CN120060291A - 一种茉莉花vigs沉默体系及其构建方法和应用 - Google Patents

一种茉莉花vigs沉默体系及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种茉莉花VIGS沉默体系及其构建方法和应用，属于植物基因工程技术领域；本发明首先提供了一种沉默茉莉花PDS基因的特异性核苷酸片段，并以烟草脆裂病毒(TRV)为载体，通过同源重组将所述特异性核苷酸片段插入pTRV2载体，构建了沉默载体pTRV2‑JsPDS；本发明将载体pTRV1、载体pTRV2、沉默载体pTRV2‑JsPDS分别转入农杆菌得到茉莉花PDS基因的VIGS沉默体系，采用该沉默体系侵染茉莉花植株，经实验验证，本发明的沉默体系可诱导茉莉花JsPDS基因的沉默，基因沉默后的茉莉花叶片中总叶绿素含量降低34.98％‑63.79％，内源JsPDS基因的相对表达量降低56.38％‑85.79％。本发明具有操作简便、周期短、沉默效率高、且无需完整基因序列信息和遗传转化体系等优点，为茉莉花基因功能研究提供了一种高效、可靠的技术手段。

Description

一种茉莉花VIGS沉默体系及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种茉莉花VIGS沉默体系及其构建方法和应用。
背景技术
茉莉花(Jasminum sambac(L.)Aiton)又名茉莉、茶叶花，是木犀科(Oleaceae)素馨属常绿灌木，原产于印度、巴基斯坦等地，并于1700多年前的汉代传入我国。茉莉花被誉为“天下第一香”，具有重要的观赏、茶用、药用和经济价值。我国茉莉花栽培面积约占全球的2/3，年产量超过世界总产量的60％，在全球茉莉花相关产业中占据重要地位。然而，茉莉花的遗传转化体系尚未成熟，愈伤组织分化困难，严重制约了其基因功能及相关机理性的研究。因此，亟需构建一种高效、可靠的茉莉花基因功能研究技术体系。
病毒诱导基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)是一种转录后水平的基因沉默机制，属于RNA介导的防御机制。该技术利用携带目标基因片段的病毒载体侵染植物，诱导植物内源基因的RNA特异性降解，从而实现基因沉默并引起表型变化，为基因功能研究提供了有效工具。VIGS技术无需遗传转化体系，具有操作简便、周期短、效率高、特异性强等优点，已在拟南芥、矮牵牛、烟草和番茄等植物中广泛应用，主要用于代谢调控和生长发育等领域的研究。烟草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus,TRV)是目前应用最广泛的VIGS载体，其优势包括能够侵染植物分生组织、沉默效率高、持续时间长、寄主植物病毒症状轻等。
八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene Desaturase,PDS)基因是类胡萝卜素合成途径的限速酶基因，其沉默会导致类胡萝卜素合成受阻，植物呈现光漂白现象，被广泛应用于VIGS体系中。现有技术中主要通过注射茉莉花花苞或幼苗叶柄构建VIGS沉默体系，但尚未形成成熟的技术方案(王宇婷.茉莉花赋香关键酶的基因表达分析与VIGS技术应用[D].福建农林大学，2017；龙思宇.福建茉莉花产业调查与VIGS技术体系的建立初探[D].福建农林大学，2017)。目前，亟待构建一套高效的茉莉花VIGS沉默体系，为茉莉花基因功能研究提供新的技术手段。
发明内容
针对现有技术中存在的一些问题，本发明的目的在于提供一种茉莉花VIGS沉默体系及其构建方法和应用，从而实现了茉莉花JsPDS基因的简单、快速、低成本的鉴定。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明首先提供一种沉默茉莉花PDS基因的特异性核苷酸片段，所述特异性核苷酸片段的序列如SEQ ID No：2所示。
SEQ ID No：2：
