CN120019162A - 核酸的空间分辨表面捕获 - Google Patents

核酸的空间分辨表面捕获 Download PDF

Info

Publication number
CN120019162A
CN120019162A CN202380067212.9A CN202380067212A CN120019162A CN 120019162 A CN120019162 A CN 120019162A CN 202380067212 A CN202380067212 A CN 202380067212A CN 120019162 A CN120019162 A CN 120019162A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequencing
nucleotide
nucleic acid
polymerase
molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202380067212.9A
Other languages
English (en)
Inventor
M·普雷维特
S·莱维
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Element Bioscience Corp
Original Assignee
Element Bioscience Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Element Bioscience Corp filed Critical Element Bioscience Corp
Publication of CN120019162A publication Critical patent/CN120019162A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/155—Modifications characterised by incorporating/generating a new priming site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/173—Modifications characterised by incorporating a polynucleotide run, e.g. polyAs, polyTs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/125—Rolling circle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface
    • C12Q2565/513—Detection characterised by immobilisation to a surface characterised by the pattern of the arrayed oligonucleotides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本公开提供了用于在支持物上捕获来自细胞样品的核酸、在所述支持物上制备文库分子、扩增所述支持物上的文库分子以产生核酸模板分子以及分析固定的核酸模板分子，包括对所述固定的核酸模板分子进行检测和/或测序的组合物、装置和方法。所述固定的核酸模板分子对应于来自所述细胞样品的所述核酸。所述固定的核酸模板分子在空间上位于所述支持物上对应于来自所述细胞样品的所述核酸的空间位置的位置处。

Description

核酸的空间分辨表面捕获
相关申请的交叉引用
本申请要求于2022年8月15日提交的美国临时专利申请号63/398,183的权益和优先权，其内容通过引用整体并入本文。
电子序列表的引用
电子序列表的内容(ELEM_014_001WO_SeqList_ST26.xml；大小9,927字节；以及创建日期：2023年8月9日)全文以引用的方式并入本文。
技术领域
本公开提供了用于在支持物上从细胞样品捕获核酸、在支持物上制备文库分子、扩增支持物上的文库分子以产生核酸模板分子以及分析固定的核酸模板分子，包括对固定的核酸模板分子进行检测和/或测序的组合物和方法。固定的核酸模板分子对应于来自细胞样品的核酸。固定的核酸模板分子以类似于细胞样品中的空间位置的排列在空间上位于支持物上。
背景技术
由于不同细胞内的各种分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)，受试者的组织内的细胞在细胞形态和/或功能上具有差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞相对于邻近细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响例如细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为和信号传导以及与组织中其他细胞的串扰。
先前已经使用仅在完整组织或组织的一部分的背景下提供针对少量分析物的数据或提供针对单个细胞的大量分析物数据但未能提供关于单个细胞在亲本生物样品(例如，组织样品)中的位置的信息的技术来研究空间异质性。
生物样品内分析物的空间分析可能需要确定分析物序列或其互补序列以及空间条形码的序列或其互补序列，以识别分析物的位置。生物样品可以放置在固体支持物上，以在进行分析以识别或表征样品内的分析物(诸如DNA、RNA或其他遗传物质)时改进特异性和效率。需要改进支持物上核酸的空间分辨表面捕获以及下游组装和测序技术，其降低获得空间序列信息所需的组装、时间和/或计算要求。本文提供了满足这种需要的组合物、装置和方法。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种用于制备空间分辨核酸的方法，该方法包括：a)提供支持物，该支持物包括：(i)包含至少一种亲水性聚合物的低非特异性结合涂层，其中该低非特异性结合涂层具有不超过45度的水接触角；和(ii)共价拴系至低非特异性结合涂层的多个固定的表面捕获引物，其中每个单独的表面捕获引物包含通用表面捕获引物序列(110)、针对反向测序引物的通用结合位点(120)和RNA捕获序列；b)在适合于细胞样品保持在经涂覆的支持物上的固定位置的条件下将细胞样品定位在经涂覆的支持物上，破坏细胞样品，在适合于保存来自细胞样品的RNA分子的空间位置信息的条件下释放细胞样品的多个RNA分子，以及在适合于使单独的RNA分子与单独的固定的表面捕获引物杂交以产生多个捕获引物-RNA双链体的条件下收集支持物的多个固定的表面捕获引物上的多个RNA分子，其中每个引物-RNA双链体包含与RNA分子杂交的固定的表面捕获引物；c)在适合于延伸固定的表面捕获引物的3'端的条件下并使用杂交的RNA作为模板链，在适合于在3'端处产生非模板polyC尾的条件下，在经涂覆的支持物上进行逆转录反应，由此产生在3'端'处具有非模板polyC尾的多个第一链cDNA分子，其中逆转录反应包括多个模板转换寡核苷酸，其中模板转换寡核苷酸中的每个模板转换寡核苷酸包含能够与第一链cDNA分子的非模板polyC尾杂交的polyG区、针对正向测序引物的通用结合位点(130)和针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)；d)从多个第一链cDNA分子的非模板polyC尾的3'末端并且使用模板转换寡核苷酸作为模板链进行引物延伸反应，由此产生多个固定的全长第一链cDNA，其中每个全长第一链cDNA包含：通用表面捕获引物序列(110)；针对反向测序引物的通用结合位点(120)；RNA捕获序列；cDNA插入区；polyC尾区；针对正向测序引物的通用结合位点(130)；以及针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)；e)移除RNA分子，同时保留多个固定的全长第一链cDNA；f)在适合于使单独的环化寡核苷酸与固定的全长第一链cDNA杂交的条件下使多个保留的固定的全长第一链cDNA与多个单链环化寡核苷酸接触，由此形成具有间隙的单链环状分子，其中单独的单链环化寡核苷酸包含：(i)与针对反向测序引物的通用结合位点(120)互补的序列，(ii)与通用表面捕获引物序列(110)互补的序列，(iii)接头区，(iv)与针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)互补的序列，(v)以及与针对正向测序引物的通用结合位点(130)互补的序列；g)使用固定的全长第一链cDNA的polyC尾区、cDNA插入区和RNA捕获序列作为模板链来进行聚合酶催化的延伸反应以填充间隙，其中聚合酶催化的延伸反应形成具有切口的单链环化分子，并且其中切口通过进行酶促连接反应而闭合以产生与固定的全长第一链cDNA杂交的单链共价闭合环状分子；h)使用固定的全长第一链cDNA的末端3'端作为起始位点以及共价闭合环状分子作为模板链进行滚环扩增反应，由此产生在支持物上空间分辨的多个固定的核酸串联体；i)对多个单独的固定的核酸串联体进行测序，其中测序包括单独的核酸串联体的cDNA插入区的至少一部分，这些单独的核酸串联体对应于从细胞样品洗脱的单独的RNA分子；以及j)确定单独的核酸串联体在经涂覆的支持物上的位置，这些位置对应于从细胞样品洗脱的单独的RNA分子的空间位置。
在一些实施例中，步骤b)的细胞样品包括单个细胞、多个细胞、组织、器官、生物体或切片的细胞样品。在一些实施例中，步骤b)的细胞样品包括新鲜样品、冷冻样品、新鲜冷冻样品或福尔马林固定的石蜡包埋样品。
在一些实施例中，步骤c)的多个模板转换寡核苷酸包括嵌合DNA和/或RNA寡核苷酸。
在一些实施例中，步骤f)的单链环化寡核苷酸的接头区包含用于多重化的至少一个样品索引序列、用于分子标记的至少一个唯一分子索引(UMI)序列和/或针对压实寡核苷酸的至少一个通用结合位点。
在一些实施例中，步骤h)的滚环扩增反应在多个压实寡核苷酸的存在下进行，其中压实寡核苷酸包括单链寡核苷酸，这些单链寡核苷酸各自在第一远侧端处具有与串联体分子的一个部分杂交的第一区并且在第二远侧端处具有与同一串联体分子的第二部分杂交的第二区，其中串联体分子的第一部分和串联体分子的第二部分接近，由此导致串联体分子的压实以形成DNA纳米球。
在一些实施例中，步骤i)的测序包括：a.使多个串联体分子与多个测序聚合酶和多个核酸测序引物接触，其中该接触在适合于形成多个复合测序聚合酶的条件下进行，其中每个复合测序聚合酶包含结合至核酸双链体的测序聚合酶，并且其中核酸双链体包含与核酸测序引物杂交的串联体分子的一部分；b.使多个复合测序聚合酶与多个经可检测地标记的核苷酸接触，该多个经可检测地标记的核苷酸在2'糖位置或3'糖位置处包含阻断部分，其中该接触在适合于将至少一个核苷酸与复合测序聚合酶中的至少一个复合测序聚合酶结合的条件下进行，并且其中该条件适合于促进聚合酶催化的核苷酸掺入；c.将核苷酸掺入至少一个复合测序聚合酶的测序引物的3'端；d.检测经掺入的核苷酸并且识别该经掺入的核苷酸的核碱基；e.从经掺入的核苷酸中移除阻断部分；以及f.重复步骤b.至e.至少一次。
在一些实施例中，步骤i)的测序包括：a.使多个串联体分子与多个测序聚合酶和多个核酸测序引物接触，其中该接触在适合于形成多个复合测序聚合酶的条件下进行，其中每个复合测序聚合酶包含结合至核酸双链体的测序聚合酶，并且其中核酸双链体包含与核酸测序引物杂交的串联体分子的一部分；b.使多个复合测序聚合酶与多个核苷酸接触，该多个核苷酸各自包含附接至磷酸酯链的磷酸酯部分的可检测标记，其中该接触在适合于将至少一个核苷酸与复合测序聚合酶中的至少一个复合测序聚合酶结合的条件下进行，并且其中该条件适合于促进聚合酶催化的核苷酸掺入；c.将核苷酸掺入至少一个复合测序聚合酶的测序引物的3'端；d.检测经掺入的核苷酸并且识别该经掺入的核苷酸的核碱基；以及e.重复步骤b.至d.至少一次。
在一些实施例中，步骤i)的测序包括：a.使多个串联体分子与多个第一测序聚合酶和多个核酸测序引物接触，其中该接触在适合于将多个第一聚合酶与多个核酸模板分子和多个核酸引物结合的条件下进行，由此形成多个第一复合聚合酶，其中每个第一复合聚合酶包含结合至核酸双链体的第一聚合酶，其中核酸双链体包含与核酸引物杂交的核酸模板分子；b.使多个第一复合聚合酶与多个经可检测地标记的多价分子接触以形成多个多价结合复合物，其中多个经可检测地标记的多价分子中的单独的经可检测地标记的多价分子包括附接至多个核苷酸臂的核，并且其中每个核苷酸臂附接至核苷酸单元，其中该接触在适合于将多价分子的互补核苷酸单元与多个第一复合聚合酶中的至少两个第一复合聚合酶结合的条件下进行，由此形成多个多价结合复合物，并且其中该条件适合于抑制互补核苷酸单元掺入到多个多价结合复合物的引物中；c.检测多个多价结合复合物；以及d.识别多个多价结合复合物中的互补核苷酸单元的核碱基，由此确定核酸模板分子的序列。
在一些实施例中，步骤i)的测序包括：a.通过移除多个第一测序聚合酶及其结合的多价分子并保留多个核酸双链体来解离多个多价结合复合物；b.在适合于将多个第二聚合酶与多个保留的核酸双链体结合的条件下使步骤e)的多个保留的核酸双链体与多个第二测序聚合酶接触，由此形成各自包含结合至核酸双链体的第二聚合酶的多个第二复合聚合酶；以及c.使多个第二复合聚合酶与多个核苷酸接触，其中该接触在适合于将来自多个核苷酸的互补核苷酸与第二复合聚合酶中的至少两个第二复合聚合酶结合的条件下进行，由此形成多个核苷酸结合复合物，并且其中该条件适合于促进结合的互补核苷酸掺入到核苷酸结合复合物的引物中。
在一些实施例中，该方法进一步包括：d.检测掺入到核苷酸复合聚合酶的引物中的互补核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括：d.检测掺入到核苷酸复合聚合酶的引物中的互补核苷酸；以及e.识别掺入到核苷酸复合聚合酶的引物中的互补核苷酸的核碱基。
在一些实施例中，其中步骤b.的使多个第一复合聚合酶与多个多价分子接触在抑制聚合酶催化的核苷酸掺入的非催化二价阳离子的存在下进行，其中非催化二价阳离子包括锶、钡或钙。
在一些实施例中，多个多价分子中的单独的多价分子包含：(a)核；和(b)多个核苷酸臂，该多个核苷酸臂包含：(i)核附接部分，(ii)间隔区，(iii)接头和(iv)核苷酸单元，其中核经由多个核苷酸臂的核附接部分附接至该多个核苷酸臂，其中间隔区附接至接头，并且其中接头附接至核苷酸单元。
在一些实施例中，接头包含具有2至6个亚基的脂族链或具有2至6个亚基的低聚乙二醇链。
在一些实施例中，其中附接至给定核的多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元，并且其中这些类型的核苷酸单元包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。
在一些实施例中，多个多价分子包括一种类型的多价分子，其中多个多价分子中的每个多价分子具有选自由以下项组成的组的相同类型的核苷酸单元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。在一些实施例中，多个多价分子包括两种或更多种类型的多价分子的任意组合的混合物，每种类型具有选自由以下项组成的组的核苷酸单元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
在一些实施例中，该方法进一步包括形成多个结合复合物，包括以下步骤：a)将第一核酸测序引物、第一测序聚合酶和第一多价分子与串联体分子的第一部分结合，由此形成第一结合复合物，其中第一多价分子的第一核苷酸单元结合至第一聚合酶；以及b)将第二核酸测序引物、第二测序聚合酶和第一多价分子与同一串联体分子的第二部分结合，由此形成第二结合复合物，其中第一多价分子的第二核苷酸单元与第二聚合酶结合，其中包括同一多价分子的第一结合复合物和第二结合复合物形成亲合力复合物。
在一些实施例中，该方法进一步包括形成亲合力复合物，包括以下步骤：a)使多个第一测序聚合酶和多个核酸测序引物与串联体核酸模板分子的不同部分接触，以在同一串联体分子上形成至少第一复合聚合酶和第二复合聚合酶；以及b)在适合于将来自多个多价分子的单个多价分子与第一复合聚合酶和第二复合聚合酶结合的条件下，使多个经可检测地标记的多价分子与同一串联体分子上的至少第一复合聚合酶和第二复合聚合酶接触，其中单个多价分子的至少第一核苷酸单元结合至第一复合聚合酶，该第一复合聚合酶包括与串联体分子的第一部分杂交的第一引物，由此形成第一结合复合物，并且其中单个多价分子的至少第二核苷酸单元结合至第二复合聚合酶，该第二复合聚合酶包括与串联体分子的第二部分杂交的第二引物，由此形成第二结合复合物，其中接触在适合于抑制结合的第一核苷酸单元和第二核苷酸单元经聚合酶催化掺入第一结合复合物和第二结合复合物中的条件下进行，并且其中结合至同一多价分子的第一结合复合物和第二结合复合物形成亲合力复合物；c)检测同一串联体分子上的第一结合复合物和第二结合复合物；以及d)识别第一结合复合物中的第一核苷酸单元，由此确定串联体分子的第一部分的序列，并且识别第二结合复合物中的第二核苷酸单元，由此确定串联体分子的第二部分的序列。
在一些实施例中，其中步骤c.的使多个第二复合聚合酶与多个核苷酸接触在促进聚合酶催化的核苷酸掺入的催化二价阳离子的存在下进行，其中催化二价阳离子包括镁或锰。
在一些实施例中，步骤c.中的多个核苷酸中的单独的核苷酸包含芳香族碱基、五碳糖和1至10个磷酸酯基团。在一些实施例中，步骤c.的多个核苷酸包括选自由以下项组成的组的一种类型的核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP，或包括选自由以下项组成的组的两种或更多种类型的核苷酸的任意组合的混合物：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
在一些实施例中，步骤c.中的多个核苷酸中的核苷酸中的至少一个核苷酸用荧光团标记。在一些实施例中，步骤c.中的多个核苷酸缺乏荧光团标记。
在一些实施例中，步骤c.的多个核苷酸中的核苷酸中的至少一个核苷酸包含附接至糖基团的3'碳位置的可移除链终止部分，其中可移除链终止部分包括烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮基基团、叠氮基基团、O-叠氮甲基基团、胺基基团、酰胺基基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫代基团、二硫基团、碳酸酯基团、脲基团或甲硅烷基基团，并且其中可移除链终止部分可用化学化合物裂解以在糖基团上产生可延伸3'OH部分。
附图说明
在所附权利要求书中对本公开的特征进行了具体阐述。通过参考阐述了说明性实施例的以下详细说明，将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本公开的原理，并且在其附图中：
图1是示例性低结合支持物的示意图，其包括玻璃基底和共价或非共价粘附至玻璃的交替的亲水涂层，并且其进一步包含充当寡核苷酸引物(例如，捕获寡核苷酸)的附着位点的化学反应性官能团。在替代性实施例中，支持物可由任何材料(诸如玻璃、塑料或聚合物材料)制成。
图2是多价分子的各种示例性构型的示意图。左(I类)：具有“星爆(starburst)”或“旋梯(helter-skelter)”构型的多价分子的示意图。中心(II类)：具有树枝状构型的多价分子的示意图。右(III类)：通过使链霉亲和素与4臂或8臂PEG-NHS与生物素和dNTP反应而形成的多个多价分子的示意图。核苷酸单元被指定为‘N’，生物素被指定为‘B’，并且链霉亲和素被指定为‘SA’。
图3是包含附接至多个核苷酸臂的通用核的示例性多价分子的示意图。
图4是包含附接至多个核苷酸臂的树枝状核的示例性多价分子的示意图。
图5示出了包含附接至多个核苷酸臂的核的示例性多价分子的示意图，其中核苷酸臂包含生物素、间隔区、接头和核苷酸单元。
图6是包含核附接部分、间隔区、接头和核苷酸单元的示例性核苷酸臂的示意图。
图7示出了示例性间隔区的化学结构(顶部)，以及各种示例性接头的化学结构，所述示例性接头包含11-原子接头、16-原子接头、23-原子接头和N3接头(底部)。
图8示出了各种示例性接头的化学结构，包括接头1至9。
图9A至图9D示出了接合/附接至核苷酸单元的各种示例性接头的化学结构。
图10示出了示例性生物素化核苷酸臂的化学结构。在该示例中，核苷酸单元经由在嘧啶碱基的5位或嘌呤碱基的7位处的炔丙胺附接物与接头连接。
图11是包含固定的表面捕获引物的支持物的示意图。
图12是示出位于支持物上的细胞样品和从细胞样品洗脱到固定至支持物的表面捕获引物上的RNA分子的示意图。
图13是示出第一链cDNA(虚线)和第一链cDNA的3'端处的非模板polyC尾的合成的示意图。
图14是示出与第一链cDNA的3'端处的非模板polyC尾杂交的模板转换寡核苷酸的示意图。rGrGrG代表示例性polyG区。模板转换寡核苷酸的polyG区可以包含核糖核苷酸碱基。
图15是示出使用模板转换寡核苷酸作为模板链延伸第一链cDNA(上方虚线箭头)以产生全长第一链cDNA的示意图。
图16是示出RNA链已被移除/降解同时保留固定至支持物的全长第一链cDNA的示意图。
图17是示出将环化寡核苷酸与固定的全长第一链cDNA杂交以形成具有间隙的单链环状分子的示意图。
图18是示出聚合酶催化的延伸反应填充导致切口的间隙的示意图。可以进行连接反应以连接切口。
图19是示出支持物上的滚环扩增反应的初始阶段的示意图。
图20是鸟嘌呤四分体(例如，G-四分体)的示意图。
图21是示例性分子内G-四链体结构的示意图。
具体实施方式
定义：
本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，这些方面可通过参考作为整体的说明书来理解。
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义，除非另有定义。一般而言，与本文所述的分子生物学、核酸化学、蛋白质化学、遗传学、微生物学、转基因细胞生产和杂交的技术相关的术语是本领域中众所周知和通常使用的那些。本文所述的技术和程序通常根据本领域中众所周知的常规方法以及如整个本说明书中引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述来执行。例如，参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版,Cold Spring HarborLaboratoryPress,Cold SpringHarbor,N.Y.2000)。另请参见Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)。与本文所述的实验室程序和技术结合利用的命名法是本领域中众所周知和通常使用的那些。
除非本文上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。单数形式“一”、“一个”和“该”以及任何词语的单数使用包括复数所指对象，除非明确且毫不含糊地限于一个所指对象。
应理解，替代性术语(例如，“或”)的使用被视为意指替代方案中的一者或两者或其任意组合。
本文所用的术语“和/或”应被视为意指指定特征或部件中的每一个与或不与另一个一起的具体公开。例如，如本文中诸如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括：“A和B”；“A或B”；“A”(仅A)；和“B”(仅B)。类似地，如本文中诸如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每个方面：“A、B和C”；“A、B或C”；“A或C”；“A或B”；“B或C”；“A和B”；“B和C”；“A和C”；“A”(仅A)；“B”(仅B)；和“C”(仅C)。
如本文和所附权利要求中所用，如本文所用的术语“包含”、“包括”、“具有”和“含有”以及它们的语法变体旨在是非限制性的，使得列表中的一个项目或多个项目不排除可被取代或添加到列出的项目的其他项目。应当理解，每当在本文中用语言“包含”描述方面时，也以其他方式提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的类似方面。
如本文所用，术语“约”和“大约”是指如由本领域普通技术人员所确定的在针对特定值或组合物的可接受误差范围内的值或组合物，这将部分地取决于如何测量或确定值或组合物，即，测量系统的限制。例如，根据本领域中的实践，“约”或“大约”可意指在一个或超过一个标准偏差内。替代性地，“约”或“大约”可意指至多10％(即，±10％)或更大的范围，这取决于测量系统的限制。例如，约5mg可包括4.5mg至5.5mg之间的任何数量。此外，特别是对于生物学系统或过程，这些术语可意指至多一个数量级或至多5倍的值。当在本公开中提供特定值或组合物时，除非另有说明，否则“约”或“大约”的含义应被假定是在针对该特定值或组合物的可接受误差范围内。此外，在提供值的范围和/或子范围的情况下，所述范围和/或子范围可以包含所述范围和/或子范围的端点。
如本文所用，术语“聚合酶”及其变体包括包含结合核苷酸(或核苷)的结构域的酶，其中聚合酶可形成具有模板核酸和互补核苷酸的复合物。聚合酶可具有一个或多个活性，包括但不限于：碱基类似物检测活性、DNA聚合活性、逆转录酶活性、DNA结合、链置换活性以及核苷酸结合和识别。聚合酶可以为可催化核苷酸(包括其类似物)聚合成核酸链的任何酶。通常但不一定，此类核苷酸聚合可以模板依赖性方式发生。通常，聚合酶包含在其处可发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合的催化作用的一个或多个活性位点。在一些实施例中，聚合酶包括其他酶活性，诸如例如3'至5'核酸外切酶活性或5'至3'核酸外切酶活性。在一些实施例中，聚合酶具有链置换活性。聚合酶可包括但不限于：天然存在的聚合酶以及其任何亚基和截短物、突变聚合酶、变体聚合酶、重组、融合或以其他方式工程化的聚合酶、经化学修饰的聚合酶、合成分子或组装体、以及保留催化核苷酸聚合的能力的任何类似物、衍生物或其片段(例如，催化活性片段)。聚合酶包括催化失活聚合酶、催化活性聚合酶、逆转录酶和包含核苷酸结合结构域的其他酶。在一些实施例中，聚合酶可从细胞被分离或者使用重组DNA技术或化学合成方法来产生。在一些实施例中，聚合酶可在原核生物、真核生物、病毒或噬菌体生物体中被表达。在一些实施例中，聚合酶可以为经翻译后修饰的蛋白质或其片段。聚合酶可源自原核生物、真核生物、病毒或噬菌体。聚合酶包括DNA引导的DNA聚合酶和RNA引导的DNA聚合酶。
