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)分别在细胞或生物体中表现出降解减少。

在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，被引入到细胞或生物体中的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)可以分别在细胞或生物体中表现出免疫原性降低(例如，先天反应减少)。

在一些实施方案中，核酸(例如，RNA核酸，如mRNA核酸)包含在核酸的合成或合成后期间引入以实现期望功能或特性的非天然的经修饰的核苷酸。修饰可以存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可以用化学合成或用聚合酶在链末端或链中的任何其他位置引入。核酸的任何区都可以被化学修饰。

本公开提供核酸(例如，RNA核酸，如mRNA核酸)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)组合的化合物。“核苷酸”是指包括磷酸酯基的核苷。经修饰的核苷酸可以通过任何有用的方法，如化学、酶促或重组合成，以包括一种或多种经修饰的或非天然核苷。核酸可以包含经连接的核苷的一个或多个区。此类区可以具有可变的骨架键。键可以是标准磷酸二酯键，在这种情况下，核酸将包含核苷酸的区。

经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准的腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且还涵盖在核苷酸和/或包含非标准或经修饰的碱基的经修饰的核苷酸之间形成的碱基对，其中例如在具有至少一种化学修饰的那些核酸中，氢键供体和氢键接受者的排列允许在非标准碱基和标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间形成氢键合。此类非标准碱基配对的一个实例是经修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可以并入本公开的核酸中。

在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的尿苷。在一些实施方案中，针对特定修饰，mRNA被统一修饰(例如，被完全修饰、在整个序列中修饰)。例如，核酸可以用1-甲基-假尿苷统一修饰，这意味着mRNA序列中的所有尿苷残基均被1-甲基-假尿苷置换。类似地，可以通过用经修饰的残基(如以上列出的经修饰的残基)置换而针对序列中存在的任何类型的核苷残基对核酸进行统一修饰。

多核苷酸(例如，mRNA)的核酸可以沿着分子的整个长度被部分或完全修饰。例如，一种或多种或全部或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一种或多种或全部)可以在本公开的核酸中或者在其预定序列区中(例如，在包括或不包括poly(A)尾的mRNA中)被统一修饰。在一些实施方案中，本公开的核酸中(或其序列区中)的所有核苷酸X是经修饰的核苷酸，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+U+C或A+G+C中的任一者。

(相对于总核苷酸含量，或者相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)，核酸可以含有约1％至约100％或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％以及95％至100％)的经修饰的核苷酸。应理解，任何剩余百分比均是由未经修饰的A、G、U或C的存在所解释的。

mRNA可以含有最少1％和最多100％的经修饰的核苷酸，或任何中间百分比，如至少5％的经修饰的核苷酸、至少10％的经修饰的核苷酸、至少25％的经修饰的核苷酸、至少50％的经修饰的核苷酸、至少80％的经修饰的核苷酸或至少90％的经修饰的核苷酸。例如，核酸可以含有经修饰的嘧啶，如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，核酸中的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被经修饰的尿嘧啶(例如，5取代的尿嘧啶)置换。经修饰的尿嘧啶可以由具有单个独特结构的化合物置换，或者可以由具有不同结构(例如，2个、3个、4个或更多个独特结构)的多个化合物置换。在一些实施方案中，核酸中的至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被经修饰的胞嘧啶(例如，5取代的胞嘧啶)置换。经修饰的胞嘧啶可以由具有单个独特结构的化合物置换，或者可以由具有不同结构(例如，2个、3个、4个或更多个独特结构)的多个化合物置换。

非翻译区(UTR)

多核苷酸(例如，mRNA)可以包含用作或充当非翻译区的一个或多个区或部分。当mRNA被设计为编码至少一种所关注抗原时，核酸可以包含这些非翻译区(UTR)中的一个或多个。核酸的野生型非翻译区被转录但不被翻译。在mRNA中，5'UTR从转录起始位点开始并继续到起始密码子，但不包括起始密码子；而3'UTR紧接在终止密码子之后开始并继续直到转录终止信号。越来越多的证据表明UTR在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥着调控作用。UTR的调控特征可以并入本公开的多核苷酸中，以尤其增强分子的稳定性。还可以并入特定特征，以确保转录物的受控下调，以防被误导到不需要的器官部位。多个5'UTR和3'UTR序列在本领域中是已知的且可获得的。

5'UTR是位于起始密码子(由核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)直接上游(5')的mRNA区。5'UTR不编码蛋白质(是非编码的)。天然5'UTR具有在翻译起始中起作用的特征。其具有如Kozak序列的特征，众所周知，参与核糖体由此起始许多基因的翻译的过程。Kozak序列具有共有序列CCR(A/G)CCAUGG，其中R是位于起始密码子(AUG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个‘G’。还已知5'UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。

在一些实施方案中，5'UTR是异源UTR，即在自然界中发现的与不同ORF相关的UTR。在另一个实施方案中，5'UTR是合成UTR，即自然界中不存在。合成UTR包括已突变以改善其特性(例如增加基因表达)的UTR以及完全合成的UTR。示例性5'UTR包括源自非洲爪蟾(Xenopus)或人的a-球蛋白或b-球蛋白(8278063；9012219)、人细胞色素b-245a多肽以及羟基类固醇(17b)脱氢酶和烟草蚀刻病毒(Tobacco etch virus)(U.S.8278063、9012219，所述文献以引用的方式整体并入本文)。还可以使用CMV即早期1(IE1)基因(US2014/0206753、WO2013/185069，所述文献以引用的方式整体并入本文)、序列GGGAUCCUACC(WO2014/144196)。在另一个实施方案中，TOP基因的5'UTR是缺乏5'TOP基序(寡嘧啶段)的TOP基因的5'UTR(例如，WO/2015/101414、W02015/101415、WO/2015/062738、WO2015/024667、WO2015/024667)；可以使用源自核糖体蛋白大32(L32)基因的5'UTR元件(WO/2015/101414、W02015/101415、WO/2015/062738)、源自羟基类固醇(17-b)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5'UTR的5'UTR元件(WO2015/024667)，或源自ATP5A1的5'UTR的5'UTR元件(WO2015/024667)。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5'UTR。

3'UTR是位于终止密码子(发出翻译终止信号的mRNA转录物的密码子)直接下游(3')的mRNA区。3'UTR不编码蛋白质(是非编码的)。已知天然或野生型3'UTR中嵌入有腺苷和尿苷的链段。这些富含AU的特征在具有高周转率的基因中尤其普遍。基于其序列特征和功能特性，富含AU元件(ARE)可以分成三个类别(Chen等人,1995)：I类ARE在富含U的区内含有AUUUA基序的若干分散拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有此类ARE的分子包括GM-CSF和TNF-α。III类ARES的定义不太明确。这些富含U的区不含有AUUUA基序。c-Jun和成肌蛋白(Myogenin)是这个类别的两个充分研究的实例。

已知大多数与ARE结合的蛋白质都会破坏信使的稳定性，而ELAV家族的成员，尤其是HuR，已被证明增加mRNA的稳定性。HuR与所有三个类别的ARE结合。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3'UTR中将使得HuR结合，并且因此使体内信息稳定。

3'UTR富含AU元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节多核苷酸(例如，mRNA)的稳定性。当对特定核酸进行工程化时，可以引入ARE的一个或多个拷贝以使本公开的核酸不太稳定，并且由此减少翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，ARE可以被鉴定并且去除或突变以增加胞内稳定性，并且从而增加所得蛋白质的翻译和产生。可以使用本公开的核酸在相关细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后的不同时间点分析蛋白质产生。例如，细胞可以用不同的ARE工程化分子转染，并且通过使用相关蛋白质的ELISA试剂盒并且测定转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质。

3'UTR可以是异源的或合成的。就3'UTR而言，珠蛋白UTR(包括非洲爪蟾b-珠蛋白UTR和人b-珠蛋白UTR)是本领域已知的(8278063、9012219、US2011/0086907)。已经开发了通过将两个连续的人b-珠蛋白3'UTR头对尾克隆在一些细胞类型中具有增强的稳定性的经修饰的b-珠蛋白构建体，并且它是本领域所熟知的(US2012/0195936、WO2014/071963)。此外，a2-珠蛋白、al-珠蛋白、UTR及其突变体也是本领域已知的(W02015/101415、WO2015/024667)。非专利文献中mRNA构建体中描述的其他3'UTR包括CYBA(Ferizi等人,2015)和白蛋白(Thess等人,2015)。其他示例性3'UTR包括牛或人生长激素(野生型或经修饰的)的3'UTR(WO2013/185069、US2014/0206753、WO2014152774)、兔b珠蛋白和乙型肝炎病毒(HBV)、α-珠蛋白3'UTR和病毒VEEV 3'UTR序列也是本领域已知的。在一些实施方案中，使用序列UUUGAAUU(WO2014/144196)。在一些实施方案中，使用人和小鼠核糖体蛋白的3'UTR。其他实例包括rps93'UTR(W02015/101414)、FIG4(W02015/101415)和人白蛋白7(W02015/101415)。

本领域普通技术人员将理解，异源或合成的5'UTR可以与任何期望的3'UTR序列一起使用。例如，异源5'UTR可以与具有异源3'UTR的合成3'UTR一起使用。

非UTR序列也可以用作核酸内的区或子区。例如，内含子或内含子序列的部分可以掺入本公开的核酸的区域中。内含子序列的掺入可以增加蛋白质产生以及核酸水平。

特征的组合可以被包括在侧接区中，并且可以包含在其他特征内。例如，ORF可以侧接有可以含有强的Kozak翻译起始信号的5'UTR和/或可以包括用于模板化添加poly-A尾的oligo(dT)序列的3'UTR。5'UTR可以包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，如美国专利申请公开号2010/0293625和PCT/US2014/069155中描述的5'UTR，所述文献以引用的方式整体并入本文。应当理解，来自任何基因的任何UTR都可以掺入核酸的区域中。此外，可以利用任何已知基因的多个野生型UTR。提供不是野生型区的变体的人工UTR也在本公开的范围内。这些UTR或其部分可以与从中选择其的转录物相同的方向放置，或者可以改变方向或位置。因此，5'或3'UTR可以倒置、缩短、延长，由一个或多个其他5'UTR或3'UTR制成。如本文所用，术语“改变”在与UTR序列有关时，意味着UTR相对于参考序列已经以某种方式改变。例如，3'UTR或5'UTR可以通过如上文所教导的方向或位置的变化而相对于野生型或天然UTR改变，或者可以通过包括另外的核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转位来改变。产生“改变的”UTR(无论是3'还是5')的任何这些变化都包含变体UTR。

在一些实施方案中，可以使用双、三或四UTR，如5'UTR或3'UTR。如本文所用，“双”UTR是其中同一UTR的两个拷贝串联或大体上串联编码的UTR。例如，双β-球蛋白3'UTR可以如美国专利公开2010/0129877中所描述的进行使用，所述美国专利公开的内容以引用的方式整体并入本文。

具有模式化的UTR也在本公开的范围内。如本文所用，“模式化的UTR”是反映重复或交替模式的那些UTR，如重复一次、两次或大于3次的ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体。在这些模式中，每个字母A、B或C表示核苷酸层面的不同UTR。

在一些实施方案中，侧接区选自蛋白质共享共同功能、结构、特征或特性的转录物家族。例如，所关注多肽可以属于在特定细胞、组织中或在发育期间的某个时间表达的蛋白质家族。来自这些基因中的任一个的UTR可以换成相同或不同蛋白质家族的任何其他UTR以产生新的多核苷酸。如本文所用，“蛋白质家族”在最广泛的意义上使用以指共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的一组具有两种或更多种所关注多肽。

非翻译区还可以包括翻译增强子元件(TEE)。作为非限制性实例，TEE可以包括美国申请第2009/0226470号中描述的TEE以及本领域中已知的TEE，所述文献以引用的方式整体并入本文。编码本文描述的多核苷酸的RNA cDNA的体外转录可以使用体外转录(IVT)系统进行转录。RNA的体外转录在本领域中是已知的，并且描述于国际公开WO 2014/152027中，所述国际公开以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，本公开的RNA根据WO2018/053209和WO 2019/036682中描述的任何一种或多种方法来制备，所述文献中的每个文献以引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，在体外转录反应中使用非扩增的线性化DNA模板产生RNA转录物以产生RNA转录物。在一些实施方案中，模板DNA是分离的DNA。在一些实施方案中，模板DNA是cDNA。在一些实施方案中，cDNA通过RNA多核苷酸(例如但不限于冠状病毒mRNA)的逆转录形成。在一些实施方案中，用质粒DNA模板转染细胞，例如天然细胞，例如大肠杆菌，例如DH-1细胞。在一些实施方案中，培养经转染的细胞以复制质粒DNA，然后将其分离和纯化。在一些实施方案中，DNA模板包括RNA聚合酶启动子，例如位于所关注基因的5'并且与其可操作地连接的T7启动子。

在一些实施方案中，体外转录模板编码5'非翻译区(UTR)，含有开放阅读框，并且编码3'UTR和poly(A)尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于由模板所编码的mRNA。

“5'非翻译区”(UTR)是指位于起始密码子(即，由核糖体翻译的mRNA转录物的第一密码子)直接上游(即，5')的不编码多肽的mRNA区。当生成RNA转录物时，5'UTR可以包含启动子序列。此类启动子序列在本领域中是已知的。应当理解，此类启动子序列将不存在于本公开的疫苗中。

“3'非翻译区”(UTR)是指位于终止密码子(即，mRNA转录物中发出翻译终止信号的密码子)直接下游(即，3')的不编码多肽的mRNA区。

“开放阅读框”是从起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束并且编码多肽的连续DNA区段。

“poly(A)尾”是位于3'UTR下游，例如，直接下游(即，3')的含有多个连续单磷酸腺苷的mRNA区。poly(A)尾可以含有10至300个单磷酸腺苷。例如，poly(A)尾可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，poly(A)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关的生物学环境中(例如，在细胞中、在体内)，poly(A)尾用于例如在细胞质中保护mRNA免受酶促降解，并且有助于转录终止和/或从细胞核中输出mRNA并翻译。

在一些实施方案中，核酸包括200至3,000个核苷酸。例如，核酸可以包括200至500个、200至1000个、200至1500个、200至3000个、500至1000个、500至1500个、500至2000个、500至3000个、1000至1500个、1000至2000个、1000至3000个、1500至3000个或2000至3000个核苷酸。