GCCGGAGAAAGTCAAGTTTGCTATTGGACTCTTGCCTGCAATAGTTGGTGGACAGGCTTATGTTGAGGCTCAAGATGGTATAACTGTTAAAGATTGGATGAGGAAACAAGGTATACCAGATCGAGTAACTGATGAGGTGTTTATAGCCATGTCTAAGGCACTGAACTTCATCAACCCCGATGAACTTTCAATGCAGTGCATTTTAATTGCTTTGAATCGATTTCTTCAGGAGAAGCATGGTTCAAAGATGGCATTTTTAGATGGCAACCCACCAGAAAGACTTTGCATGCCAATTGTTGA
本发明还提供一种茉莉花PDS基因的VIGS沉默载体，所述VIGS沉默载体包含所述的特异性核苷酸片段。
本发明还提供一种茉莉花PDS基因的VIGS沉默载体的构建方法，所述构建方法包括：
将所述特异性核苷酸片段连接到pTRV2载体上，构建得到沉默载体pTRV2-JsPDS。
其中，所述特异性核苷酸片段通过PCR扩增得到；所述特异性核苷酸片段的扩增引物如SEQ ID No：3-4所示。
pTRV2-JsPDS-F(SEQ ID No：3)：tgagtaaggttaccgaattcGCCGGAGAAAGTCAAGTTT
pTRV2-JsPDS-R(SEQ ID No：4)：ggacatgcccgggcctcgagTCAACAATTGGCATGCAAA
本发明还提供一种茉莉花PDS基因的VIGS沉默体系，所述VIGS沉默体系包括：含有pTRV1载体的农杆菌、含有pTRV2载体的农杆菌、含有权利要求2所述VIGS沉默载体的农杆菌。
本发明还提供所述的特异性核苷酸片段、或所述的VIGS沉默载体、或所述VIGS沉默体系在沉默茉莉花PDS基因或鉴定茉莉花PDS基因功能中的应用。
其中，所述应用包括：利用所述的VIGS沉默体系侵染茉莉花植株，侵染后的植株清洗后转移至基质中继续培养，观察叶片表型变化、检测PDS基因表达情况。
进一步的，所述VIGS沉默体系中，分别将含有pTRV1载体的农杆菌、含有pTRV2载体的农杆菌、含有权利要求2所述的VIGS沉默载体的农杆菌在含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基培养后，分别收集菌体，使用侵染液将菌体重悬至OD600≈1.2，得到含有pTRV1载体的农杆菌侵染液、含有pTRV2载体的农杆菌侵染液和含有VIGS沉默载体的农杆菌侵染液，将含有pTRV1载体的农杆菌侵染液分别与含有pTRV2载体的农杆菌侵染液、含有VIGS沉默载体的农杆菌侵染液混合后进行侵染；
所述菌体重悬使用的侵染液包括10mM MES、200μM AS和10mM MgCl2，pH值为5.6。
进一步的，所述清洗包括蒸馏水清洗，所述继续培养包括：20℃黑暗培养2d，弱光培养3d，随后正常培养；所述弱光培养包括：白天温度25℃，夜间温度20℃，光照强度为2000Lux，光照时间16h/d，空气相对湿度为60％；所述正常培养包括：白天温度30℃，夜间温度25℃，光照强度为4000Lux，光照时间16h/d，空气相对湿度为60％；所述基质优选混合基质，体积比为80％泥炭土：20％珍珠岩。
进一步的，所述含有pTRV1载体的农杆菌侵染液分别与含有pTRV2载体的农杆菌侵染液、含有VIGS沉默载体的农杆菌侵染液等体积比混合后室温黑暗静置；所述混合好的侵染液室温黑暗静置4-6h。
进一步的，所述茉莉花植株为扦插生根且腋芽未萌发的双瓣茉莉花植株，侵染前将扦插生根的茉莉花植株洗净，吸干表面水分，剪去部分叶片和根，并用无菌注射器针头在腋芽附近扎孔；
所述侵染为真空侵染，所述真空侵染条件为：真空度0.095Mpa，侵染时间为10-20min，随后缓慢放气以恢复正常气压，重复两次。优选地，所述侵染时间为15min。
优选地，所述农杆菌为GV3101菌株。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明设计了基于JsPDS基因的特异性核苷酸片段，在所述特异性核苷酸片段的基础上又设计了用于扩增所述特异性核苷酸片段的引物，进一步的，以扩增产物构建得到了沉默载体，并以所述沉默载体首次构建了基于JsPDS基因的VIGS沉默体系，本发明构建的茉莉花VIGS沉默体系，侵染植株的过程较传统的遗传转化手段操作简便且用时短，弥补了茉莉花遗传转化体系不成熟、基因功能研究滞后的不足。