如本文所用，术语“链置换”是指聚合酶局部地分离双链核酸链并且以基于模板的方式合成新链的能力。链置换聚合酶从模板链置换互补链并且催化新链合成。链置换聚合酶包括嗜中温和嗜热聚合酶。链置换聚合酶包括野生型酶和变体(包括核酸外切酶减突变体、突变体版本、嵌合酶和经截短的酶)。链置换聚合酶的实例包括但不限于phi29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶大片段、Bsu DNA聚合酶大片段(exo-)、Bca DNA聚合酶(exo-)、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、T5聚合酶、M-MuLV逆转录酶、HIV病毒逆转录酶、Deep Vent DNA聚合酶和KOD DNA聚合酶。phi29 DNA聚合酶可以为野生型phi29 DNA聚合酶(例如，来自Expedeon的MagniPhi)、或变体EquiPhi29 DNA聚合酶(例如，来自赛默飞世尔科技公司)、或嵌合QualiPhi DNA聚合酶(例如，来自4basebio)。
本文所用的术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”以及其他相关术语可互换地使用，并且是指核苷酸的聚合物且不限于任何特定长度。核酸包括重组和化学合成形式。核酸可被分离。核酸包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物(例如，肽核酸(PNA)和非天然存在的核苷酸类似物)以及含有DNA和RNA的嵌合形式。核酸可以是单链或双链的。核酸包含核苷酸的聚合物，其中核苷酸可包含天然或非天然碱基和/或糖。核酸包含天然存在的核苷间键，例如磷酸二酯键。核酸可缺失磷酸酯基团。核酸可包含非天然核苷间键，包括硫代磷酸酯、硫醇代磷酸酯和/或肽核酸(PNA)键。在一些实施例中，核酸包含一种类型的多核苷酸或者两种或更多种不同类型的多核苷酸的混合物。
如本文所用，术语“可操作地链接”和“可操作地连接”或相关术语是指组分的并置。经并置的组分可共价链接在一起。例如，两个核酸组分可以酶促方式连接在一起，其中将该两个组分连接在一起的键包括磷酸二酯键。第一和第二核酸组分可链接在一起，其中第一核酸组分可对第二核酸组分赋予功能。例如，引物结合序列与目的序列之间的链接形成具有可与引物结合的部分的核酸文库分子。在另一实例中，转基因(例如，编码多肽的核酸或目的核酸序列)可连接至支持物，其中该链接允许支持物中含有的转基因序列进行表达或起作用。在一些实施例中，转基因可操作地链接至影响转基因表达的宿主细胞调控序列(例如，启动子序列)。在一些实施例中，载体包含至少一个宿主细胞调控序列，包括启动子序列、增强子、转录和/或翻译起始序列、转录和/或翻译终止序列、多肽分泌信号序列等等。在一些实施例中，宿主细胞调控序列控制转基因的水平、定时和/或位置的表达。
术语“链接的”、“连接的”、“附接的”、“追加的”以及其变体包括化合物或分子的任意组合之间任何类型的融合、结合、附着或缔合，其具有足够的稳定性以承受在特定程序中的使用。该程序可以包括但不限于：核苷酸结合；核苷酸掺入；去封闭(例如，移除链终止部分)；洗涤；移除；流动；检测；成像和/或识别。例如，此类键可包括例如：共价键、离子键、氢键、偶极-偶极键、亲水键、疏水键或亲和键、涉及范德华力的键或缔合、机械键等。在一些实施例中，此类键在分子内出现，例如将单链或双链线性核酸分子的端部链接在一起以形成环状分子。在一些实施例中，此类键可以发生在不同分子的组合之间，或分子与非分子之间，包括但不限于：核酸分子与固体表面之间的键；蛋白质和可检测报道基因部分之间的键；核苷酸和可检测报道基因部分之间的键；等等。键的一些实例可以在例如Hermanson,G.,“Bioconjugate Techniques”,第二版(2008)；Aslam,M.,Dent,A.,“Bioconjugation:Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”,London:Macmillan(1998)；Aslam,M.,Dent,A.,“Bioconjugation:Protein Coupling Techniques for theBiomedical Sciences”,London:Macmillan(1998)中找到。
如本文所用，术语“引物”和相关术语是指能够与DNA和/或RNA多核苷酸模板杂交以形成双链体分子的寡核苷酸。引物可包括天然核苷酸和/或核苷酸类似物。引物可以为重组核酸分子。引物可具有任何长度，但通常范围为4至50个核苷酸。典型的引物包含5'端和3'端。引物的3'端可包含充当聚合酶催化的引物延伸反应中的核苷酸聚合起始位点的3'OH部分。替代性地，引物的3'端可缺失3'OH部分或可包含抑制聚合酶催化的反应中的核苷酸聚合的末端3'阻断基团。沿引物的长度的任何一个核苷酸或超过一个核苷酸可用可检测报道基因部分来标记。引物可在溶液中(例如，可溶性引物)或可固定至支持物(例如，捕获引物)。
术语“模板核酸”、“模板多核苷酸”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”、“模板链”和其他变体是指在本文描述的任何反复迭代测序方法中用作基础核酸分子的核酸链。模板核酸可以为单链或双链的，或者模板核酸可具有单链或双链部分。模板核酸可从天然存在的来源、重组形式获得或经化学合成以包括任何类型的核酸类似物。模板核酸可以为线性的、环状的或其他形式。模板核酸可以包括具有插入序列的插入部分。模板核酸也可包含至少一个衔接子序列。插入部分可以任何形式被分离，包括从新鲜冷冻的石蜡包埋组织、穿刺活组织检查、循环肿瘤细胞、无细胞循环DNA或任何类型的核酸文库获得的染色体的、基因组的、细胞器的(例如，线粒体的、叶绿体或核糖体的)重组分子、克隆的、扩增的cDNA、RNA(诸如前体mRNA或mRNA)、寡核苷酸、全基因组DNA。插入部分可从任何来源被分离，包括从生物体诸如原核生物、真核生物(例如，人类、植物和动物)、真菌、病毒细胞、组织、正常或患病细胞或组织、体液(包括血液、尿液、血清、淋巴液、肿瘤、唾液、肛门和阴道分泌物、羊膜样品、汗液、精液)、环境样品、培养物样品或使用重组分子生物学或化学合成方法制备的合成核酸分子。插入部分可从任何器官被分离，包括头、颈、脑、乳房、卵巢、子宫颈、结肠、直肠、子宫内膜、胆囊、肠、膀胱、前列腺、睾丸、肝、肺、肾、食道、胰腺、甲状腺、垂体、胸腺、皮肤、心脏、喉或其他器官。可使模板核酸经受核酸分析，包括测序和组合物分析。
术语“衔接子”和相关术语是指可以可操作地链接至靶多核苷酸的寡核苷酸，其中衔接子对共连接衔接子-靶分子赋予功能。衔接子包含DNA、RNA、嵌合DNA/RNA或其类似物。衔接子可包含至少一个核糖核苷残基。衔接子可以为单链、双链的或具有单链和/或双链部分。衔接子可以被配置成线性形式、茎-环形式、发夹形式或Y形形式。衔接子可以为任何长度，包括4至100个核苷酸或更长。衔接子可具有平端、悬垂端或两者的组合。悬垂端包括5'悬垂端和3'悬垂端。单链衔接子的5'端或双链衔接子的一个链可具有5'磷酸酯基团或缺失5'磷酸酯基团。衔接子可包含未与靶多核苷酸杂交的5'尾(例如，有尾衔接子)，或者衔接子可以为无尾的。衔接子可包含与引物(诸如扩增引物、测序引物或捕获引物(例如，可溶性或固定的捕获引物))的至少一部分互补的序列。衔接子可包含随机序列或简并序列。衔接子可包含至少一个肌苷残基。衔接子可包含至少一个硫代磷酸酯、硫醇代磷酸酯和/或磷酰胺键。衔接子可包含条形码序列，该条形码序列可以用于在多重测定中区分来自不同样品源的多核苷酸(例如，插入序列)。衔接子可包含唯一的识别序列(例如，唯一分子索引(UMI)；或唯一分子标签)，该唯一标识序列可用于唯一地标识衔接子追加至其的核酸分子。在一些实施例中，唯一识别序列可用于增加错误纠正和准确度、降低假阳性变体识别率和/或增加变体检测的灵敏度。衔接子可包含至少一个限制酶识别序列，包括选自由以下项组成的组的任一者或者两者或更多者的任意组合：I型、II型、III型、IV型、Hs型或IIB型。
在一些实施例中，扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、靶捕获序列、环化锚定序列、样品条形码序列、空间条形码序列或锚定区序列中的任一者可以为约3至50个核苷酸的长度、约5至40个核苷酸的长度或约5至25个核苷酸的长度。
术语“通用序列”和相关术语是指核酸分子中两个或更多个多核苷酸分子共有的序列。例如，具有通用序列的衔接子可以可操作地接合至多个多核苷酸，使得共接合的分子群体携带相同的通用衔接子序列。通用衔接子序列的实例包括扩增引物序列、测序引物序列或捕获引物序列(例如，可溶性或固定的捕获引物)。
当用于指代核酸分子时，术语“杂交(hybridize)”或“杂交(hybridizing)”或“杂交(hybridization)”或其他相关术语是指两个不同核酸之间进行氢键结合以形成双链体核酸。杂交也包括单个核酸分子的两个不同区之间进行氢键结合以形成具有双链体区的自杂交分子。杂交可包括Watson-Crick或Hoogstein结合以形成双链体双链核酸或核酸分子内的双链区。双链核酸或单个核酸的该两个不同区可以为完全地互补的或部分地互补的。互补核酸链不需要跨它们的整个长度彼此杂交。互补碱基配对可以为标准A-T或C-G碱基配对或者可以为碱基配对相互作用的其他形式。双链体核酸可包括错配的经碱基配对的核苷酸。
当用于指代核酸时，术语“延伸(extend、extending、extension)”和其他变体是指一个或多个核苷酸到核酸分子中的掺入。核苷酸掺入包括一个或多个核苷酸到核酸链的末端3'OH端中的聚合，导致核酸链的延伸。可用天然核苷酸和/或核苷酸类似物来进行核苷酸掺入。通常，但不一定，核苷酸掺入以模板依赖性方式发生。可使用延伸核酸分子的任何合适的方法，包括由DNA聚合酶或RNA聚合酶催化的引物延伸。
术语“核苷酸”和相关术语是指包含芳香族碱基、五碳糖(例如，核糖或脱氧核糖)和至少一个磷酸酯基团的分子。正则或非正则核苷酸与该术语的使用一致。在一些实施例中，磷酸酯包括单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯或者对应的磷酸酯类似物。术语“核苷”是指包含芳香族碱基和糖的分子。核苷酸和核苷可以为未经标记的或用可检测报道基因部分标记的。
核苷酸(和核苷)通常包含杂环碱基，包括经取代或未经取代的含氮母体杂芳环，其通常存在于核酸中，包括天然存在的、经取代的、经修饰的或工程化的变体或它们的类似物。核苷酸(或核苷)的碱基能够与适当的互补碱基形成Watson-Crick和/或Hoogstein氢键。示例性的碱包括但不限于：嘌呤类和嘧啶类，诸如：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、腺嘌呤(A)、乙烯腺嘌呤、N6-Δ2-异戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-Δ2-异戊烯基-2-甲硫腺嘌呤(2ms6iA)、N6-甲基腺嘌呤、鸟嘌呤(G)、异鸟嘌呤、N2-二甲基鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、2-硫代嘧啶、6-硫鸟嘌呤(6sG)、次黄嘌呤和O6-甲基鸟嘌呤；7-脱氮嘌呤，诸如7-脱氮腺嘌呤(7-脱氮-A)和7-脱氮鸟嘌呤(7-脱氮-G)；嘧啶类，诸如胞嘧啶(C)、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、胸腺嘧啶(T)、4-硫胸腺嘧啶(4sT)、5,6-二氢胸腺嘧啶、O4-甲基胸腺嘧啶、尿嘧啶(U)、4-硫尿嘧啶(4sU)和5,6-二氢尿嘧啶(二氢尿嘧啶；D)；吲哚类，诸如硝基吲哚和4-甲基吲哚；吡咯类，诸如硝基吡咯；水粉蕈素；肌苷类；羟甲基胞嘧啶类；5-甲基胞嘧啶类；碱基(Y)；以及甲基化、糖基化和酰化的碱基部分；等等。附加的示例性碱基可见于Fasman,1989,在“Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology”中,第385至394页,CRC Press,Boca Raton,Fla。
核苷酸(和核苷)通常包含糖部分，诸如碳环部分(Ferraro和Gotor2000Chem.Rev.100:4319-48)，无环部分(Martinez等人,1999Nucleic Acids Research27:1271-1274；Martinez等人,1997Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters第7卷:3013-3016)和其他糖部分(Joeng等人,1993J.Med.Chem.36:2627-2638；Kim等人,1993J.Med.Chem.36:30-7；Eschenmosser 1999Science 284:2118-2124；和美国专利第5,558,991号)。糖部分包含：核糖基；2'-脱氧核糖基；3'-脱氧核糖基；2',3'-二脱氧核糖基；2',3'-二脱氢二脱氧核糖基；2'-烷氧基核糖基；2'-叠氮核糖基；2'-氨基核糖基；2'-氟核糖基；2'-巯基羧基；2'-烷硫基核糖基；3'-烷氧基核糖基；3'-叠氮核糖基；3'-氨基核糖基；3'-氟核糖基；3'-巯基羧基；3'-烷硫基核糖基碳环；无环的或其他修饰的糖。
在一些实施例中，核苷酸包含一个、两个或三个磷原子的链，其中链通常经由酯或磷酰胺键附接至糖部分的5'碳。在一些实施例中，核苷酸为具有磷链的类似物，其中磷原子用居间的O、S、NH、亚甲基或亚乙基而链接在一起。在一些实施例中，链中的磷原子包括经取代的侧基，包括O、S或BH3。在一些实施例中，链包含用类似物取代的磷酸酯基团，包括磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和O-甲基亚磷酰胺基团。
如本文所用，“核苷酸单元”或“核苷酸部分”是指核苷酸(例如，dATP、dTTP、dGTP、dCTP或dUTP)或其类似物，其包含碱基、糖和至少一个磷酸酯基团。核苷酸单元可以附接至本文所述的测序反应中使用的多价分子。一般而言，附接至同一多价分子的所有核苷酸单元将具有相同的同一性(例如，全部为A、全部为T、全部为C或全部为G)，尽管本领域技术人员将理解，可能存在其中多价分子包含不同同一性的核苷酸单元将是有利的。
术语“报道基因部分”、“报道基因部分”或相关术语是指产生或导致产生可检测信号的化合物。报道基因部分有时被称为“标记”。可使用任何合适的报道基因部分，包括发光、光致发光、电致发光、生物发光、化学发光、荧光、磷光、发色团、放射性同位素、电化学、质谱、Raman、半抗原、亲和标签、原子或酶。报道基因部分产生由化学或物理变化(例如，热、光、电、pH、盐浓度、酶活性或邻近事件)引起的可检测信号。邻近事件包括彼此接近、或彼此缔合、或彼此结合的两个报道基因部分。本领域技术人员众所周知对报道基因部分进行选择，使得每一者在可与其他报道基因部分相区别的波长处吸收激发辐射和/或发出荧光，以允许监测相同反应中或不同反应中不同报道基因部分的存在。可选择具有在光谱上有区别的发射曲线或具有最小重叠光谱发射曲线的两个或更多个不同报道基因部分。报道基因部分可链接(例如，可操作地链接)至核苷酸、核苷、核酸、酶(例如，聚合酶或逆转录酶)或支持物(例如，表面)。
报道基因部分(或标记)包括荧光标记或荧光团。可以用作荧光标记或荧光团的示例性荧光部分包括但不限于，荧光素和荧光素衍生物，诸如羧基荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、羧基萘酚荧光素、异硫氰酸荧光素、NHS-荧光素、碘乙酰胺基荧光素、马来酰亚胺荧光素、SAMSA-荧光素、氨基硫脲荧光素、碳酸肼甲硫乙酰氨基荧光素，罗丹明和罗丹明衍生物，诸如TRITC、TMR、丽丝胺罗丹明、德克萨斯红、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明10、NHS-罗丹明、TMR-碘乙酰胺、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、丽丝胺罗丹明B磺酰肼、德克萨斯红磺酰氯、德克萨斯红酰肼，香豆素和香豆素衍生物，诸如AMCA、AMCA-NHS、AMCA-磺基-NHS、AMCA-HPDP、DCIA、AMCE-酰肼，BODIPY和衍生物诸如BODIPYFLC3-SE、BODIPY 530/550C3、BODIPY 530/550C3-SE、BODIPY 530/550C3酰肼、BODIPY 493/503C3酰肼、BODIPY FL C3酰肼、BODIPY FLIA、BODIPY 530/551IA、Br-BODIPY 493/503、Cascade Blue和衍生物，诸如Cascade Blue乙酰三氮化物、Cascade Blue尸胺、Cascade Blue乙二胺、Cascade Blue酰肼，LuciferYellow和衍生物，诸如Lucifer Yellow碘乙酰胺、Lucifer Yellow CH，花青和衍生物，诸如吲哚鎓基花青染料、苯并吲哚鎓基花青染料、吡啶鎓基花青染料、噻唑鎓基花青染料、喹啉鎓基花青染料、咪唑鎓基花青染料、Cy 3、Cy5、镧系元素螯合物和衍生物，诸如BCPDA、TBP、TMT、BHHCT、BCOT、铕螯合物、铽螯合物，AlexaFluor染料、DyLight染料、Atto染料、LightCyclerRed染料、CALFlour染料、JOE和其衍生物、Oregon Green染料、WellRED染料、IRD染料、藻红蛋白和藻胆素染料、孔雀石绿、二苯基乙烯、DEG染料、NR染料、近红外染料和本领域已知的其他染料，诸如Haugland,Molecular Probes Handbook,(Eugene,Oreg.)第6版；Lakowicz,Principles ofFluorescence Spectroscopy,第2版,Plenum Press New York(1999)或Hermanson,Bioconjugate Techniques，第2版中所描述的那些，或其衍生物；或其任意组合。花青染料可以磺化或非磺化形式存在，并且由被两个氮原子之间的聚甲炔桥分开的两个假吲哚、苯并吲哚鎓、吡啶鎓、噻唑鎓和/或喹啉鎓基团组成。可商购获得的花青荧光团包括例如：Cy3(其可包含1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓或1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-2-(3-{1-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧基)-6-氧代己基]-3,3-二甲基-5-磺基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基}丙-1-烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚鎓-5-磺酸酯)、Cy5(其可包含1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-吲哚-2-亚基)五-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓或1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-2-((1E,3E)-5-((E)-1-(6-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-6-氧代己基)-3,3-二甲基-5-磺基吲哚-2-亚基)五-1,3-二烯-1-基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-鎓-5-磺酸酯)和Cy7(其可包含1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)七-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚鎓或1-(5-羧基戊基)-2-[(1E,3E,5E,7Z)-7-(1-乙基-5-磺基-1,3-二氢-2H-吲哚-2-亚基)七-1,3,5-三烯-1-基]-3H-吲哚鎓-5-磺酸酯)，其中“Cy”代表‘花青’，并且第一个数字识别两个假吲哚基团之间的碳原子的数量。Cy2是一种噁唑衍生物而不是假吲哚，并且苯并衍生化的Cy3.5、Cy5.5和Cy7.5是该规则的例外。
在一些实施例中，报道基因部分可以为FRET对，例如使得可在单个激发和成像步骤下执行多个分类。如本文所用，FRET可包括激发交换(Forster)转移或电子交换(Dexter)转移。
当用于指代核酸时，术语“扩增(amplify)”、“扩增(amplifying)”、“扩增(amplification)”和其他相关术语包括产生原始多核苷酸模板分子的多个拷贝，其中拷贝包含与模板序列互补的序列，或者拷贝包含与模板序列相同的序列。在一些实施例中，拷贝包含与模板序列基本上相同或与和模板序列互补的序列基本上相同的序列。
如本文所用，术语“支持物”是指被设计用于生物学分子或生物学样品的沉积以进行测定和/或分析的底物。要沉积到支持物上的生物学分子的实例包括核酸(例如，DNA、RNA)、多肽、糖类、脂质、单个细胞或多个细胞。生物学样品的实例包括但不限于：唾液、痰、粘液、血液、血浆、血清、尿液、粪便、汗液、泪液和来自组织或器官的液体。
在一些实施例中，支持物为固体、半固体或两者的组合。在一些实施例中，支持物为多孔的、半多孔的、无孔的或孔隙率的任意组合。在一些实施例中，支持物可以为基本上平面的、凹面的、凸面的或其任意组合。在一些实施例中，支持物可以为柱形的，例如包括毛细管或毛细管的内表面。
在一些实施例中，支持物的表面可以为基本上光滑的。在一些实施例中，支持物可具有规则或不规则的纹理，包括凸块、经蚀刻、孔、三维支架或其任意组合。
在一些实施例中，支持物包括具有任何形状(包括球形、半球形、柱形、桶形、环形、盘形、杆状、锥形、三角形、立方体、多边形、管状或线状)的珠子。
支持物可由任何材料制成，包括但不限于：玻璃、熔融二氧化硅、硅、聚合物(例如，聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))或其任意组合。设想了玻璃和塑料底物两者的各种组合物。
在一些方面，支持物可具有在其上固定的多个(例如，两个或更多个)核酸模板。在一些实施例中，多个固定的核酸模板具有相同的序列。在一些实施例中，多个固定的核酸模板具有不同的序列。在一些实施例中，多个核酸模板中的单独的核酸模板分子固定至支持物上的不同位点。在一些实施例中，多个核酸模板中的两个或更多个单独的核酸模板分子固定至支持物上的位点。
术语“阵列”是指包含位于支持物上的预定位置处的多个位点以形成位点的阵列的支持物。位点可以为离散的并且被间隙区分开。在一些实施例中，支持物上的预定位点可以一维排列成行或列，或者以二维排列成行和列。在一些实施例中，该多个预定位点在支持物上以有组织的方式排列。在一些实施例中，该多个预定位点以任何有组织的图案排列，包括直线、六边形图案、网格图案、具有反射对称性的图案、具有旋转对称性的图案等等。不同位点对之间的间距可相同或可不同。在一些实施例中，支持物包含至少102个位点、至少103个位点、至少104个位点、至少105个位点、至少106个位点、至少107个位点、至少108个位点、至少109个位点、至少1010个位点、至少1011个位点、至少1012个位点、至少1013个位点、至少1014个位点、至少1015个位点或更多个位点，其中位点位于支持物上的预定位置处。在一些实施例中，用核酸模板固定支持物上的多个预定位点(例如，102至1015个位点或更多个位点(例如，102个位点、103个位点、104个位点、105个位点、106个位点、107个位点、108个位点、109个位点、1010个位点、1011个位点、1012个位点、1013个位点、1014个位点、1015个位点或更多个位点)以形成核酸模板阵列。在一些实施例中，核酸模板通过与固定的表面捕获引物杂交而固定在多个预定位点处，或者核酸模板共价附接至表面捕获引物。在一些实施例中，核酸模板固定在多个预定位点处，例如固定在102至1015个位点或更多个位点(例如，102至1015个位点或更多个位点，例如，102个位点、103个位点、104个位点、105个位点、106个位点、107个位点、108个位点、109个位点、1010个位点、1011个位点、1012个位点、1013个位点、1014个位点或1015个位点或更多个位点)处。在一些实施例中，固定的核酸模板以克隆方式被扩增以在多个预定位点处产生固定的核酸簇。在一些实施例中，单独的固定的核酸簇包含线性簇，或包含单链或双链串联体。
在一些实施例中，包含位于支持物上的随机位置处的多个位点的支持物在本文中被称为在其上具有随机地定位的位点的支持物。在此类实施例中，支持物上随机地定位的位点的位置不是预定的。因此，该多个随机地定位的位点在支持物上以无序和/或不可预测的方式排列。在一些实施例中，支持物包含至少102个位点、至少103个位点、至少104个位点、至少105个位点、至少106个位点、至少107个位点、至少108个位点、至少109个位点、至少1010个位点、至少1011个位点、至少1012个位点、至少1013个位点、至少1014个位点、至少1015个位点或更多个位点，其中位点在支持物上随机地定位。在一些实施例中，用核酸模板固定支持物上的多个随机地定位的位点(例如，102至1015个位点或更多个位点(例如，102个位点、103个位点、104个位点、105个位点、106个位点、107个位点、108个位点、109个位点、1010个位点、1011个位点、1012个位点、1013个位点、1014个位点、1015个位点或更多个位点)以形成用核酸模板固定的支持物。在一些实施例中，核酸模板通过与固定的表面捕获引物杂交而固定在多个随机地定位的位点处，或者核酸模板共价附接至表面捕获引物。在一些实施例中，核酸模板固定在多个随机地定位的位点处，例如固定在102至1015个位点或更多个位点(例如，102至1015个位点或更多个位点，例如，102个位点、103个位点、104个位点、105个位点、106个位点、107个位点、108个位点、109个位点、1010个位点、1011个位点、1012个位点、1013个位点、1014个位点或1015个位点或更多个位点)处。在一些实施例中，固定的核酸模板以克隆方式被扩增以在多个随机定位的位点处产生固定的核酸簇。在一些实施例中，单独的固定的核酸簇包含线性簇，或包含单链或双链串联体。