体外转录系统通常包含转录缓冲液、三磷酸核苷酸(NTP)、RNase抑制剂和聚合酶。

NTP可以在内部制备，可以从供应商选择，或者可以根据本文所述合成。NTP可以选自但不限于本文描述的包括天然和非天然(经修饰的)NTP在内的NTP。

本公开的方法中可以使用任何数量的RNA聚合酶或变体。聚合酶可以选自但不限于噬菌体RNA聚合酶，例如T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和/或突变体聚合酶，如但不限于能够掺入经修饰的核酸和/或经修饰的核苷酸(包括经化学修饰的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。一些实施方案排除了DNase的使用。

在一些实施方案中，RNA转录物通过酶促加帽被加帽。在一些实施方案中，多核苷酸(例如，mRNA)包含5'末端帽，例如7mG(5')ppp(5')NlmpNp。

化学合成

固相化学合成.多核苷酸(例如，mRNA)可以全部或部分使用固相技术来制备。核酸的固相化学合成是其中分子固定在固相载体上并且在反应物溶液中逐步合成的自动化方法。固相合成可用于核酸序列中的化学修饰的位点特异性引入。

液相化学合成。通过依序添加单体构建块来合成多核苷酸(例如，mRNA)可以在液相中进行。

合成方法的组合。上文所讨论的合成方法各自具有其自身的优势和限制。已尝试组合这些方法以克服限制。方法的此类组合在本公开的范围内。固相或液相化学合成与酶促连接的组合使用提供了单独通过化学合成无法获得的产生长链核酸的高效方法。

核酸区或子区的连接

也可以使用通过连接酶进行的组装核酸。DNA或RNA连接酶通过形成磷酸二酯键来促进多核苷酸链的5'和3'端的分子间连接。如嵌合多核苷酸和/或环状核酸等核酸可以通过一个或多个区或子区的连接来制备。DNA片段可以通过经连接酶催化的反应连接以产生具有不同功能的重组DNA。两种寡脱氧核苷酸(一种具有5'磷酰基并且另一种具有游离3'羟基)充当DNA连接酶的底物。

纯化

本文所描述的核酸的纯化可以包括但不限于核酸净化、质量保证和质量控制。可以通过本领域中已知的方法，如但不限于珠粒(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)、poly-T珠粒、LNATM寡-T捕获探针(Inc,Vedbaek,Denmark)或基于HPLC的纯化方法，如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)进行净化。术语“纯化”在关于核酸使用时，如“经纯化的核酸”，是指与至少一种污染物分隔开的核酸。“污染物”是使得另一种物质变得不合适、不纯净或较差的任何物质。因此，经纯化的核酸(例如，DNA和RNA)以与其在自然界中发现的形式或环境不同的形式或环境、或者与在使其经受处理或纯化方法之前其存在的形式或环境不同的形式或环境存在。

质量保证和/或质量控制检查可以使用如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析性HPLC等方法进行。

在一些实施方案中，核酸可以通过包括但不限于逆转录酶-PCR的方法进行测序。

定量

在一些实施方案中，多核苷酸(例如mRNA)可以在外来体中或当来源于一种或多种体液时定量。体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耳垢、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper's fluid)或射精前液、汗液、粪便、头发、眼泪、囊肿液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺吸出物、囊胚腔液和脐带血。可替代地，外来体可以从选自由以下组成的组的器官获取：肺、心脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳房、前列腺、脑、食道、肝和胎盘。

可以使用构建体特异性探针、细胞术、qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱分析或其组合进行分析，同时可以使用免疫组织化学方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法来分离外来体。外来体也可以通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸收捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合来分离。

这些方法使研究者能够实时监测剩余或递送的核酸水平。这是可能的，因为在一些实施方案中，本公开的核酸由于结构或化学修饰而不同于内源形式。

在一些实施方案中，核酸可以使用如但不限于紫外可见光谱法(UV/Vis)等方法定量。UV/Vis光谱仪的非限制性实例是光谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)。可以分析定量的核酸，以便确定核酸是否具有适当尺寸，检查核酸是否未发生降解。核酸的降解可以通过以下方法来检查，如但不限于琼脂糖凝胶电泳、基于HPLC的纯化方法(如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC))、液相色谱-质谱分析(LCMS)、毛细管电泳(CE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。

多价疫苗

如本文所提供的经修饰的脂质组合物/核酸疫苗可以包含编码相同或不同物种的两种或更多种抗原的一种或多种RNA。在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗包含编码两种或更多种冠状病毒抗原的一种或多种RNA。在一些实施方案中，RNA可以编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种冠状病毒抗原。

在一些实施方案中，编码抗原的两种或更多种不同RNA(例如，mRNA)可以配制在同一脂质纳米颗粒中。在其他实施方案中，两种或更多种不同的RNA编码抗原可以配制在单独的脂质纳米颗粒中(每种RNA配制在单个脂质纳米颗粒中)。然后可以将脂质纳米颗粒组合并作为单一疫苗组合物(例如，包含编码多种抗原的多种RNA)施用，或者可以单独施用。

组合疫苗

如本文所提供的经修饰的脂质组合物/核酸疫苗可以包含编码相同或不同病毒株的两种或更多种抗原的一种或多种RNA。本文还提供了组合疫苗，其包含编码一种或多种冠状病毒的RNA和一种或多种不同生物体的抗原。因此，本公开的疫苗可以是靶向相同毒株/物种的一种或多种抗原或不同毒株/物种的一种或多种抗原的组合疫苗，例如诱导对在冠状病毒感染风险高的同一地理区域中发现的生物体或当暴露于冠状病毒时个体可能暴露于的生物体的免疫的抗原。

疫苗施用

在一些实施方案中，可以将经修饰的脂质组合物/核酸疫苗施用于受试者(例如，哺乳动物受试者，诸如人受试者)，并且RNA多核苷酸在体内翻译以产生抗原性多肽(抗原)。组合物(例如，包含RNA)的“有效量”至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、RNA的物理特征(例如，长度、核苷酸组成和/或经修饰的核苷的程度)、疫苗的其他组分和其他决定因素，诸如受试者的年龄、体重、身高、性别和总体健康状况。通常，有效量的经修饰的脂质组合物/核酸疫苗根据受试者细胞中的抗原产生提供诱导的或加强的免疫反应。在一些实施方案中，有效量的含有具有至少一种化学修饰的RNA多核苷酸的组合物比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未经修饰的多核苷酸的组合物更有效。增加的抗原产生可以通过增加的细胞转染(用RNA疫苗转染的细胞的百分比)、增加来自多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达、减少的核酸降解(如例如通过增加来自经修饰的多核苷酸的蛋白质翻译的持续时间来证明的)或改变的宿主细胞的抗原特异性免疫反应来证明。

术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载剂的组合，使得组合物特别适合于体内或离体的诊断或治疗用途。“药学上可接受的载剂”在施用于受试者后或施用于受试者时不会引起不期望的生理作用。药物组合物中的载剂也必须是“可接受的”，即它与活性成分相容并且能够稳定活性成分。一种或多种增溶剂可用作递送活性剂的药物载剂。药学上可接受的载剂的实例包括但不限于生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以获得可用作剂型的组合物。其他载剂的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和十二烷基硫酸钠。其他合适的药物载剂和稀释剂以及其使用的药物必需品在Remington's PharmaceuticalSciences中进行了描述。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗可用于治疗或预防冠状病毒感染。经修饰的脂质组合物/核酸疫苗可以作为主动免疫方案的一部分预防性或治疗性地施用于健康个体或在感染早期在温育阶段期间或在症状发作后的活动性感染期间。在一些实施方案中，提供给细胞、组织或受试者的RNA的量可以是对于免疫预防有效的量。

经修饰的脂质组合物/核酸疫苗可以与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可以是佐剂或加强剂。如本文所用，当提及预防性组合物(诸如疫苗)时，术语“加强剂”是指额外施用预防性(疫苗)组合物。可以在较早施用预防性组合物之后给予加强剂(或加强疫苗)。预防性组合物的初次施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或大于99年。在示例性实施方案中，预防性组合物的初次施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。

在一些实施方案中，经修饰的脂质组合物/核酸疫苗可以肌内、鼻内或皮内施用，类似于本领域已知的灭活疫苗的施用。

经修饰的脂质组合物/核酸疫苗可用于各种环境，这取决于感染的流行程度或未满足的医疗需求的程度或水平。作为非限制性实例，RNA疫苗可用于治疗和/或预防多种感染性疾病。RNA疫苗具有优异的特性，因为它们比市售疫苗产生更大的抗体滴度、更好的中和免疫力、产生更持久的免疫反应和/或更早地产生反应。

试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括装有本文描述的经修饰的脂质组合物的容器。试剂盒还可以包括用于根据本发明的方法施用或递送经修饰的脂质组合物的指导材料。本领域技术人员应当理解，在本发明的方法中应用经修饰的脂质组合物的说明书可以是任何形式的说明书。此类说明包括但不限于书面说明材料(诸如标签、小册子、活页)、口头指导材料(诸如录音带或CD)或视频说明(诸如录像带或DVD)。

实施方案1.一种经修饰的脂质组合物，包含：

(a)结构组分，所述结构组分包含选自由大豆衍生脂质、心磷脂、鞘脂、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、半乳糖基胆固醇和葡糖基胆固醇组成的组的一种或多种脂质；由以下物质修饰

(b)可电离脂质；

其中所述一种或多种脂质增加了所述经修饰的脂质组合物向脾脏的递送，其特征在于增加的脾脏与肝脏递送比率。

实施方案2.如实施方案1所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构组分包含鞘脂并且所述鞘脂是源自牛心脏的心磷脂。

实施方案3.如实施方案1所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构组分包含源自动物脑的鞘磷脂脂质。

实施方案4.一种经修饰的脂质组合物，包含：

(a)包含大豆衍生脂质的结构组分，由以下物质修饰

(b)可电离脂质。

实施方案5.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中结构脂质是大豆PI、大豆LPI、大豆PG、大豆极性脂质、大豆LPC、大豆PC、大豆PE、大豆PA、大豆PL(磷脂)混合物、大豆PS、大豆LPS、HSPC、心磷脂或它们的任何组合。

实施方案6.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆衍生脂质是大豆极性脂质组合物、大豆PL混合物或它们的组合。

实施方案7.如实施方案5或6所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆PL混合物包含

约30％至约50％的PC，

约20％至约40％的PE，

约10％至约25％的PI，

约1％至约15％的PA，

约1％至约15％的LPC，和

约0％至约10％的其他脂质。

实施方案8.如实施方案7所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆PL混合物包含百分比比率为约38:30:18:7:7:0的PC:PE:PI:PA:LPC:其他脂质。

实施方案9.如实施方案5或6所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆极性脂质组合物包含

约40％至约50％的PC，

约15％至约30％的PE，

约10％至约25％的PI，

约1％至约15％的PA，

约0％至约10％的LPC，和

约0％至约15％的其他脂质。

实施方案10.如实施方案9所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆极性脂质组合物包含百分比比率为约46:22:18:7:0:7的PC:PE:PI:PA:LPC:其他脂质。

实施方案11.如实施方案4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆衍生脂质增加了所述经修饰的脂质组合物向脾脏的递送，其特征在于增加的脾脏与肝脏递送比率。

实施方案12.如实施方案1或11所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脾脏与肝脏递送比率为1.0或更大。

实施方案13.如实施方案1或11所述的经修饰的脂质组合物，其中存在于所述经修饰的脂质组合物中的结构脂质组分的量的增加增加了所述脾脏与肝脏递送比率。

实施方案14.如实施方案1所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构组分通过用所述可电离脂质重构所述结构组分而被修饰。

实施方案15.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构组分包含纯化的大豆衍生脂质，并且所述结构组分通过用所述可电离脂质重构所述纯化的大豆衍生脂质而被修饰。

实施方案16.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质具有选自由以下各项组成的组的一种或多种特征：

(i)至少2个可电离胺；

(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每个脂质尾部的长度为至少6个碳原子；

(iii)约4.5至约7.5的pKa；

(v)至少3的N:P比率。

实施方案17.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质选自由1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5、SM-102(脂质H)和ALC-315组成的组。

实施方案18.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质由的化合物表示，其中每个R独立地是C₈-C₁₄烷基。

实施方案19.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质选自以下化合物组之一：

每个A独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₁-C₁₆支链或非支链烯基，所述烷基或所述烯基任选地被杂原子取代或被OH、SH或卤素取代；

每个B独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₁-C₁₆支链或非支链烯基，所述烷基或所述烯基任选地被杂原子取代或被OH、SH或卤素取代；

每个X独立地是可生物降解部分；并且

W是其中：

R₅是OH、SH或NR₁₀R₁₁；

每个s独立地是1、2、3、4或5；

每个u独立地是1、2、3、4或5；

t是1、2、3、4或5；

Q是O、S或NR₁₃，其中每个R₁₃是H或C₁-C₅烷基；

是环状或杂环部分；

Y是烷基、羟基、羟烷基或

-亚烷基-O-、-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-或-S-；

每个M独立地是可生物降解部分；

l和m中的每一者是1至10的整数；

t1是0至10的整数；并且

iii)式

R₂₀和R₃₀各自独立地是H、C₁-C₅支链或非支链烷基或C₂-C₅支链或非支链烯基，或R₂₀和R₃₀与相邻N原子一起形成3至7元环，所述环任选地被R^a取代；

R₁和R₂合在一起形成环；

n是0、1、2、3或4；

Y是O或S；

v是0、1、2、3或4；

y是0、1、2、3或4；

每个A各自独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₂-C₁₆支链或非支链烯基，所述烷基或所述烯基任选地被一个或多个杂原子间杂或任选地被OH、SH或卤素取代；

每个B各自独立地是C₁-C₁₆支链或非支链烷基或C₂-C₁₆支链或非支链烯基，所述烷基或所述烯基任选地被一个或多个杂原子间杂或任选地被OH、SH或卤素取代；并且

每个X独立地是可生物降解部分；和

iv)包含至少一个头部基团和式(TI)或(TI')

其中：

E各自独立地是-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-、-C(O-R₁₃)-O-、-C(O)O(CH₂)_r-、-C(O)N(R⁷)(CH₂)_r-、-S-S-或-C(O-R₁₃)-O-(CH₂)_r-，其中每个R⁷独立地是H、烷基、烯基、环烷基、羟烷基或氨基烷基；