(2)本发明提供了一种沉默茉莉花JsPDS基因的特异性核苷酸片段，所述特异性核苷酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。该片段能够有效干扰茉莉花内源的JsPDS基因的表达，使植株内源JsPDS基因发生沉默。实验结果表明，与对照组相比，沉默植株中内源JsPDS基因的相对表达量降低56.38％-85.79％，叶片中叶绿素a含量降低28.06％-59.55％，叶绿素b含量降低46.91％-71.09％，总叶绿素含量降低34.98％-63.79％，为茉莉花基因功能研究提供了可靠的技术手段。
(3)本发明利用VIGS技术克服了茉莉花遗传转化体系不成熟的难题，通过真空渗透法瞬时转化茉莉花扦插苗，结合TRV载体实现了内源基因的高效沉默。该方法操作简便、周期短、效率高，为茉莉花基因功能研究提供了新的思路和方法。
附图说明
图1为实施例1中JsPDS基因的特异性核苷酸片段的PCR扩增结果；其中Marker代表DNA ladder DL2000，1和2代表JsPDS基因的特异性核苷酸片段。
图2为实施例1中茉莉花扦插苗真空侵染前预处理示意图，包括剪去老叶(A)、将根部修剪至4-5cm(B)、用无菌注射器的针头在腋芽附近扎孔(C)。
图3为实施例1中对照组和实验组侵染后的茉莉花扦插苗腋芽成枝后的表型；对照组以含有pTRV1载体和pTRV2载体的侵染液进行侵染，实验组以含有pTRV1载体和pTRV2-JsPDS载体的侵染液进行侵染。
图4为实施例1中对照组和实验组侵染后的茉莉花扦插苗腋芽成枝后叶片中叶绿素含量的测定结果，包括叶绿素a含量(A)、叶绿素b含量(B)、总叶绿素含量(C)；对照组以含有pTRV1载体和pTRV2载体的侵染液进行侵染，实验组以含有pTRV1载体和pTRV2-JsPDS载体的侵染液进行侵染。
图5为实施例1中qRT-PCR检测对照组和实验组侵染后的茉莉花扦插苗腋芽成枝后叶片中JsPDS基因的相对表达量结果；对照组以含有pTRV1载体和pTRV2载体的侵染液进行侵染，实验组以含有pTRV1载体和pTRV2-JsPDS载体的侵染液进行侵染。
图6为对比例1中对照组和实验组浸染后的茉莉花扦插苗腋芽成枝后的表型；对照组以含有pTRV1载体和pTRV2载体的侵染液进行侵染，实验组以含有pTRV1载体和pTRV2-JsPDS2载体的侵染液进行侵染。
图7为对比例1中qRT-PCR检测对照组和实验组浸染后的茉莉花扦插苗腋芽成枝后叶片中JsPDS基因的相对表达量结果；对照组以含有pTRV1载体和pTRV2载体的侵染液进行侵染，实验组以含有pTRV1载体和pTRV2-JsPDS2载体的侵染液进行侵染。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明的实施例中，没有多作说明的都是采用常规实验方法完成，实施例中所涉及过程没有多作说明的都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解并且容易实现的，除非特殊说明，以下实施例中所涉及的实验材料、载体和试剂等均可从商业途径获得，因此不再详细描述。
实施例1中所述双瓣茉莉植株为江苏省农业科学院茉莉花种质资源圃5年生茉莉花，为公知公用材料。
实施例1中涉及的引物序列见表1。
表1.引物序列
注：小写字母为接头引物。
实施例1：一种茉莉花VIGS沉默体系及其构建方法和应用
S1.VIGS沉默表达载体pTRV2-JsPDS的构建：
(1)JsPDS基因特异性片段的克隆：
在茉莉花基因组(NCBI数据库，登录号为PRJNA690159)中搜索JsPDS基因的CDS序列(JsPDS基因序列见序列表SEQ ID No：1)，通过SGN VIGS Tool在线软件分析选择JsPDS基因特异性核苷酸片段(JsPDS基因特异性片段序列见序列表SEQ ID No：2)。利用PrimerPremier 5.0设计JsPDS基因特异性核苷酸片段的扩增引物，在扩增引物的上下游分别引入EcoR I和Xba I酶切位点，并在引物中增加病毒载体pTRV2酶切位点两侧的序列(5’-tgagtaaggttaccgaattc-3’和5’-ggacatgcccgggcctcgag-3’)，得到最终引物序列，记为pTRV2-JsPDS-F/R(序列见表1中SEQ ID No：3-4所示)。