在一些实施例中，支持物上的该多个固定的表面捕获引物彼此流体连通以允许试剂(例如，核酸模板分子、可溶性引物、酶、核苷酸、二价阳离子、缓冲液、等等)的溶液流动到支持物上，使得支持物上的该多个固定的表面捕获引物可以大规模并行方式基本上同时与试剂发生反应。在一些实施例中，该多个固定的表面捕获引物的流体连通可用于在该多个固定的表面捕获引物上基本上同时进行核酸扩增反应(例如，RCA、MDA、PCR和桥式扩增)。
在一些实施例中，支持物上的多个固定的核酸簇彼此流体连通，以允许试剂(例如，酶、核苷酸、二价阳离子等)的溶液流动到支持物上，使得支持物上的多个固定的核酸簇可以基本上同时以大规模并行方式与试剂反应。在一些实施例中，多个固定的核酸簇的流体连通可用于在多个固定的核酸簇上基本上同时进行核苷酸结合测定和/或进行核苷酸聚合反应(例如，引物延伸或测序)，并且任选地进行大规模并行测序的检测和成像。
当用于指代固定的酶时，术语“固定的”和相关术语是指通过共价键或非共价相互作用附接至支持物、或附接至支持物上的涂层、或埋入由支持物上涂层形成的基底内的酶(例如，聚合酶)。
当用于指代固定的核酸时，术语“固定的”和相关术语是指通过共价键或非共价相互作用附接至支持物、或附接至支持物上的涂层、或埋入由支持物上的涂层形成的基质内的核酸分子，其中核酸分子包括表面捕获引物、核酸模板分子和捕获引物的延伸产物。捕获引物的延伸产物可包括核酸串联体(例如，核酸簇)。
在一些实施例中，一个或多个核酸模板固定在支持物上，例如固定在支持物上的位点处。在一些实施例中，一个或多个核酸模板以克隆方式被扩增。在一些实施例中，该一个或多个核酸模板从支持物以克隆方式被扩增(例如，在溶液中)，并且随后沉积到支持物上并固定在支持物上。在一些实施例中，该一个或多个核酸模板的克隆扩增反应在支持物上进行，导致在支持物上固定。在一些实施例中，使用核酸扩增反应以克隆方式扩增该一个或多个核酸模板(例如，在溶液中或在支持物上)，该核酸扩增反应包括以下项中的任一者或以下项的任意组合：聚合酶链式反应(PCR)、多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、桥式扩增、等温桥式扩增、滚环扩增(RCA)、环至环扩增、解旋酶依赖性扩增、重组酶依赖性扩增和/或单链结合(SSB)蛋白依赖性扩增。
术语“存留时间”和相关术语是指在靶核酸、聚合酶、缀合或未缀合的核苷酸之间形成的结合复合物保持稳定而没有任何结合组分从结合复合物解离的时间长度。存留时间指示结合复合物的稳定性和结合相互作用的强度。可通过观察结合复合物的开始和/或存留时间(诸如通过观察来自结合复合物的经标记的组分的信号)来测量存留时间。例如，经标记的核苷酸或包含一个或多个核苷酸的经标记的试剂可存在于结合复合物中，因而允许来自标记的信号在结合复合物的存留时间期间被检测到。一个示例性标记为荧光标记。
简介
本公开提供了用于在支持物上从细胞样品捕获核酸、在支持物上制备文库分子、扩增支持物上的文库分子以产生核酸模板分子以及分析固定的核酸模板分子，包括对固定的核酸模板分子进行检测和/或测序的组合物、装置和方法。固定的核酸模板分子对应于来自细胞样品的核酸。固定的核酸模板分子以类似于细胞样品中的空间位置的排列在空间上位于支持物上。
用于制备空间分辨核酸的方法
本公开提供了用于制备空间分辨核酸的方法，该方法包括：步骤(a)提供用至少一层低非特异性结合涂层钝化的支持物。在一些实施例中，低非特异性结合涂层包括提供低结合/低散射基层的高对比度噪声比(CNR)涂层。在一些实施例中，低非特异性结合涂层包括至少一个亲水性聚合物层。在一些实施例中，低非特异性结合涂层具有不超过45度的水接触角。在一些实施例中，低非特异性结合涂层可以在支持物上形成连续层，或者低非特异性结合涂层可以以横跨支持物的有组织的图案放置在支持物上，例如作为斑点、网格和/或或线条。在一些实施例中，低非特异性结合涂层可以提供具有高对比度噪声(CNR)比的表面。下面提供了低非特异性结合涂层的附加描述。在一些实施例中，支持物用细胞结合涂层钝化，该细胞结合涂层包含聚赖氨酸、聚精氨酸、其他聚阳离子、组织特异性抗体、去污剂、两亲肽、组织特异性或通用受体配体尤其是细胞表面受体配体和/或凝集素。在一些实施例中，细胞结合涂层可以以横跨支持物的有组织的图案放置在支持物上，例如作为点、网格和/或线。在一些实施例中，细胞结合涂层可以以低密度存在，其被优化以提供细胞或组织结合而不干扰低非特异性结合涂层的低结合/高CNR性质。
在步骤(a)中的一些实施例中，支持物为固体、半固体或两者的组合。在一些实施例中，支持物为多孔的、半多孔的、无孔的或孔隙率的任意组合。在一些实施例中，支持物可以为基本上平面的、凹面的、凸面的或其任意组合。
在步骤(a)中的一些实施例中，低非特异性结合涂层包含多个表面捕获引物，其选择性地杂交(捕获)来自细胞样品的核酸诸如RNA和/或DNA。表面捕获引物可以与来自细胞样品的RNA或DNA的任何部分杂交。在一些实施例中，表面捕获引物包含RNA捕获序列，其包括polyT序列、靶标特异性序列和/或随机序列。在一些实施例中，表面捕获引物包含通用衔接子序列，诸如通用表面捕获引物序列、通用表面钉扎引物序列、针对反向测序引物的通用结合位点、针对正向测序引物的通用结合位点和/或针对压实寡核苷酸的通用结合位点。在一些实施例中，polyT序列包含3至30个具有胸腺嘧啶碱基的核苷酸。在一些实施例中，单独的表面捕获引物包含(例如，以5'至3'方向排列)：通用表面捕获引物序列(110)、针对反向测序引物的通用结合位点(120)和RNA捕获序列(例如，参见图11)。在一些实施例中，RNA捕获序列包括poly-T序列和/或RNA靶特异性序列。在一些实施例中，表面捕获引物的5'端拴系至低非特异性结合涂层。在一些实施例中，支持物进一步包含多个表面钉扎引物，该多个表面钉扎引物拴系至低非特异性结合涂层。在一些实施例中，固定的表面钉扎引物用于将串联体分子的至少一个部分固定至支持物(例如，串联体分子如下所述)。在一些实施例中，固定的表面钉扎引物具有不可延伸的3'端并且不能用于扩增。在一些实施例中，表面捕获引物和表面钉扎引物可以共价拴系至低非特异性结合涂层。
在一些实施例中，通用表面捕获引物序列(110)包括序列：5'-AGTCGTCGCAGCCTCACCTGATC-3'(SEQ ID NO:1)。
在一些实施例中，通用表面捕获引物序列(110)包括序列：5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，针对反向测序引物的通用结合位点(120)包括序列：5'-ATGTCGGAAGGTGTGCAGGCTACCGCTTGTCAACT-3'(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，针对反向测序引物的通用结合位点(120)包括序列：5'-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3'(SEQ ID NO:4)。
在一些实施例中，针对反向测序引物的通用结合位点(120)包括序列：5'-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-3'(SEQ ID NO:5)。
在一些实施例中，用于制备空间分辨核酸的方法进一步包括步骤(b)：在适合于细胞样品保持在经涂覆的支持物上的固定位置的条件下将细胞样品定位在支持物上。在一些实施例中，可以例如使用诸如镊子的工具将细胞样品手动定位在支持物上。在一些实施例中，细胞样品可以是流过或放置到支持物上的组织切片。在一些实施例中，支持物包括流通池，其可以是封闭的流通池或可重新密封的流通池。在一些实施例中，细胞样品可以被透化以允许核酸从细胞内部洗脱到细胞外部并接触支持物。在一些实施例中，RNA可以从细胞内部洗脱到固定在经涂覆的支持物上的表面捕获引物上。在一些实施例中，洗脱的RNA可以与表面捕获引物杂交以产生多个捕获引物-RNA双链体，每个捕获引物-RNA双链体包含与RNA分子杂交的表面捕获引物(例如，参见图12)。在一些实施例中，RNA可以通过扩散、通过热辅助扩散、通过辐射辅助扩散、通过电泳、通过离心或通过其他方法从细胞内部洗脱到支持物上。在一些实施例中，RNA可以以保留细胞样品中RNA分子的空间位置信息的方式从细胞内部洗脱到表面捕获引物上。在一些实施例中，与经涂覆的支持物上的表面捕获引物杂交的RNA分子的位置对应于当RNA分子先前位于细胞样品内部时RNA分子的空间位置。在一些实施例中，可以在将细胞样品定位在支持物上之前或之后或同时透化细胞样品。在一些实施例中，可以用化学固定试剂处理细胞样品或者不对细胞样品进行化学固定。在一些实施例中，细胞样品可以可以染色、去染色或不染色。在一些实施例中，可以在步骤(b)中对细胞样品进行成像、或染色和成像。可以采用以下文献中描述的技术中的任一种技术对细胞样品进行染色“Histological and Histochemical Methods:Theory and Practice”,第4版,Kiernan,J.A.,编辑(2008)。在一些实施例中，可以使用负染色或通过荧光或干涉测量方法来进行成像。在一些实施例中，在步骤(b)中，可以将细胞样品(例如，组织切片)定位在支持物上用于自动化或半自动化扫描。在一些实施例中，在将核酸从细胞样品洗脱到步骤(b)的支持物上的固定的表面捕获引物上之后，可以将细胞样品从支持物移除。在一些实施例中，可以在下文描述的步骤(c)至(i)中的任何步骤之后从支持物移除细胞样品。在一些实施例中，可以在步骤(c)至(i)中的任一个期间对细胞样品进行成像、或染色和成像。
在一些实施例中，用于制备空间分辨核酸的方法进一步包括步骤(c)：通过使捕获引物-RNA双链体与莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶、多个核苷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP和/或UTP)接触来在支持物上进行逆转录反应。在一些实施例中，逆转录反应通过延伸固定的表面捕获引物的3'端并使用杂交的RNA作为模板链来产生多个第一链cDNA分子。在一些实施例中，逆转录反应可以在适合于MMLV逆转录酶在第一链cDNA的3'端处产生非模板polyC尾的条件下进行(例如，参见图13)。替代性地，可以使用末端脱氧核苷酸转移酶和dCTP将非模板PolyC尾附加到第一链cDNA的3'端。
在一些实施例中，步骤(c)的逆转录反应可以在多个模板转换寡核苷酸的存在下进行。单独的模板转换寡核苷酸可以与cDNA的第一链的3'端处的非模板polyC尾杂交(例如，参见图14)。在一些实施例中，模板转换寡核苷酸包含DNA/RNA嵌合寡核苷酸。在一些实施例中，模板转换寡核苷酸包含可以与cDNA的第一链的3'端处的polyC尾杂交的polyG区。在一些实施例中，模板转换寡核苷酸的polyG区包含核糖核苷酸碱基(例如，参见图14)。在一些实施例中，模板转换寡核苷酸进一步包含至少一个通用衔接子序列，例如针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)和针对正向测序引物的通用结合位点(130)(例如，参见图14)。
在一些实施例中，针对正向测序引物的通用结合位点(130)包括序列：5'-CGTGCTGGATTGGCTCACCAGACACCTTCCGACAT-3'(SEQ ID NO:6)。
在一些实施例中，针对正向测序引物的通用结合位点(130)包括序列：5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'(SEQ ID NO:7)。
在一些实施例中，针对正向测序引物的通用结合位点(130)包括序列：5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'(SEQ ID NO:8)。
在一些实施例中，针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)包括序列：5'-CATGTAATGCACGTACTTTCAGGGT-3'(SEQ ID NO:9)。
在一些实施例中，针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)包括序列：5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'(SEQ ID NO:10)。
在一些实施例中，用于制备空间分辨核酸的方法进一步包括步骤(d)：使用MMLV逆转录酶、多个核苷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP和/或dUTP)以及模板转换寡核苷酸(TSO)的至少一部分作为模板链来延伸cDNA的第一链(参见图15中带有箭头的上虚线，标记为‘第1链cDNA(TSO)’)。在一些实施例中，步骤(d)的延伸反应从第一链cDNA的polyC尾的3'末端延伸。步骤(d)的延伸反应可以产生cDNA的全长第一链，其包含(在5'至3'方向上)：通用表面捕获引物序列(110)；针对反向测序引物的通用结合位点(120)；RNA捕获序列；对应于RNA的cDNA插入；polyC尾；针对正向测序引物的通用结合位点(130)；以及针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)。
在一些实施例中，用于制备空间分辨核酸的方法进一步包括步骤(e)：移除RNA，同时保留固定的全长第一链cDNA。在一些实施例中，可以使用RNase来移除RNA。在一些实施例中，保留的固定的全长第一链cDNA包含(在5'至3'方向上)：通用表面捕获引物序列(110)；针对反向测序引物的通用结合位点(120)；RNA捕获序列；对应于RNA的cDNA插入；polyC尾；针对正向测序引物的通用结合位点(130)；以及针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)(例如，参见图16)。
在一些实施例中，用于制备空间分辨核酸的方法进一步包括步骤(f)：使保留的固定的全长第一链cDNA与多个单链环化寡核苷酸接触。在一些实施例中，单独的环化寡核苷酸包含：与针对反向测序引物的通用结合位点(120)互补的衔接子序列；与通用表面捕获引物序列(110)互补的衔接子序列；接头区；与针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)互补的衔接子序列；以及与针对正向测序引物的通用结合位点(130)互补的衔接子序列(例如，参见图17)。在一些实施例中，环化寡核苷酸缺少与通用表面捕获引物序列(110)互补的衔接子序列。在适合于环化寡核苷酸与固定的第一链cDNA的通用衔接子序列杂交但不与RNA捕获序列、cDNA插入区或polyC尾杂交的条件下，使保留的固定的全长第一链cDNA与多个单链环化寡核苷酸接触。环化寡核苷酸与固定的全长第一链cDNA的杂交形成具有间隙的单链环状分子。在一些实施例中，接头区可以包括以下项中的任一者或两者或更多者的任意组合：至少一个用于多重化的样品索引序列；用于分子标记的至少一个唯一分子索引(UMI)序列；和/或针对压实寡核苷酸的通用结合位点。在一些实施例中，样品索引包含5至20个碱基，其可用于在多重测定中区分来自不同样品来源的多核苷酸(例如，插入序列)。在一些实施例中，唯一分子索引(UMI)包含3至20个碱基，其可用于唯一地识别附加有UMI序列的单独的核酸分子(例如，分子标记)。在一些实施例中，唯一分子索引(UMI)包含随机序列。
在一些实施例中，用于制备空间分辨核酸的方法进一步包括步骤(g)：使用polyC尾区、第一链cDNA插入区和RNA捕获序列区作为模板链，进行聚合酶催化的延伸反应以填充间隙。聚合酶催化的延伸反应形成带有切口的单链环化分子。在一些实施例中，步骤(g)进一步包括进行酶促连接反应以产生单链、共价闭合环状分子，其与固定的全长第一链cDNA杂交(例如，参见图18)。
在一些实施例中，用于制备空间分辨核酸的方法进一步包括步骤(h)：使用固定的全长第1链cDNA的末端3'端作为起始位点进行滚环扩增反应，以产生固定至支持物的核酸串联体。在一些实施例中，滚环扩增反应采用具有链置换活性的DNA聚合酶和多个核苷酸(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP和/或dUTP)。滚环扩增反应可以使用共价闭合环状分子作为模板链来产生具有多个串联重复单元的串联体，其中每个单元包含：接头区(或其互补序列)；通用表面捕获引物序列(110)(或其互补序列)；针对反向测序引物的通用结合位点(120)(或其互补序列)；RNA捕获序列(或其互补序列)；第一链cDNA插入区(或其互补序列)；polyC区(或其互补序列)；针对正向测序引物的通用结合位点(130)(或其互补序列)；以及针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)(或其互补序列)(例如，参见图19)。
在一些实施例中，步骤(h)中的滚环扩增反应可在存在或不存在多个压实寡核苷酸的情况下进行。在一些实施例中，压实寡核苷酸包括单链寡核苷酸，其在一端处具有与串联体分子的一部分杂交的第一区，并且在另一端处具有与同一串联体分子的另一部分杂交的第二区，其中压实寡核苷酸与给定串联体的杂交压实串联体的大小和/或形状。在一些实施例中，压实寡核苷酸的5'和3'区可以与串联体的不同部分杂交，以将串联体的远侧部分拉到一起，从而使串联体压实以形成DNA纳米球。压实寡核苷酸的附加描述可以在下面找到。
在一些实施例中，步骤(h)的具有链置换活性的DNA聚合酶可以选自由以下项组成的组：phi29 DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶的大片段、Bsu DNA聚合酶的大片段、和Bca(exo-)DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段、T5聚合酶、M-MuLV逆转录酶、HIV病毒逆转录酶或Deep Vent DNA聚合酶。在一些实施例中，phi29 DNA聚合酶可以是野生型phi29 DNA聚合酶(例如，来自Expedeon公司(Expedeon)的MagniPhi)或变体EquiPhi29 DNA聚合酶(例如，来自赛默飞世尔科技公司)或嵌合QualiPhi DNA聚合酶(例如，来自4basebio公司)。
在一些实施例中，用于制备空间分辨核酸的方法进一步包括步骤(i)：对多个固定的串联体进行测序。在一些实施例中，步骤(i)的测序包括对单独的固定的串联体的至少一部分进行测序以识别单独的捕获的RNA。在一些实施例中，经涂覆的支持物上的单独的测序串联体的位置对应于来自细胞样品的单独的RNA的空间位置。在一些实施例中，步骤(i)的测序包括对单独的固定的串联体的至少一部分进行测序，包括对对应于捕获的RNA的串联体的cDNA插入部分的至少一部分进行测序。在一些实施例中，对步骤(a)的低非特异性结合涂层上的固定的串联体进行测序可以提供在测序期间具有高对比度噪声(CNR)比的表面。高对比度噪声(CNR)比可以为支持物上串联体的准确空间位置提供改进的灵敏度和特异性，这对应于细胞样品中感兴趣的RNA转录本的准确位置。在一些实施例中，步骤(i)的测序包括使用荧光标记的核苷酸试剂和测序聚合酶。在一些实施例中，步骤(i)的测序包括成像以检测在使用荧光标记的核苷酸试剂和测序聚合酶的测序反应期间从固定的串联体发出的荧光信号。
在一些实施例中，可以使用采用标记的或未标记的链终止核苷酸的任何核酸测序方法对多个固定的串联体进行测序，其中链终止核苷酸包括3'-O-叠氮基基团(或3'-O-甲基叠氮基基团)或在糖3'位置处的任何其他类型的庞大阻断基团。在一些实施例中，可以使用使用标记的多价分子和未标记的链终止核苷酸的两阶段测序方法对串联体模板分子进行测序。在一些实施例中，可以使用合成测序(SBS)方法对串联体模板分子进行测序，该方法采用标记的链终止核苷酸。在一些实施例中，可以使用结合测序方法(SBB)对串联体模板分子进行测序，该方法采用未标记的链终止核苷酸。在一些实施例中，可以使用磷酸酯链标记的核苷酸对串联体模板分子进行测序。这些不同的测序方法描述如下。
在一些实施例中，可以通过在适合于探针与固定的串联体选择性杂交的条件下将固定的串联体与用可检测报道基因部分标记的多个寡核苷酸探针接触来检测固定的串联体。在一些实施例中，接触步骤可进一步包括成像步骤。在一些实施例中，寡核苷酸探针包含靶标特异性序列，诸如与cDNA插入区的任何部分互补的序列。在一些实施例中，寡核苷酸探针包含可与通用衔接子序列杂交的序列，该通用衔接子序列包括针对表面捕获引物的通用结合位点、针对表面钉扎引物的通用结合位点、针对正向测序引物的通用结合序列、针对反向测序引物的通用结合序列、样品条形码序列和/或唯一分子索引序列中的任一者。
在一些实施例中，用于制备空间分辨核酸的方法进一步包括步骤(j)：确定经涂覆的支持物上的单独的串联体的位置，其对应于从细胞样品洗脱的单独的RNA的空间位置。在一些实施例中，步骤(i)的测序和成像可用于确定固定至经涂覆的支持物的单独的串联体的位置，其对应于从细胞样品洗脱的单独的RNA的空间位置。
细胞样品
在本文所述的方法中的任一种方法中，细胞样品是指单个细胞、完整细胞、多个细胞、组织、器官、生物体或这些细胞样品中的任何细胞样品的切片。细胞样品可以从生物体中提取(例如，活检)，或者从在液体中或培养皿中生长的细胞培养物获得。细胞样品包括新鲜的、冷冻的、新鲜冷冻的或存档的样品(例如，福尔马林固定石蜡包埋的；FFPE)。细胞样品可被嵌入蜡、石蜡、树脂、环氧树脂或琼脂中。可以将细胞样品固定在例如丙酮、乙醇、甲醇、甲醛、多聚甲醛-Triton或戊二醛中的任一者或者两者或更多者的任意组合中。细胞样品可以是切片的或未切片的。细胞样品可以染色的、脱色的或不染色的。
在一些实施例中，细胞样品可以从病毒、真菌、原核生物或真核生物获得。在一些实施例中，细胞样品可以从动物、昆虫或植物获得。在一些实施例中，细胞样品包含一种或多种病毒感染的细胞。
在一些实施例中，细胞样品可以从任何生物体获得，该生物体包括人、猿、类人猿、犬、猫科动物、牛、马、鼠、猪、山羊、狼、蛙、鱼、植物、昆虫或细菌。
在一些实施例中，细胞样品可以从任何器官获得，所述器官包括头、颈、脑、乳房、卵巢、子宫颈、结肠、直肠、子宫内膜、胆囊、肠、膀胱、前列腺、睾丸、肝、肺、肾、食道、胰腺、甲状腺、脑垂体、胸腺、皮肤、心脏、喉或其他器官。
在本文所述的方法中的任一种方法中，细胞样品含有多种RNA，其可被洗脱到固定至经涂覆的支持物上的多个表面捕获引物上。在一些实施例中，洗脱的RNA包含靶RNA和/或非靶RNA。在一些实施例中，洗脱的RNA包含野生型RNA、突变体RNA和/或剪接变体RNA。在一些实施例中，洗脱的RNA包含预剪接的RNA、部分剪接的RNA和/或完全剪接的RNA。在一些实施例中，洗脱的RNA包含编码RNA、非编码RNA、mRNA、tRNA、替代rRNA、rRNA、微小RNA(miRNA)、成熟微小RNA、未成熟微小RNA、lncRNA、ncRNA和/或内含子RNA。在一些实施例中，洗脱的RNA包含管家RNA、细胞特异性RNA、组织特异性RNA或疾病特异性RNA。在一些实施例中，洗脱的RNA包含由一种或多种细胞响应于刺激(诸如热、光、化学品或药物)而表达的RNA。在一些实施例中，洗脱的RNA包含在健康细胞或患病细胞中发现的RNA。在一些实施例中，洗脱的RNA包含从使用重组DNA程序引入细胞样品中的转基因DNA序列转录的RNA。例如，RNA可以从受诱导型或组成型启动子序列控制的转基因DNA序列转录。在一些实施例中，洗脱的RNA包含从非转基因的DNA序列转录的RNA。
透化
在本文所述的方法中的任一种方法中，可以使细胞样品透化以允许样品内的核酸，包括靶核酸分子(例如，RNA和/或DNA)从细胞内部迁移到固定在支持物上的多个捕获寡核苷酸。细胞样品可以与一种或多种透化剂接触，包括有机溶剂、去污剂、化合物、交联剂和/或酶。在一些实施例中，有机溶剂包含丙酮、乙醇和甲醇。在一些实施例中，洗涤剂包含皂苷、Triton X-100、Tween-20、或十二烷基硫酸钠(SDS)、或N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液。在一些实施例中，交联剂包括多聚甲醛。在一些实施例中，酶包括胰蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶(例如蛋白酶K)。在一些实施例中，可以使用碱性条件或酸性条件用蛋白酶来透性化细胞样品。在一些实施例中，来自细胞样品的靶核酸分子以保留细胞样品中靶核酸分子的空间位置信息的方式杂交(捕获)在固定于支持物(或支持物涂层)上的捕获寡核苷酸上。
在本文所述的方法中的任一种方法中，细胞样品包含透性化的细胞样品。在一些实施例中，所述方法包含用透性化试剂处理细胞样品，所述透性化试剂改变细胞膜以允许实验试剂渗透到细胞中。例如，透性化试剂从细胞膜上移除膜脂。在一些实施例中，可以用透性化试剂处理细胞样品，该透性化试剂包括有机溶剂、洗涤剂、化学化合物、交联剂和/或酶的任意组合。在一些实施例中，有机溶剂包含丙酮、乙醇和甲醇。在一些实施例中，洗涤剂包含皂苷、Triton X-100、Tween-20、十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液或非离子聚氧乙烯表面活性剂(例如，NP40)。在一些实施例中，交联剂包括多聚甲醛。在一些实施例中，酶包括胰蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶(例如蛋白酶K)。在一些实施例中，可以使用碱性条件或酸性条件用蛋白酶来使细胞透性化。在一些实施例中，透性化试剂包含水和/或PBS。
例如，可以用70％乙醇透性化固定的细胞约30至60分钟，并且可以用PBS-T(例如，具有0.05％Tween-20的PBS)更换透性化试剂。在一些实施例中，可以用3％多聚甲醛和0.1％戊二醛后固定细胞约30至60分钟，并用PBS-T洗涤多次。
细胞固定
在本文所述的方法中的任一种方法中，细胞样品包含固定的细胞样品。在一些实施例中，可以用固定试剂(fixationreagent)(例如，固定试剂(fixingreagent))处理细胞样品，该固定试剂保存细胞和其内容物以抑制降解并且可以抑制细胞裂解。例如，固定试剂可以保存由细胞样品携带的RNA。在一些实施例中，固定试剂抑制细胞样品中核酸的损失。
在一些实施例中，固定试剂可以使RNA交联以防止RNA从细胞样品中逃逸。在一些实施例中，交联固定试剂包含醛、甲醛、多聚甲醛、福尔马林、戊二醛、亚氨酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)和/或乙二醛(双官能醛)的任意组合。