R₁₃是支链或非支链C₃-C₁₀烷基；

r是1、2、3、4或5；

R^a各自独立地是C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基；

u1和u2各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；

表示将所述尾部基团与所述头部基团连接的键；并且

其中所述脂质的pKa是约4至约8。

实施方案20.如实施方案19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由式表示的组i)的化合物、其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体，其中：

每个X独立地是可生物降解部分；

每个q独立地是2、3、4或5；

V是支链或非支链C₂-C₁₀亚烷基、C₂-C₁₀亚烯基、C₂-C₁₀亚炔基或C₂-C₁₀亚杂烷基，所述亚烷基、所述亚烯基、所述亚炔基或所述亚杂烷基任选地被一个或多个OH、SH和/或卤素基团取代；

每个m独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

实施方案21.如实施方案20所述的经修饰的脂质组合物，其中V是支链或非支链C₂-C₃亚烷基，并且每个R₆独立地是H或甲基。

实施方案22.如实施方案19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由式表示的组i)的化合物、其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体，其中：

每个X独立地是可生物降解部分；

每个s独立地是1、2、3、4或5；

T是–NHC(O)O-、–OC(O)NH-或任选地被一个或多个

-(CH₂)_vOH、-(CH₂)_vSH、-(CH₂)_v-卤素基团取代的二价杂环，

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；并且

每个m独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

实施方案23.如实施方案22所述的经修饰的脂质组合物，其中T是二价哌嗪或二价二氧代哌嗪。

实施方案24.如实施方案20-23中任一项所述的经修饰的脂质组合物，其中X是-OCO-、-COO-、-CONH-或-NHCO-。

实施方案25.如实施方案19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由下式之一表示的组ii)的化合物：

其中：

t1是0至10的整数；

每个M独立地是可生物降解部分；

每个m1独立地是3至6的整数，

每个l1独立地是4至8的整数，

m2和l2各自独立地是0至3的整数，

R₈₀和R₉₀各自独立地是未经取代的C₅-C₈烷基或烯基；或者R₈₀是H或未经取代的C₁-C₄烷基或烯基，并且R₉₀是未经取代的C₅-C₁₁烷基或烯基；并且

R₁₁₀和R₁₂₀各自独立地是未经取代的C₅-C₈烷基或烯基；或者R₁₁₀是H或未经取代的C₁-C₄烷基或烯基，并且R₁₂₀是未经取代的C₅-C₁₁烷基或烯基。

实施方案26.如实施方案25所述的经修饰的脂质组合物，其中：

M是-OC(O)-或-C(O)O-；

是：OH、

每个R^c独立地是H或C₁-C₃烷基；并且

每个t1独立地是1、2、3或4。

实施方案27.如实施方案19所述经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是组iii)的化合物，其中R₁和R₂各自是H，或每个R₁是H，并且R₂变量之一是OH；并且X是–OC(O)-或

–C(O)O-。

实施方案28.如实施方案27所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由式III)表示的组iii)的化合物，其中：

R₂₀和R₃₀各自独立地是H或C₁-C₃支链或非支链烷基；或者R₂₀和R₃₀与相邻的N原子合在一起形成3至7元环，所述环任选地被R^a取代；

R^a是H或OH；

Z不存在，是S、O或NH；并且

n是0、1或2。

实施方案29.如实施方案27所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由式V)表示的组iii)的化合物。

实施方案30.如实施方案19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是包含至少一个头部基团和至少一个尾部基团的组iv)的化合物，其中：

所述尾部基团具有式(TI)(或TI')的结构；并且

所述头部基团具有以下式中的一者的结构：

i)

其中：

n是0、1、2、3或4；并且

Z不存在，是O、S或NR₁₂，其中R₁₂是H或C₁-C₇支链或非支链烷基；条件是当Z并非不存在时，相邻的R₁和R₂不能是OH、NR₁₀R₁₁或SH；

ii)

其中：

R₁是H、C₁-C₃烷基、OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁；

v和y中的每一者独立地是1、2、3或4；

iii)

其中W是

其中

R₅是OH、SH、(CH₂)_sOH或NR₁₀R₁₁；

每个R₂₀独立地是H或C₁-C₃支链或非支链烷基；

R₁₆是H、＝O、＝S或CN；

s、u和t中的每一者独立地是1、2、3、4或5；

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；

每个Y是二价杂环；

Q是O、S、CH₂或NR₁₃，其中每个R₁₃是H或C₁-C₅烷基；

T是–NHC(O)O-、–OC(O)NH-或二价杂环；并且

iv)

其中：

是环状或杂环部分；

Y是烷基、羟基、羟烷基、

-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-、-N(R⁷)C(O)N(R⁷)-、-S-或-S-S-；

X和Z中的每一者独立地不存在，是-O-、-C(O)-、-N(R⁷)-、-O-亚烷基-、

-亚烷基-O-、-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-或-S-；

t是0、1、2或3；

t1是0至10的整数；并且

W是羟基、经取代的或未经取代的羟烷基、经取代的或未经取代的氨基、经取代的或未经取代的氨基羰基或经取代的或未经取代的杂环基或杂芳基；并且

其中所述脂质的pKa是约4至约8。

实施方案31.如实施方案30所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是组iv)的化合物，并且其中所述脂质的至少一个尾部基团具有下式之一：

其中：

R⁷各自独立地是H或甲基；

R^b在每种情况下独立地是H或C₁-C₄烷基；

u1和u2各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；并且

u3和u4各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；并且

所述头部基团具有以下式中的一者的结构：

i)其中m是1、2、3、4、5、6、7或8；

ii)

iii)以及

iv)

实施方案32.如实施方案31所述的经修饰的脂质组合物，其中至少一个尾部基团具有式(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TII')和/或(TIII')的结构，其中u1是3-5，u2是0-3，u3和u4各自独立地是1-7，并且R^a各自独立地是甲基。

实施方案33.如实施方案19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是表I、表II、表III或表IV中的化合物。

实施方案34.如实施方案33所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是

实施方案35.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物还包含固醇和/或聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

实施方案36.如实施方案35所述的经修饰的脂质组合物，其中所述PEG-脂质缀合物是PEG-DMG或PEG-PE。

实施方案37.如实施方案36所述的经修饰的脂质组合物，其中所述PEG-脂质缀合物是PEG2000-DMG或PEG2000-PE。

实施方案38.如实施方案35所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物包含：

约20mol％至约50mol％的所述可电离脂质，

约10mol％至约75mol％的所述结构组分，

约0mol％至约45mol％的所述固醇，和

约0.5mol％至约3mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

实施方案39.如实施方案35所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物包含：

约20mol％至约50mol％的所述可电离脂质，

约20mol％至约60mol％的所述结构组分，

约7mol％至约45mol％的所述固醇，和

约0.5mol％至约3mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

实施方案40.如实施方案38所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:50:12.5:2.5、约35:20:42.5:2.5、约22.5:75:0:2.5、约35:30:32.5:2.5、约35:16:46.5:2.5、约35:25:37.5:2.5、约35:40:22.5:2.5、约45:10:43.5:1.5、约50:20:28.5:1.5或约50:10:38.5:1.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

实施方案41.如实施方案35所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构脂质包含结构脂质1和结构脂质2，其中结构脂质1和结构脂质2是不同的结构脂质。

实施方案42.如实施方案41所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:(3+13):46.5:2.5、约35:(15+5):42.5:2.5或约35:(45+5):12.5:2.5的可电离脂质:(结构脂质1+结构脂质2):固醇:PEG-脂质。

实施方案43.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物是选自由脂质复合体、脂质体、脂质纳米颗粒、基于聚合物的载剂、外泌体、层状体、胶束和乳液组成的组的亲脂性部分。

实施方案44.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物是选自由阳离子脂质体、纳米脂质体、蛋白脂质体、单层脂质体、多层脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体和多囊脂质体组成的组的脂质体。

实施方案45.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物是脂质纳米颗粒。

实施方案46.如实施方案45所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有小于约200nm的粒度。

实施方案47.如实施方案45所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有小于约100nm的尺寸。

实施方案48.如实施方案45所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的平均多分散指数(PDI)在约0.1至约0.4的范围内。

实施方案49.如实施方案45所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的平均PDI在约0.2至约0.3的范围内。

实施方案50.如实施方案1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物还包含一种或多种异源功能剂。

实施方案51.如实施方案50所述的经修饰的脂质组合物，其中所述异源功能剂被所述经修饰的脂质组合物包封、嵌入在所述经修饰的脂质组合物的表面上或缀合至所述经修饰的脂质组合物的所述表面。

实施方案52.如实施方案50所述的经修饰的脂质组合物，其中所述异源功能剂包含多核苷酸。

实施方案53.如实施方案52所述的经修饰的脂质组合物，其中所述多核苷酸是mRNA或circRNA。

实施方案54.如实施方案50所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物具有约50:1至约10:1的总脂质:异源功能剂重量比。

实施方案55.如实施方案54所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物具有约40:1至约28:1的总脂质:异源功能剂重量比。

实施方案56.如实施方案54所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物具有约37:1至约33:1的总脂质:异源功能剂重量比。

实施方案57.一种用于将一种或多种异源功能剂递送至细胞或受试者的方法，所述方法包括

将所述细胞与所述一种或多种异源功能剂和如实施方案1-56中任一项所述的经修饰的脂质组合物接触或向所述受试者施用所述一种或多种异源功能剂和如实施方案1-56中任一项所述的经修饰的脂质组合物，其中所述异源功能剂被所述经修饰的脂质组合物包封、嵌入在所述经修饰的脂质组合物的表面上或缀合至所述经修饰的脂质组合物的所述表面。

实施方案58.如实施方案57所述的方法，其中将所述一种或多种异源功能剂递送至脾细胞、免疫细胞、淋巴细胞、造血干细胞和/或骨髓细胞。

实施方案59.如实施方案57所述的方法，其中所述经修饰的脂质组合物增加所述脾细胞、免疫细胞、淋巴细胞、造血干细胞和/或骨髓细胞的转染。

实施方案60.如实施方案59所述的方法，其中脾淋巴细胞以亲本群体的至少1％、至少2％或至少5％的频率被转染。

实施方案61.如实施方案59所述的方法，其中脾骨髓细胞以亲本群体的至少5％、至少10％或至少15％或更多的频率被转染。

实施方案62.如实施方案59所述的方法，其中所述造血干细胞以亲本群体的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的频率被转染。

实施方案63.如实施方案57所述的方法，其中所述异源功能剂包含多核苷酸。

实施方案64.如实施方案63所述的方法，其中所述多核苷酸是mRNA或circRNA。

实施例

现在一般性地描述本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的而被包括在内，而并非旨在限制本发明。

实施例1：经修饰的脂质组合物的制备和修饰

该实施例描述了包含结构脂质(例如，从天然来源提取的脂质)的结构组分的制备和结构组分的修饰以形成经修饰的脂质组合物。

包含从来源提取的脂质的结构组分

包含分离的细胞外囊泡(EV)的结构组分的提取和分离可以利用美国专利申请公开号2020/0254028中公开的方法来完成，该专利以引用的方式整体并入本文。

从天然来源提取和分离脂质可以利用国际申请公开号WO 2010/120939、国际申请公开号WO 2021/041301、美国专利号7,847,113和美国专利号8,592,188中公开的方法来完成，这些专利以引用的方式整体并入本文。具体地，国际专利申请公开号WO 2021/041301的实施例1-17中公开的所有实验方案以引用的方式整体并入本文，包括：实施例1.从植物中分离植物信使包；实施例2.产生经纯化的植物信使包(PMP)；实施例3.植物信使包表征；实施例4.植物信使包稳定性的表征；实施例5.用货物装载PMP；实施例6.通过用离子液体调配PMP来增加PMP细胞摄取；实施例7.使用可电离脂质修饰PMP；实施例8.用微流体调配LPMP；实施例9.使用可电离脂质将mRNA装载并递送到脂质重构的PMP中；实施例10.在具有或不具有可电离脂质修饰的情况下，天然和重构的PMP的细胞摄取；实施例11.通过用阳离子脂质调配PMP来增加PMP细胞摄取；实施例12.使用阳离子脂质修饰PMP；实施例13.使用阳离子脂质将mRNA装载并递送到脂质重构的PMP中；实施例14.在具有和不具有阳离子脂质修饰的情况下，天然和重构的PMP的细胞摄取；实施例15.使用阳离子脂质GL67和乙基PC改善的装载；实施例16.优化mRNA装载的脂质比率；以及实施例17.优化质粒装载的脂质比率。

天然或合成衍生的脂质也可以从商业来源获得。例如，大豆脂质提取物、神经酰胺或心磷脂可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,AL)获得。

制备和修饰结构脂质原料以形成经修饰的脂质组合物。来自大豆的极性脂质提取物从Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,AL)获得。将脂质从Avanti Polar Lipids,Inc.提供的安瓿(通常100mg/4ml二氯甲烷)定量转移到100ml圆底烧瓶中，并通过旋转蒸发除去MeCl₂。将脂质膜在真空下干燥至少30分钟，然后通过搅拌在选定的缓冲液中再水合30分钟。使用液体N₂和37℃水浴对脂质分散体进行10次冻融循环，然后作为等分试样在氩气下在-20℃下储存。所有步骤均在氩气下进行，以限制脂质暴露于空气。

为了形成经修饰的脂质组合物，用可电离脂质和固醇以及PEG-脂质修饰结构脂质组分。

在一种方法中，使用Bligh-Dyer方法(Bligh和Dyer,1959,JBiolchem Physiol37:911-917)从结构组分的浓缩溶液中提取结构脂质，并如上文所描述的分离。含有结构脂质的脂质膜是通过用惰性气体(例如，氮气)流蒸发结构组分的浓缩溶液中的溶剂来制备的。将可电离脂质添加到氯仿:甲醇(9:1)中的结构脂质原液中，使其量达到总脂质的25％或40％(w/w)，并通过剧烈混合使脂质重悬。

在另一种方法中，使用IGNITETM微流体仪器(PrecisionNanoSystems)作为模型微流体系统。该方法允许通过将水相与含有从结构源提取的溶解脂质的一种可混溶溶剂或多种可混溶溶剂的组合混合，通过自组装形成经修饰的脂质组合物。