采用植物RNA提取试剂盒(Plant RNA Kit，YEASEN)提取茉莉花叶片的总RNA，并用反转录试剂盒(Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit，YEASEN)将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用引物pTRV2-JsPDS-F/R进行PCR扩增，反应体系见表2。
表2.PCR扩增反应体系
PCR扩增程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸15s，35个循环；72℃终延伸5min。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。从图中可以看出，1和2泳道得到的目的条带大小为300bp。回收目的条带并测序验证，获得JsPDS基因特异性核苷酸片段(见序列表SEQ ID No：2)。
SEQ ID No：1：
ATGTCCCAACTTGGACATGTTTCTGCTGTTAATTTGAGTGGGCAACGTAGCCTATGGAATCCTCAGTTCTCGAGATGTTGCTGTCTTGATGGGAAAATGAATGCCCTATCATTTGCAAGTACTGATGCTATGGGTCATAAAATGAAAAGCCCGTCTGGTCACGCTTTAGCATTGAGATCAAGAAAAGGCGCGTCTTCTTTAAAGGTTGTTTGCATTGACTATCCAAGACCCGAGATTGATAATACAGTCAATTATTTGGAAGCCGCTTATTTATCGTCATCCTTTTCTAGTGCTCCACGTCCAAACAAGCAATTAAAGATAGTCATTGCGGGCGCAGGTTTGGCTGGTTTGTCTACGGCAAAATATTTGGCAGATGCAGGTCATAAACCAATATTGTTGGAAGGAAGGGATGTGCTAGGTGGAAAGGTGGCTGCTTGGAAAGATGATGATGGAGACTGGTATGAGACTGGTTTACACATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATGTGCAGAACCTATTTGGAGAGCTAGGCATTAATGATCGGCTGCAGTGGAAGGAGCATTCTATGATATTTGCAATGCCAAGCAAGCCTGGAGAGTTTAGCCGATTCGATTTTCCTGAAGTCTTACCTGCGCCTTTAAATGGAATATGGGCAATCTTGAAAAACAGTGAAATGCTTACTTGGCCGGAGAAAGTCAAGTTTGCTATTGGACTCTTGCCTGCAATAGTTGGTGGACAGGCTTATGTTGAGGCTCAAGATGGTATAACTGTTAAAGATTGGATGAGGAAACAAGGTATACCAGATCGAGTAACTGATGAGGTGTTTATAGCCATGTCTAAGGCACTGAACTTCATCAACCCCGATGAACTTTCAATGCAGTGCATTTTAATTGCTTTGAATCGATTTCTTCAGGAGAAGCATGGTTCAAAGATGGCATTTTTAGATGGCAACCCACCAGAAAGACTTTGCATGCCAATTGTTGATCATATTACTTCAAAAGGTGGCGAAGTCCAACTTAACTCACGAATTCAAAAGATTGAGCTAAACAAAGACGGAACCGTTCAGAACTTTGTGCTAAGTAATGGGAATACGGTTGAAGGAGATGCTTATGTATTTGCAACTCCGGTTGATATCCTGAAGCTCTTACTGCCTGAGGACTGGAAAAAGATTCAATATTTCCAAAAGTTGGATAAATTGGTCGGGGTTCCAGTTATTAATGTTCACATATG GTTTGACAGAAAACTGAAAAACACATATGATCATCTACTCTTCAGCAGGAGTCAACTTCTCAGTGTCTATGCTGACATGTCTGTAACGTGTAAGGAATACTACAATCCTAATAAATCCATGCTGGAATTGGTTTTTGCACCTGCCGAAGAATGGATCTCTTGCAGTGACACAGAAATCATTGATGCCACAATGAAAGAACTTGCAAAACTCTTTCCGGATGAAATTTCTGCAGACCAGACAAAAGCGAAAATTGTTAAGTACCATGTTGTAAAAACTCCAAGATCCGTCTATAAGACTGTACCTGGCTCTGAACTTTACCGTCCCTTACAAAGATCTCCTATACAAGGATTCTATTTAGCTGGTGATTATACAAAGCAAAAGTACTTGGCTTCCATGGAAGGAGCCGTCCTATCGGGAAAGCTTTGTGCACAAGCCATAGTACAGGATTATGAGTTGCTGGCTGCTAGAGTACCGAAGAAGTTGACGGAGGCAAGTTTTGTTTAA