在一些实施例中，固定试剂包含至少一种醇，包括甲醇或乙醇。在一些实施例中，固定试剂包含至少一种酮，包括丙酮。在一些实施例中，固定试剂包含乙酸、冰乙酸和/或苦味酸。在一些实施例中，固定试剂包含氯化汞。在一些实施例中，固定试剂包含锌盐，所述锌盐包含硫酸锌或氯化锌。在一些实施例中，固定试剂可以使多肽变性。
在一些实施例中，固定试剂包含相对于水/PBS 4％w/v的多聚甲醛。在一些实施例中，固定试剂包含10％的35％中性pH的甲醛。在一些实施例中，固定试剂包含相对于水/PBS2％v/v的戊二醛。在一些实施例中，固定试剂包含25％的37％甲醛溶液、70％苦味酸和5％乙酸。
在一些实施例中，可以用4％多聚甲醛将细胞样品固定在支持物上约30至60分钟并用PBS洗涤。
压实寡核苷酸
在一些实施例中，滚环扩增反应可以在多个压实寡核苷酸的存在下进行，该压实寡核苷酸当与串联体分子杂交使压实串联体的大小和/或形状以形成压实纳米球。在一些实施例中，压实寡核苷酸包括单链寡核苷酸，其在一端处具有与串联体分子的一部分杂交的第一区，并且在另一端处具有与同一串联体分子的另一部分杂交的第二区，其中压实寡核苷酸与给定串联体的杂交压实串联体的大小和/或形状。
在一些实施例中，压实寡核苷酸包括5'区、任选的内部区域(插入区)和3'区。压实寡核苷酸的5'和3'区可以与同一串联体的不同部分杂交，以将串联体的远侧部分拉到一起，从而使串联体压实以形成DNA纳米球。例如但不限于，压实寡核苷酸的5'区被设计为与串联体分子的第一部分(例如，通用压实寡核苷酸结合位点)杂交，并且压实寡核苷酸的3'区被设计为与串联体分子的第二部分(例如，通用压实寡核苷酸结合位点)杂交。与在不存在压实寡核苷酸的情况下生成的串联体相比，在RCA期间包括压实寡核苷酸可以促进具有更紧密大小和形状的DNA纳米球的形成。DNA纳米球的紧凑和稳定的特性(例如，通过增加信号强度)提高了测序准确性，并且纳米球在多个测序循环中保持其形状和尺寸。
在一些实施例中，压实寡核苷酸包含单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸包含DNA、RNA或DNA和RNA的组合。压实寡核苷酸可以是任何长度，包括20至150个核苷酸，例如，20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个核苷酸，或它们之间的任何范围。在一些实施例中，压实寡核苷酸的长度可以是30至100个核苷酸。在一些实施例中，压实寡核苷酸的长度可以是40至80个核苷酸。在一些实施例中，压实寡核苷酸的长度可以是80至1200个核苷酸。
在一些实施例中，压实寡核苷酸包含5'区和3'区，以及任选地介于5'区与3'区之间的中间区。中间区可以是任何长度，例如长度为约2至20个核苷酸，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，或它们之间的任何范围。中间区包含具有连续相同碱基(例如，AAA、GGG、CCC、TTT或UUU)的均聚物。中间区包含非均聚物序列。
在一些实施例中，压实寡核苷酸的5'区可以沿其长度与串联体分子的第一部分完全互补或部分互补。在一些实施例中，压实寡核苷酸的3'区可以沿其长度与串联体分子的第二部分完全互补或部分互补。在一些实施例中，压实寡核苷酸的5'区可以与串联体分子的第一通用序列部分杂交。在一些实施例中，压实寡核苷酸的3'区可以与串联体分子的第二通用序列部分杂交。
在一些实施例中，压实寡核苷酸的5'区可以具有与3'区相同的序列。压实寡核苷酸的5'区可以具有与3'区不同的序列。在一些实施例中，压实寡核苷酸的3'区可以具有与5'区相反的序列。在一些实施例中，压实寡核苷酸的5'区可以具有与3'区相反的序列。
在一些实施例中，压实寡核苷酸中的任一者的3'区可以在末端3'端处包括另外的三个碱基，其包含2'-O-甲基RNA碱基(例如，指定为mUmUmU)，或末端3'端缺少另外的2'-O-甲基RNA碱基。
在一些实施例中，压实寡核苷酸在其5'或3'端处包含一个或多个经修饰的碱基或键以赋予某些功能。在一些实施例中，压实寡核苷酸在其5'和/或3'端处包含至少一个硫代磷酸酯键以赋予核酸外切酶抗性。在一些实施例中，在3'端处或附近的至少一个核苷酸包含赋予核酸外切酶抗性的2'氟碱基。在一些实施例中，压实寡核苷酸的3'端是不可延伸的。在一些实施例中，压实寡核苷酸的3'端包含阻断聚合酶催化的延伸的至少一个2'-O-甲基RNA碱基。例如，压实寡核苷酸的3'端包含三个碱基，所述三个碱基包含2'-O-甲基RNA碱基(例如，指定为mUmUmU)。在一些实施例中，压实寡核苷酸在其3'端处包含阻断聚合酶催化的延伸的3'反向dT。在一些实施例中，压实寡核苷酸包含阻断聚合酶催化的延伸的3'磷酸化。在一些实施例中，压实寡核苷酸的内部区包含至少一个锁核酸(LNA)，其增加通过使压实寡核苷酸与串联体分子杂交而形成的双链体的热稳定性。在一些实施例中，压实寡核苷酸包含磷酸化的5'端(例如，使用多核苷酸激酶)。
在一些实施例中，压实寡核苷酸在末端3'端处包括另外的三个碱基，其包含2'-O-甲基RNA碱基(例如，指定为mUmUmU)，或末端3'端缺少另外的2'-O-甲基RNA碱基。
在一些实施例中，压实寡核苷酸可以包括具有连续鸟嘌呤的至少一个区。例如，压实寡核苷酸可包含具有2个、3个、4个、5个、6个或更多个连续鸟嘌呤的至少一个区。在一些实施例，压实寡核苷酸包括可形成鸟嘌呤四分体结构的四个连续鸟嘌呤(参见图20)。可经由Hoogsteen氢键结合使鸟嘌呤四分体结构稳定。可通过中心阳离子(包括钾、钠、锂、铷或铯)使鸟嘌呤四分体结构稳定。
至少一个压实寡核苷酸可以形成鸟嘌呤四联体(图20)并与串联体中的通用结合序列杂交，这可以导致串联体折叠以形成分子内G-四联体结构(图21)。串联体可自塌陷以形成紧凑的纳米球。在纳米球中形成鸟嘌呤四分体和G-四链体可以增加纳米球的稳定性，以保持其紧凑的大小和形状，从而可以承受细胞样品内测序期间pH、温度和/或试剂重复流动的变化。
在一些实施例中，滚环扩增反应包含具有相同序列的多个压实寡核苷酸。替代性地，滚环扩增反应包含具有两种或更多种不同序列的混合物的多个压实寡核苷酸。
在一些实施例中，固定的串联体模板分子可以自塌缩成紧凑的核酸纳米球。可对纳米球进行成像并且可获得FWHM测量结果以给出纳米球的形状/尺寸。
在一些实施例中，在滚环扩增反应中包括压实寡核苷酸可以促进串联体塌缩成DNA纳米球。使用压实寡核苷酸进行RCA有助于在多个测序循环期间保持DNA纳米球的紧凑大小和形状，这可以改进细胞样品内DNA纳米球的点图像的FWHM(半最大值全宽度)。在一些实施例中，DNA纳米球在多个测序循环期间不会散开。在一些实施例中，DNA纳米球的点图像在多个测序循环期间不会放大。在一些实施例中，DNA纳米球的点图像在多个测序循环期间保持离散点。点图像可被表示为高斯点，并且尺寸可以FWHM来测量。如由较小FWHM所指示的较小点尺寸通常与点的具有改善的图像相关。在一些实施例中，纳米球点的FWHM可以为约10μm或更小。
用于测序的方法
本公开提供了对固定至支持物的多个串联体模板分子(例如，本文所述的固定的串联体分子中的任何固定的串联体分子)进行测序的方法。在一些实施例中，测序反应采用多个测序引物、多个测序聚合酶和包含核苷酸和/或多价分子的任一种或它们的任意组合的核苷酸试剂。在一些实施例中，核苷酸试剂包括规范核苷酸。在一些实施例中，核苷酸试剂包含核苷酸类似物，该核苷酸类似物包含经可检测地标记的核苷酸。在一些实施例中，核苷酸试剂包括携带可移除或不可移除链终止部分的核苷酸。在一些实施例中，核苷酸试剂包含多价分子，这些多价分子各自包含附接至多个聚合物臂的中心核，每个聚合物臂在臂端处具有核苷酸部分。在一些实施例中，测序反应采用结合未标记的核苷酸而不掺入。在一些实施例中，测序反应采用掺入未标记的核苷酸类似物。在一些实施例中，测序反应采用掺入具有可移除链终止部分的经可检测地标记的核苷酸。在一些实施例中，测序反应采用两阶段测序反应，包括结合经可检测地标记的多价分子而不掺入，并掺入核苷酸类似物。在一些实施例中，测序反应采用磷酸酯链标记的核苷酸。
用于使用核苷酸类似物进行测序的方法
在一些方面，本公开提供了用于测序的方法，该方法包括步骤(a)：使测序聚合酶与(i)核酸串联体分子和(ii)核酸引物(例如，正向或反向测序引物)接触，其中该接触在适合使测序聚合酶与核酸串联体分子(该核酸串联体分子与核酸引物杂交)结合的条件下进行，其中与核酸引物杂交的核酸串联体分子形成核酸双链体。在一些实施例中，测序聚合酶包含重组突变体测序聚合酶。在一些实施例中，引物包含3'可延伸端。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(b)：在适合于将至少一个核苷酸与测序聚合酶(该测序聚合酶结合至核酸双链体)结合的条件下，并且适用于聚合酶催化的核苷酸掺入的条件下，使测序聚合酶与多个核苷酸接触。在一些实施例中，在至少一种包含镁和/或锰的催化阳离子的存在下，使测序聚合酶与多个核苷酸接触。在一些实施例中，多个核苷酸包括至少一个在糖2'或3'位置处具有链终止部分的核苷酸类似物。在一些实施例中，该多个核苷酸包括缺失链终止部分的至少一个核苷酸。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(c)：在适合于掺入至少一种核苷酸的条件下，将至少一种核苷酸掺入到可延伸引物的3'端中。在一些实施例中，适用于核苷酸结合聚合酶和掺入核苷酸的条件可以相同或不同。在一些实施例中，适合于掺入核苷酸的条件包含加入至少一种包含镁和/或锰的催化阳离子。在一些实施例中，至少一种核苷酸结合测序聚合酶并掺入可延伸引物的3'端。在一些实施例中，步骤(c)中将核苷酸掺入引物的3'端中包括引物延伸反应。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(d)：将步骤(c)中将至少一个核苷酸掺入可延伸引物的3'端中重复至少一次。在一些实施例中，该多个核苷酸包括用可检测报道基因部分标记的多个核苷酸。可检测报道基因部分包括荧光团。在一些实施例中，荧光团附接至核苷酸碱基。在一些实施例中，荧光团用可从碱基裂解/移除的接头附接至核苷酸碱基。在一些实施例中，该多个核苷酸中的核苷酸中的至少一个核苷酸未用可检测报道基因部分标记。在一些实施例中，附接至核苷酸的特定可检测报道基因部分(例如，荧光团)可对应于核苷酸碱基(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允许对核苷酸碱基的检测和识别。在一些实施例中，该方法进一步包括：在步骤(c)和/或(d)处检测该至少一个经掺入的核苷酸。在一些实施例中，该方法进一步包括：在步骤(c)和/或(d)处识别该至少一个经掺入的核苷酸。在一些实施例中，可以通过检测和识别结合测序聚合酶的核苷酸来确定核酸串联体分子的序列，由此确定串联体分子的序列。在一些实施例中，核酸串联体分子的序列可以通过检测和识别掺入引物3'端的核苷酸来确定，由此确定串联体分子的序列。
在一些实施例中，在用于测序的方法中，结合至核酸双链体的多个测序聚合酶包含多个复合聚合酶，其具有至少第一复合聚合酶和第二复合聚合酶，其中(a)第一复合聚合酶包含结合至第一核酸双链体的第一测序聚合酶，其中该第一核酸双链体包含与第一核酸引物杂交的第一核酸模板序列，(b)第二复合聚合酶包含结合至第二核酸双链体的第二测序聚合酶，其中该第二核酸双链体包含与第二核酸引物杂交的第二核酸模板序列，(c)第一核酸模板序列和第二核酸模板序列包含相同或不同的序列，(d)第一核酸串联体和第二核酸串联体被克隆扩增，(e)第一引物和第二引物包含可延伸的3'端或不可延伸的3'端，并且(f)多个复合聚合酶固定至支持物。在一些实施例中，固定至支持物的多个复合聚合酶的密度为约102至1015(例如，102至1015或更多，例如，102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015)复合聚合酶每mm2。
用于核酸的两阶段测序方法
在一些方面，本公开提供了用于对核酸分子进行测序的两阶段方法。在一些实施例中，第一阶段通常包括将多价分子与复合聚合酶结合以形成多价-复合聚合酶，并检测多价-复合聚合酶。
在一些实施例中，第一阶段包括步骤(a)：使多个第一测序聚合酶与(i)多个核酸串联体分子和(ii)多个核酸引物(例如，正向或反向测序引物)接触，其中该接触在适合于将多个第一测序聚合酶结合至多个核酸串联体分子和多个核酸引物的条件下进行，由此形成多个第一复合聚合酶，该多个第一复合聚合酶各自包含与核酸双链体结合的第一测序聚合酶，其中核酸双链体包含与核酸引物杂交的核酸串联体分子。在一些实施例中，第一聚合酶包含重组突变体测序聚合酶。
在一些实施例中，用于对串联体分子测序的方法中，引物包含3'可延伸端或3'不可延伸端。在一些实施例中，多个核酸串联体分子包含扩增的模板分子(例如，克隆扩增的模板分子)。在一些实施例中，多个核酸串联体分子包含靶标目的序列的一个拷贝。在一些实施例中，多个核酸分子包含靶标目的序列的两个或更多个串联拷贝(例如，串联体)。在一些实施例中，多个核酸串联体分子中的核酸串联体分子包含相同的靶标目的序列或不同的靶标目的序列。在一些实施例中，多个核酸串联体分子和/或多个核酸引物为在溶液中的或固定至支持物的。在一些实施例中，当多个核酸串联体分子和/或多个核酸引物固定至支持物时，与第一测序聚合酶的结合产生多个固定的第一复合聚合酶。在一些实施例中，多个核酸串联体分子和/或核酸引物固定至支持物上的102至1015个不同的位点(例如，102至1015个位点或更多个位点，例如，102个位点、103个位点、104个位点、105个位点、106个位点、107个位点、108个位点、109个位点、1010个位点、1011个位点、1012个位点、1013个位点、1014个位点或1015个位点)。在一些实施例中，多个串联体分子和核酸引物与多个第一测序聚合酶的结合产生固定至支持物上的102至1015个不同位点的多个第一复合聚合酶(例如，102至1015个位点或更多个位点，例如，102个位点、103个位点、104个位点、105个位点、106个位点、107个位点、108个位点、109个位点、1010个位点、1011个位点、1012个位点、1013个位点、1014个位点或1015个位点)。在一些实施例中，支持物上的多个固定的第一复合聚合酶固定至支持物上的预定或随机位点。在一些实施例中，多个固定的第一复合聚合酶彼此流体连通以允许试剂(例如，包括测序聚合酶的酶、多价分子、核苷酸和/或二价阳离子)的溶液流动到支持物上，使得支持物上的多个固定的复合聚合酶以大规模并行方式与试剂的溶液反应。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(b)：使多个第一复合聚合酶与多个多价分子接触以形成多个多价-复合聚合酶(例如，结合复合物)。在一些实施例中，多个多价分子中的单独的多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核，并且每个核苷酸臂附接至核苷酸(例如，核苷酸单元)(例如，图2至6)。在一些实施例中，在适合于将多价分子的互补核苷酸单元与该多个第一复合聚合酶中的至少两个结合由此形成多个多价-复合聚合酶的条件下进行步骤(b)的接触。在一些实施例中，该条件适合于抑制互补核苷酸单元的聚合酶催化掺入多个多价-复合聚合酶的引物中。在一些实施例中，该多个多价分子包含至少一个具有多个核苷酸臂(例如，图2至6)的多价分子，每个核苷酸臂附接有核苷酸类似物(例如，核苷酸类似物单元)，其中核苷酸类似物包括位于糖2'和/或3'位置的链终止部分。在一些实施例中，该多个多价分子包括包含多个核苷酸臂的至少一个多价分子，每个核苷酸臂附接有缺失链终止部分的核苷酸单元。在一些实施例中，该多个多价分子中的多价分子中的至少一个多价分子用可检测报道基因部分标记。多价分子的任何部分都可以被标记，包括核、核苷酸臂或核碱基。在一些实施例中，可检测报道基因部分包括荧光团。在一些实施例中，在至少一种包含锶、钡和/或钙的非催化阳离子存在下，进行步骤(b)的接触。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(c)：检测多个多价-复合聚合酶。在一些实施例中，检测包括检测结合至复合聚合酶的多价分子，其中多价分子的互补核苷酸单元结合至引物，但互补核苷酸单元的掺入被抑制。在一些实施例中，多价分子用可检测报道基因部分标记以允许检测。在一些实施例中，标记的多价分子包含附接至多价分子的核、接头和/或核苷酸单元的荧光团。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(d)：识别结合至多个第一复合聚合酶的互补核苷酸单元的碱基，由此确定串联体分子的序列。在一些实施例中，多价分子用可检测报道基因部分进行标记，该可检测报道基因部分对应于附接至核苷酸臂的特定核苷酸单元，以允许识别结合至多个第一复合聚合酶的互补核苷酸单元(例如，核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)。
在一些实施例中，两阶段测序方法的第二阶段通常包括核苷酸掺入。在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(e)：解离多个多价-复合聚合酶并移除多个第一测序聚合酶及其结合的多价分子，并保留多个核酸双链体。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(f)：将步骤(e)的多个保留的核酸双链体与多个第二测序聚合酶接触，其中该接触在适合于使多个第二测序聚合酶结合至多个保留的核酸双链体的条件下进行，由此形成多个第二复合聚合酶，每个第二复合聚合酶包含与核酸双链体结合的第二测序聚合酶。在一些实施例中，第二测序聚合酶包含重组突变体测序聚合酶。
在一些实施例中，步骤(a)的该多个第一测序聚合酶具有与步骤(f)的该多个第二测序聚合酶的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列。在一些实施例中，步骤(a)的该多个第一测序聚合酶具有与步骤(f)的该多个第二测序聚合酶的氨基酸序列不同的氨基酸序列。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(g)：使多个第二复合聚合酶与多个核苷酸接触，其中该接触在适合于将来自多个核苷酸的互补核苷酸与复合聚合酶的至少两个结合的条件下进行，由此形成多个核苷酸复合聚合酶。在一些实施例中，步骤(g)的接触在适合于促进结合的互补核苷酸经聚合酶催化掺入核苷酸复合-聚合酶的引物中条件下进行，由此形成多个核苷酸复合聚合酶。在一些实施例中，步骤(g)中将核苷酸掺入引物的3'端中包括引物延伸反应。在一些实施例中，步骤(g)的接触在至少一种包含镁和/或锰的催化阳离子的存在下进行。在一些实施例中，步骤(g)的接触在镁和/或锰的存在下进行。在一些实施例中，该多个核苷酸包括天然核苷酸(例如，非类似物核苷酸)或核苷酸类似物。在一些实施例中，多个核苷酸包括可移除或不可移除的2'和/或3'链终止部分。在一些实施例中，该多个核苷酸包括用可检测报道基因部分标记的多个核苷酸。可检测报道基因部分可包括荧光团。在一些实施例中，荧光团附接至核苷酸碱基。在一些实施例中，荧光团用接头附接至核苷酸碱基，该接头可从碱基裂解/移除或不可从碱基移除。在一些实施例中，附接至核苷酸的特定可检测报道基因部分(例如，荧光团)可对应于核苷酸碱基(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允许对核苷酸碱基的检测和识别。在一些实施例中，该多个核苷酸中的核苷酸中的至少一个核苷酸未用可检测报道基因部分标记。在一些实施例中，该多个核苷酸用可检测报道基因部分标记。
在一些实施例中，测序方法进一步包括步骤(h)：当核苷酸用可检测报道基因部分标记时，步骤(h)包括检测掺入核苷酸复合聚合酶的引物中的互补核苷酸。在一些实施例中，该多个核苷酸用可检测报道基因部分标记以允许检测。在一些实施例中，在对串联体分子进行测序的方法中，当核苷酸未被标记时，则省略检测步骤。
在一些实施例中，测序方法进一步包括步骤(i)：当核苷酸用可检测报道基因部分标记时，步骤(i)包括识别掺入核苷酸复合聚合酶的引物中的互补核苷酸的碱基。在一些实施例中，步骤(i)中识别掺入的互补核苷酸可用于确认结合至步骤(d)中的多个第一复合聚合酶的多价分子的互补核苷酸的身份。在一些实施例中，步骤(i)的识别可用于确定核酸串联体分子的序列。在一些实施例中，在对串联体分子进行测序的方法中，当核苷酸未被标记时，则省略识别步骤。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(j)：当通过使多个第二复合聚合酶与包含至少一个具有2'和/或3'链终止部分的核苷酸的多个核苷酸接触来进行步骤(g)时，从经掺入的核苷酸中移除链终止部分。
在一些实施例中，用于测序的方法进一步包括步骤(k)：重复步骤(a)至(j)至少一次。在一些实施例中，核酸串联体分子的序列可以通过在步骤(c)和(d)中检测和识别结合测序聚合酶但不掺入引物的3'端的多价分子来确定。在一些实施例中，核酸串联体分子的序列可以通过检测和识别在步骤(h)和(i)中掺入引物3'端的核苷酸来确定(或确认)。
在一些实施例中，在用于对核酸分子进行测序的任何方法中，使多个第一复合聚合酶与多个多价分子结合，形成至少一个亲合力复合物，该方法包括以下步骤：(a)使第一核酸引物、第一测序聚合酶和第一多价分子与串联体模板分子的第一部分结合，由此形成第一结合复合物，其中第一多价分子的第一核苷酸单元结合至第一测序聚合酶；以及(b)将第二核酸引物、第二测序聚合酶和第一多价分子与同一串联体模板分子的第二部分结合，由此形成第二结合复合物，其中第一多价分子的第二核苷酸单元与第二测序聚合酶结合，其中包括同一多价分子的第一结合复合物和第二结合复合物形成亲合力复合物。在一些实施例中，第一测序聚合酶包括本文所述的任何野生型或突变型聚合酶。在一些实施例中，第二测序聚合酶包含本文所述的任何野生型或突变聚合酶。串联体模板分子包含目的序列和至少一个通用测序引物结合位点的串联重复序列。第一核酸引物和第二核酸引物可沿串联体模板分子与测序引物结合位点结合。图2至6中示出了示例性多价分子。
在一些实施例中，在用于对核酸分子进行测序的任何方法中，其中该方法包括将多个第一复合聚合酶与多个多价分子结合，以形成至少一个亲合力复合物，该方法包括以下步骤：(a)使多个测序聚合酶和多个核酸引物与串联体核酸串联体分子的不同部分接触，以在同一串联体模板分子上形成至少第一和第二复合聚合酶；(b)在适用于将来自多个多价分子的单个多价分子与第一复合聚合酶和第二复合聚合酶结合的条件下，使多个多价分子与同一串联体模板分子上的至少第一复合聚合酶和第二复合聚合酶接触，其中单个多价分子的至少第一核苷酸单元结合至第一复合聚合酶，该第一复合聚合酶包括与串联体模板分子的第一部分杂交的第一引物，由此形成第一结合复合物(例如，第一三元复合物)，并且其中单个多价分子的至少第二核苷酸单元结合至第二复合聚合酶，该第二复合聚合酶包括与串联体模板分子的第二部分杂交的第二引物，由此形成第二结合复合物(例如，第二三元复合物)，其中接触在适用于抑制结合的第一核苷酸单元和第二核苷酸单元经聚合酶催化掺入第一结合复合物和第二结合复合物中的条件下进行，并且其中与同一多价分子结合的第一结合复合物和第二结合复合物形成亲合力复合物；以及(c)检测同一串联体模板分子上的第一结合复合物和第二结合复合物，以及(d)识别第一结合复合物中的第一核苷酸单元，由此确定串联体模板分子的第一部分的序列，并且识别第二结合复合物中的第二核苷酸单元，由此确定串联体模板分子的第二部分的序列。在一些实施例中，多个测序聚合酶包含本文所述的任何野生型或突变型测序聚合酶。串联体模板分子包含目的序列和至少一个通用测序引物结合位点的串联重复序列。多个核酸引物可沿串联体模板分子与测序引物结合位点结合。图2至6中示出了示例性多价分子。
在一些实施例中，两阶段测序可以采用用荧光团标记的多价分子，并且检测和/或识别步骤包括使用荧光成像。在一些实施例中，荧光成像包括双波长激发/四波长发射荧光成像。在一些实施例中，采用了四种不同类型的多价分子，每种分子包括不同的核苷酸单元(或核苷酸单元类似物)。例如，第一种类型的多价分子包括dATP核苷酸单元，第二种类型的多价分子包括dGTP核苷酸单元，第三种类型的多价分子包括dCTP核苷酸单元，并且第四种类型的多价分子包括dTTP核苷酸单元。在一些实施例中，四种不同类型的多价分子均用不同的荧光团标记，该荧光团对应于附接至给定多价分子的核苷酸单元，以允许识别核苷酸单元。在一些实施例中，检测步骤包括在足以激发所有四个荧光团的波长下同时或单独激发，并且在足以检测每个相应的荧光团的波长下对荧光发射进行成像。在一些实施例中，四个经标记的多价分子用于确定核酸模板分子中的末端核苷酸的同一性。在一些实施例中，四种类型的多价分子用不同的荧光团标记，所述荧光团包含例如能发出诸如蓝色、绿色、黄色、橙色或红色等不同可见光颜色的荧光团。在一些实施例中，四种类型的多价分子用不同的荧光团标记，所述荧光团包含例如Cy2或激发或发射性质类似的染料或荧光团、Cy3或激发或发射性质类似的染料或荧光团、Cy3.5或激发或发射性质类似的染料或荧光团、Cy5或激发或发射性质类似的染料或荧光团、Cy5.5或激发或发射性质类似的染料或荧光团，以及Cy7或激发或发射性质类似的染料或荧光团。在一些实施例中，检测步骤包括在532nm、568nm和633nm中的任意两者下同时激发，并且分别在约570nm、592nm、670nm和702nm下对荧光发射进行成像。在一些实施例中，荧光成像包括双波长激发/双波长发射荧光成像。在一些实施例中，四种不同类型的多价分子均用可区分的荧光团(或荧光团的集合)标记，并且检测步骤包括在足以激发一个、两个、三个或四个荧光团或荧光团的集合的波长下同时或单独激发，以及在足以检测每个相应的荧光团的波长下对荧光发射进行成像。
在一些实施例中，两阶段测序方法可以使用三种不同类型的经标记的多价分子和一种类型的未经标记的多价分子(例如，“暗”多价分子)进行，其中经标记的多价分子用不同的荧光团标记，该荧光团对应于附接至给定多价分子的核苷酸单元，以允许识别核苷酸单元。在一些实施例中，检测步骤包括在足以激发三种类型的荧光团的波长下同时激发，并且在足以检测每个相应的荧光团的波长下对荧光发射进行成像，并且参考“暗”或未经标记的点的位置来确定或可确定第四种类型的多价分子的检测。
在一些实施例中，荧光团包括FRET供体和受体对，使得可以在单个激发和成像步骤下执行多次检测和识别。在一些实施例中，测序循环包括形成多个复合聚合酶，使所述复合聚合酶与多种不同类型的经以荧光方式标记的多价分子接触，并且检测结合至复合聚合酶的经以荧光方式标记的多价分子。在一些实施例中，测序循环可以在小于30分钟内、小于20分钟内或小于10分钟内进行。在一些实施例中，用经标记的多价分子进行测序反应给出了测序运行中碱基调用准确性的平均Q评分，所述平均Q评分大于或等于30，和/或大于或等于40。在一些实施例中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的碱基调用的Q评分大于30和/或大于等于40。在一些实施例中，本公开提供了所述方法，在本文中，至少95％的碱基调用的Q评分大于30。