可以使用来自商业来源的结构脂质提取物。可替代地，使用Bligh-Dyer方法(Bligh和Dyer,J Biolchem Physiol,37:911-917(1959))从结构组分的浓缩溶液中提取来自结构来源的脂质，并如上文所描述的分离。将氯仿:甲醇(9:1)、DMF：甲醇(4:1)或乙醇中的结构脂质提取物原液与可电离脂质(例如，C12-200)和其他外源脂质(例如，固醇和PEG脂质)混合，使其占总脂质的25％或40％(w/w)，通过剧烈混合重悬，并通过用惰性气体(例如，氮气)流蒸发溶剂进行干燥以制备脂质膜。可以使用多种有机溶剂来溶解干燥的脂质膜:乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1-丁醇、二甲基亚砜、乙腈:乙醇(1:1)、乙腈:甲醇(3:1)、丙酮:甲醇(3:1)、甲基叔丁基醚:丙醇(3:2)、四氢呋喃:甲醇(3:2)、二甲基亚砜:甲醇(3:1)和二甲基甲酰胺:甲醇(4:1)。将275μL有机溶剂添加到1mg干燥的脂质膜中，或者在其他情况下，添加适量的有机溶剂以形成5.5mM脂质混合物。将样品在水浴超声仪中在37℃下进行超声处理10分钟。

将脂质溶液(溶于有机溶剂或溶剂组合中的经修饰的脂质组合物脂质；有机相)装载到1mL滑动尖头注射器(Becton Dickinson)中，并放置在安装到IGNITETM微流体装置(Precision Nanosystems)上的设置为37℃的加热块中。将825μL水相(用于可电离脂质或H₂O的10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 3.2，或用于阳离子脂质的PBS)装载到1mL滑动尖头注射器(Becton Dickinson)中并安装到微流体装置上。将水相和有机相在微流体装置中以3:1的体积比以9-12mL/min的流速混合。将所得颗粒在Slide-A-LyzerTM G2盒(20kDa MWCO)中用PBS在室温下透析2-4小时。然后将盒转移到2.5L 1xPBS中，并在4℃和60RPM下透析过夜。将4mL 10K过滤器用1mL水冲洗，用EtOH和1X PBS填充，在4℃下以2000xg离心10分钟。弃去PBS。用5mL注射器和针头从透析管中取出颗粒，然后将其放入标记的过滤管中。将管以2000xg离心20-45分钟。回收经修饰的脂质组合物并在4℃下储存。

经修饰的脂质组合物的表征

可以使用Zetasizer(Malvern Panalytical)测量颗粒的流体动力学直径和多分散性。可以使用制造商提供的浓度和尺寸标准，通过NanoFCM来确定颗粒的最终浓度和尺寸。用可电离脂质(例如，C12-200、2213、2231、2252等)修饰结构组分使得经修饰的脂质组合物的表面电荷发生pH依赖性变化：随着pH降低，经修饰的脂质组合物的表面电荷将增加。

按照制造商的说明，通过使用Malvern NanoSight进行纳米颗粒跟踪分析(NTA)或使用iZon qNano进行可调电阻脉冲传感(TRPS)来确定经修饰的脂质组合物的颗粒浓度。脂质浓度可以使用荧光亲脂染料来确定，诸如DiOC6(ICN Biomedicals)，如Rutter和Innes,Plant Physiol.173(1):728-741,2017所描述的。简而言之，可以将经修饰的脂质组合物悬浮在用MES缓冲液(20mM MES，pH 6)和2mM 2,29-联吡啶二硫化物稀释的100ml 10mM DiOC6(ICN Biomedicals)中，并在37℃下温育10分钟，用3mL MES缓冲液洗涤，重新沉淀(40,000g，60分钟，4℃)，并重悬在新鲜MES缓冲液中。可以在485nm激发和535nm发射下测量DiOC6荧光强度。

还可以按照Wu等人,Analyst.140(2):386-406(2015)的方案，通过在JEOL 1010透射电子显微镜上的电子显微镜和冷冻电子显微镜来表征经修饰的脂质组合物，该文献以引用的方式整体并入本文。可以使用Malvern Zetasizer or iZon qNano，按照制造商的说明测量经修饰的脂质组合物的尺寸和ζ电位。使用氯仿萃取分离脂质，并用LC-MS/MS进行表征。

实施例2：示例性经修饰的脂质组合物的制备和表征。

本实施例描述了包含用可电离脂质、固醇和PEG脂质重构的结构脂质(大豆PI)的经修饰的脂质组合物的制备，以及与其他脂质组合物(例如，DOPE LNP)相比经修饰的脂质组合物的表征。

大豆PI组合物。在本实施例中，对于经修饰的脂质组合物，使用来自大豆的极性脂质提取物(根据实施例1制备的结构脂质大豆PI(来自大豆)原液)作为结构脂质；使用C12-200[1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)]作为可电离脂质；使用胆固醇(14:0)作为固醇；使用DMPE-PEG2k作为模型PEG化脂质。制备经修饰的脂质组合物以得到摩尔比分别为22.5:75:0:2.5、35:50:12.5:2.5、35:30:32.5:2.5或35:16:46.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质(C12-200:大豆PI极性脂质:胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。对于具有3％结构脂质的组合物，制备经修饰的脂质组合物以得到摩尔比为35:3+13:46.5:2.5的可电离脂质:(结构脂质1+结构脂质2):固醇:PEG-脂质(C12-200:(大豆PI极性脂质+DOPC):胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。将上述脂质溶解于乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。

LNP组合物。制备作为对照的LNP(脂质纳米颗粒)调配物以得到摩尔比分别为35:16:46.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质(C12-200:DOPE:胆固醇:DMPE-PEG2k((1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]))。DOPE：1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(Avanti Polar Lipids,Inc.)。将上述脂质溶解于乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。

根据实施例1制备上述组合物。可替代地，将它们装载到Slide-A-Lyzer G2透析盒(10k MWCO)中，并在轻轻搅拌的情况下在室温下在200倍样品体积的1x PBS中透析4小时。更新PBS溶液，并且在轻轻搅拌的情况下在4℃下，将组合物进一步透析至少14小时。然后收集经透析的组合物，并通过以3000xg离心(Amicon Ultra离心过滤器，100k MWCO)进行浓缩。

使用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical)对经浓缩的颗粒的尺寸、多分散性和颗粒浓度进行表征。

实施例3：用各种货物装载经修饰的脂质组合物。

本实施例描述了用各种货物(异源功能剂)诸如小分子、蛋白质和核酸装载经修饰的脂质组合物的方法。

将小分子装载到经修饰的脂质组合物中。如实施例1或实施例2中所描述的制备经修饰的脂质组合物。为了将小分子装载到经修饰的脂质组合物中，将经修饰的脂质组合物与固体形式或溶解的小分子一起置于PBS溶液中。将溶液在22℃下放置1小时。可替代地，根据Wang等人,Nature Comm.4:文章编号:1867(2013)的方案对溶液进行超声处理，以诱导穿孔并扩散到外泌体中，该文献以引用的方式整体并入本文。可替代地，根据Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.40(17):e130(2012)的方案对经修饰的脂质组合物进行电穿孔，该文献以引用的方式整体并入本文。可替代地，将经修饰的脂质组合物中的脂质与小分子溶液混合，并根据Haney等人,J Contr.Rel.(2015)的方案通过脂质挤出机，该文献以引用的方式整体并入本文。在使用之前，可以使用如实施例1中所描述的方法纯化装载的经修饰的脂质组合物，以除去未结合的小分子。

将蛋白质或肽装载到经修饰的脂质组合物中。如实施例1或实施例2中所描述的制备经修饰的脂质组合物。为了将蛋白质或肽装载到经修饰的脂质组合物中，将经修饰的脂质组合物与蛋白质或肽一起置于PBS溶液中。如果蛋白质或肽不溶，则调节pH直到其可溶。如果蛋白质或肽仍然不溶，则使用不溶性蛋白质或肽。然后根据Wang等人,Nature Comm.4:文章编号:1867(2013)的方案对溶液进行超声处理，以诱导穿孔并扩散到经修饰的脂质组合物中，该文献以引用的方式整体并入本文。可替代地，根据Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.40(17):e130(2012)的方案对经修饰的脂质组合物进行电穿孔，该文献以引用的方式整体并入本文。可替代地，将经修饰的脂质组合物中的脂质与蛋白质或肽溶液混合，并根据Haney等人,J Contr.Rel.(2015)的方案通过脂质挤出机，该文献以引用的方式整体并入本文。在使用之前，可以使用如实施例1中所描述的方法纯化装载的经修饰的脂质组合物，以除去未结合的肽和蛋白质。为了测量蛋白质或肽的装载，可以对装载和未装载的经修饰的脂质组合物的小样品使用皮尔斯定量比色肽测定法。

将核酸装载到经修饰的脂质组合物中。如实施例1或实施例2中所描述的制备经修饰的脂质组合物。为了将核酸装载到经修饰的脂质组合物中，将经修饰的脂质组合物与核酸一起置于PBS溶液中。然后根据Wang等人,Nature Comm.4:文章编号:1867(2013)的方案对溶液进行超声处理，以诱导穿孔并扩散到经修饰的脂质组合物中，该文献以引用的方式整体并入本文。可替代地，根据Wahlgren等人,Nucl.Acids.Res.40(17):e130(2012)的方案对经修饰的脂质组合物进行电穿孔，该文献以引用的方式整体并入本文。可替代地，将经修饰的脂质组合物中的脂质与核酸溶液混合，并根据Haney等人,J Contr.Rel.(2015)的方案通过脂质挤出机，该文献以引用的方式整体并入本文。在使用之前，可以使用如实施例1中所描述的方法纯化装载的经修饰的脂质组合物，以除去未结合的核酸。按照制造商的说明使用来自Thermo Fisher的Quant-It测定法对装载在经修饰的脂质组合物中的核酸进行定量，或者如果核酸是荧光标记的，则用酶标仪对荧光进行定量。

实施例4：用mRNA装载经修饰的脂质组合物并确定生物分布

本实施例说明了用mRNA装载经修饰的脂质组合物以及将装载mRNA的经修饰的脂质组合物递送到小鼠体内的方法。另外，该实施例说明了基于不同结构脂质和不同脂质摩尔比的经修饰的脂质组合物的不同生物分布。在本实施例中，使用C12-200作为模型可电离脂质，并使用各种结构脂质作为结构组分。使用编码萤火虫荧光素酶和hEPO的mRNA(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)作为模型mRNA。使用挤出或微流体配制含有mRNA的经修饰的脂质组合物。

用mRNA装载经修饰的脂质组合物。为了通过挤出制备具有C12-200的脂质组合物，将溶解在不含核酸酶的水中的mRNA以每1mg结构脂质35μg mRNA添加到干燥的脂质膜中，并在室温下放置1小时以进行水合。使用0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 3.2(Teknova)将重悬脂质溶液的pH调节至4.5，以促进RNA捕获。然后将脂质溶液进行5次冻融循环。随后，使用0.1M碳酸氢盐缓冲液pH 10使脂质溶液的pH达到pH 9，然后对脂质进行另外5次冻融循环。将脂质组合物在配有100kDa MWCO膜的透析装置中对PBS进行过夜透析。通过超速离心除去游离RNA。将脂质组合物在4℃下以100,000g离心30分钟，除去上清液，并用1mL PBS或水洗涤沉淀。如上文所描述的重复离心，并将最终沉淀重悬于所需缓冲液(例如PBS)中。通过NanoFCM评估囊泡的大小和最终浓度。

为了通过微流体制备具有C12-200的脂质组合物，将1mg含有25％(w/w)C12-200的结构脂质溶解在275μL DMF:MeOH(4:1)中，并在水浴超声仪中在37℃下进行超声处理10分钟。将脂质溶液(有机相)装载到1mL滑动尖头注射器(Becton Dickinson)中，并放置在安装到微流体装置上的设置为37℃的加热块中。将35μg萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA溶解在825μL H₂O或PBS pH 7.4中，以配制水相。将35μg人EPO(hEPO)mRNA溶解在825μLH₂O或PBS pH 7.4中，以配制水相。将水相装载到1mL滑动尖头注射器(BectonDickinson)中并安装到微流体装置(IGNITE^TM,Precision Nanonystems)上。将水相和有机相在微流体装置中以3:1的体积比和12mL/min的流速混合。将所得颗粒在Slide-A-Lyzer^TM G2盒(20kDa MWCO)中用PBS在室温下透析4-24小时。通过NanoFCM评估囊泡的大小和最终浓度。

RNA装载由Quant-iT^TM 测定法(Thermo Scientific)确定。测定法根据制造商的方案在肝素(5mg/mL)和1％Triton^TM X-100的存在下进行，以裂解装载mRNA的脂质组合物并释放包封的货物。

将萤火虫荧光素酶mRNA(Fluc)递送至小鼠。测试了各种经修饰的脂质组合物的生物分布。本实施例中测试的调配物根据实施例1-4制备，并列于表1至表6中。

本实施例中所使用的FLuc mRNA(TriLink，CleanCap FLuc mRNA)的编码部分如下：

AUGGAGGACGCCAAGAACAUCAAGAAGGGCCCCGCCCCCUUCUACCCCCUGGAGGACGGCACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAGGCCAUGAAGCGGUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUCACCGACGCCCACAUCGAGGUGGACAUCACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUGCGGCUGGCCGAGGCCAUGAAGCGGUACGGCCUGAACACCAACCACCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAACAGCCUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGCUGGGCGCCCUGUUCAUCGGCGUGGCCGUGGCCCCCGCCAACGACAUCUACAACGAGCGGGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUGGUGUUCGUGAGCAAGAAGGGCCUGCAGAAGAUCCUGAACGUGCAGAAGAAGCUGCCCAUCAUCCAGAAGAUCAUCAUCAUGGACAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAGAGCAUGUACACCUUCGUGACCAGCCACCUGCCCCCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAGACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCUGCCCAAGGGCGUGGCCCUGCCCCACCGGACCGCCUGCGUGCGGUUCAGCCACGCCCGGGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCCAUCCUGAGCGUGGUGCCCUUCCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACCCUGGGCUACCUGAUCUGCGGCUUCCGGGUGGUGCUGAUGUACCGGUUCGAGGAGGAGCUGUUCCUGCGGAGCCUGCAGGACUACAAGAUCCAGAGCGCCCUGCUGGUGCCCACCCUGUUCAGCUUCUUCGCCAAGAGCACCCUGAUCGACAAGUACGACCUGAGCAACCUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGCGCCCCCCUGAGCAAGGAGGUGGGCGAGGCCGUGGCCAAGCGGUUCCACCUGCCCGGCAUCCGGCAGGGCUACGGCCUGACCGAGACCACCAGCGCCAUCCUGAUCACCCCCGAGGGCGACGACAAGCCCGGCGCCGUGGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCCAAGGUGGUGGACCUGGACACCGGCAAGACCCUGGGCGUGAACCAGCGGGGCGAGCUGUGCGUGCGGGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUGAACAACCCCGAGGCCACCAACGCCCUGAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAGUACAAGGGCUACCAGGUGGCCCCCGCCGAGCUGGAGAGCAUCCUGCUGCAGCACCCCAACAUCUUCGACGCCGGCGUGGCCGGCCUGCCCGACGACGACGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCCGUGGUGGUGCUGGAGCACGGCAAGACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUACGUGGCCAGCCAGGUGACCACCGCCAAGAAGCUGCGGGGCGGCGUGGUGUUCGUGGACGAGGUGCCCAAGGGCCUGACCGGCAAGCUGGACGCCCGGAAGAUCCGGGAGAUCCUGAUCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUGA(SEQ ID NO:1)