SEQ ID No：2：
GCCGGAGAAAGTCAAGTTTGCTATTGGACTCTTGCCTGCAATAGTTGGTGGACAGGCTTATGTTGAGGCTCAAGATGGTATAACTGTTAAAGATTGGATGAGGAAACAAGGTATACCAGATCGAGTAACTGATGAGGTGTTTATAGCCATGTCTAAGGCACTGAACTTCATCAACCCCGATGAACTTTCAATGCAGTGCATTTTAATTGCTTTGAATCGATTTCTTCAGGAGAAGCATGGTTCAAAGATGGCATTTTTAGATGGCAACCCACCAGAAAGACTTTGCATGCCAATTGTTGA
(2)pTRV2载体的双酶切：
用限制性内切酶EcoR I和Xba I双酶切空载体pTRV2质粒，反应体系见表3。将反应体系在37℃下酶切3h，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带，得到线性化pTRV2载体。
表3.双酶切反应体系
组分 加入量
10×M Buffer 5μL
pTRV2质粒 2μg
EcoR I(15U/μL) 2.5μL
Xba I(15U/μL) 2.5μL
ddH2O 补齐至50μL
总计 50μL
(3)同源重组连接：
采用同源克隆试剂盒(Seamless Cloning Master Mix，上海生工)将JsPDS基因特异性核苷酸片段连接至线性化pTRV2载体上，反应体系见表4。将反应体系在50℃下反应20min，随后冰上冷却2min，得到连接产物。
表4.同源重组反应体系
组分 加入量
2×Seamless Cloning Master Mix 5μL
线性化载体 50ng
目的片段 150ng
ddH2O 补齐至10μL
总计 10μL
(4)重组质粒的筛选：
将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，37℃摇菌50min，涂布于含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性单克隆。用pTRV2载体通用引物pTRV2-F/R(序列见表1中SEQ IDNo：5-6所示)进行菌液PCR检测，挑选阳性克隆并测序，测序正确的菌液摇菌，并提取重组质粒pTRV2-JsPDS备用。
S2.农杆菌侵染液的制备：
(1)质粒转化农杆菌：
取500ng重组质粒pTRV2-JsPDS、pTRV2和pTRV1分别加入冰上预先融化的50μL农杆菌GV3101感受态细胞中，冰浴20min，液氮速冻5min，37℃水浴5min，冰浴3min，加入700μL的LB液体培养基，28℃振荡培养箱中200rpm摇菌4h，得到菌液。
将得到的菌液分别涂布于含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB固体培养基上筛选阳性单克隆。用pTRV2载体引物pTRV2-F/R(序列见表1中SEQ ID No：5-6所示)分别进行菌液PCR，得到含有pTRV2-JsPDS载体的农杆菌GV3101和含有pTRV2载体的农杆菌GV3101；用pTRV1载体引物pTRV1-F/R(序列见表1中SEQ ID No：7-8所示)进行菌液PCR，得到含有pTRV1载体的农杆菌GV3101。
(2)农杆菌菌液制备：
分别将含有pTRV2-JsPDS载体、pTRV2载体和pTRV1载体的农杆菌GV3101菌液以1:50体积比分别转入含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃摇菌过夜至OD600为1.2-1.4。将菌液转移到50mL离心管中，6000rpm离心10min，弃上清，收集菌体。用侵染液(含10mM MES、200μM AS和10mM MgCl2，以无菌水为溶剂，现配现用，pH为5.6)重悬，调整OD600为1.2，得到含有pTRV1、pTRV2载体或pTRV2-JsPDS载体的侵染液。