结合测序方法
在一些方面，本公开提供了用于对本文所述的任何固定的串联体分子进行测序的方法，其中测序方法包括采用未标记的链终止核苷酸的结合测序(SBB)程序。在一些实施例中，结合测序(SBB)方法包括步骤(a)在使三元复合物稳定的条件下，依次使引发的模板核酸与至少两种单独的混合物接触，其中所述至少两种单独的混合物各自包括聚合酶和核苷酸，由此顺序接触导致引发的模板核酸在三元复合物稳定条件下与模板中第一、第二和第三碱基类型同源的碱基类型的核苷酸接触；(b)检查至少两种单独的混合物以确定是否形成三元复合物；以及(c)识别引发的模板核酸分子的下一个正确核苷酸，其中如果在步骤(b)中检测到三元复合物，则下一个正确核苷酸被识别为第一碱基类型、第二碱基类型或第三碱基类型的同源物，并且其中如果步骤(b)中不存在三元复合物，将下一个正确的核苷酸推算为第四碱基类型的核苷酸同源物；(d)在步骤(b)之后将下一个正确的核苷酸添加到引发的模板核酸的引物中，由此产生延伸的引物；以及(e)对包含延伸引物的引发的模板核酸重复步骤(a)至(d)至少一次。示例性的结合测序方法描述于美国专利第10,246,744号和第10,731,141号(其中这两个专利的内容通过引用整体并入本文中)。用于使用经磷酸酯链标记的核苷酸进行测序的方法
本公开提供了用于对本文所述的固定的串联体分子中的任何固定的串联体分子进行测序的方法，其中该测序方法包括用磷酸酯链标记的核苷酸进行测序，包括步骤(a):使(i)多个测序聚合酶、(ii)固定至支持物的多个串联体模板分子和(iii)多个核酸测序引物(例如，正向或反向测序引物)接触，其中该接触在适合于形成多个复合测序聚合酶的条件下进行，每种复合物包含结合至核酸双链体的测序聚合酶，其中核酸双链体包含与核酸测序引物杂交的串联体模板分子的一部分。在一些实施例中，测序聚合酶包括可以结合并掺入核苷酸类似物的重组突变体测序聚合酶。在一些实施例中，测序聚合酶固定至与串联体相同的支持物。在一些实施例中，测序聚合酶未固定至支持物。在一些实施例中，测序引物包含3'可延伸端或可转化为3'可延伸端的3'封闭端。
在一些实施例中，用于对串联体模板分子进行测序的方法进一步包括步骤(b)：在适合于将至少一个磷酸酯链标记的核苷酸与复合测序聚合酶中的一个复合测序聚合酶结合的条件下，使多个复合测序聚合酶与多个磷酸酯链标记的核苷酸接触，并且该条件适合于促进聚合酶催化的核苷酸掺入。在一些实施例中，在至少一种包含镁和/或锰的催化阳离子的存在下，使复合测序聚合酶与多个核苷酸接触。在一些实施例中，多个磷酸酯链标记的核苷酸中的单独的磷酸酯链标记的核苷酸包含芳香族碱基、五碳糖(例如，核糖或脱氧核糖)和包含3至20个(例如，约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个磷酸酯基团)磷酸酯基团的磷酸酯链，其中末端磷酸酯基团链接至可检测报道基因部分(例如，荧光团)。第一磷酸酯基团、第二磷酸酯基团和第三磷酸酯基团可以被称为α、β和γ磷酸酯基团。在一些实施例中，附接至末端磷酸酯基团的特定可检测报道基因部分对应于核苷酸碱基(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)，以允许检测和识别核碱基。在一些实施例中，测序聚合酶能够与经互补磷酸酯链标记的核苷酸结合，并掺入与模板分子中的核苷酸相对的互补核苷酸。在一些实施例中，聚合酶催化的核苷酸掺入反应在α和β磷酸酯基团之间裂解，从而释放链接至可检测报道基因部分的多磷酸酯链。在一些实施例中，多个磷酸酯链标记的核苷酸包括包含dATP、dGTP、dCTP、dTTP和/或dUTP的一种类型或任何两种或更多种类型的核苷酸的混合物。
在一些实施例中，测序方法进一步包括步骤(c)：检测由经磷酸酯链标记的核苷酸发出的荧光信号，该经磷酸酯链标记的核苷酸由测序聚合酶结合并且掺入到测序引物的末端中。在一些实施例中，步骤(c)进一步包括识别由测序聚合酶结合并掺入到测序引物的末端中的经磷酸酯链标记的核苷酸。
在一些实施例中，测序方法进一步包括步骤(d)：重复步骤(b)至(c)至少一次。在一些实施例中，采用经磷酸酯链标记的核苷酸的测序方法可以根据美国专利第7,170,050号；第7,302,146号；和/或第7,405,281号中描述的方法进行。
在一些实施例中，在步骤(a)中，将多个串联体模板分子固定至包含多个单独的隔室的支持物。在一些实施例中，多个测序聚合酶处于隔室中的溶液中。在一些实施例中，至少一个测序聚合酶固定至单独的隔室的底部。在一些实施例中，单独的隔室包括光可以穿透的二氧化硅底部。在一些实施例中，单独的隔室包括配置有包括金属包覆膜(例如，铝包覆膜)中的孔的纳米光子限制结构的二氧化硅底部。在一些实施例中，金属包覆中的孔的小孔径是例如大约70nm。在一些实施例中，纳米光子限制结构的高度是大约100nm。在一些实施例中，纳米光子限制结构包括零模式波导(ZMW)。在一些实施例中，纳米光子限制结构含有液体。
在一些实施例中，共价闭合环状文库分子(600)可以充当非固定的模板分子。在一些实施例中，测序方法包括步骤(a)：提供其上固定有多个测序聚合酶的支持物。在一些实施例中，测序聚合酶包括持续性DNA聚合酶。在一些实施例中，测序聚合酶包含野生型或突变体DNA聚合酶，包括例如Phi29 DNA聚合酶。在一些实施例中，支持物包括多个单独的隔室，并且测序聚合酶固定到隔室的底部。在一些实施例中，单独的隔室包括光可以穿透的二氧化硅底部。在一些实施例中，单独的隔室包括配置有包括金属包覆膜(例如，铝包覆膜)中的孔的纳米光子限制结构的二氧化硅底部。在一些实施例中，金属包覆中的孔的小孔径是例如大约70nm。在一些实施例中，纳米光子限制结构的高度是大约100nm。在一些实施例中，纳米光子限制结构包括零模式波导(ZMW)。在一些实施例中，纳米光子限制结构含有液体。
在一些实施例中，测序方法进一步包括步骤(b)：在适合于单独的固定的测序聚合酶与单链环状模板分子(例如，共价闭合环状文库分子(600))结合和适合于单独的测序引物与单独的单链环状模板分子杂交的条件下，使多个固定的测序聚合酶与多个单链环状核酸模板分子和多个寡核苷酸测序引物接触，由此产生多个聚合酶/模板/引物复合物。在一些实施例中，单独的测序引物与单链环状模板分子上的通用测序引物结合位点杂交。
在一些实施例中，测序方法进一步包括步骤(c)：使多个聚合酶/模板/引物复合物与多个经磷酸酯链标记的核苷酸接触，每个经磷酸酯链标记的核苷酸包括芳香族碱基、五碳糖(例如，核糖或脱氧核糖)和包括3至20个磷酸酯基团的磷酸酯链，其中末端磷酸酯基团链接至可检测报道基因部分(例如，荧光团)。第一磷酸酯基团、第二磷酸酯基团和第三磷酸酯基团可以被称为α、β和γ磷酸酯基团。在一些实施例中，附接至末端磷酸酯基团的特定可检测报道基因部分对应于核苷酸碱基(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)，以允许检测和识别核碱基。在一些实施例中，在适合于聚合酶催化的核苷酸掺入的条件下，使多个聚合酶/模板/引物复合物与多个经磷酸酯链标记的核苷酸接触。在一些实施例中，测序聚合酶能够与经互补磷酸酯链标记的核苷酸结合，并掺入与模板分子中的核苷酸相对的互补核苷酸。在一些实施例中，聚合酶催化的核苷酸掺入反应在α磷酸酯基团与β磷酸酯基团之间切割，由此释放链接至荧光团的多磷酸酯链。
在一些实施例中，测序方法进一步包括步骤(d)：检测由经磷酸酯链标记的核苷酸发出的荧光信号，所述经磷酸酯链标记的核苷酸由测序聚合酶结合并且掺入到测序引物的末端中。在一些实施例中，步骤(d)进一步包含识别由测序聚合酶结合并掺入到测序引物的末端中的经磷酸酯链标记的核苷酸。
在一些实施例中，测序方法进一步包括步骤(d)：重复步骤(c)至(d)至少一次。在一些实施例中，采用经磷酸酯链标记的核苷酸的测序方法可以根据美国专利第7,170,050号；第7,302,146号；和/或第7,405,281号中描述的方法进行。
测序聚合酶
在本文所述的方法中的任一种方法中，测序聚合酶可以用于进行测序反应。在一些实施例中，测序聚合酶能够结合并掺入与串联体模板分子中的核苷酸相对的互补核苷酸。在一些实施例中，测序聚合酶能够结合与串联体模板分子中的核苷酸相对的多价分子的互补核苷酸单元。在一些实施例中，多个测序聚合酶包括重组突变体聚合酶。
用于以核苷酸和/或多价分子测序的合适聚合酶的实例包括但不限于：KlenowDNA聚合酶；水栖栖热菌DNA聚合酶I(Taq聚合酶)；KlenTaq聚合酶；Candidatusaltiarchaeales古菌；Candidatus HadarchaeumYellowstonense；Hadesarchaea古菌；广古菌(Euryarchaeota)古菌；热原体古菌；嗜热球菌聚合酶，诸如Thermococcus litoralis、噬菌体T7 DNA聚合酶；人类α、δ和εDNA聚合酶；噬菌体聚合酶，诸如T4、RB69和phi29噬菌体DNA聚合酶；激烈火球菌DNA聚合酶(Pfu聚合酶)；枯草芽孢杆菌DNA聚合酶III；大肠杆菌DNA聚合酶IIIα和ε；9度N聚合酶；逆转录酶，诸如HIV M型或O型逆转录酶；禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶；莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶；或端粒酶。DNA聚合酶的另外的非限制性实例包括来自各种古生菌属(诸如气热菌属、Archaeglobus、除硫球菌属、火棒菌属、火球菌属、火叶菌属、热网菌属、葡萄嗜热菌属、斯特氏菌属、硫化叶菌属、热球菌属和火山鬃菌属等等或其变体)的那些，包括如本领域中已知的此类聚合酶，诸如9度N、VENT、DEEP VENT、THERMINATOR、Pfu、KOD、Pfx、Tgo和RB69聚合酶。
核苷酸和链终止核苷酸
在本文所述的方法中的任一种方法中，本文所述的测序方法中的任一种测序方法可以采用至少一个核苷酸。核苷酸包括碱基、糖和至少一个磷酸酯基团。在一些实施例中，该多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含芳香族碱基、五碳糖(例如，核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸酯基团(例如，1至10个磷酸酯基团)。该多个核苷酸可包括选自由以下项组成的组的至少一种类型的核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。该多个核苷酸可包括选自由以下项组成的组的两个或更多个类型的核苷酸的任意组合的混合物：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和/或dUTP。在一些实施例中，该多个核苷酸中的至少一个核苷酸不是核苷酸类似物。在一些实施例中，该多个核苷酸中的至少一个核苷酸包括核苷酸类似物。
在一些实施例中，在本文所述的用于测序的方法中的任一种方法中，多个核苷酸中的至少一个核苷酸包含一个、两个或三个磷原子的链，其中所述链通常通过酯或磷酰胺键附接至糖部分的5'碳。在一些实施例中，该多个核苷酸中的至少一个核苷酸为具有磷链的类似物，其中磷原子用居间的O、S、NH、亚甲基或亚乙基而链接在一起。在一些实施例中，链中的磷原子包括经取代的侧基，包括O、S或BH3。在一些实施例中，链包含用类似物取代的磷酸酯基团，包括磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和O-甲基亚磷酰胺基团。
在一些实施例中，在本文所述用于测序的任何方法中，多个核苷酸中的至少一个核苷酸包括终止子核苷酸类似物，其在糖2'位置处、在糖3'位置处、或在糖2'和3'位置处具有链终止部分(例如，阻断部分)。在一些实施例中，链终止部分可抑制引物延伸反应期间后续核苷酸单元或游离核苷酸在新生链中的聚合酶催化掺入。在一些实施例中，链终止部分附接至3'糖羟基位置，其中糖包括核糖或脱氧核糖部分。在一些实施例中，链终止部分可从3'糖团羟基位置移除/裂解以生成具有3'OH糖基团的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸掺入反应中用后续核苷酸延伸。在一些实施例中，链终止部分包含烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫代基团、二硫化物基团、碳酸基团、脲基团、缩醛基或甲硅烷基基团。在一些实施例中，链终止部分可从核苷酸裂解/移除，例如通过用化学剂、pH变化、光或热使链终止部分发生反应。在一些实施例中，链终止部分烷基、烯基、炔基和烯丙基可用四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)与哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些实施例中，链终止部分芳基和苄基可用H2 Pd/C裂解。在一些实施例中，链终止部分胺、酰胺、酮、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可用膦或用硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))裂解。在一些实施例中，链终止部分碳酸酯可用MeOH中的碳酸钾(K2CO3)、用吡啶中的三乙胺或用乙酸(AcOH)中的Zn裂解。在一些实施例中，链终止部分脲和甲硅烷基可用四丁基氟化铵、吡啶-HF、用氟化铵或用三乙胺三氢氟酸盐裂解。
在一些实施例中，在本文所述用于测序的任何方法中，多个核苷酸中的至少一个核苷酸包括终止子核苷酸类似物，其在糖2'位置处、在糖3'位置处、或在糖2'和3'位置处具有链终止部分(例如，阻断部分)。在一些实施例中，链终止部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团。在一些实施例中，链终止部分包括3'-O-叠氮基或3'-O-叠氮基甲基基团。在一些实施例中，链终止部分叠氮化物、叠氮基和叠氮基甲基基团可用膦化合物裂解/移除。在一些实施例中，膦化合物包括衍生的三烷基膦部分或衍生的三芳基膦部分。在一些实施例中，膦化合物包括：三(2-羧乙基)膦(TCEP)、或双磺基三苯基膦(BS-TPP)、或三(羟丙基)膦(THPP)。在一些实施例中，裂解剂包括4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)。
在一些实施例中，在本文所述用于对测序的任何方法中，核苷酸包含链终止部分，其选自由以下项组成的组：3'-脱氧核苷酸、2',3'-双脱氧核苷酸、3'-甲基、3'-叠氮基、3'-叠氮基甲基、3'-O-叠氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-氨基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺酰基、3'-丙二酰基、3'-氨基、3'-O-氨基、3'-巯基、3'-氨基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-叔丁基、3'-芴基甲氧基羰基、3'叔-丁氧基羰基、3'-O-烷基羟氨基、3'-硫代磷酸酯和3-O-苄基、或其衍生物。
在一些实施例中，在本文所述的用于测序的方法中的任一种方法中，多个核苷酸包含用可检测报道基因部分标记的多个核苷酸。可检测报道基因部分包括荧光团。在一些实施例中，荧光团附接至核苷酸碱基。在一些实施例中，荧光团用可从碱基裂解/移除的接头附接至核苷酸碱基。在一些实施例中，该多个核苷酸中的核苷酸中的至少一个核苷酸未用可检测报道基因部分标记。在一些实施例中，附接至核苷酸的特定可检测报道基因部分(例如，荧光团)可对应于核苷酸碱基(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)以允许对核苷酸碱基的检测和识别。
在一些实施例中，在本文所述用于对核酸分子进行测序的任何方法中，核苷酸碱基上的可裂解接头包含可裂解部分，其包含烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫代基团、二硫基团、碳酸酯基团、脲基团、缩醛基或甲硅烷基基团。在一些实施例中，通过用化学剂、pH变化、光或热使可裂解部分发生反应，碱基上的可裂解接头可从碱基裂解/移除。在一些实施例中，可裂解部分烷基、烯基、炔基和烯丙基可用四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)与哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些实施例中，可裂解部分芳基和苄基可用H2 Pd/C裂解。在一些实施例中，可裂解部分胺、酰胺、酮、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可用膦或用包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)的硫醇基团裂解。在一些实施例中，可裂解部分碳酸酯可用MeOH中的碳酸钾(K2CO3)、用吡啶中的三乙胺或用乙酸(AcOH)中的Zn裂解。在一些实施例中，可裂解部分脲和甲硅烷基可用四丁基氟化铵、吡啶-HF、用氟化铵或用三乙胺三氢氟酸盐裂解。
在一些实施例中，在本文所述的用于测序的方法中的任一种方法中，核苷酸碱基上的可切割接头包含可切割部分，该可切割部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基。在一些实施例中，可裂解部分叠氮化物、叠氮基和叠氮基甲基基团可用膦化合物裂解/移除。在一些实施例中，膦化合物包括衍生的三烷基膦部分或衍生的三芳基膦部分。在一些实施例中，膦化合物包括：三(2-羧乙基)膦(TCEP)、或双磺基三苯基膦(BS-TPP)、或三(羟丙基)膦(THPP)。在一些实施例中，裂解剂包括4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)。
在一些实施例中，在本文所述的用于测序的方法中的任一种方法中，链终止部分(例如，在糖2'和/或糖3'定位处)和核苷酸碱基上的可切割接头具有相同或不同的可切割部分。在一些实施例中，链接至碱基的链终止部分(例如，在糖2'和/或糖3'位置处)和可检测报道基因部分可用相同化学剂化学裂解/移除。在一些实施例中，链接至碱基的链终止部分(例如，在糖2'和/或糖3'位置处)和可检测报道基因部分可用不同化学剂化学裂解/移除。
多价分子
在本文所述的方法中的任一种方法中，测序采用至少一种多价分子，该多价分子包括附接至核的多个核苷酸臂并且具有任何构型，包括星爆型、螺旋型或瓶刷构型(例如，图2)。在一些实施例中，该多价分子包含：(1)核；以及(2)多个核苷酸臂，其包含：(i)核附接部分，(ii)包含PEG部分的间隔区，(iii)接头，和(iv)核苷酸单元，其中核附接至多个核苷酸臂，其中间隔基附接至接头，其中接头附接至核苷酸单元。在一些实施例中，核苷酸单元包含碱基、糖和至少一个磷酸酯基团，并且接头通过碱基附接至核苷酸单元。在一些实施例中，接头包含脂族链或低聚乙二醇链，其中两个接头链均具有2至6个亚基。在一些实施例中，接头也包含芳香族部分。图6中示出了示例性核苷酸臂。图2至5中示出了示例性多价分子。示例性间隔区示于图7中(顶部)，并且示例性接头示于图7(底部)和图8中。图9A至9D中示出了附接至接头的示例性核苷酸。图10中示出了示例性生物素化核苷酸臂。
在一些实施例中，多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核，并且其中多个核苷酸臂具有选自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP组成的组的相同类型的核苷酸单元。
在一些实施例中，多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核，其中每个臂包括核苷酸单元。在一些方面，该多核苷酸单元包括芳香族碱基、五碳糖(例如，核糖或脱氧核糖)以及一个或多个磷酸酯基团(例如，1至10个磷酸酯基团)。该多个多价分子可包括具有选自由以下项组成的组的一种类型的核苷酸单元的一种类型的多价分子：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。该多个多价分子可包括两个或更多个类型的多价分子的任意组合的混合物，其中混合物中的单独的多价分子包含选自由以下项组成的组的核苷酸单元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和/或dUTP。
在一些实施例中，核苷酸单元包含一个、两个或三个磷原子的链，其中该链通常经由酯键或磷酰胺键附接至糖部分的5'碳。在一些实施例中，至少一个核苷酸单元为具有磷链的核苷酸类似物，其中磷原子用居间的O、S、NH、亚甲基或亚乙基而链接在一起。在一些实施例中，链中的磷原子包括经取代的侧基，包括O、S或BH3。在一些实施例中，链包含用类似物取代的磷酸酯基团，包括磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和O-甲基亚磷酰胺基团。
在一些实施例中，多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核，并且其中单独的核苷酸臂包含核苷酸单元，该核苷酸单元是在糖2'位置处、在糖3'位置、或糖2'和3'位置处具有链终止部分(例如，阻断部分)的核苷酸类似物。在一些实施例中，核苷酸单元包含在糖2'位置处、在糖3'位置处或在糖2'和3'位置处的链终止部分(例如，阻断部分)。在一些实施例中，链终止部分可抑制引物延伸反应期间后续核苷酸单元或游离核苷酸在新生链中的聚合酶催化掺入。在一些实施例中，链终止部分附接至3'糖羟基位置，其中糖包括核糖或脱氧核糖部分。在一些实施例中，链终止部分可从3'糖团羟基位置移除/裂解以生成具有3'OH糖基团的核苷酸，其可在聚合酶催化的核苷酸掺入反应中用后续核苷酸延伸。在一些实施例中，链终止部分包含烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮基团、胺基团、酰胺基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫代基团、二硫化物基团、碳酸基团、脲基团、缩醛基或甲硅烷基基团。在一些实施例中，链终止部分可从核苷酸单元切割/移除，例如通过用化学剂、pH变化、光或热使链终止部分反应。在一些实施例中，链终止部分烷基、烯基、炔基和烯丙基可用四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4)与哌啶或用2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(DDQ)裂解。在一些实施例中，链终止部分芳基和苄基可用H2 Pd/C裂解。在一些实施例中，链终止部分胺、酰胺、酮、异氰酸酯、磷酸酯、硫、二硫化物可用膦或用硫醇基团(包括β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT))裂解。在一些实施例中，链终止部分碳酸酯可用MeOH中的碳酸钾(K2CO3)、用吡啶中的三乙胺或用乙酸(AcOH)中的Zn裂解。在一些实施例中，链终止部分脲和甲硅烷基可用四丁基氟化铵、吡啶-HF、用氟化铵或用三乙胺三氢氟酸盐裂解。
在一些实施例中，核苷酸单元包含在糖2'位置处、在糖3'位置处或在糖2'和3'位置处的链终止部分(例如，阻断部分)。在一些实施例中，链终止部分包括叠氮化物、叠氮基或叠氮基甲基基团。在一些实施例中，链终止部分包括3'-O-叠氮基或3'-O-叠氮基甲基基团。在一些实施例中，链终止部分叠氮化物、叠氮基和叠氮基甲基基团可用膦化合物裂解/移除。在一些实施例中，膦化合物包括衍生的三烷基膦部分或衍生的三芳基膦部分。在一些实施例中，膦化合物包括：三(2-羧乙基)膦(TCEP)、或双磺基三苯基膦(BS-TPP)、或三(羟丙基)膦(THPP)。在一些实施例中，裂解剂包括4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)。
在一些实施例中，核苷酸单元包含选自由以下项组成的组的链终止部分：3'-脱氧核苷酸、2',3'-二脱氧核苷酸、3'-甲基、3'-叠氮基、3'-叠氮基甲基、3'-O-叠氮基烷基、3'-O-乙炔基、3'-O-氨基烷基、3'-O-氟烷基、3'-氟甲基、3'-二氟甲基、3'-三氟甲基、3'-磺酰基、3'-丙二酰基、3'-氨基、3'-O-氨基、3'-巯基、3'-氨基甲基、3'-乙基、3'丁基、3'-叔丁基、3'-芴基甲氧基羰基、3'叔丁氧基羰基、3'-O-烷基羟基氨基基团、3'-硫代磷酸酯和3-O-苄基或其衍生物。
在一些实施例中，多价分子包含附接至多个核苷酸臂的核，其中核苷酸臂包含间隔区、接头和核苷酸单元，并且其中核、接头和/或核苷酸单元用可检测报道基因部分标记。在一些实施例中，可检测报道基因部分包括荧光团。在一些实施例中，附接至多价分子的特定可检测报道基因部分(例如，荧光团)可对应于核苷酸单元的碱基(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)，以允许对核苷酸碱基的检测和识别。
在一些实施例中，多价分子的至少一个核苷酸臂具有附接至可检测报道基因部分的核苷酸单元。在一些实施例中，可检测报道基因部分附接至核苷酸碱基。在一些实施例中，可检测报道基因部分包括荧光团。在一些实施例中，附接至多价分子的特定可检测报道基因部分(例如，荧光团)可对应于核苷酸单元的碱基(例如，dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP)，以允许对核苷酸碱基的检测和识别。
在一些实施例中，多价分子的核包含亲和素样或链霉亲和素样部分，并且核附接部分包含生物素。在一些实施例中，核包含链霉亲和素型或亲和素型部分，其包括亲和素蛋白，以及可以与至少一个生物素部分结合的亲和素的任何衍生物、类似物和其他非天然形式。其他形式的亲和素部分包括天然和重组亲和素和链霉亲和素以及衍生分子，例如非糖基化亲和素和截短的链霉亲和素。例如，亲和素部分可包括亲和素的去糖基化形式、由链霉菌属(例如，阿维丁链霉菌)产生的细菌链霉亲和素，以及衍生形式，例如N-酰基亲和素，例如N-乙酰基、N-邻苯二甲酰基和N-琥珀酰基亲和素，以及市售产品EXTRAVIDINTM、CAPTAVIDINTM、NEUTRAVIDINTM和NEUTRALITE AVIDINTM。