本实施例中所使用的hEPO mRNA的编码部分如下：

AUGGGCGUGCACGAGUGCCCCGCCUGGCUGUGGCUGCUGCUGAGCCUGCUGAGCCUGCCCCUGGGCCUGCCCGUGCUGGGCGCCCCCCCCCGGCUGAUCUGCGACAGCCGGGUGCUGGAGCGGUACCUGCUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAACAUCACCACCGGCUGCGCCGAGCACUGCAGCCUGAACGAGAACAUCACCGUGCCCGACACCAAGGUGAACUUCUACGCCUGGAAGCGGAUGGAGGUGGGCCAGCAGGCCGUGGAGGUGUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGAGCGAGGCCGUGCUGCGGGGCCAGGCCCUGCUGGUGAACAGCAGCCAGCCCUGGGAGCCCCUGCAGCUGCACGUGGACAAGGCCGUGAGCGGCCUGCGGAGCCUGACCACCCUGCUGCGGGCCCUGGGCGCCCAGAAGGAGGCCAUCAGCCCCCCCGACGCCGCCAGCGCCGCCCCCCUGCGGACCAUCACCGCCGACACCUUCCGGAAGCUGUUCCGGGUGUACAGCAACUUCCUGCGGGGCAAGCUGAAGCUGUACACCGGCGAGGCCUGCCGGACCGGCGACCGGUGA(SEQ ID NO:2)

方案1中示出了经修饰的脂质组合物的单剂量静脉内递送的设计和评估。

经修饰的脂质组合物调配物。制备经修饰的脂质组合物调配物以得到摩尔比分别为35:3+13:46.5:2.5、35:16:46.5:2.5、35:30:32.5:2.5、35:50:12.5:2.5或22.5:75:0:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质((C12-200:不同结构脂质(如表1至表3中所列):胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)或(2213/2231/2252:不同结构脂质(如表4至表6中所列):胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。为了制备该调配物，将上述脂质溶解在乙醇中。然后将脂质以上述摩尔比混合，并稀释以获得5.5mM的总脂质浓度。用无RNAse的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，最终浓度为50mM柠檬酸盐缓冲液。

将脂质混合物和mRNA溶液分别以1:3体积比在NanoAssemblr Ignite(PrecisionNanosystems)上以9-12mL/min的总流速混合。然后将所得调配物装载到Slide-A-Lyzer G2透析盒(10k MWCO)中，并在轻轻搅拌的情况下在室温下在200倍样品体积的1x PBS中透析4小时。更新PBS溶液，并且在轻轻搅拌的情况下在4℃下，将调配物进一步透析至少14小时。然后收集经透析的调配物，并通过以3000xg离心(Amicon Ultra离心过滤器，100k MWCO)进行浓缩。

使用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical)对经浓缩的颗粒的尺寸、多分散性和颗粒浓度进行表征。mRNA包封效率的特征在于Quant-iT RiboGreen RNA测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)。将颗粒稀释至期望的mRNA浓度，以获得最终的10％蔗糖PBS溶液。然后将调配物在液氮中快速冷冻。

表1至表6中示出了具有mRNA的所得调配物。方案1中示出了经修饰的脂质组合物的单剂量静脉内递送的设计和评估。

如方案1中所示，针对每种调配物对两只小鼠进行了评估。在0h时将测试样品静脉注射到小鼠体内，然后在4-6h后给小鼠注射D-荧光素(200μL，15mg/mL)。5分钟后，在自动曝光下对动物进行全身活体成像。然后将动物安乐死，并在暴露1秒和1分钟时对器官进行成像。

表1.

图1A示出了小鼠静脉内施用使用结构脂质DOPE、DOPC、DSPC、LPC、脑鞘磷脂(SM)、神经酰胺、葡糖基神经酰胺、乳糖基神经酰胺、乳糖基PE、MGDG、DGDG、半乳糖基胆固醇、葡糖基胆固醇、甘油三酯(TG)或心磷脂(CA)以16％、30％、50％或75％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图1B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。表1中描述了具有mRNA的对应调配物。

表2.

图2A示出了小鼠静脉内施用使用结构脂质DOPE、DOPS、大豆PS、脑PS、LPS、DOPG、大豆PG、DOPA、14:0PA、大豆PA、蛋PA和LPA以3％、16％、30％或50％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图2B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。表2中描述了具有mRNA的对应调配物。

表3.

图3A示出了与携带相同货物的相同摩尔比的DOPE LNP组合物相比，小鼠静脉内施用使用结构脂质大豆极性脂质、大豆PL混合物、大豆PC、大豆LPC、大豆PE、大豆PS、大豆PG、大豆PA和大豆PI以16％、30％或50％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的示例性经修饰的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组图3B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。表3中描述了具有mRNA的对应调配物。

表4.

图4A示出了与携带相同货物作为对照的LNP组合物相比，小鼠静脉内施用使用可电离脂质2213和结构脂质半乳糖基胆固醇、脑鞘磷脂(SM)、神经酰胺、心脏心磷脂(CA)、大豆极性脂质或大豆LPC以16％或50％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的示例性经修饰的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图4B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。表4中描述了具有mRNA的对应调配物。

表5.

图5A示出了与携带相同货物作为对照的LNP组合物相比，小鼠静脉内施用使用可电离脂质2231和结构脂质葡糖基胆固醇、脑SM、心脏CA、大豆PC、大豆LPC、大豆PS、大豆极性脂质和大豆PL混合物以16％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的示例性经修饰的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图5B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。表5中描述了具有mRNA的对应调配物。

表6.

图6A示出了与携带相同货物作为对照的LNP组合物相比，小鼠静脉内施用使用可电离脂质2252和结构脂质脑SM、CA、大豆PC、大豆LPC、大豆PS、大豆极性脂质和大豆PL混合物以16％或50％脂质摩尔比(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)的示例性经修饰的脂质组合物后4-6小时的全身辐射率(平均辐射率p/s/cm²/sr)。N＝2/组。图6B示出了静脉内给药相同组合物(10ug/100uL；1:1FLuc:hEPO mRNA)后4小时的脾脏与肝脏比率。表6中描述了具有mRNA的对应调配物。

实施例5：经修饰的脂质组合物的转染

本实施例中测试的调配物(含有4:1CRE:FLuc mRNA 7.5μg的经修饰的脂质组合物/mRNA或LNP组合物)根据实施例1-5制备并列于表7中。

本文提供了调配物的单剂量静脉内递送的设计和评估。每组三只TdTomato/Ai9小鼠(缓冲液、2213脑SM、2213LNP、2213大豆LPC和2213大豆极性脂质)在D0静脉内注射7.5μg/100μL(0.375mg/kg)。在D3，收集脾脏并准备进行FACS。

表7.具有CRE mRNA的结构脂质

流式细胞术和荧光激活细胞分选(FACS)。分析了从小鼠脾脏中收集的淋巴细胞和骨髓细胞中tdTomato+细胞的频率。将脾脏通过过滤器过滤，在4℃下以500x g离心5分钟，然后细胞进行红细胞裂解。将细胞离心并重悬于Fc块中，在冰上温育10分钟，然后添加抗体。将细胞在冰上黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液洗涤并对其进行流式细胞术。使用的抗体包括CD4、F4/80、CD31、EpCam、CD11b、tdtomato、CD45、活/死染色剂、CD11C、CD19、CD8b、CD3、MHCII、Ly6G和CD64。

总之，与静脉内递送根据实施例1-5制备的缓冲液的三只小鼠相比，向三只Ai9/tdTomato小鼠静脉内施用单剂量的2213脑SM、2213大豆LPC、2213大豆极性脂质或2213LNP(含有4:1CRE:FLuc mRNA 7.5μg)。通过FACS对给药后三天采集的脾脏测量作为转染量度的tdTomato+细胞的频率。

图7A示出了以PBS和2213LNP(0.375mg/kg；4:1CRE:FLuc mRNA)作为对照，在静脉内给药使用可电离脂质2213和结构脂质脑SM(16％脂质摩尔比)、大豆LPC(16％脂质摩尔比)和大豆极性脂质(50％脂质摩尔比)(0.375mg/kg；4:1CRE:FLuc mRNA)的经修饰的脂质组合物三天后收集的Ai9小鼠的脾脏中的淋巴细胞转染。N＝3/组。

图7B示出了以PBS和2213LNP(0.375mg/kg；4:1CRE:FLuc mRNA)作为对照，在静脉内给药使用可电离脂质2213和结构脂质脑SM(16％脂质摩尔比)、大豆LPC(16％脂质摩尔比)和大豆极性脂质(50％脂质摩尔比)(0.375mg/kg；4:1CRE:FLuc mRNA)的经修饰的脂质组合物三天后收集的Ai9小鼠的脾脏中的骨髓细胞转染。N＝3/组。结果表明脾脏淋巴细胞和骨髓细胞中的转染较高。

实施例6：在小鼠中用SARS-CoV-2S mRNA测试经修饰的脂质组合物

该实验被设计成测试包含表8中编码冠状病毒抗原(例如，刺突(S)蛋白)(诸如SARS-CoV-2抗原)的mRNA的候选冠状病毒疫苗在小鼠中的免疫原性。

表8.SARS-CoV-2刺突(S)mRNA序列(具有经修饰的帽)