(3)侵染液混合：
将含有pTRV1载体的侵染液分别与含有pTRV2载体的侵染液、含有pTRV2-JsPDS载体的侵染液按1:1体积比混合，得到含有pTRV1载体和pTRV2载体的侵染液、含有pTRV1载体和pTRV2-JsPDS载体的侵染液，黑暗静置4-6小时，备用。
S3.农杆菌侵染茉莉花：
(1)植物材料准备：
选择健康无病虫害的双瓣茉莉植株，剪取腋芽饱满的半木质化至木质化枝条作为插穗。扦插基质体积比为40％泥炭土：30％珍珠岩：30％蛭石，培养条件为空气相对湿度70％，昼/夜温度25℃/20℃，光/暗周期8h/16h。六周后，将扦插苗用于侵染实验。侵染前，洗净茉莉花植株，吸干表面水分，剪去老叶(图2A)，将根修剪至4-5cm(图2B)，用无菌注射器针头在腋芽附近扎孔(图2C)。
(2)真空渗透侵染茉莉花：
将茉莉花扦插苗随机分为2组(对照组和实验组)，每组30株。实验组浸泡于含有pTRV1载体和pTRV2-JsPDS载体的侵染液中；对照组浸泡于含有pTRV1载体和pTRV2载体的侵染液中。然后利用真空渗透装置(SHZ-Ⅲ，上海亚荣)，采用真空抽吸法对茉莉花植株进行浸染，具体包括：真空度到达0.095Mpa后，保持15min，随后缓慢放气恢复正常气压，重复上述步骤2次，即可成功浸染。侵染后，用蒸馏水清洗植株表面多余的侵染液，之后转移至基质中(体积比为80％泥炭土：20％珍珠岩)，置于光照培养箱培养，20℃黑暗培养2d，随后弱光培养3d(白天温度25℃，夜间温度20℃，光照强度为2000Lux，光照时间16h/d，空气相对湿度为60％)，最后正常培养(白天温度30℃，夜间温度25℃，光照强度为4000Lux，光照时间16h/d，空气相对湿度为60％)。
S4.沉默植株表型观察和效果统计：
(1)沉默后表型观察：
正常培养3-4周后，对实验组和对照组新叶的颜色进行观察，结果如图3所示。从图中可见对照组茉莉花植株叶片未见变黄表型，实验组中部分植株叶片呈现不同程度的失绿现象；表明，TRV病毒介导的VIGS体系可将茉莉花JsPDS基因成功沉默。
(2)叶绿素含量测定：
叶绿素含量的测定参照李合生(2000)植物生理生化实验原理和技术中的方法并加以改进，具体方法如下：
分别取对照组和实验组具有沉默表型的植株叶片，用去离子水冲洗干净，滤纸吸干多余水分，取约0.05g新鲜叶片切碎，置于5ml 95％乙醇溶液室温避光浸提48h以上，叶片颜色发白时测量665nm和649nm波长处的吸光值，通过以下公式计算出提取液中各色素的浓度(mg/L)，再换算成单位鲜样品中各色素的含量(mg/g FW)。
叶绿素a浓度＝13.95×A665–6.88×A649
叶绿素b浓度＝24.96×A649–7.32×A665
叶绿体色素的含量＝(色素浓度×提取液体积)/样品鲜重
结果表明，相对于对照组，实验组的沉默植株叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均极显著降低(表5和图4)。实验组植株叶片中叶绿素a含量降低28.06％-59.55％，叶绿素b含量降低46.91％-71.09％，总的叶绿素含量降低34.98％-63.79％。
表5.pTRV2-JsPDS载体构建的沉默体系沉默植株叶片中叶绿素含量测定结果
注：不同字母表示差异极显著，p﹤0.01；表中沉默植株1-3为实验组的三种典型表型。
(3)qRT-PCR检测沉默效果：
利用PrimerPremier 5.0软件在JsPDS基因沉默核苷酸片段以外设计定量引物JsPDS-qF/qR(序列见序列表1中SEQ ID No：9-10所示)，以茉莉花JsEF1α基因作为内参基因(JsEF1α用于定量的序列见序列表SEQ ID No：13所示；内参基因引物为JsEF1α-qF/qR，序列见序列表1中SEQ ID No：11-12所示)。分别取对照组的植株叶片和实验组具有沉默表型的植株叶片，采用植物RNA提取试剂盒提取叶的总RNA，并用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。将cDNA稀释10倍用于qRT-PCR检测，反应体系如表6，反应程序如表7。qRT-PCR试验在ROCHE(480II)实时定量PCR仪上进行操作。