在一些实施例中，本文所述用于对核酸分子进行测序的任何方法可包括形成结合复合物，其中结合复合物包含(i)聚合酶、与引物形成双链体的核酸串联体分子和核苷酸，或结合复合物包含(ii)聚合酶、与引物形成双链体的核酸串联体分子和多价分子的核苷酸单元。在一些实施例中，结合复合物的存留时间大于约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1秒。结合复合物的存留时间大于约0.1至0.25秒、或约0.25至0.5秒、或约0.5至0.75秒、或约0.75至1秒、或约1至2秒、或约2至3秒、或约3至4秒、或约4至5秒，和/或其中所述方法在或可以在以下温度下进行：处于或高于15℃、处于或高于20℃、处于或高于25℃、处于或高于35℃、处于或高于37℃、处于或高于42℃、处于或高于55℃、处于或高于60℃、或处于或高于72℃、或处于或高于80℃，或在由前述中任一者限定的范围内。结合复合物(例如，三元复合物)在经受导致聚合酶、模板分子、引物和/或核苷酸单元或核苷酸中的任一者之间的相互作用的离解的条件之前保持稳定。例如，离解条件包括：使结合复合物与去污剂、EDTA和/或水中的任一者或它们的任意组合接触。在一些实施例中，本公开提供了所述方法，其中结合复合物沉积在、附接至或杂交至在检测步骤中表现出大于20的对比度噪声比的表面。在一些实施例中，本公开提供了所述方法，其中在当核苷酸或核苷酸单元与模板核酸的下一个碱基互补时使结合复合物稳定，并且当核苷酸或核苷酸单元与模板核酸的下一个碱基不互补时使结合复合物不稳定的条件下进行接触。
自动化模式
在本文所述的方法中的任一种方法中，用于制备空间分辨核酸的步骤的任意组合可以使用流体分配系统以自动化模式进行，包括细胞接种、细胞固定、细胞透化、逆转录反应、环化寡核苷酸杂交、环化寡核苷酸连接反应、滚环扩增和测序。
在一些实施例中，细胞样品沉积在流动池(例如，支持物上)。流通池可以被涂覆有促进细胞粘附或粘附到流通池的试剂。其上粘附有细胞样品的流动池可以放置在具有流动池保持器/支架的测序装置上，该流动池保持器/支架流体连接至自动流体分配系统并配置在荧光显微镜上。在一些实施例中，测序装置可被配置有至少一个流体递送装置、至少一个流体装置(例如，微流体装置)、至少一个成像装置和/或至少一个传感器以检测来自测序反应的信号。
在一些实施例中，自动流体分配系统可用于将固定试剂递送至流动池上的细胞样品，并且细胞样品可在适合于细胞固定的条件下孵育。
在一些实施例中，自动流体分配系统可用于将透化试剂递送至流动池上的固定细胞样品，并且细胞样品可在适合于细胞透化的条件下孵育。
在一些实施例中，自动流体分配系统可用于在适合于产生固定至流动池的多个cDNA的条件下递送用于在流动池上进行RNA逆转录的试剂。
在一些实施例中，自动流体分配系统可用于递送用于在适合于在流动池上产生多个共价闭合环状分子的条件下进行环化寡核苷酸杂交和连接的试剂。
在一些实施例中，自动流体分配系统可用于递送用于在适合于产生固定至流动池的多个串联体分子的条件下进行滚环扩增的试剂。
在一些实施例中，自动流体分配系统可用于递送用于在适合于在流动池上产生多个测序读数产物的条件下进行串联体分子的测序循环的测序试剂。在一些实施例中，单独的循环时间可以在少于30分钟内实现。在一些实施例中，视场(FOV)可以超过1mm2并且用于扫描大区域(＞10mm2)的循环时间可以少于5分钟。
在一些实施例中，自动流体分配系统可用于递送试剂以从串联体分子移除多个测序读数产物并将串联体分子保留在流动池上。
支持物和低非特异性涂层
在一些方面，本公开提供了成对测序组合物和方法，该组合物和方法采用包含在其上被固定的多个寡核苷酸表面引物的支持物。在一些实施例中，用低非特异性结合涂层使支持物钝化。在一些实施例中，本文所述的表面涂层表现出与通常用于核酸捕获、扩增和测序工作流程的试剂(诸如染料、核苷酸、酶和核酸引物)的非常低非特异性结合。表面涂层可表现出与常规表面涂层相比的低背景荧光信号或高对比度噪声(CNR)比。
在一些实施例中，低非特异性结合涂层包括一个层或多个层(图1)。在一些实施例中，多个表面引物固定到低非特异性结合涂层。在一些实施例中，至少一种表面引物嵌入在低非特异性结合涂层内。在一些实施例中，低非特异性结合涂层实现具有改善的核酸杂交和扩增性能。在一些实施例中，支持物包含底物(或支持结构)、共价或非共价附接的低结合化学修饰层的一个或多个层(例如，硅烷层、聚合物膜)、以及可用于将单链核酸文库分子拴系至支持物的一个或多个共价或非共价附接的表面引物。在一些实施例中，涂层的配制(例如，一个或多个层的化学组成、用于将该一个或多个层与支持物和/或与彼此交联的偶联化学、以及层的总数)可进行变化，使得蛋白质、核酸分子以及其他杂交和扩增反应组分与涂层的非特异性结合相对于可比较的单层被最小化或减少。本文所述的涂层的配制可进行变化，使得涂层上的非特异性杂交相对于可比较的单层被最小化或减少。涂层的配制可进行变化，使得涂层上的非特异性扩增相对于可比较的单层被最小化或减少。涂层的配制可进行变化，使得涂层上的特定扩增率和/或产量被最大化。在本文所公开的一些情况下，适合于检测的扩增水平在不超过2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个或超过30个扩增循环中被实现。
包含该一个或多个经化学修饰的层(例如，低非特异性结合聚合物的层)的支持结构可以为独立的或被集成到另一结构或组件中。例如，在一些实施例中，支持结构可包括集成式或组装式微流体流动池内的一个或多个表面。支持结构可包括微板形式内的一个或多个表面，例如，微板中的孔的底表面。在一些实施例中，支持结构包括毛细管的内表面(诸如内腔表面)。在一些实施例中，支持结构包括蚀刻到平面芯片中的毛细管的内表面(诸如内腔表面)。
用于将第一经化学修饰的层接枝至支持物的表面的附接化学通常将取决于从其制造表面的材料和层的化学性质两者。在一些实施例中，第一层可共价附接至表面。在一些实施例中，第一层可通过支持物与第一层的分子组分之间的非共价相互作用(诸如静电相互作用、氢键或范德华相互作用)而非共价附接(例如，吸附)至支持物。在任一情况下，可在第一层的附接或沉积之前处理支持物。本领域技术人员已知的多种表面制备技术中的任一者可用于清洁或处理表面。例如，可使用Piranha溶液(硫酸(H2SO4)和过氧化氢(H2O2)的混合物)对玻璃或硅表面进行酸洗，在KOH和NaOH中进行碱处理，和/或使用氧等离子体处理方法进行清洁。
硅烷化学构成了非限制性方法，用于共价修饰玻璃或硅表面上的硅烷醇基团以附接更多反应性官能团(例如，胺或羧基)，然后可用于将连接头分子(例如，各种长度的直链碳氢化合物分子，诸如C6、C12、C18碳氢化合物或直链聚乙二醇(PEG)分子)或层分子(例如，支化PEG分子或其他聚合物)偶联到表面。可用于产生所公开的低结合涂层中的任一者的合适的硅烷的实例包括但不限于：(3-氨丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、多种PEG-硅烷中的任一者(例如，包含1K、2K、5K、10K、20K等的分子量)、氨基-PEG硅烷(即，包含游离氨基官能团)、马来酰亚胺-PEG硅烷、生物素-PEG硅烷等等。
本领域技术人员已知的多种分子中的任一者(包括但不限于氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、其他单体或聚合物、或者其组合)可用于产生支持物上的该一个或多个经化学修饰的层，其中对所使用的组分的选择可进行变化以改变层的一个或多个性质，例如，官能团和/或经拴系的寡核苷酸引物的表面密度、层的亲水性/疏水性、或层的三三维性质(即，“厚度”)。可用于在任何所公开的涂层中产生低非特异性结合材料的一个或多个层的聚合物的实例包括但不限于：各种分子量和分支结构的聚乙二醇(PEG)、链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、葡聚糖、聚赖氨酸和聚赖氨酸共聚物、或其任意组合。可用于将材料的一个或多个层(例如，聚合物层)接枝至表面和/或使层彼此交联的缀合化学的实例包括但不限于：生物素-链霉亲和素相互作用(或其变体)、his标签-Ni/NTA缀合化学、甲氧基醚缀合化学、羧酸酯缀合化学、胺缀合化学、NHS酯、马来酰亚胺、硫醇、环氧树脂、叠氮化物、酰肼、炔烃、异氰酸酯和硅烷。
低非特异性结合表面涂层可被均匀地施加在支持物上。替代性地，表面涂层可被图案化，使得化学修饰层被限制于支持物的一个或多个离散区。例如，可以使用光刻技术对涂层进行图案化，以在支持物上产生经化学修饰的区的有序阵列或随机图案。替代性地或以组合方式，可使用例如接触印刷和/或喷墨印刷技术来对涂层进行图案化。在一些实施例中，经化学修饰的区的有序阵列或随机图案可包括至少1个、5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个、8000个、9000个或10,000个或更多个离散区。
在一些实施例中，低非特异性结合涂层包含非特异性地吸附或共价接枝至支持物的亲水性聚合物。通常，利用聚(乙二醇)(PEG，也被称为聚氧化乙烯(PEO)或聚氧乙烯)或带有不同的分子量和使用例如硅烷化学链接至支持物的端基团的其他亲水性聚合物来执行钝化。远离表面的端基团可包括但不限于：生物素、甲氧基醚、羧酸酯、胺、NHS酯、马来酰亚胺和双硅烷。在一些实施例中，亲水性聚合物(例如，线性聚合物、支链聚合物或多支链聚合物)的两个或更多个层可被沉积在表面上。在一些实施例中，两个或更多个层可以彼此共价偶联或内部交联以改善所得涂层的稳定性。在一些实施例中，具有不同的核苷酸序列和/或碱基修饰的表面引物(或其他生物分子，例如，酶或抗体)可以以各种表面密度拴系至所得层。在一些实施例中，例如，表面官能团密度和表面引物浓度两者可以变化以获得所期望的表面引物密度范围。此外，可通过用携带相同官能团的其他分子稀释表面引物来控制表面引物密度。例如但不限于，胺标记的表面引物可以在与NHS-酯涂覆的表面反应中用胺标记的聚乙二醇稀释，以降低最终的引物密度。杂交区与表面附接官能团之间带有接头的不同长度的表面引物也可被施加以控制表面密度。合适的接头的实例包括在引物的5'端处的poly-T链和poly-A链(例如，0至20个碱基，例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基)、PEG接头(例如，3至20个单体单元，例如，约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单体单元)和碳链(例如，C6、C12、C18等)。为了测量引物密度，可将经以荧光方式标记的引物拴系至表面，并且随后将荧光读段与针对已知浓度的染料溶液的荧光读段进行比较。
在一些实施例中，低非特异性结合涂层包括经由支持物上的化学基团至少共价结合至支持物的一部分的官能化聚合物涂层、接枝至官能化聚合物涂层的引物、以及引物上的水溶性保护涂层和官能化聚合物涂层。在一些实施例中，官能化聚合物涂层包含聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(PAZAM)。
为了缩放引物表面密度并且为亲水性或两性涂层添加附加的维度，已开发了包含PEG和其他亲水性聚合物的多层涂层的支持物。通过使用亲水性和两性表面分层方法(包括但不限于下文所述的聚合物/共聚物材料)，可以显著增加支持物上的引物负载密度。传统PEG涂层方法使用单层引物沉积，该方法已通常被报告用于单分子应用，但对于核酸扩增应用来说不产生高拷贝数。如本文所述，可使用传统交联方法与任何相容的聚合物或单体亚基来实现“分层”，使得可循序地构建包含两个或更多个高度交联的层的表面。合适的聚合物的实例包括但不限于：链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、葡聚糖、聚赖氨酸、以及聚赖氨酸和PEG的共聚物。在一些实施例中，不同的层可通过多种缀合反应(包括但不限于：生物素-链霉亲和素结合、叠氮化物-炔烃点击反应、胺-NHS酯反应、硫醇-马来酰亚胺反应、以及带正电荷的聚合物与带负电荷的聚合物之间的离子相互作用)中的任一者附接至彼此。在一些实施例中，高引物密度材料可在溶液中被构造并且随后在多个步骤中被分层到表面上。
可从其制造支持结构的材料的实例包括但不限于：玻璃、熔融二氧化硅、硅、聚合物(例如，聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))或其任意组合。设想了玻璃和塑料支持结构两者的各种组合物。
支持结构可以本领域技术人员已知的多种几何形状和大小中的任一者来呈现，并且可包括本领域技术人员已知的多种材料中的任一者。例如，支持结构可以为局部地平面的(例如，包括显微镜载玻片或显微镜载玻片的表面)。总的来说，支持结构可以为柱形的(例如，包括毛细管或毛细管的内表面)、球形的(例如，包括无孔珠子的外表面)或不规则的(例如，包括不规则形状的无孔珠子或颗粒的外表面)。在一些实施例中，用于核酸杂交和扩增的支持结构的表面可以为固体无孔表面。在一些实施例中，用于核酸杂交和扩增的支持结构的表面可以是多孔的，使得本文所述的涂层穿透多孔表面，并且对其执行的核酸杂交和扩增反应可以在孔内发生。
包含该一个或多个经化学修饰的层(例如，低非特异性结合聚合物的层)的支持结构可以为独立的或被集成到另一结构或组件中。例如，支持结构可包括集成式或组装式微流体流动池内的一个或多个表面。支持结构可包括微板形式内的一个或多个表面，例如，微板中的孔的底表面。在一些实施例中，支持结构包括毛细管的内表面(诸如内腔表面)。在一些实施例中，支持结构包括被蚀刻到平面芯片中的毛细管的内表面(诸如内腔表面)。
如本文所述，本公开的低非特异性结合支持物表现出蛋白质、核酸和用于固相核酸扩增的杂交和/或扩增配制物的其他组分的减少的非特异性结合。可以定性方式或以定量方式来评估给定支持物表面所表现出的非特异性结合的程度。例如，在标准化的一组条件下将表面暴露于荧光染料(例如，花青(诸如Cy3或Cy5等)、荧光素、香豆素、罗丹明等或本文所公开的其他染料)、经以荧光方式标记的核苷酸、经以荧光方式标记的寡核苷酸和/或经以荧光方式标记的蛋白质(例如聚合酶)，之后执行指定的冲洗方案和荧光成像，可用作用于比较包含不同表面配制物的支持物上的非特异性结合的定性工具。在一些实施例中，在标准化设置条件下，将表面暴露于荧光染料、荧光标记的核苷酸、荧光标记的寡核苷酸和/或荧光标记的蛋白质(例如，聚合酶)，然后进行指定的冲洗方案和荧光成像，可以用作定量工具，用于比较包含不同表面配方的支持物上的非特异性结合的——前提是已注意确保，荧光成像是在荧光信号与支持物表面上的荧光团的数量(例如，在荧光团的信号饱和和/或自猝灭不成问题的条件下)线性相关(或以可预测的方式相关)的条件下进行的，并使用合适的校准标准。在一些实施例中，本领域技术人员已知的其他技术(例如，放射性同位素标记和计数方法)可用于定量评估本公开的不同支持物表面配制物所表现出的非特异性结合的程度。
本文所公开的一些表面表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100、或大于100、或本文中的范围所涵盖的任何中间值的荧光团(诸如Cy3)的特异性与非特异性结合的比率。本文所公开的一些表面表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100、或大于100、或本文中的范围所涵盖的任何中间值的荧光团(诸如Cy3)的特异性与非特异性荧光的比率。
在一些实施例中，所公开的低结合支持物表现出的非特异性结合程度可以使用标准化的实验方案进行评估：使表面与标记蛋白质(例如，牛血清白蛋白(BSA)、链霉亲和素、DNA聚合酶、逆转录酶、解旋酶、单链结合蛋白(SSB)等或其任意组合)、标记的核苷酸、标记的寡核苷酸等接触，在孵育和漂洗的标准化设置条件下，随后检测保留在表面上的标记的量，并将由此产生的信号与适当的校准标准进行比较。在一些实施例中，标记可包括荧光标记。在一些实施例中，标记可包括放射性同位素。在一些实施例中，标记可包括本领域技术人员已知的任何其他可检测标记。在一些实施例中，因此可根据每单位面积非特异性结合的蛋白质分子(或核酸分子或其他分子)的数量来评估给定支持物表面配制物所表现出的非特异性结合的程度。在一些实施例中，本公开的低结合支持物可表现出小于0.001个分子每μm2、小于0.01个分子每μm2、小于0.1个分子每μm2、小于0.25个分子每μm2、小于0.5个分子每μm2、小于1个分子每μm2、小于10个分子每μm2、小于100个分子每μm2、或小于1,000个分子每μm2的非特异性蛋白质结合(或其他指定分子的非特异性结合，(例如，花青(诸如Cy3或Cy5等)、荧光素、香豆素、罗丹明等或本文所公开的其他染料))。本领域技术人员将认识到，本公开的给定支持物表面可表现出落在该范围内的任何位置的(例如，小于86个分子每μm2的)非特异性结合。例如，在与磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中的经Cy3标记的链霉亲和素(GEAmersham)的1μM溶液接触达15分钟、之后用去离子水进行3次冲洗之后，本文所公开的一些经修饰的表面表现出小于0.5个分子/μm2的非特异性蛋白质结合。本文所公开的一些经修饰的表面表现出小于0.25个分子每μm2的Cy3染料分子的非特异性结合。在独立的非特异性结合测定中，1μM经标记的Cy3 SA(赛默飞世尔科技公司)、1μM Cy5 SA染料(赛默飞世尔科技公司)、10μM氨基烯丙基-dUTP-ATTO-647N(Jena Biosciences)、10μM氨基烯丙基-dUTP-ATTO-Rhol 1(Jena Biosciences)、10μM氨基烯丙基-dUTP-ATTO-Rhol 1(JenaBiosciences)、10μM 7-炔丙基氨基-7-去氮杂-dGTP-Cy5(Jena Biosciences)和10μM7-炔丙基氨基-7-去氮杂-dGTP-Cy3(Jena Biosciences)以384孔板形式在经低结合涂覆的支持物上在37℃温育达15分钟。将每个孔用50uL去离子无RNA酶/DNA酶水冲洗2至3次，并且用25mMACES缓冲液(pH 7.4)冲洗2至3次。使用如由制造商指定的Cy3、AF555或Cy5滤光片组(根据所执行的染料测试)以800的PMT增益设定和50μm至100μm的分辨率在GE Typhoon仪器上对384孔板进行成像。对于更高分辨率成像，在带有全内反射荧光(TIRF)物镜(100倍，数值孔径1.5，Olympus)、CCD相机(例如，Olympus EM-CCD单色相机、Olympus XM-10单色相机或Olympus DP80彩色和单色相机)、照明源(例如，Olympus 100W汞灯、Olympus 75W氙灯、或Olympus U-HGLGPS荧光光源)以及532nm或635nm的激发波长的Olympus IX83显微镜(例如，倒置荧光显微镜)(Olympus Corp.,Center Valley,Pa.)上收集图像。二向色镜购自Semrock(IDEX Health&Science,LLC,Rochester,N.Y.)，例如，405nm、488nm、532nm或633nm二向色反射镜/分束器，并且带通滤光片选择为与适当的激发波长整合的532LP或645LP。本文所公开的一些经修饰的表面表现出小于0.25个分子每μm2的染料分子的非特异性结合。在一些实施例中，将经涂覆的支持物浸入缓冲液(例如，25mMACES，pH 7.4)中，同时获取图像。
在一些实施例中，本文所公开的表面表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100、或大于100、或本文中的范围所涵盖的任何中间值的荧光团(诸如Cy3)的特异性与非特异性结合的比率。在一些实施例中，本文所公开的表面表现出至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100、或大于100、或本文中的范围所涵盖的任何中间值的针对荧光团(诸如Cy3)的特异性与非特异性荧光信号的比率。
符合本文公开内容的低背景表面可表现出至少4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1、或超过每个非特异性地吸附的分子50个附接的特定染料分子的特异性染料附接(例如，Cy3附接)与非特异性染料吸附(例如，Cy3染料吸附)比率。类似地，当经受激发能量时，符合本文公开内容的已附接有荧光团(例如，Cy3)的低背景表面可表现出至少4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1或超过50:1的特定荧光信号(例如，从附接至表面的经Cy3标记的寡核苷酸产生)与非特异性吸附染料荧光信号的比率。
在一些实施例中，可例如通过测量水接触角来评估所公开的支持物表面的亲水性的程度(或与水性溶液的“可湿性”)，其中将一小滴水放置在表面上，并且使用例如光学张力计来测量其与表面的接触角。在一些实施例中，可确定静态接触角。在一些实施例中，可确定前进或后退接触角。在一些实施例中，本文所公开的针对亲水性低结合支持物表面的水接触角的范围可以为约0度至约30度。在一些实施例中，本文所公开的针对亲水性低结合支持物表面的水接触角可不超过50度、40度、30度、25度、20度、18度、16度、14度、12度、10度、8度、6度、4度、2度或1度。在许多情况下，接触角不超过40度。本领域技术人员将认识到，本公开的给定亲水性低结合支持物表面可表现出具有在该范围内的任何位置的值的水接触角。
在一些实施例中，本文所公开的亲水性表面有助于减少针对生物测定的洗涤时间，这通常是由于生物分子与低结合表面的减少的非特异性结合。在一些实施例中，可在小于60秒、50秒、40秒、30秒、20秒、15秒、10秒或小于10秒内执行足够的洗涤步骤。例如，可在小于30秒内执行足够的洗涤步骤。
本公开的一些低结合表面对于延长暴露于溶剂和升高的温度或者对于溶剂暴露的重复循环或温度中的变化可表现出稳定性或持久性方面的显著改善。例如，可通过以下操作来测试所公开的表面的稳定性：对表面上的官能团或表面上的经拴系的生物分子(例如，寡核苷酸引物)以荧光方式进行标记，并且在延长暴露于溶剂和升高的温度或者溶剂暴露的重复循环或温度中的变化之前、期间和之后监测荧光信号。在一些实施例中，用于评估表面的质量的荧光中的变化的程度可以为历经暴露于溶剂和/或升高的温度1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时或100小时的时间段小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％(或如历经这些时间段所测量的这些百分比的任意组合)。在一些实施例中，用于评估表面的质量的荧光中的变化的程度可以为历经重复暴露于溶剂变化和/或温度中的变化5个循环、10个循环、20个循环、30个循环、40个循环、50个循环、60个循环、70个循环、80个循环、90个循环、100个循环、200个循环、300个循环、400个循环、500个循环、600个循环、700个循环、800个循环、900个循环或1,000个循环小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％(或如历经该循环的范围所测量的这些百分比的任意组合)。
在一些实施例中，本文所公开的表面可表现出特定信号与非特定信号或其他背景的高比率。例如，当用于核酸扩增时，一些表面可表现出比表面的相邻无种群区的信号大的扩增信号，倍数为至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍或大于100倍。类似地，一些表面表现出比表面的相邻经扩增核酸种群区的信号大的扩增信号，倍数为至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍或大于100倍。
在一些实施例中，当用于核酸杂交或扩增应用以产生杂交或克隆扩增的核酸分子(例如，已经用荧光团直接或间接标记的)群体时，所公开的低背景表面的荧光图像表现出对比-噪声比(CNR)为至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、210、220、230、240、250或大于250。
一个或多个类型的引物可附接或拴系至支持物表面。在一些实施例中，一种或更多种类型的衔接子或引物可包含间隔区序列、用于与衔接子连接的靶文库核酸序列杂交的衔接子序列、正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物和/或分子条形码序列，或其任意组合。在一些实施例中，1个引物或衔接子序列可以拴系至表面的至少一层。在一些实施例中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个不同的引物或衔接子序列可拴系至表面的至少一层。
在一些实施例中，拴系的衔接子和/或引物序列的长度范围可为约10个核苷酸至约100个核苷酸。在一些实施例中，拴系的衔接子和/或引物序列长度可为至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、或至少100个核苷酸。在一些实施例中，拴系的衔接子和/或引物序列长度可为至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20、或至多10个核苷酸。本段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些实施例中，拴系的衔接子和/或引物序列的长度可以在约20个核苷酸至约80个核苷酸的范围内。本领域技术人员将认识到，经拴系的衔接子和/或引物序列的长度可具有在该范围内的任何值，例如，约24个核苷酸。
在一些实施例中，本公开的低结合支持物表面上的引物(例如，捕获引物)的所得表面密度的范围可以为约100个引物分子每μm2至约100,000个引物分子每μm2。在一些实施例中，本公开的低结合支持物表面上的引物的所得表面密度可以在约1,000个引物分子每μm2至约1,000,000个引物分子每μm2的范围内。在一些实施例中，引物的表面密度可以为至少1,000个、至少10,000个、至少100,000个、或至少1,000,000个分子每μm2。在一些实施例中，引物的表面密度可以为至多1,000,000个、至多100,000个、至多10,000个、或至多1,000个分子每μm2。本段中所述的下限值和上限值中的任一者可组合以形成被包括在本公开内的范围，例如，在一些实施例中，引物的表面密度可以在约10,000个分子每μm2至约100,000个分子每μm2的范围内。本领域技术人员将认识到，引物分子的表面密度可以具有该范围内的任何值，例如约455,000个分子每μm2。在一些实施例中，最初与支持物表面上的衔接子或引物序列杂交的目标文库核酸序列的表面密度可以小于或等于所指示的拴系的引物的表面密度。在一些实施例中，与支持物表面上的衔接子或引物序列杂交的克隆扩增的靶文库核酸序列的表面密度可以跨越与所指示的拴系的引物的表面密度相同的范围。