递送货物S蛋白mRNA的编码部分的实例如下：

uaauacgacucacuauaagGAGAAUAAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUGUCCAGCCAGUGUGUGAACCUGACCACCAGAACACAGCUGCCUCCAGCCUACACCAACAGCUUUACCAGAGGCGUGUACUACCCCGACAAGGUGUUCAGAUCCAGCGUGCUGCACUCUACCCAGGACCUGUUCCUGCCUUUCUUCAGCAACGUGACCUGGUUCCACGCCAUCCACGUGUCCGGCACCAAUGGCACCAAGAGAUUCGACAACCCCGUGCUGCCCUUCAACGACGGGGUGUACUUUGCCAGCACCGAGAAGUCCAACAUCAUCAGAGGCUGGAUCUUCGGCACCACACUGGACAGCAAGACCCAGAGCCUGCUGAUCGUGAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAAGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCCUUCCUGGGCGUCUACUACCACAAGAACAACAAGAGCUGGAUGGAAAGCGAGUUCCGGGUGUACAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAGUACGUGUCCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAGCAGGGCAACUUCAAGAACCUGCGCGAGUUCGUGUUUAAGAACAUCGACGGCUACUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUCAACCUCGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCUCUGCUCUGGAACCCCUGGUGGAUCUGCCCAUCGGCAUCAACAUCACCCGGUUUCAGACACUGCUGGCCCUGCACAGAAGCUACCUGACACCUGGCGAUAGCAGCAGCGGAUGGACAGCUGGUGCCGCCGCUUACUAUGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUCCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACCGACGCCGUGGAUUGUGCUCUGGAUCCUCUGAGCGAGACAAAGUGCACCCUGAAGUCCUUCACCGUGGAAAAGGGCAUCUACCAGACCAGCAACUUCCGGGUGCAGCCCACCGAAUCCAUCGUGCGGUUCCCCAAUAUCACCAAUCUGUGCCCCUUCGGCGAGGUGUUCAAUGCCACCAGAUUCGCCUCUGUGUACGCCUGGAACCGGAAGCGGAUCAGCAAUUGCGUGGCCGACUACUCCGUGCUGUACAACUCCGCCAGCUUCAGCACCUUCAAGUGCUACGGCGUGUCCCCUACCAAGCUGAACGACCUGUGCUUCACAAACGUGUACGCCGACAGCUUCGUGAUCCGGGGAGAUGAAGUGCGGCAGAUUGCCCCUGGACAGACAGGCAAGAUCGCCGACUACAACUACAAGCUGCCCGACGACUUCACCGGCUGUGUGAUUGCCUGGAACAGCAACAACCUGGACUCCAAAGUCGGCGGCAACUACAAUUACCUGUACCGGCUGUUCCGGAAGUCCAAUCUGAAGCCCUUCGAGCGGGACAUCUCCACCGAGAUCUAUCAGGCCGGCAGCACCCCUUGUAACGGCGUGGAAGGCUUCAACUGCUACUUCCCACUGCAGUCCUACGGCUUUCAGCCCACAAAUGGCGUGGGCUAUCAGCCCUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAACUGCUGCAUGCCCCUGCCACAGUGUGCGGCCCUAAGAAAAGCACCAAUCUCGUGAAGAACAAAUGCGUGAACUUCAACUUCAACGGCCUGACCGGCACCGGCGUGCUGACAGAGAGCAACAAGAAGUUCCUGCCAUUCCAGCAGUUUGGCCGGGAUAUCGCCGAUACCACAGACGCCGUUAGAGAUCCCCAGACACUGGAAAUCCUGGACAUCACCCCUUGCAGCUUCGGCGGAGUGUCUGUGAUCACCCCUGGCACCAACACCAGCAAUCAGGUGGCAGUGCUGUACCAGGACGUGAACUGUACCGAAGUGCCCGUGGCCAUUCACGCCGAUCAGCUGACACCUACAUGGCGGGUGUACUCCACCGGCAGCAAUGUGUUUCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGAGCCGAGCACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCCAUCGGCGCUGGAAUCUGCGCCAGCUACCAGACACAGACAAACAGCCCUCGGAGAGCCAGAAGCGUGGCCAGCCAGAGCAUCAUUGCCUACACAAUGUCUCUGGGCGCCGAGAACAGCGUGGCCUACUCCAACAACUCUAUCGCUAUCCCCACCAACUUCACCAUCAGCGUGACCACAGAGAUCCUGCCUGUGUCCAUGACCAAGACCAGCGUGGACUGCACCAUGUACAUCUGCGGCGAUUCCACCGAGUGCUCCAACCUGCUGCUGCAGUACGGCAGCUUCUGCACCCAGCUGAAUAGAGCCCUGACAGGGAUCGCCGUGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGUGUUCGCCCAAGUGAAGCAGAUCUACAAGACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGCGGCUUCAAUUUCAGCCAGAUUCUGCCCGAUCCUAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCUUCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAAGUGACACUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAGCAGUAUGGCGAUUGUCUGGGCGACAUUGCCGCCAGGGAUCUGAUUUGCGCCCAGAAGUUUAACGGACUGACAGUGCUGCCUCCUCUGCUGACCGAUGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCCGGCACAAUCACAAGCGGCUGGACAUUUGGAGCAGGCGCCGCUCUGCAGAUCCCCUUUGCUAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGAGUGACCCAGAAUGUGCUGUACGAGAACCAGAAGCUGAUCGCCAACCAGUUCAACAGCGCCAUCGGCAAGAUCCAGGACAGCCUGAGCAGCACAGCAAGCGCCCUGGGAAAGCUGCAGGACGUGGUCAACCAGAAUGCCCAGGCACUGAACACCCUGGUCAAGCAGCUGUCCUCCAACUUCGGCGCCAUCAGCUCUGUGCUGAACGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCUCCUGAGGCCGAGGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACAGGCAGACUGCAGAGCCUCCAGACAUACGUGACCCAGCAGCUGAUCAGAGCCGCCGAGAUUAGAGCCUCUGCCAAUCUGGCCGCCACCAAGAUGUCUGAGUGUGUGCUGGGCCAGAGCAAGAGAGUGGACUUUUGCGGCAAGGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGUCUGCCCCUCACGGCGUGGUGUUUCUGCACGUGACAUAUGUGCCCGCUCAAGAGAAGAAUUUCACCACCGCUCCAGCCAUCUGCCACGACGGCAAAGCCCACUUUCCUAGAGAAGGCGUGUUCGUGUCCAACGGCACCCAUUGGUUCGUGACACAGCGGAACUUCUACGAGCCCCAGAUCAUCACCACCGACAACACCUUCGUGUCUGGCAACUGCGACGUCGUGAUCGGCAUUGUGAACAAUACCGUGUACGACCCUCUGCAGCCCGAGCUGGACAGCUUCAAAGAGGAACUGGACAAGUACUUUAAGAACCACACAAGCCCCGACGUGGACCUGGGCGAUAUCAGCGGAAUCAAUGCCAGCGUCGUGAACAUCCAGAAAGAGAUCGACCGGCUGAACGAGGUGGCCAAGAAUCUGAACGAGAGCCUGAUCGACCUGCAAGAACUGGGGAAGUACGAGCAGUACAUCAAGUGGCCCUGGUACAUCUGGCUGGGCUUUAUCGCCGGACUGAUUGCCAUCGUGAUGGUCACAAUCAUGCUGUGUUGCAUGACCAGCUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGUUGUAGCUGUGGCAGCUGCUGCAAGUUCGACGAGGACGAUUCUGAGCCCGUGCUGAAGGGCGUGAAACUGCACUACACAUGAUGACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCCUGGAGCUAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAcggcu(SEQ ID NO:3)

用SARS-CoV-2S mRNA装载经修饰的脂质组合物

制备和表征经修饰的脂质组合物以及用mRNA装载经修饰的脂质组合物的方案和详细实验程序遵循实施例1-4中描述的方案和详细实验程序。

本实施例描述了经修饰的脂质组合物的调配物，该经修饰的脂质组合物包含用可电离脂质(C12-200)、固醇(胆固醇)和PEG脂质(DMPE-PEG2k)重构的结构脂质(大豆衍生的)，以包封mRNA(例如，SARS-CoV-2刺突(S)mRNA序列)。根据实施例1-3制备经修饰的脂质组合物。SARS-CoV-2刺突(S)mRNA序列(本文描述)用作装载的mRNA。

大豆衍生的经修饰的脂质组合物/mRNA调配物。根据实施例1-3配制大豆衍生的经修饰的脂质组合物，其包含摩尔比分别为35:50:12.5:2.5或35:20:42.5:2.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质(C12-200:大豆衍生的脂质:胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。为了制备该调配物，将上述脂质溶解在乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。用无RNAse的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，最终浓度为50mM柠檬酸盐缓冲液。将调配物维持在15:1的可电离脂质与mRNA的可电离脂质氮:mRNA磷酸盐(N:P)比率下。

使用Zetasizer Ultra(Malvern Panalytical)对经浓缩的颗粒的尺寸、多分散性和颗粒浓度进行表征。将颗粒稀释至期望的mRNA浓度，以获得最终的10％蔗糖PBS溶液。然后将调配物在液氮中快速冷冻。表9中示出了具有mRNA的所得调配物，并且图8A中描绘了每种调配物的脂质摩尔比。

表9.具有mRNA的调配物

针对每种调配物和缓冲液对三只C57BL/6小鼠进行了评估。在D0时使用肌内(IM)途径将测试样品注射到小鼠的一条大腿上部。在D28，通过眼眶后穿刺将末端出血收集到肝素采血管中。将样品以2000g离心10分钟，并将血浆转移并在-80℃下储存。

血浆收集。如上所述，在D28收集血液样品。

通过多重ELISA评估结合抗体滴度。进行针对SARS-CoV-2的抗体反应(IgG)的分析，以使用多重ELISA和中和测定来定量靶向SARS-CoV-2抗原的小鼠抗体的反应。通过将血浆以1/10倍稀释来测定针对SARS-CoV-2的IgG抗体滴度。简言之，用S抗体涂在ELISA板上过夜。第二天，封闭板，稀释样品，并添加所有稀释液过夜。3天后，检测抗体和ELISA显影完成。通过选择样品不再稀释的最后稀释度来选择抗体滴度。

总之，每组三只小鼠肌内施用根据实施例1-3制备的单剂量的大豆衍生的经修饰的脂质组合物/SARS-CoV-2(含有S mRNA 10μg)。在D28通过多重ELISA评估抗体反应(IgG)。

图8A示出了大豆衍生的经修饰的脂质组合物的脂质摩尔比。图8B示出了在单剂量肌内递送来自图8A的大豆衍生的经修饰的脂质组合物(SmRNA 10μg)之后28天后小鼠血液中对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)具有特异性的抗体(IgG)的水平。N＝3/组。对照是PBS。结果表明，图8A中描述的任何给定大豆衍生的调配物的单剂量肌内疫苗接种能够在小鼠疫苗接种后28天诱导高水平的RBD-抗原特异性IgG。

实施例7：用大豆修饰的脂质组合物进行免疫细胞转染

本实施例中测试的调配物(含有CRE mRNA 25ug的经修饰的脂质组合物/mRNA)根据实施例1-5制备并列于表10中。测试的结构脂质是氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)或大豆磷脂酰胆碱。这些脂质组分是商业获得的。

本文提供了调配物的单剂量静脉内递送的设计和评估。每组四只cre报告基因Ai9/TdTomato小鼠(表10中列出的调配物)在D0以1.25mg/kg的剂量静脉内注射100uL。在D3，收集脾脏和骨髓并准备进行流式细胞术。

表10.具有CRE mRNA的经修饰的脂质组合物

流式细胞术。分析了从小鼠脾脏中收集的淋巴细胞和骨髓细胞中tdTomato+细胞的频率。将脾脏通过过滤器过滤，在4℃下以500x g离心5分钟，然后细胞进行红细胞裂解。将细胞离心并重悬于Fc块中，在冰上温育10分钟，然后添加抗体。将细胞在冰上黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液洗涤并对其进行流式细胞术。通过离心从收集的股骨中取出骨髓。对骨髓进行红细胞溶解。然后将细胞离心并重悬于FC块中，在冰上温育10分钟，然后将抗体混合物添加到细胞中。将细胞在冰上黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液洗涤并对其进行流式细胞术。使用的抗体包括CD4、F4/80、CD31、EpCam、CD11b、tdtomato、CD45、活/死染色剂、CD11C、CD19、CD8b、CD3、MHCII、Ly6G和CD64。

总之，与静脉内递送根据实施例1-5制备的缓冲液的初始小鼠相比，向四只cre报告基因Ai9小鼠静脉内施用单剂量的来自表10的经修饰的脂质调配物(含有CRE mRNA 25μg)。通过Flowjo分析从在给药后三天在细胞仪上运行的脾脏或骨髓样品中测量作为转染量度的tdTomato+细胞的频率。

图9A示出了在静脉内给药经修饰的脂质组合物(表10，1.25mg/kg CRE mRNA)三天后收集的脾脏中cre报告基因Ai9/tdTomato小鼠中的淋巴细胞转染，以初始小鼠作为对照。N＝4/实验组。数据反映了从几个实验收集的数据。初始组代表所有实验的汇总结果。

图9B示出了在静脉内给药经修饰的脂质组合物(表10，1.25mg/kg CRE mRNA)三天后收集的脾脏中cre报告基因Ai9小鼠中的骨髓细胞转染，以初始小鼠作为对照。N＝4/实验组。数据反映了从几个实验收集的数据。初始组代表所有实验的汇总结果。

结果表明脾脏淋巴细胞和骨髓细胞中的转染较高。

图10示出了在静脉内给药经修饰的脂质组合物(表10中的组6-8、16-18，1.25mg/kg CRE mRNA)三天后收集的骨髓中cre报告基因Ai9小鼠中的造血干细胞(HSC)转染，以初始小鼠作为对照。N＝3-4/实验组。数据反映了从几个实验收集的数据。初始组代表所有实验的汇总结果。

结果表明，所有测试的经修饰的脂质组合物均进行了转染，其中来自组6和16的调配物具有最高的转染频率。

实施例8：在仓鼠中测试经修饰的脂质组合物/SARS-CoV-2调配物

如果未特别说明，则根据实施例1-5中描述的制备经修饰的脂质组合物/mRNA调配物。该实验被设计成测试包含表8中编码冠状病毒抗原(例如，刺突(S)蛋白)(诸如SARS-CoV-2抗原)的mRNA的候选冠状病毒疫苗在仓鼠中的免疫原性。递送货物S蛋白mRNA的编码部分的实例在实施例6中进一步描述。

经修饰的脂质组合物/mRNA的配制和表征

本实施例进一步描述了用可电离脂质、结构脂质(天然或天然与合成的组合)、固醇和PEG脂质配制的几种组合物的调配物，以包封用于经修饰的脂质组合物/mRNA的mRNA(例如，S mRNA)。

在一些调配物中，根据实施例1-5配制大豆组合物，其包含表11中概述的给定摩尔比的可电离脂质:大豆脂质:固醇:PEG-脂质。在一些情况下，大豆脂质购自Avanti。为了制备该调配物，将上述脂质溶解在乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。用无RNAse的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，最终浓度为50mM柠檬酸盐缓冲液。将调配物维持在3:1-15:1的可电离脂质与mRNA的可电离脂质氮:mRNA磷酸盐(N:P)比率下(表11)。

将脂质混合物和mRNA溶液分别以1:3的体积比在IGNITE^TM(Precision Nanosystems)上以14mL/分钟的总流速混合。然后将所得调配物装载到Slide-A-Lyzer G2透析盒(10k MWCO)中，并在室温下用1x PBS透析2小时。更新PBS，并且在轻轻搅拌的情况下在4℃下，将调配物进一步透析至少14小时。然后收集经透析的调配物，并通过使用Ultra离心过滤器(100k MWCO)以2000xg离心进行浓缩。使用ZetasizerUltra(Malvern Panalytical)对经浓缩的调配物的大小、多分散性和颗粒浓度进行表征，并且使用QUANT-IT^TM RNA测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)对所述经浓缩的调配物的mRNA包封效率进行表征。

表11.调配物的表征

仓鼠的疫苗接种和给药

在本实验中，实验组(n＝14只仓鼠/组)在第0天和第21天肌内给药市售单价疫苗(1ug)或调配物19(大豆，含有S mRNA，10ug)或调配物19(大豆，含有S mRNA，1ug)。18只仓鼠的对照组(汇总的初始仓鼠)未给药。在第21天和第42天抽血，此时向所有仓鼠引入鼻内SARS-CoV-2攻击。如下所述进行样品处理和测定程序。

血液收集。通过眼眶后放血或心脏穿刺将全血收集在血清分离管中。对血液样品进行处理以得到血清。简言之，使血液在室温下凝结30分钟至1小时。然后将样品以1000-1300x g离心5-10分钟。收集血清并储存在-20℃。

鼻灌洗液收集。收集鼻灌洗液以通过ELISA测量IgA水平。根据BIOQUAL标准程序，通过吸入异氟烷使动物镇静。通过导管将0.3mL PBS引入动物的上鼻孔中。将冷冻管置于动物鼻下以收集灌洗液滴。

组织收集。在终末出血后，对动物进行尸检，取出肺和鼻甲，将其整体称重并快速冷冻成小块，用于TCID50和qRT-PCR。可替代地，从10％NBF中的动物收集左肺叶进行组织病理学评估。

脾脏样品处理。在终末出血后，对动物进行尸检，取出脾脏。将脾脏储存在5mL完全RPMI 1640培养基中并进行处理。简言之，将脾脏样品通过预处理的70μm细胞过滤器进行过滤。细胞分离后，将样品以500x g离心10分钟，然后小心地除去上清液。将脾细胞的单细胞悬浮液进行红细胞ACK裂解并洗涤。然后将细胞悬浮液通过100μm MACs SmartStrainer(Miltenyi Biotec目录号：130-110-917)过滤到新的无菌管中，并在4摄氏度下以500x g离心8分钟。除去离心细胞悬浮液的上清液后，将细胞沉淀重悬于1-2mL L-谷氨酰胺CTL-Test,培养基中。将细胞短暂地置于冰上，然后进行细胞计数，并以2.5×106个细胞/mL重悬于L-谷氨酰胺CTL-Test,培养基中。