表6.qRT-PCR反应体系
组分 加入量(μL)
TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×) 10
Primer-F(10μM) 0.4
Primer-R(10μM) 0.4
cDNA 2
ddH2O 7.2
总计 20
表7.qRT-PCR反应程序
数据处理采用2-ΔΔCt法进行计算，得到JsPDS基因的相对表达量。与对照组相比，茉莉花内源JsPDS基因的相对表达量降低56.38％-85.79％(表8和图5)。结果表明，茉莉花VIGS技术能够有效沉默JsPDS基因，该方法可用于茉莉花基因功能的研究。
表8.pTRV2-JsPDS载体构建的沉默体系沉默植株JsPDS基因的相对表达量
样品 JsPDS基因相对表达量 下降比例(％)
对照组(TRV2) 1.000±0.026A /
沉默植株1(TRV2-JsPDS-1) 0.436±0.009B 56.38
沉默植株2(TRV2-JsPDS-2) 0.142±0.011C 85.79
沉默植株3(TRV2-JsPDS-3) 0.154±0.002C 84.51
注：不同字母表示差异极显著，p﹤0.01。
SEQ ID No：13：
TGGTCGTTTTGCTGTGAGGGATATGCGACAGACTGTTGCTGTTGGAGTCATCAAGA ATGTGGACAAGAAGGACCCATCTGGTGCAAAGGTGACCAAGGCTGC
对比例1：
本对比例通过设计不同的特异性核苷酸片段进行了对比实验，本对比例的具体过程如下：
S1.VIGS沉默表达载体pTRV2-JsPDS2的构建；
S2.农杆菌侵染液的制备；
S3.农杆菌侵染茉莉花；
S4.沉默植株表型观察和效果统计
其中步骤S1、步骤S2和步骤S3与实施例1中对应部分的操作步骤相同；对比例中所用特异性核苷酸片段的序列如SEQ ID No：14所示，pTRV2-JsPDS2的载体构建引物的核苷酸序列见表9中SEQ ID No：15-16所示。
表9.特异性沉默片段JsPDS2克隆引物
SEQ ID No：14：
ATCAAGAAAAGGCGCGTCTTCTTTAAAGGTTGTTTGCATTGACTATCCAAGACCCGAGATTGATAATACAGTCAATTATTTGGAAGCCGCTTATTTATCGTCATCCTTTTCTAGTGCTCCACGTCCAAACAAGCAATTAAAGATAGTCATTGCGGGCGCAGGTTTGGCTGGTTTGTCTACGGCAAAATATTTGGCAGATGCAGGTCATAAACCAATATTGTTGGAAGGAAGGGATGTGCTAGGTGGAAAGGTGGCTGCTTGGAAAGATGATGATGGAGACTGGTATGAGACTGGTTTACA
本对比例中，对照组植株以含有pTRV1载体和pTRV2载体的侵染液进行侵染，实验组植株以含有pTRV1载体和pTRV2-JsPDS2载体的侵染液进行侵染。
步骤S4.沉默植株表型观察和效果统计：
(1)沉默后表型观察：
正常培养3-4周后，对实验组和对照组新叶的颜色进行观察，结果如图6所示。从图中可见对照组和实验组茉莉花植株叶片未见明显变黄表型。
(2)qRT-PCR检测沉默效果：
分别取对照组和实验组的植株叶片，采用植物RNA提取试剂盒提取叶的总RNA，并用反转录试剂盒将其反转录为cDNA。将cDNA稀释10倍用于qRT-PCR检测。具体步骤与实施例1中相同。与对照组相比，茉莉花内源JsPDS基因的相对表达量降低12.41％-16.84％(表10和图7)。结果表明，pTRV2-JsPDS2能够沉默JsPDS基因，但沉默的效率较低，未引起植株叶片失绿的表型。
表10.pTRV2-JsPDS2载体构建的沉默体系沉默植株JsPDS基因的相对表达量
样品 JsPDS基因相对表达量 下降比例(％)
对照组(TRV2) 1.000±0.036A /
沉默植株1(TRV2-JsPDS2-1) 0.876±0.015B 12.41
沉默植株3(TRV2-JsPDS2-2) 0.832±0.029B 16.84
注：不同字母表示差异极显著，p﹤0.01。