如上文所列出的局部密度不排除跨表面的密度中的变化，使得表面可包括具有例如500,000/μm2的寡核苷酸密度的区，同时也包括具有基本上不同的局部密度的至少第二区。
在一些实施例中，可使用荧光成像技术来评估使用所公开的反应配制物和低结合支持物的核酸杂交和/或扩增反应的性能，其中图像的对比度噪声比(CNR)提供评估支持物上的扩增特异性和非特异性结合中的关键度量。CNR通常被定义为：CNR＝(信号-背景)/噪声。背景项通常被认为是针对指定的感兴趣区(ROI)中的特定特征(衍射极限点(diffraction limited spot)，DLS)周围的间隙区所测量的信号。虽然信噪比(SNR)通常被认为是总体信号质量的基准，但可显示，在需要快速图像捕获的应用中，具有改善的CNR可提供优于作为针对信号质量的基准的SNR的显著优点(例如，对于其而言必须使循环时间最小化的测序应用)，如下文实施例中所示。在高CNR处，即使在CNR中的轻微改善的情况下，也可大幅度减少实现准确区分(以及因此在测序应用的情况下的准确碱基识别)所需的成像时间。关于成像集成时间的成像数据中的具有改善的CNR提供了用于更准确地检测特征(诸如支持物表面上的经以克隆方式扩增的核酸集落)的方法。
在大多数基于系综的测序方法中，背景项通常被测量为与“间隙”区相关联的信号。除“间隙”背景(B间隙)之外，“内质(intrastitial)”背景(B内质)存在于由经扩增DNA集落占据的区内。这两个背景信号的组合决定了可实现的CNR，并且随后直接地影响光学仪器要求、架构成本、试剂成本、运行时间、成本/基因组，并最终影响针对基于循环阵列的测序应用的准确度和数据质量。B间隙背景信号有多种来源；一些实例包括：来自可消耗流通池的自发荧光、生成虚假荧光信号的检测分子的非特异性吸附(其可能遮蔽来自ROI的信号)、非特异性DNA扩增产物(例如，从引物二聚体生成的那些)的存在。在典型的下一代测序(NGS)应用中，当前视场(FOV)中的该背景信号随时间推移被平均和减去。从单独的DNA集落产生的信号(即，FOV中的(信号)-B(间隙))产生可被分类的可辨别特征。在一些实施例中，内质背景(B(内质))可贡献混杂荧光信号，该混杂荧光信号不特定于感兴趣靶标，但是存在于相同ROI中，因此使得平均和减去困难得多。
本文所述的低结合经涂覆的支持物上的核酸扩增可通过减少非特异性结合来减小B(间隙)背景信号，可导致特异性核酸扩增中的改善，并且可导致非特异性扩增中的减少(这可影响从间隙和内质区两者产生的背景信号)。在一些实施例中，所公开的低结合经涂覆的支持物(任选地与所公开的杂交和/或扩增反应配制物组合使用)可导致CNR中优于使用常规支持物以及杂交、扩增和/或测序方案所实现的那些的改善，改善的倍数为2倍、5倍、10倍、100倍、250倍、500倍或1000倍。尽管本文在使用荧光成像作为读出或检测模式的上下文中进行描述，但是相同的原理也适用于所公开的低结合经涂覆的支持物以及核酸杂交和扩增配制物针对其他检测模式(包括光学和非光学检测模式两者)的使用。
通过引用并入
在整个本申请中，引用了各种出版物、专利和/或专利申请。出版物、专利和/或专利申请的公开内容特此通过引用以其整体并入本申请中，以便更全面地描述本公开所属领域的现状。
等效物
本公开的一个或多个实施例的细节在以上所附描述中阐述。虽然类似或等效于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料可以用于本公开的实践或测试，但现在描述优选的方法和材料。根据本说明书及权利要求，本公开的其他特征、目的和优点将变得显而易见。在说明书和所附权利要求中，除非上下文另外明确规定，否则单数形式包括复数指示物。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。本说明书中引用的所有专利和出版物以引用的方式并入。
前述描述仅出于说明的目的而呈现，并不旨在将本公开限制于所公开的精确形式，而是由所附权利要求书限制。

Claims (26)

1.一种用于制备空间分辨核酸的方法，其包括：
a)提供支持物，所述支持物包括：(i)包含至少一种亲水性聚合物的低非特异性结合涂层，其中所述低非特异性结合涂层具有不超过45度的水接触角；和(ii)共价拴系至所述低非特异性结合涂层的多个固定的表面捕获引物，其中每个单独的表面捕获引物包含通用表面捕获引物序列(110)、针对反向测序引物的通用结合位点(120)和RNA捕获序列；
b)在适合于细胞样品保持在经涂覆的支持物上的固定位置的条件下将所述细胞样品定位在所述经涂覆的支持物上，破坏所述细胞样品，在适合于保存来自所述细胞样品的多个RNA分子的空间位置信息的条件下释放所述细胞样品的所述RNA分子，以及在适合于使单独的RNA分子与单独的固定的表面捕获引物杂交以产生多个捕获引物-RNA双链体的条件下收集所述支持物的所述多个固定的表面捕获引物上的所述多个RNA分子，其中每个引物-RNA双链体包含与RNA分子杂交的固定的表面捕获引物；
c)在适合于延伸所述固定的表面捕获引物的3'端的条件下并使用杂交的RNA作为模板链，在适合于在所述3'端处产生非模板polyC尾的条件下，在所述经涂覆的支持物上进行逆转录反应，由此产生在所述3'端'处具有非模板polyC尾的多个第一链cDNA分子，其中所述逆转录反应包括多个模板转换寡核苷酸，其中所述模板转换寡核苷酸中的每个模板转换寡核苷酸包含能够与所述第一链cDNA分子的所述非模板polyC尾杂交的polyG区、针对正向测序引物的通用结合位点(130)和针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)；
d)从所述多个第一链cDNA分子的所述非模板polyC尾的3'末端并且使用所述模板转换寡核苷酸作为模板链进行引物延伸反应，由此产生多个固定的全长第一链cDNA，其中每个全长第一链cDNA包含：通用表面捕获引物序列(110)；针对反向测序引物的通用结合位点(120)；RNA捕获序列；cDNA插入区；polyC尾区；针对正向测序引物的通用结合位点(130)；以及针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)；
e)移除所述RNA分子，同时保留所述多个固定的全长第一链cDNA；
f)在适合于使单独的环化寡核苷酸与固定的全长第一链cDNA杂交的条件下使所述多个保留的固定的全长第一链cDNA与多个单链环化寡核苷酸接触，由此形成具有间隙的单链环状分子，其中单独的单链环化寡核苷酸包含：(i)与所述针对反向测序引物的通用结合位点(120)互补的序列，(ii)与所述通用表面捕获引物序列(110)互补的序列，(iii)接头区，(iv)与所述针对表面钉扎引物的通用结合位点(140)互补的序列，(v)以及与所述针对正向测序引物的通用结合位点(130)互补的序列；
g)使用所述固定的全长第一链cDNA的所述polyC尾区、所述cDNA插入区和所述RNA捕获序列作为模板链来进行聚合酶催化的延伸反应以填充所述间隙，其中所述聚合酶催化的延伸反应形成具有切口的单链环化分子，并且其中所述切口通过进行酶促连接反应而闭合以产生与所述固定的全长第一链cDNA杂交的单链共价闭合环状分子；
h)使用所述固定的全长第一链cDNA的末端3'端作为起始位点以及所述共价闭合环状分子作为模板链进行滚环扩增反应，由此产生在所述支持物上空间分辨的多个固定的核酸串联体；
i)对多个单独的固定的核酸串联体进行测序，其中所述测序包括单独的核酸串联体的cDNA插入区的至少一部分，所述单独的核酸串联体对应于从所述细胞样品洗脱的所述单独的RNA分子；以及
j)确定所述单独的核酸串联体在所述经涂覆的支持物上的位置，所述位置对应于从所述细胞样品洗脱的所述单独的RNA分子的空间位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的所述细胞样品包括单个细胞、多个细胞、组织、器官、生物体或切片的细胞样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)的所述细胞样品包括新鲜样品、冷冻样品、新鲜冷冻样品或福尔马林固定的石蜡包埋样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)的所述多个模板转换寡核苷酸包括嵌合DNA和/或RNA寡核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤f)的所述单链环化寡核苷酸的所述接头区包含用于多重化的至少一个样品索引序列、用于分子标记的至少一个唯一分子索引(UMI)序列和/或针对压实寡核苷酸的至少一个通用结合位点。
6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤h)的所述滚环扩增反应在多个压实寡核苷酸的存在下进行，其中所述压实寡核苷酸包括单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸各自在第一远侧端处具有与串联体分子的一个部分杂交的第一区并且在第二远侧端处具有与同一串联体分子的第二部分杂交的第二区，其中所述串联体分子的第一部分和所述串联体分子的所述第二部分接近，由此导致所述串联体分子的压实以形成DNA纳米球。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤i)的所述测序包括：
a.使多个串联体分子与多个测序聚合酶和多个核酸测序引物接触，其中所述接触在适合于形成多个复合测序聚合酶的条件下进行，其中每个复合测序聚合酶包含结合至核酸双链体的测序聚合酶，并且其中所述核酸双链体包含与所述核酸测序引物杂交的串联体分子的一部分；
b.使所述多个复合测序聚合酶与多个经可检测地标记的核苷酸接触，所述多个经可检测地标记的核苷酸在2'糖位置或3'糖位置处包含阻断部分，其中所述接触在适合于将至少一个核苷酸与所述复合测序聚合酶中的至少一个复合测序聚合酶结合的条件下进行，并且其中所述条件适合于促进聚合酶催化的核苷酸掺入；
c.将核苷酸掺入至少一个复合测序聚合酶的测序引物的3'端；
d.检测经掺入的核苷酸并且识别所述经掺入的核苷酸的核碱基；
e.从所述经掺入的核苷酸中移除所述阻断部分；以及
f.重复步骤b.至e.至少一次。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤i)的所述测序包括：
a.使多个串联体分子与多个测序聚合酶和多个核酸测序引物接触，其中所述接触在适合于形成多个复合测序聚合酶的条件下进行，其中每个复合测序聚合酶包含结合至核酸双链体的测序聚合酶，并且其中所述核酸双链体包含与所述核酸测序引物杂交的串联体分子的一部分；
b.使所述多个复合测序聚合酶与多个核苷酸接触，所述多个核苷酸各自包含附接至磷酸酯链的磷酸酯部分的可检测标记，其中所述接触在适合于将至少一个核苷酸与所述复合测序聚合酶中的至少一个复合测序聚合酶结合的条件下进行，并且其中所述条件适合于促进聚合酶催化的核苷酸掺入；
c.将核苷酸掺入至少一个复合测序聚合酶的测序引物的3'端；
d.检测经掺入的核苷酸并且识别所述经掺入的核苷酸的核碱基；以及
e.重复步骤b.至d.至少一次。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤i)的所述测序包括：
a.使多个串联体分子与多个第一测序聚合酶和多个核酸测序引物接触，其中所述接触在适合于将多个第一聚合酶与多个核酸模板分子和多个核酸引物结合的条件下进行，由此形成多个第一复合聚合酶，其中每个第一复合聚合酶包含结合至核酸双链体的第一聚合酶，其中所述核酸双链体包含与核酸引物杂交的核酸模板分子；
b.使所述多个第一复合聚合酶与多个经可检测地标记的多价分子接触以形成多个多价结合复合物，其中所述多个经可检测地标记的多价分子中的单独的经可检测地标记的多价分子包括附接至多个核苷酸臂的核，并且其中每个核苷酸臂附接至核苷酸单元，其中所述接触在适合于将所述多价分子的互补核苷酸单元与所述多个第一复合聚合酶中的至少两个第一复合聚合酶结合的条件下进行，由此形成多个多价结合复合物，并且其中所述条件适合于抑制所述互补核苷酸单元掺入到所述多个多价结合复合物的引物中；
c.检测所述多个多价结合复合物；以及
d.识别所述多个多价结合复合物中的所述互补核苷酸单元的核碱基，由此确定所述核酸模板分子的序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤i)的所述测序包括：
a.通过移除所述多个第一测序聚合酶及其结合的多价分子来离解所述多个多价结合复合物，并且保留多个核酸双链体；
b.在适合于将多个第二聚合酶与所述多个保留的核酸双链体结合的条件下使步骤e)的多个保留的核酸双链体与所述多个第二测序聚合酶接触，由此形成各自包含结合至核酸双链体的第二聚合酶的多个第二复合聚合酶；以及
c.使所述多个第二复合聚合酶与多个核苷酸接触，其中所述接触在适合于将来自所述多个核苷酸的互补核苷酸与所述第二复合聚合酶中的至少两个第二复合聚合酶结合的条件下进行，由此形成多个核苷酸结合复合物，并且其中所述条件适合于促进结合的互补核苷酸掺入到所述核苷酸结合复合物的引物中。
11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括：
d.检测被掺入到核苷酸复合聚合酶的所述引物中的所述互补核苷酸。
12.根据权利要求10所述的方法，其进一步包括：
d.检测被掺入到核苷酸复合聚合酶的所述引物中的所述互补核苷酸；以及
e.识别被掺入到所述核苷酸复合聚合酶的所述引物中的所述互补核苷酸的核碱基。
13.根据权利要求9所述的方法，其中步骤b.的所述使所述多个第一复合聚合酶与多个多价分子接触在抑制聚合酶催化的核苷酸掺入的非催化二价阳离子的存在下进行，其中所述非催化二价阳离子包括锶、钡或钙。
14.根据权利要求9所述的方法，其中多个多价分子中的单独的多价分子包含：(a)核；和(b)多个核苷酸臂，所述多个核苷酸臂包含：(i)核附接部分，(ii)间隔区，(iii)接头和(iv)核苷酸单元，其中所述核经由所述多个核苷酸臂的核附接部分附接至所述多个核苷酸臂，其中所述间隔区附接至所述接头，并且其中所述接头附接至所述核苷酸单元。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述接头包含具有2至6个亚基的脂族链或具有2至6个亚基的低聚乙二醇链。
16.根据权利要求14所述的方法，其中附接至给定核的所述多个核苷酸臂具有相同类型的核苷酸单元，并且其中所述类型的核苷酸单元包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP。
17.根据权利要求9所述的方法，其中多个多价分子包括一种类型的多价分子，其中所述多个多价分子中的每个多价分子具有选自由以下项组成的组的相同类型的核苷酸单元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
18.根据权利要求9所述的方法，其中多个多价分子包括两种或更多种类型的多价分子的任意组合的混合物，每种类型具有选自由以下项组成的组的核苷酸单元：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
19.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括形成多个结合复合物，包括以下步骤：
a)将第一核酸测序引物、第一测序聚合酶和第一多价分子与串联体分子的第一部分结合，由此形成第一结合复合物，其中所述第一多价分子的第一核苷酸单元与所述第一聚合酶结合；以及
b)将第二核酸测序引物、第二测序聚合酶和所述第一多价分子与同一串联体分子的第二部分结合，由此形成第二结合复合物，其中所述第一多价分子的第二核苷酸单元与所述第二聚合酶结合，
其中包含同一多价分子的所述第一结合复合物和所述第二结合复合物形成亲合力复合物。
20.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括形成亲合力复合物，包括以下步骤：
a)使所述多个第一测序聚合酶和所述多个核酸测序引物与串联体核酸模板分子的不同部分接触，以在同一串联体分子上形成至少第一复合聚合酶和第二复合聚合酶；以及
b)在适合于将来自多个多价分子的单个多价分子与所述第一复合聚合酶和所述第二复合聚合酶结合的条件下，使多个经可检测地标记的多价分子与同一串联体分子上的所述至少第一复合聚合酶和所述第二复合聚合酶接触，其中所述单个多价分子的至少第一核苷酸单元结合至所述第一复合聚合酶，所述第一复合聚合酶包括与所述串联体分子的第一部分杂交的第一引物，由此形成第一结合复合物，并且其中所述单个多价分子的至少第二核苷酸单元结合至所述第二复合聚合酶，所述第二复合聚合酶包括与所述串联体分子的第二部分杂交的第二引物，由此形成第二结合复合物，
·其中所述接触在适合于抑制结合的第一核苷酸单元和第二核苷酸单元经聚合酶催化掺入所述第一结合复合物和所述第二结合复合物中的条件下进行，并且
·其中结合至同一多价分子的所述第一结合复合物和所述第二结合复合物形成亲合力复合物；
c)检测同一串联体分子上的所述第一结合复合物和所述第二结合复合物；以及
d)识别所述第一结合复合物中的所述第一核苷酸单元，由此确定所述串联体分子的所述第一部分的序列，并且识别所述第二结合复合物中的所述第二核苷酸单元，
由此确定所述串联体分子的所述第二部分的序列。
21.根据权利要求10所述的方法，其中步骤c.的所述使所述多个第二复合聚合酶与所述多个核苷酸接触在促进聚合酶催化的核苷酸掺入的催化二价阳离子的存在下进行，其中所述催化二价阳离子包括镁或锰。
22.根据权利要求10所述的方法，其中步骤c.中的所述多个核苷酸中的单独的核苷酸包含芳香族碱基、五碳糖和1至10个磷酸酯基团。
23.根据权利要求10所述的方法，其中步骤c.的所述多个核苷酸包括选自由以下项组成的组的一种类型的核苷酸：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP，或包括选自由以下项组成的组的两种或更多种类型的核苷酸的任意组合的混合物：dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP。
24.根据权利要求10所述的方法，其中步骤c.中的所述多个核苷酸中的所述核苷酸中的至少一个核苷酸用荧光团标记。
25.根据权利要求10所述的方法，其中步骤c.中的所述多个核苷酸缺乏荧光团标记。
26.根据权利要求10所述的方法，其中步骤c.的所述多个核苷酸中的所述核苷酸中的至少一个核苷酸包含附接至糖基团的3'碳位置的可移除链终止部分，其中所述可移除链终止部分包括烷基基团、烯基基团、炔基基团、烯丙基基团、芳基基团、苄基基团、叠氮基基团、叠氮基基团、O-叠氮甲基基团、胺基基团、酰胺基基团、酮基基团、异氰酸酯基团、磷酸酯基团、硫代基团、二硫基团、碳酸酯基团、脲基团或甲硅烷基基团，并且其中所述可移除链终止部分可用化学化合物裂解以在所述糖基团上生成可延伸3'OH部分。
CN202380067212.9A 2022-08-15 2023-08-15 核酸的空间分辨表面捕获 Pending CN120019162A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202263398183P 2022-08-15 2022-08-15
US63/398183 2022-08-15
PCT/US2023/072233 WO2024040068A1 (en) 2022-08-15 2023-08-15 Spatially resolved surface capture of nucleic acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN120019162A true CN120019162A (zh) 2025-05-16

Family

ID=87933817

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202380067212.9A Pending CN120019162A (zh) 2022-08-15 2023-08-15 核酸的空间分辨表面捕获

Country Status (9)

Country Link
US (1) US12540350B2 (zh)
EP (1) EP4573213A1 (zh)
JP (1) JP2025528821A (zh)
KR (1) KR20250070619A (zh)
CN (1) CN120019162A (zh)
AU (1) AU2023325064A1 (zh)
CA (1) CA3264896A1 (zh)
IL (1) IL318890A (zh)
WO (1) WO2024040068A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10704094B1 (en) 2018-11-14 2020-07-07 Element Biosciences, Inc. Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding
US12391929B2 (en) 2019-05-24 2025-08-19 Element Biosciences, Inc. Polymerase-nucleotide conjugates for sequencing by trapping
US12469162B2 (en) 2020-08-31 2025-11-11 Element Biosciences, Inc. Primary analysis in next generation sequencing
US12359193B2 (en) 2022-03-04 2025-07-15 Element Biosciences, Inc. Single-stranded splint strands and methods of use
US12505571B2 (en) 2020-08-31 2025-12-23 Element Biosciences, Inc. Primary analysis in next generation sequencing
US12371743B2 (en) 2022-03-04 2025-07-29 Element Biosciences, Inc. Double-stranded splint adaptors and methods of use
EP4551718A1 (en) 2022-07-05 2025-05-14 Element Biosciences, Inc. Pcr-free library preparation using double-stranded splint adaptors and methods of use
AU2023325064A1 (en) 2022-08-15 2025-03-06 Element Biosciences, Inc. Spatially resolved surface capture of nucleic acids
AU2023343187A1 (en) 2022-09-12 2025-03-13 Element Biosciences, Inc. Double-stranded splint adaptors with universal long splint strands and methods of use
WO2025196650A1 (en) 2024-03-19 2025-09-25 Element Biosciences, Inc. Flow cell devices and use thereof
WO2026080904A2 (en) 2024-10-11 2026-04-16 Element Biosciences, Inc. Systems and methods for performing dna sequencing

Family Cites Families (259)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS50109781A (zh) 1974-02-06 1975-08-29
US4222743A (en) 1978-07-20 1980-09-16 Wang Wei Kung Method and apparatus for detecting biological particles by fluorescent stain
CA1340806C (en) 1986-07-02 1999-11-02 James Merrill Prober Method, system and reagents for dna sequencing
JP2955759B2 (ja) 1988-07-20 1999-10-04 セゲブ・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド 核酸配列を増幅及び検出する方法
US5184021A (en) 1991-06-24 1993-02-02 Siscan Systems, Inc. Method and apparatus for measuring the dimensions of patterned features on a lithographic photomask
US5422712A (en) 1992-04-01 1995-06-06 Toa Medical Electronics Co., Ltd. Apparatus for measuring fluorescent spectra of particles in a flow
WO1993024658A1 (en) 1992-05-29 1993-12-09 Gen Trak, Inc. Signal amplification probe and methods of use
FR2710075B1 (fr) 1993-09-15 1995-10-27 Bio Merieux Réactif et procédé pour la détection d'une séquence nucléotidique avec amplification de signal.