IgA和IgG ELISA。进行标准间接ELISA以分析来自D23、42和49的血清样品与SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的结合抗体。简言之，用重组刺突RBD涂在ELISA板上过夜。第二天，封闭板，稀释样品，并添加所有稀释液并温育。温育后，检测抗体和ELISA显影完成。IgA抗体滴度定义为在滴定曲线的线性部分上产生OD450特定截止值的稀释度的倒数。通过选择样品不再稀释的最后稀释度来选择IgG抗体滴度。

噬斑减少中和试验(PRNT)。对来自D23、42、46和49的血清样品进行了SARS-CoV-2PRNT测定。将Vero E6细胞接种在生长培养基(DMEM+10％ FBS+庆大霉素)中。将细胞在37℃、5.0％ CO2下温育，直到第二天细胞达到80％-100％汇合。将热灭活血清样品或稀释培养基(DMEM+2％FBS+庆大霉素)中的阳性对照病毒添加到细胞中，并通过移液以不同稀释度进行混合，然后将病毒稀释液添加到样品和阳性对照孔中。将板密封并温育1h。除去培养基，一式两份添加滴定的样品/病毒稀释液，然后将板再次温育1h。然后添加覆盖甲基纤维素培养基，并将板温育3天。感染后，除去甲基纤维素覆盖培养基，洗涤并固定板。固定后，将细胞单层在室温下用0.2％结晶紫(30％ MeOH、80％dH2O)染色30分钟。将板洗涤并干燥。记录每个孔中的噬斑，并基于在病毒对照孔中检测到的平均噬斑数计算IC50滴度。

TCID50测定。对经处理的肺和鼻甲样品进行了TCID50测定，以确定感染性病毒滴度。用TMPRSS2细胞接种板并温育直至80％-100％汇合。吸出生长培养基并用每孔180μL稀释培养基(DMEM+2％ FBS+庆大霉素)替换。添加20μL经处理的组织样品(或阳性/阴性对照)，通过移液混合，然后以10倍稀释度逐行连续稀释。将板温育4天。温育后，在TCID测定表中，细胞病变效应(CPE)的存在表示为加号(+)，CPE的不存在表示为减号(-)；其中未感染的细胞被定义为具有清晰的汇合细胞层。使用Read-Muench公式计算TCID50值。

qRT-PCR。对肺和鼻甲样品进行了病毒载量的定量RT-PCR分析。SARS-CoV-2基因组RNA(gRNA)的qRT-PCR测定利用了专门设计用于扩增并结合冠状病毒核衣壳基因的保守区域的引物和探针；将信号与已知的标准曲线进行比较，并计算出每克组织的拷贝数。SARS-CoV-2亚基因组RNA(sgRNA)的qRT-PCR测定利用了专门设计用于扩增并结合来自SARS-COV-2的信使RNA的E基因的区域的引物和探针，该区域未被包装到病毒体中。将该信号与含有信使RNA的一部分(包括不在病毒中的部分)的序列的质粒的已知标准曲线进行比较，并计算出每克组织的拷贝数。

抗SARS-CoV-2/S T细胞反应的ELISPOT细胞因子评估。使用IFNγ免疫斑点双色ELISPOT测定法评估仓鼠针对SARS-CoV-2抗原的T细胞反应。在细胞过滤器上分离脾细胞，并在红细胞裂解之前和之后进行过滤。对活脾细胞进行计数，并在Luna细胞计数器上通过吖啶橙排除试验评估其活力。通过用SARS-CoV-2/S肽池刺激细胞过夜来进行ELISPOT测定。第二天，使用IFNγ彩色免疫斑点测定法对IFNγ产生细胞进行评估。使用Immunospot CTL-S6 Fluor分析仪对板进行分析。

图11A示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，1ug)后仓鼠血液中S特异性IgG的水平。图11B示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有S mRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有S mRNA，1ug)后仓鼠血液中RBD特异性IgG的水平。结果表明，两种剂量的经修饰的脂质组合物调配物均诱导高IgG结合滴度，并且高于商业单价疫苗诱导的滴度。

图12A示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，1ug)后仓鼠血液中S特异性IgG的量。图12B示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有S mRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有S mRNA，1ug)后仓鼠血液中RBD特异性IgG的量。结果表明，与市售单价疫苗相比，两种剂量的调配物诱导了更高量的SARS-CoV-2特异性IgG抗体。

图13示出了在给药后第21天一次肌内给药调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，10ug)或调配物19/SARS-CoV-2(大豆，含有SmRNA，1ug)后仓鼠中的抑制百分比。结果表明，与市售单价疫苗(1ug)相比，任一剂量(1ug或10ug)的单剂量大豆经修饰的脂质组合物调配物诱导更高的抑制百分比增加。

实施例9：经修饰的脂质组合物/SARS-CoV-2调配物在小鼠中的免疫原性

如果未特别说明，则根据实施例1-5中描述的制备经修饰的脂质组合物/mRNA调配物。该实验被设计成测试包含表8中编码冠状病毒抗原(例如，刺突(S)蛋白)(诸如SARS-CoV-2抗原)的mRNA的候选冠状病毒疫苗在小鼠中的免疫原性。递送货物S蛋白mRNA的编码部分的实例在实施例6中进一步描述。

经修饰的脂质组合物/mRNA的配制和表征

根据实施例1-5制备脂质纳米颗粒(LNP)调配物，其由表12中概述的给定摩尔比的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质组成。将脂质溶解于乙醇中。将这些脂质以指定摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释至5.5mM总脂质浓度，并且用无RNAse的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，最终浓度为50mM柠檬酸盐缓冲液。将调配物维持在3:1-15:1的可电离脂质与mRNA的N:P比率下(表12)。

在一些调配物中，根据实施例1-5配制大豆经修饰的脂质组合物，其包含表12中概述的给定摩尔比的可电离脂质:大豆脂质:固醇:PEG-脂质。在一些情况下，大豆脂质购自Avanti。为了制备该调配物，将上述脂质溶解在乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。用无RNAse的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，最终浓度为50mM柠檬酸盐缓冲液。将调配物维持在3:1-15:1的可电离脂质与mRNA的可电离脂质氮:mRNA磷酸盐(N:P)比率下(表12)。

表12.调配物的表征

小鼠的疫苗接种和收集

在本实验中，实验组(n＝6只小鼠/组)在第0天肌内给药经修饰的脂质组合物或LNP对照(10ug/40uL，表12)。在第7天和第10天，收集脾脏和同侧腹股沟淋巴结和同侧腘淋巴结，并进行流式细胞术处理。简言之，将淋巴结汇集并保存在冰上。使用胶原酶溶液在37℃下消化LN 10分钟。然后将样品洗涤并通过70um细胞过滤器过滤。将样品离心，与FC块一起温育，然后染色。生发B细胞被鉴定为CD19+/GL7+/CD95+/B220+。类别转换B细胞被鉴定为CD19+/GL7+/CD95+/B220+/IgF-/IgG+。滤泡T细胞被鉴定为CD4+/CXCR5+/PD-1+。

总之，对每个实验组(调配物20或21)肌内施用一定剂量的根据实施例1-5和表12制备的经修饰的脂质组合物/SARS-CoV-2(含有S mRNA 10μg/40uL)。LNP 1或初始小鼠为对照。在第7天或第10天对每组的一个队列实施安乐死，并收集脾脏和淋巴结。图14A和B分别示出了在D7和D10每组的汇集淋巴结中生发中心B细胞和T滤泡辅助细胞的绝对数量，图14C和D分别示出了在D7和D10每组的汇集淋巴结中B细胞中生发中心B细胞的频率和CD4 T细胞中T滤泡辅助细胞的频率。结果表明，单次肌内给药经修饰的脂质组合物在给药后7天和10天诱导生发中心。图14E示出了在D7和D10每组的汇集淋巴结中类别转换B细胞的绝对数量。结果表明，单次肌内给药经修饰的脂质组合物诱导了B细胞的稳健类别转换，与LNP 1对照相当或更好。

实施例10：经修饰的脂质组合物的生物分布

如果未特别说明，则根据实施例1-5中描述的制备经修饰的脂质组合物/mRNA调配物。该实验被设计成测试包含1:1fLuc:EPO的mRNA的候选组合物在小鼠体内的生物分布。EPO mRNA的编码部分的实例如下：

AUGGGCGUGCACGAGUGCCCCGCCUGGCUGUGGCUGCUGCUGAGCCUGCUGAGCCUGCCCCUGGGCCUGCCCGUGCUGGGCGCCCCCCCCCGGCUGAUCUGCGACAGCCGGGUGCUGGAGCGGUACCUGCUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAACAUCACCACCGGCUGCGCCGAGCACUGCAGCCUGAACGAGAACAUCACCGUGCCCGACACCAAGGUGAACUUCUACGCCUGGAAGCGGAUGGAGGUGGGCCAGCAGGCCGUGGAGGUGUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGAGCGAGGCCGUGCUGCGGGGCCAGGCCCUGCUGGUGAACAGCAGCCAGCCCUGGGAGCCCCUGCAGCUGCACGUGGACAAGGCCGUGAGCGGCCUGCGGAGCCUGACCACCCUGCUGCGGGCCCUGGGCGCCCAGAAGGAGGCCAUCAGCCCCCCCGACGCCGCCAGCGCCGCCCCCCUGCGGACCAUCACCGCCGACACCUUCCGGAAGCUGUUCCGGGUGUACAGCAACUUCCUGCGGGGCAAGCUGAAGCUGUACACCGGCGAGGCCUGCCGGACCGGCGACCGGUGA(SEQ ID NO:4)

FLuc mRNA(TriLink，CleanCap FLuc mRNA)的编码部分的实例如下：

AUGGAGGACGCCAAGAACAUCAAGAAGGGCCCCGCCCCCUUCUACCCCCUGGAGGACGGCACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAGGCCAUGAAGCGGUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUCACCGACGCCCACAUCGAGGUGGACAUCACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUGCGGCUGGCCGAGGCCAUGAAGCGGUACGGCCUGAACACCAACCACCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAACAGCCUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGCUGGGCGCCCUGUUCAUCGGCGUGGCCGUGGCCCCCGCCAACGACAUCUACAACGAGCGGGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUGGUGUUCGUGAGCAAGAAGGGCCUGCAGAAGAUCCUGAACGUGCAGAAGAAGCUGCCCAUCAUCCAGAAGAUCAUCAUCAUGGACAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAGAGCAUGUACACCUUCGUGACCAGCCACCUGCCCCCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAGACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGCAGCGGCAGCACCGGCCUGCCCAAGGGCGUGGCCCUGCCCCACCGGACCGCCUGCGUGCGGUUCAGCCACGCCCGGGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCCAUCCUGAGCGUGGUGCCCUUCCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACCCUGGGCUACCUGAUCUGCGGCUUCCGGGUGGUGCUGAUGUACCGGUUCGAGGAGGAGCUGUUCCUGCGGAGCCUGCAGGACUACAAGAUCCAGAGCGCCCUGCUGGUGCCCACCCUGUUCAGCUUCUUCGCCAAGAGCACCCUGAUCGACAAGUACGACCUGAGCAACCUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGCGCCCCCCUGAGCAAGGAGGUGGGCGAGGCCGUGGCCAAGCGGUUCCACCUGCCCGGCAUCCGGCAGGGCUACGGCCUGACCGAGACCACCAGCGCCAUCCUGAUCACCCCCGAGGGCGACGACAAGCCCGGCGCCGUGGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCCAAGGUGGUGGACCUGGACACCGGCAAGACCCUGGGCGUGAACCAGCGGGGCGAGCUGUGCGUGCGGGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUGAACAACCCCGAGGCCACCAACGCCCUGAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAGUACAAGGGCUACCAGGUGGCCCCCGCCGAGCUGGAGAGCAUCCUGCUGCAGCACCCCAACAUCUUCGACGCCGGCGUGGCCGGCCUGCCCGACGACGACGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCCGUGGUGGUGCUGGAGCACGGCAAGACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUACGUGGCCAGCCAGGUGACCACCGCCAAGAAGCUGCGGGGCGGCGUGGUGUUCGUGGACGAGGUGCCCAAGGGCCUGACCGGCAAGCUGGACGCCCGGAAGAUCCGGGAGAUCCUGAUCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUGA(SEQ ID NO:5)

经修饰的脂质组合物/mRNA的配制和表征

本实施例进一步描述了用可电离脂质、结构脂质(天然或天然与合成的组合)、固醇和PEG脂质配制的几种经修饰的脂质组合物的调配物，以包封用于经修饰的脂质组合物/mRNA的mRNA(例如，fLuc:EPO mRNA)。

根据实施例1-5制备脂质纳米颗粒(LNP)调配物，其由表13中概述的给定摩尔比的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质组成。将脂质溶解于乙醇中。将这些脂质以指定摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释至5.5mM总脂质浓度，并且用无RNAse的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，最终浓度为50mM柠檬酸盐缓冲液。将调配物维持在3:1-15:1的可电离脂质与mRNA的N:P比率下(表13)。

在一些调配物中，根据实施例1-5配制大豆组合物，其包含表13中概述的给定摩尔比的可电离脂质:大豆脂质:固醇:PEG-脂质。在一些情况下，大豆脂质购自Avanti。为了制备该调配物，将上述脂质溶解在乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。用无RNAse的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，最终浓度为50mM柠檬酸盐缓冲液。将调配物维持在3:1-15:1的可电离脂质与mRNA的可电离脂质氮:mRNA磷酸盐(N:P)比率下(表13)。