实施效果分析：
本发明构建了茉莉花JsPDS基因沉默体系，实施例1以pTRV2-JsPDS载体构建的沉默体系的沉默效果，显著优于对比例1以pTRV2-JsPDS2载体构建的沉默体系的沉默效果；实施例1构建的沉默体系具有操作简便、周期短、沉默效率高、且无需完整的基因序列信息和遗传转化体系等优点；本发明所述的pTRV2-JsPDS沉默体系能有效降低了茉莉花JsPDS基因的表达水平，叶绿素合成受阻，导致叶片失绿表型，能够作为VIGS沉默体系在茉莉花应用中的报告基因。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.沉默茉莉花PDS基因的特异性核苷酸片段，其特征在于，所述特异性核苷酸片段的序列如SEQ ID No：2所示。
2.茉莉花PDS基因的VIGS沉默载体，其特征在于，所述VIGS沉默载体包含权利要求1所述的特异性核苷酸片段。
3.权利要求2所述的茉莉花PDS基因的VIGS沉默载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
将权利要求1所述特异性核苷酸片段连接到pTRV2载体上，构建得到沉默载体pTRV2-JsPDS。
4.根据权利要求3所述的茉莉花PDS基因的VIGS沉默载体的构建方法，其特征在于，所述特异性核苷酸片段通过PCR扩增得到；所述特异性核苷酸片段的扩增引物如SEQ ID No：3-4所示。
5.茉莉花PDS基因的VIGS沉默体系，其特征在于，所述VIGS沉默体系包括：含有pTRV1载体的农杆菌、含有pTRV2载体的农杆菌、含有权利要求2所述VIGS沉默载体的农杆菌。
6.权利要求1所述的特异性核苷酸片段、或权利要求2所述的VIGS沉默载体、或权利要求3或4所述方法构建的VIGS沉默载体、或权利要求5所述VIGS沉默体系在沉默茉莉花PDS基因或鉴定茉莉花PDS基因功能中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：
利用权利要求5所述的VIGS沉默体系侵染茉莉花植株，侵染后的植株清洗后转移至基质中继续培养，观察叶片表型变化、检测PDS基因表达情况。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述VIGS沉默体系中，分别将含有pTRV1载体的农杆菌、含有pTRV2载体的农杆菌、含有权利要求2所述的VIGS沉默载体的农杆菌在含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基培养后，分别收集菌体，使用侵染液将菌体重悬至OD600≈1.2，得到含有pTRV1载体的农杆菌侵染液、含有pTRV2载体的农杆菌侵染液和含有VIGS沉默载体的农杆菌侵染液，将含有pTRV1载体的农杆菌侵染液分别与含有pTRV2载体的农杆菌侵染液、含有VIGS沉默载体的农杆菌侵染液混合后进行侵染；
所述菌体重悬使用的侵染液包括10mM MES、200μM AS和10mM MgCl2，pH值为5.6。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述清洗包括蒸馏水清洗，所述继续培养包括：20℃黑暗培养2d，弱光培养3d，随后正常培养；所述弱光培养包括：白天温度25℃，夜间温度20℃，光照强度为2000Lux，光照时间16h/d，空气相对湿度为60％；所述正常培养包括：白天温度30℃，夜间温度25℃，光照强度为4000Lux，光照时间16h/d，空气相对湿度为60％；所述基质优选混合基质，体积比为80％泥炭土：20％珍珠岩。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述含有pTRV1载体的农杆菌侵染液分别与含有pTRV2载体的农杆菌侵染液、含有VIGS沉默载体的农杆菌侵染液等体积比混合后室温黑暗静置；所述混合好的侵染液室温黑暗静置4-6h；所述茉莉花植株为扦插生根且腋芽未萌发的双瓣茉莉花植株；所述侵染为真空侵染，所述真空侵染的条件为：真空度0.095Mpa，侵染时间为10-20min，随后缓慢放气以恢复正常气压，重复两次；优选地，所述侵染时间为15min。
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