表13.调配物的表征

生物发光筛选

将8-9周龄的Balb/c小鼠用于表13中提供的调配物的基于生物发光的筛选工作，其中LNP 1和LNP 2用作对照。小鼠从杰克逊实验室获得，并且在操纵之前使所述小鼠适应一周。对于表13中描述的每种经修饰的脂质组合物或LNP组合物，向小鼠肌内给药含有1:1FLuc:hEPO的实验或对照组合物(每种5ug，10ug/40uL剂量，n＝3/组)。给药后4-6小时，向动物注射200μL 15mg/mL D-荧光素(GoldBio)，并将其置于IVIS Lumina LT成像仪(PerkinElmer)内的固定鼻锥中。利用LivingImage软件进行成像。在自动曝光时捕获全身生物发光，之后将动物从IVIS去除。这显示为平均辐射率。之后将小鼠放入CO2室中进行安乐死。在将每只动物置于背靠位中之后，对其进行心脏穿刺。使用25G胰岛素注射器(BD)进行血液收集。一旦收集了所有的血液样品，就使用台式离心机将管以2000G旋转10分钟，并且将血浆等分到单独的埃本多夫管(Fisher Scientific)中，并在-80℃下储存以用于后续EPO定量。使用EPO MSD试剂盒(Meso Scale Diagnostics)测定血浆中的EPO水平(pg/mL)。如上所述，收集器官，诸如肌肉、肝脏、脾脏、腘淋巴结(LN)、腹股沟LN、腋窝LN、臂LN、肺和骨髓，并成像。在1秒、1分钟和5分钟暴露下对器官进行成像。

如图15所示，实验组(即，经修饰的脂质组合物)的平均辐射率表现出比对照LNP更低的肝脏表达，表明全身暴露较少，同时在淋巴结中表现出相当的表达水平。

尽管出于清楚理解的目的，已经通过图示和实例的方式详细描述了前述发明，但是这些描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文所引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地以引用的方式整体并入。其他实施例在权利要求内。

Claims

1.一种经修饰的脂质组合物，包含：

(b)可电离脂质；

2.如权利要求1所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构组分包含源自牛心脏的心磷脂。

3.如权利要求1所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构组分包含鞘脂并且所述鞘脂是源自动物脑的鞘磷脂脂质。

4.一种经修饰的脂质组合物，包含：

(a)包含大豆衍生脂质的结构组分，由以下物质修饰

(b)可电离脂质。

5.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中结构脂质是大豆PI、大豆LPI、大豆PG、大豆极性脂质、大豆LPC、大豆PC、大豆PE、大豆PA、大豆PL(磷脂)混合物、大豆PS、大豆LPS、HSPC、心磷脂或它们的组合。

6.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆衍生脂质是大豆极性脂质组合物、大豆PL混合物或它们的组合。

7.如权利要求5或6所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆PL混合物包含

约30％至约50％的PC，

约20％至约40％的PE，

约10％至约25％的PI，

约1％至约15％的PA，

约1％至约15％的LPC，和

约0％至约10％的其他脂质。

8.如权利要求7所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆PL混合物包含百分比比率为约38:30:18:7:7:0的PC:PE:PI:PA:LPC:其他脂质。

9.如权利要求5或6所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆极性脂质组合物包含

约40％至约50％的PC，

约15％至约30％的PE，

约10％至约25％的PI，

约1％至约15％的PA，

约0％至约10％的LPC，和

约0％至约15％的其他脂质。

10.如权利要求9所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆极性脂质组合物包含百分比比率为约46:22:18:7:0:7的PC:PE:PI:PA:LPC:其他脂质。

11.如权利要求4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述大豆衍生脂质增加了所述经修饰的脂质组合物向脾脏的递送，其特征在于增加的脾脏与肝脏递送比率。

12.如权利要求1或11所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脾脏与肝脏递送比率为1.0或更大。

13.如权利要求1或11所述的经修饰的脂质组合物，其中存在于所述经修饰的脂质组合物中的结构脂质组分的量的增加增加了所述脾脏与肝脏递送比率。

14.如权利要求1所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构组分通过用所述可电离脂质重构所述结构组分而被修饰。

15.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构组分包含纯化的大豆衍生脂质，并且所述结构组分通过用所述可电离脂质重构所述纯化的大豆衍生脂质而被修饰。

16.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质具有选自由以下各项组成的组的一种或多种特征：

(i)至少2个可电离胺；

(iii)约4.5至约7.5的pKa；

(v)至少3的N:P比率。

17.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质选自由1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5、SM-102(脂质H)和ALC-315组成的组。

18.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质由的化合物表示，其中每个R独立地是C₈-C₁₄烷基。

19.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质选自以下化合物组之一：

每个X独立地是可生物降解部分；并且

W是其中：

R₅是OH、SH或NR₁₀R₁₁；

每个s独立地是1、2、3、4或5；

每个u独立地是1、2、3、4或5；

t是1、2、3、4或5；

Q是O、S或NR₁₃，其中每个R₁₃是H或C₁-C₅烷基；

是环状或杂环部分；

Y是烷基、羟基、羟烷基或

A不存在，是-O-、-N(R⁷)-、-O-亚烷基-、-亚烷基-O-、-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、

-C(O)N(R⁷)-、-N(R⁷)C(O)N(R⁷)-、-S-、-S-S-或二价杂环；

X和Z中的每一者独立地不存在，是-O-、-CO-、-N(R⁷)-、-O-亚烷基-、-亚烷基-O-、

-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-或-S-；

每个M独立地是可生物降解部分；

l和m中的每一者是1至10的整数；

t1是0至10的整数；并且

iii)式

R₁和R₂合在一起形成环；

n是0、1、2、3或4；

Y是O或S；

v是0、1、2、3或4；

y是0、1、2、3或4；

每个A各自独立地是C₁-C₁₆支链或非支链亚烷基或C₂-C₁₆支链或非支链亚烯基，所述亚烷基或亚烯基任选地被一个或多个杂原子间杂或任选地被OH、SH或卤素取代；

每个X独立地是可生物降解部分；和

iv)包含至少一个头部基团和式(TI)或(TI')

其中：

R₁₃是支链或非支链C₃-C₁₀烷基；

r是1、2、3、4或5；

R^a各自独立地是C₁-C₅烷基、C₂-C₅烯基或C₂-C₅炔基；

u1和u2各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；

表示将所述尾部基团与所述头部基团连接的键；并且

其中所述脂质的pKa是约4至约8。

20.如权利要求19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由式表示的组i)的化合物、其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体，其中：

每个X独立地是可生物降解部分；

每个q独立地是2、3、4或5；

每个m独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

21.如权利要求20所述的经修饰的脂质组合物，其中V是支链或非支链C₂-C₃亚烷基，并且每个R₆独立地是H或甲基。

22.如权利要求19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由式表示的组i)的化合物、其药学上可接受的盐和前述中的任一者的立体异构体，其中：

每个X独立地是可生物降解部分；

每个s独立地是1、2、3、4或5；

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；并且

每个m独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

23.如权利要求22所述的经修饰的脂质组合物，其中T是二价哌嗪或二价二氧代哌嗪。

24.如权利要求20-23中任一项所述的经修饰的脂质组合物，其中X是-OCO-、-COO-、

-CONH-或-NHCO-。

25.如权利要求19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由下式之一表示的组ii)的化合物：

其中：

t1是0至10的整数；

每个M独立地是可生物降解部分；

每个m1独立地是3至6的整数，

每个l1独立地是4至8的整数，

m2和l2各自独立地是0至3的整数，

26.如权利要求25所述的经修饰的脂质组合物，其中：

M是-OC(O)-或-C(O)O-；

是：OH、

每个R^c独立地是H或C₁-C₃烷基；并且

每个t1独立地是1、2、3或4。

27.如权利要求19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是组iii)的化合物，其中R₁和R₂各自是H，或每个R₁是H，并且R₂变量之一是OH；并且X是

–OC(O)-或–C(O)O-。

28.如权利要求27所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由式III)表示的组iii)的化合物，其中：

R^a是H或OH；

Z不存在，是S、O或NH；并且

n是0、1或2。

29.如权利要求27所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是由式V)表示的组iii)的化合物。

30.如权利要求19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是包含至少一个头部基团和至少一个尾部基团的组iv)的化合物，其中：

所述尾部基团具有式(TI)(或TI')的结构；并且

所述头部基团具有以下式中的一者的结构：

i)

其中：

n是0、1、2、3或4；并且

ii)

其中：

R₁是H、C₁-C₃烷基、OH、卤素、SH或NR₁₀R₁₁；

v和y中的每一者独立地是1、2、3或4；

iii)

其中W是

其中

R₅是OH、SH、(CH₂)_sOH或NR₁₀R₁₁；

每个R₂₀独立地是H或C₁-C₃支链或非支链烷基；

R₁₆是H、＝O、＝S或CN；

s、u和t中的每一者独立地是1、2、3、4或5；

每个v独立地是0、1、2、3、4或5；

每个Y是二价杂环；

Q是O、S、CH₂或NR₁₃，其中每个R₁₃是H或C₁-C₅烷基；

T是–NHC(O)O-、–OC(O)NH-或二价杂环；并且

iv)

其中：

是环状或杂环部分；

Y是烷基、羟基、羟烷基、

-亚烷基-O-、-OC(O)-、-C(O)O-、-N(R⁷)C(O)-、-C(O)N(R⁷)-或-S-；

t是0、1、2或3；

t1是0至10的整数；并且

其中所述脂质的pKa是约4至约8。

31.如权利要求30所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是组iv)的化合物，并且其中所述脂质的至少一个尾部基团具有下式之一：

其中：

R⁷各自独立地是H或甲基；

R^b在每种情况下独立地是H或C₁-C₄烷基；

u1和u2各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；并且

u3和u4各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；并且

所述头部基团具有以下式中的一者的结构：

i)其中m是1、2、3、4、5、6、7或8；

ii)

iii)以及

iv)

32.如权利要求31所述的经修饰的脂质组合物，其中至少一个尾部基团具有式(TII)、(TIII)、(TIV)、(TV)、(TII')和/或(TIII')的结构，其中u1是3-5，u2是0-3，u3和u4各自独立地是1-7，并且R^a各自独立地是甲基。

33.如权利要求19所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是表I、表II、表III或表IV中的化合物。

34.如权利要求33所述的经修饰的脂质组合物，其中所述可电离脂质是

35.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物还包含固醇和/或聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

36.如权利要求35所述的经修饰的脂质组合物，其中所述PEG-脂质缀合物是PEG-DMG或PEG-PE。

37.如权利要求36所述的经修饰的脂质组合物，其中所述PEG-脂质缀合物是PEG2000-DMG或PEG2000-PE。

38.如权利要求35所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物包含：

约20mol％至约50mol％的所述可电离脂质，

约10mol％至约75mol％的所述结构组分，

约0mol％至约45mol％的所述固醇，和

约0.5mol％至约3mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

39.如权利要求35所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物包含：

约20mol％至约50mol％的所述可电离脂质，

约20mol％至约60mol％的所述结构组分，

约7mol％至约45mol％的所述固醇，和

约0.5mol％至约3mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。

40.如权利要求38所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:50:12.5:2.5、约35:20:42.5:2.5、约22.5:75:0:2.5、约35:30:32.5:2.5、约35:16:46.5:2.5、约35:25:37.5:2.5、约35:40:22.5:2.5、约45:10:43.5:1.5、约50:20:28.5:1.5或约50:10:38.5:1.5的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质。

41.如权利要求35所述的经修饰的脂质组合物，其中所述结构脂质包含结构脂质1和结构脂质2，其中结构脂质1和结构脂质2是不同的结构脂质。

42.如权利要求41所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物包含摩尔比为约35:(3+13):46.5:2.5、约35:(15+5):42.5:2.5或约35:(45+5):12.5:2.5的可电离脂质:(结构脂质1+结构脂质2):固醇:PEG-脂质。

43.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物是选自由脂质复合体、脂质体、脂质纳米颗粒、基于聚合物的载剂、外泌体、层状体、胶束和乳液组成的组的亲脂性部分。

44.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物是选自由阳离子脂质体、纳米脂质体、蛋白脂质体、单层脂质体、多层脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体和多囊脂质体组成的组的脂质体。

45.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物是脂质纳米颗粒。

46.如权利要求45所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有小于约200nm的粒度。

47.如权利要求45所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒具有小于约100nm的尺寸。

48.如权利要求45所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的平均多分散指数(PDI)在约0.1至约0.4的范围内。

49.如权利要求45所述的经修饰的脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的平均PDI在约0.2至约0.3的范围内。

50.如权利要求1或4所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物还包含一种或多种异源功能剂。

51.如权利要求50所述的经修饰的脂质组合物，其中所述异源功能剂被所述经修饰的脂质组合物包封、嵌入在所述经修饰的脂质组合物的表面上或缀合至所述经修饰的脂质组合物的所述表面。

52.如权利要求50所述的经修饰的脂质组合物，其中所述异源功能剂包含多核苷酸。

53.如权利要求52所述的经修饰的脂质组合物，其中所述多核苷酸是mRNA或circRNA。

54.如权利要求50所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物具有约50:1至约10:1的总脂质:异源功能剂重量比。

55.如权利要求54所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物具有约40:1至约28:1的总脂质:异源功能剂重量比。

56.如权利要求54所述的经修饰的脂质组合物，其中所述经修饰的脂质组合物具有约37:1至约33:1的总脂质:异源功能剂重量比。

57.一种用于将一种或多种异源功能剂递送至细胞或受试者的方法，所述方法包括

将所述细胞与所述一种或多种异源功能剂和如权利要求1-56中任一项所述的经修饰的脂质组合物接触或向所述受试者施用所述一种或多种异源功能剂和如权利要求1-56中任一项所述的经修饰的脂质组合物，其中所述异源功能剂被所述经修饰的脂质组合物包封、嵌入在所述经修饰的脂质组合物的表面上或缀合至所述经修饰的脂质组合物的所述表面。

58.如权利要求57所述的方法，其中将所述一种或多种异源功能剂递送至脾细胞、免疫细胞、淋巴细胞、造血干细胞和/或骨髓细胞。

59.如权利要求57所述的方法，其中所述经修饰的脂质组合物增加所述脾细胞、免疫细胞、淋巴细胞、造血干细胞和/或骨髓细胞的转染。

60.如权利要求59所述的方法，其中脾淋巴细胞以亲本群体的至少1％、至少2％或至少5％的频率被转染。

61.如权利要求59所述的方法，其中脾骨髓细胞以亲本群体的至少5％、至少10％或至少15％的频率被转染。

62.如权利要求59所述的方法，其中所述造血干细胞以亲本群体的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％或至少35％的频率被转染。

63.如权利要求57所述的方法，其中所述异源功能剂包含多核苷酸。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述多核苷酸是mRNA或circRNA。