US5512131A (en) 1993-10-04 1996-04-30 President And Fellows Of Harvard College Formation of microstamped patterns on surfaces and derivative articles
US20030017081A1 (en) 1994-02-10 2003-01-23 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
WO1995025180A1 (en) 1994-03-16 1995-09-21 Gen-Probe Incorporated Isothermal strand displacement nucleic acid amplification
CA2185590A1 (en) 1995-09-18 1997-03-19 Kazunori Okano Dna sequencing method and dna sample preparation method
US6261797B1 (en) 1996-01-29 2001-07-17 Stratagene Primer-mediated polynucleotide synthesis and manipulation techniques
EP1736554B1 (en) 1996-05-29 2013-10-09 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions
US6482590B1 (en) 1996-12-20 2002-11-19 Aventis Behring Gmbh Method for polynucleotide amplification
CN1251609A (zh) 1997-02-12 2000-04-26 尤金·Y·查恩 分析聚合物的方法和产品
JP2002503954A (ja) 1997-04-01 2002-02-05 グラクソ、グループ、リミテッド 核酸増幅法
WO1999022030A1 (en) 1997-10-28 1999-05-06 The Regents Of The University Of California Dna polymorphism identity determination using flow cytometry
DE19747572C1 (de) 1997-10-28 1999-04-08 Inst Chemo Biosensorik Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung von Fluoreszenzimmuntests
US6284497B1 (en) 1998-04-09 2001-09-04 Trustees Of Boston University Nucleic acid arrays and methods of synthesis
US6376619B1 (en) 1998-04-13 2002-04-23 3M Innovative Properties Company High density, miniaturized arrays and methods of manufacturing same
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
AT410718B (de) 1998-10-28 2003-07-25 Schindler Hansgeorg Dr Vorrichtung zur visualisierung von molekülen
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6492161B1 (en) 1999-06-02 2002-12-10 Prokaria Ltd. Bacteriophage RM 378 of a thermophilic host organism
US6300070B1 (en) 1999-06-04 2001-10-09 Mosaic Technologies, Inc. Solid phase methods for amplifying multiple nucleic acids
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7211390B2 (en) 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
WO2001023610A2 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
EP2278030B1 (en) 2000-04-10 2017-05-24 Taxon Biosciences, Inc. Methods for the survey and genetic analysis of populations
JP2004510433A (ja) 2000-10-06 2004-04-08 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク Ｄｎａおよびｒｎａを解読するための大量並行方法
WO2002079762A2 (en) 2000-10-27 2002-10-10 Dumas David P Apparatus for fluorescence detection on arrays
JP3999479B2 (ja) 2001-07-10 2007-10-31 オリンパス株式会社 光学装置
EP1478774A4 (en) 2001-10-09 2006-11-29 Nanosphere Inc ELECTRONIC DETECTION OF DNA BASED ON AN ASSEMBLY AND IMPLEMENTING NANOPARTICLE-LIKE PROBES
AU2002351193A1 (en) 2001-11-28 2003-06-10 Mj Bioworks Incorporated Parallel polymorphism scoring by amplification and error correction
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
ATE414177T1 (de) 2002-09-30 2008-11-15 Hoffmann La Roche Oligonukleotide zur genotypisierung des thymidylat-synthase gens
US20090186343A1 (en) 2003-01-28 2009-07-23 Visigen Biotechnologies, Inc. Methods for preparing modified biomolecules, modified biomolecules and methods for using same
WO2005003375A2 (en) 2003-01-29 2005-01-13 454 Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
WO2004074503A2 (en) 2003-02-21 2004-09-02 Hoser Mark J Nucleic acid sequencing methods, kits and reagents
US7030383B2 (en) 2003-08-04 2006-04-18 Cadent Ltd. Speckle reduction method and apparatus
US7354706B2 (en) 2003-09-09 2008-04-08 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Use of photopolymerization for amplification and detection of a molecular recognition event
US20050064435A1 (en) 2003-09-24 2005-03-24 Xing Su Programmable molecular barcodes
WO2005042781A2 (en) 2003-10-31 2005-05-12 Agencourt Personal Genomics Corporation Methods for producing a paired tag from a nucleic acid sequence and methods of use thereof
EP1725572B1 (de) 2003-11-05 2017-05-31 AGCT GmbH Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung
EP1694869A2 (en) 2003-11-10 2006-08-30 Investigen, Inc. Methods of preparing nucleic acid for detection
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
BRPI0510093B8 (pt) 2004-04-20 2022-12-27 Dendritic Nanotechnologies Inc polímeros dendríticos
US7462452B2 (en) 2004-04-30 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Field-switch sequencing
US7264934B2 (en) 2004-06-10 2007-09-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Rapid parallel nucleic acid analysis
US7170050B2 (en) 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
US7315019B2 (en) 2004-09-17 2008-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of optical confinements and uses thereof
WO2006084132A2 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Agencourt Bioscience Corp. Reagents, methods, and libraries for bead-based squencing
EP1885876A2 (de) 2005-03-17 2008-02-13 Genovoxx GmbH Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung
GB0507835D0 (en) 2005-04-18 2005-05-25 Solexa Ltd Method and device for nucleic acid sequencing using a planar wave guide
US8632970B2 (en) 2005-05-09 2014-01-21 Affymetrix, Inc. Multiplex capture of nucleic acids
US7601499B2 (en) 2005-06-06 2009-10-13 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
US8407013B2 (en) 2005-06-07 2013-03-26 Peter K. Rogan AB initio generation of single copy genomic probes
JP5331476B2 (ja) 2005-06-15 2013-10-30 カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
EP1920072A2 (en) 2005-07-01 2008-05-14 Dako Denmark A/S In situ hybridization detection method
GB0514935D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods for sequencing a polynucleotide template
GB0514910D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
EP1910688A4 (en) 2005-08-04 2010-03-03 Helicos Biosciences Corp MULTICHANNEL FLOW CELLS
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
EP1960550B1 (en) 2005-12-12 2010-09-15 The Government of the United States of America as represented by The Secretary of the Department of Health and Human Services Probe for nucleic acid sequencing and methods of use
EP1977001A4 (en) 2006-01-20 2009-12-02 Genein Co Ltd OLIGONUCLEOTIDE FOR THE DETECTION OF SEPSIS ASSOCIATED BACTERIA, AND MICRO ARRAYS AND METHOD FOR DETECTION OF BACTERIA USING THE OLIGONUCLEOTIDE
DK1987159T4 (da) 2006-02-08 2020-11-16 Illumina Cambridge Ltd Fremgangsmåde til sekventering af en polynukleotidtemplate
SG170028A1 (en) 2006-02-24 2011-04-29 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
US8120002B2 (en) 2006-07-20 2012-02-21 Koninklijke Philips Electronics N.V. Multi-color biosensor for detecting luminescence sites on a substrate having a refractive optical element for adjusting and focusing at least two incident irradiation beams of different wavelengths
US7754429B2 (en) 2006-10-06 2010-07-13 Illumina Cambridge Limited Method for pair-wise sequencing a plurity of target polynucleotides
WO2008070352A2 (en) 2006-10-27 2008-06-12 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090075343A1 (en) 2006-11-09 2009-03-19 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by nicking
US7755841B2 (en) 2007-01-30 2010-07-13 Dmetrix, Inc. Liquid-lens variable-control optics in array microscope
WO2008151127A1 (en) 2007-06-04 2008-12-11 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for chemical ligation
US7960116B2 (en) 2007-09-28 2011-06-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nucleic acid sequencing methods and systems
US8951731B2 (en) 2007-10-15 2015-02-10 Complete Genomics, Inc. Sequence analysis using decorated nucleic acids
DK2725107T3 (da) 2007-10-19 2019-01-02 Univ Columbia DNA-sekventering med ikke-fluorescerende nukleotidreversible terminatorer og ddNTP'er modificeret med spaltbart mærke og nukleinsyre omfattende inosin med reversible terminatorer
US7897344B2 (en) 2007-11-06 2011-03-01 Complete Genomics, Inc. Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs
US8415099B2 (en) 2007-11-05 2013-04-09 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
WO2009073629A2 (en) 2007-11-29 2009-06-11 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
EP2217928B1 (en) 2007-12-04 2017-08-09 Pacific Biosciences of California, Inc. Alternate labeling strategies for single molecule sequencing
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
WO2009097368A2 (en) 2008-01-28 2009-08-06 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
US7767400B2 (en) 2008-02-03 2010-08-03 Helicos Biosciences Corporation Paired-end reads in sequencing by synthesis
WO2009098867A1 (ja) 2008-02-07 2009-08-13 Mitsui Engineering & Shipbuilding Co., Ltd. 蛍光検出装置および蛍光検出方法
AU2009212165A1 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Pacific Biosciences Of California, Inc. CIS reactive oxygen quenchers integrated into linkers
AU2009223702B2 (en) 2008-03-13 2013-08-22 Pacific Biosciences Of California, Inc. Labeled reactants and their uses
EP2274446B1 (en) 2008-03-31 2015-09-09 Pacific Biosciences of California, Inc. Two slow-step polymerase enzyme systems and methods
WO2009145820A2 (en) 2008-03-31 2009-12-03 Pacific Biosciences Of California, Inc. Generation of modified polymerases for improved accuracy in single molecule sequencing
US8039817B2 (en) 2008-05-05 2011-10-18 Illumina, Inc. Compensator for multiple surface imaging
EP2636756B2 (en) 2008-05-27 2019-11-20 Dako Denmark A/S Compositions and methods for detection of chromosomal aberrations with novel hybridization buffers
US20100035252A1 (en) 2008-08-08 2010-02-11 Ion Torrent Systems Incorporated Methods for sequencing individual nucleic acids under tension
AU2009288696A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Pacific Biosciences Of California, Inc. Sequencing by cognate sampling
CA2737505C (en) 2008-09-16 2017-08-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Substrates and optical systems and methods of use thereof
US8481264B2 (en) 2008-09-19 2013-07-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Immobilized nucleic acid complexes for sequence analysis
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
WO2010054000A1 (en) 2008-11-04 2010-05-14 Richard Joseph Methods, flow cells and systems for single cell analysis
US8367813B2 (en) 2008-11-17 2013-02-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Phospholink nucleotides for sequencing applications
US8252910B2 (en) 2008-11-19 2012-08-28 Pacific Biosciences Of California, Inc. Modular nucleotide compositions and uses therefor
WO2010059880A2 (en) 2008-11-19 2010-05-27 Pacific Biosciences Of California, Inc. Photo-induced damage mitigating agents and preparation and methods of use thereof
EP2230312A1 (en) 2009-03-19 2010-09-22 Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH Probe compound for detecting and isolating enzymes and means and methods using the same
WO2010117420A2 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fret-labeled compounds and uses therefor
FR2945545B1 (fr) 2009-05-14 2011-08-05 Univ Aix Marseille Ii Methode de detection d'adn procaryote extrait d'un echantillon de selles
WO2010141391A2 (en) 2009-06-05 2010-12-09 Life Technologies Corporation Mutant dna polymerases
CA2770389C (en) 2009-08-25 2015-12-29 Illumina, Inc. Methods for selecting and amplifying polynucleotides
CN107419002A (zh) 2009-09-01 2017-12-01 皇家飞利浦电子股份有限公司 用于微阵列选择的设备和方法
EP2494073B1 (de) 2009-10-26 2017-11-29 AGCT GmbH Konjugate von nukleotiden und methoden zu deren anwendung
US9023769B2 (en) 2009-11-30 2015-05-05 Complete Genomics, Inc. cDNA library for nucleic acid sequencing
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
JP5901046B2 (ja) 2010-02-19 2016-04-06 国立大学法人 千葉大学 ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント
CN102985803A (zh) 2010-02-19 2013-03-20 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 集成的分析系统和方法
US10787701B2 (en) 2010-04-05 2020-09-29 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays
US8715932B2 (en) 2010-08-20 2014-05-06 Intel Corporation Nucleic acid sequencing
WO2012027625A2 (en) 2010-08-25 2012-03-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Scaffold-based polymerase enzyme substrates
US9029103B2 (en) 2010-08-27 2015-05-12 Illumina Cambridge Limited Methods for sequencing polynucleotides
US8175452B1 (en) 2010-10-26 2012-05-08 Complete Genomics, Inc. Method and system for imaging high density biochemical arrays with sub-pixel alignment
US20130225623A1 (en) 2010-10-27 2013-08-29 Mount Sinai School Of Medicine Methods of Treating Psychiatric or Neurological Disorders with MGLUR Antagonists
AU2011319755B2 (en) 2010-10-27 2017-02-23 President And Fellows Of Harvard College Compositions of toehold primer duplexes and methods of use
EP3564392B1 (en) 2010-12-17 2021-11-24 Life Technologies Corporation Methods for nucleic acid amplification
EP2689028B1 (en) 2011-03-23 2017-08-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Isolation of polymerase-nucleic acid complexes and loading onto substrates
US10100350B2 (en) 2011-05-06 2018-10-16 Rutgers, The State University Of New Jersey Molecular constructs for differentiating a target molecule from an off-target molecule
US9139874B2 (en) 2011-07-07 2015-09-22 Life Technologies Corporation Bi-directional sequencing compositions and methods
US10364464B2 (en) 2011-08-08 2019-07-30 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for co-amplifying subsequences of a nucleic acid fragment sequence
US9708649B2 (en) 2011-10-31 2017-07-18 Hitachi High-Technologies Corporation Method and substrate for nucleic acid amplification, and method and apparatus for nucleic acid analysis
CN105385757B (zh) 2011-12-12 2020-04-03 塞雷公司 用于室温原位检测生物样品中的目标核酸的方法和试剂盒
WO2013096692A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Illumina, Inc. Apparatus and methods for kinetic analysis and determination of nucleic acid sequences
US20130165350A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Affymetrix, Inc. Surface linkers for array synthesis
EP3222627B1 (en) 2012-02-15 2019-08-07 Pacific Biosciences of California, Inc. Polymerase enzyme substrates with protein shield
EP3744857A1 (en) 2012-03-20 2020-12-02 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods of lowering the error rate of massively parallel dna sequencing using duplex consensus sequencing
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9637782B2 (en) 2012-09-28 2017-05-02 Pacific Biosciences Of California, Inc. Charged triplet-state quenchers for mitigation of photo-induced damage
US9476089B2 (en) 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
JP6030153B2 (ja) 2013-01-17 2016-11-24 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体分子計測装置
EP3578666A1 (en) 2013-03-12 2019-12-11 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
US9273349B2 (en) 2013-03-14 2016-03-01 Affymetrix, Inc. Detection of nucleic acids
US9328382B2 (en) 2013-03-15 2016-05-03 Complete Genomics, Inc. Multiple tagging of individual long DNA fragments
AU2014233145A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Theranos Ip Company, Llc Nucleic acid amplification
US10053725B2 (en) 2013-04-23 2018-08-21 President And Fellows Of Harvard College In situ interaction determination
US9957291B2 (en) 2013-08-05 2018-05-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Protected fluorescent reagent compounds
ES2711168T3 (es) 2013-08-28 2019-04-30 Becton Dickinson Co Análisis masivo en paralelo de células individuales
US9582877B2 (en) 2013-10-07 2017-02-28 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
WO2015066708A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Northwestern University Quantification and spatio-temporal tracking of a target using a spherical nucleic acid (sna)
US9546398B2 (en) 2013-11-14 2017-01-17 Agilent Technologies, Inc. Polymerase idling method for single molecule DNA sequencing
US10385335B2 (en) 2013-12-05 2019-08-20 Centrillion Technology Holdings Corporation Modified surfaces
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
KR102321956B1 (ko) 2014-01-31 2021-11-08 스위프트 바이오사이언시스 인코포레이티드 Dna 기질을 처리하는 개선 방법
US10309879B2 (en) 2014-02-21 2019-06-04 Massachusetts Institute Of Technology Expansion microscopy
WO2015175188A1 (en) 2014-05-14 2015-11-19 General Electric Company Microfluidic flow cell assemblies for imaging and method of use
WO2016007839A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 President And Fellows Of Harvard College Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy
EP3754027A1 (en) 2014-12-01 2020-12-23 The Broad Institute, Inc. Methods for altering or modulating spatial proximity between nucleic acids inside of a cell
EP3258952A4 (en) 2015-02-04 2018-12-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Multimeric protected fluorescent reagents
GB201502152D0 (en) 2015-02-10 2015-03-25 Nuclera Nucleics Ltd Novel use
AU2016220404B2 (en) 2015-02-17 2021-05-27 Mgi Tech Co., Ltd. DNA sequencing using controlled strand displacement
WO2016138496A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
WO2016154345A1 (en) 2015-03-24 2016-09-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for single molecule composition loading
US11085073B2 (en) 2015-04-24 2021-08-10 Qiagen Gmbh Method for immobilizing a nucleic acid molecule on a solid support
WO2016190236A1 (ja) 2015-05-28 2016-12-01 コニカミノルタ株式会社 インサイチュハイブリダイゼイション用のプローブ試薬
ES2789349T3 (es) 2015-05-29 2020-10-26 Illumina Cambridge Ltd Utilización mejorada de cebadores de superficie en grupos
JP6698708B2 (ja) 2015-06-09 2020-05-27 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 分子タグ付けのための方法、システム、組成物、キット、装置、及びコンピュータ可読媒体
EP3320115B1 (en) 2015-07-06 2020-09-02 Life Technologies Corporation Substrates and methods useful in sequencing
US20180195099A1 (en) 2015-07-07 2018-07-12 Thermo Fisher Scientific Geneart Gmbh Enzymatic synthesis of nucleic acid sequences
WO2017014762A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 Omniome, Inc. Nucleic acid sequencing methods and systems
US10077470B2 (en) 2015-07-21 2018-09-18 Omniome, Inc. Nucleic acid sequencing methods and systems
ES2888626T3 (es) * 2015-07-27 2022-01-05 Illumina Inc Cartografiado espacial de información de secuencia de ácidos nucleicos
MA42667A (fr) 2015-08-20 2021-05-05 Genomatica Inc Compositions et systèmes multiplexés pour la transcription-traduction et la synthèse protéique couplées sans cellules et procédés pour les utiliser
JP6882282B2 (ja) 2015-11-03 2021-06-02 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 三次元核酸含有マトリックスの立体撮像のための方法と装置
WO2017087724A1 (en) 2015-11-17 2017-05-26 Omniome, Inc. Methods for determining sequence profiles
WO2017087974A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Pacific Biosciences Of California, Inc. Protected dye-labeled reagents
EP3376997B1 (en) 2015-11-20 2024-11-13 Pacific Biosciences of California, Inc. Labeled nucleotide analogs, reaction mixtures, and methods and systems for sequencing
EP3397950A1 (en) 2015-12-30 2018-11-07 Omniome, Inc. Sequencing device
WO2017117235A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Omniome, Inc. Sequencing methods for double stranded nucleic acids
WO2017120385A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 California Institute Of Technology Polymeric compositions and related systems and methods for regulating biological hydrogels
US11326206B2 (en) 2016-04-07 2022-05-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods of quantifying target nucleic acids and identifying sequence variants
KR102254451B1 (ko) 2016-04-22 2021-05-20 옴니옴 인코포레이티드 뉴클레오타이드-특이적 삼원 복합체 형성의 향상된 검출을 사용하는 핵산 서열 결정 방법 및 시스템
US10597643B2 (en) 2016-04-29 2020-03-24 Omniome, Inc. Polymerases engineered to reduce nucleotide-independent DNA binding
EP3449012B1 (en) 2016-04-29 2020-12-23 Omniome, Inc. Sequencing method employing ternary complex destabilization to identify cognate nucleotides
CA3022431C (en) 2016-04-29 2023-03-21 Omniome, Inc. Method of nucleic acid sequence determination
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10428378B2 (en) 2016-08-15 2019-10-01 Omniome, Inc. Sequencing method for rapid identification and processing of cognate nucleotide pairs
KR102230444B1 (ko) 2016-08-15 2021-03-23 옴니옴 인코포레이티드 핵산을 시퀀싱하기 위한 방법 및 시스템
US9994541B2 (en) 2016-08-23 2018-06-12 Institut Pasteur De Montevideo Nitroalkene trolox derivatives and methods of use thereof in the treatment and prevention of inflammation related conditions
US11248254B2 (en) 2016-12-30 2022-02-15 Omniome, Inc. Method and system employing distinguishable polymerases for detecting ternary complexes and identifying cognate nucleotides
US9932631B1 (en) 2017-09-11 2018-04-03 Omniome, Inc. Genotyping by polymerase binding
CN110249059B (zh) 2017-01-20 2021-04-13 欧姆尼欧美公司 核酸的等位基因特异性捕获
US10975427B2 (en) 2017-01-20 2021-04-13 Omniome, Inc. Process for cognate nucleotide detection in a nucleic acid sequencing workflow
EP3583214B1 (en) 2017-02-02 2023-11-22 New York Genome Center, Inc. Methods and compositions for identifying or quantifying targets in a biological sample
WO2018152244A1 (en) 2017-02-14 2018-08-23 Seqwell, Inc. Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US11492666B2 (en) 2017-02-15 2022-11-08 Pacific Biosciences Of California, Inc. Distinguishing sequences by detecting polymerase dissociation
EP4011396A1 (en) 2017-03-10 2022-06-15 QuiaPEG Pharmaceuticals AB Releasable conjugates
US10737267B2 (en) 2017-04-04 2020-08-11 Omniome, Inc. Fluidic apparatus and methods useful for chemical and biological reactions
US9951385B1 (en) 2017-04-25 2018-04-24 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
US10161003B2 (en) 2017-04-25 2018-12-25 Omniome, Inc. Methods and apparatus that increase sequencing-by-binding efficiency
AU2018302034B2 (en) 2017-07-18 2021-05-20 Pacific Biosciences Of California, Inc. Method of chemically modifying plastic surfaces
WO2019035897A1 (en) 2017-08-15 2019-02-21 Omniome, Inc. SCANNING APPARATUS AND METHODS USEFUL FOR DETECTION OF CHEMICAL OR BIOLOGICAL ANALYTES
CA3078158A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Cartana Ab Rna templated ligation
WO2019079593A1 (en) 2017-10-19 2019-04-25 Omniome, Inc. BACKGROUND NOISE REDUCTION AND STABILIZATION OF SIMULTANEOUS COMPLEXES IN LINKED ASSAY WORKFLOWS
IL271026B2 (en) 2017-12-21 2024-11-01 Illumina Inc Flow cells with hydrogel coating
KR20200139671A (ko) 2018-02-06 2020-12-14 옴니옴 인코포레이티드 핵산 프라이머 연장을 위한 조성물 및 기술
WO2019157529A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
CA3097583A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Omniome, Inc. Improving accuracy of base calls in nucleic acid sequencing methods
WO2019209946A1 (en) 2018-04-25 2019-10-31 Qiagen Sciences Llc Sequential paired-end sequencing
US10400272B1 (en) 2018-04-26 2019-09-03 Omniome, Inc. Methods and compositions for stabilizing nucleic acid-nucleotide-polymerase complexes
WO2019231568A1 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Omniome, Inc. Increased signal to noise in nucleic acid sequencing
GB2589496B (en) 2018-06-12 2023-01-25 Element Biosciences Inc Improved reverse transcriptase for nucleic acid sequencing
CN112567048B (zh) 2018-07-24 2026-01-23 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 三元复合物种类的连续形成
CN112770776B (zh) 2018-07-30 2025-08-19 瑞德库尔有限责任公司 用于样品处理或分析的方法和系统
EP3853358A1 (en) 2018-09-17 2021-07-28 Omniome, Inc. Engineered polymerases for improved sequencing
WO2020076976A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Three-dimensional spatial molecular indexing
WO2020076979A1 (en) 2018-10-10 2020-04-16 Readcoor, Inc. Surface capture of targets
US10768173B1 (en) 2019-09-06 2020-09-08 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
US10876148B2 (en) 2018-11-14 2020-12-29 Element Biosciences, Inc. De novo surface preparation and uses thereof
US20200149095A1 (en) 2018-11-14 2020-05-14 Element Biosciences, Inc. Low binding supports for improved solid-phase dna hybridization and amplification
US10704094B1 (en) 2018-11-14 2020-07-07 Element Biosciences, Inc. Multipart reagents having increased avidity for polymerase binding
GB2613480B (en) 2018-11-15 2023-11-22 Element Biosciences Inc Methods for generating circular nucleic acid molecules
WO2020118255A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Element Biosciences, Inc. Flow cell device and use thereof
EP3894590B1 (en) 2018-12-10 2025-10-22 10X Genomics, Inc. Methods of using master / copy arrays for spatial detection
WO2020126602A1 (en) 2018-12-18 2020-06-25 Illumina Cambridge Limited Methods and compositions for paired end sequencing using a single surface primer
US20200347443A1 (en) 2019-05-01 2020-11-05 Element Biosciences, Inc. Nucleic acid hybridization methods
US20210332430A1 (en) 2020-01-17 2021-10-28 Element Biosciences, Inc. High performance fluorescence imaging module for genomic testing assay
US20250027144A1 (en) 2019-05-01 2025-01-23 Element Biosciences, Inc. High performance fluorescence imaging module for genomic testing assay
WO2020242901A1 (en) 2019-05-24 2020-12-03 Element Biosciences, Inc. Polymerase-nucleotide conjugates for sequencing by trapping
US12391929B2 (en) 2019-05-24 2025-08-19 Element Biosciences, Inc. Polymerase-nucleotide conjugates for sequencing by trapping
SG11202112049VA (en) 2019-05-24 2021-12-30 Element Biosciences Inc Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
US20220186310A1 (en) 2019-05-24 2022-06-16 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
US10872678B1 (en) 2019-06-19 2020-12-22 Micron Technology, Inc. Speculative section selection within a memory device
CN114364797B (zh) 2019-09-18 2023-10-20 株式会社日立高新技术 生物分子分析方法
EP4034677A4 (en) * 2019-09-23 2023-11-01 Element Biosciences, Inc. Methods for cellularly addressable nucleic acid sequencing
US11287422B2 (en) 2019-09-23 2022-03-29 Element Biosciences, Inc. Multivalent binding composition for nucleic acid analysis
US12448648B2 (en) 2019-12-23 2025-10-21 Mgi Tech Co., Ltd. Controlled strand-displacement for paired end sequencing
US11408032B2 (en) 2020-01-17 2022-08-09 Element Biosciences, Inc. Tube lens design for improved depth-of-field
EP4484571A3 (en) * 2020-02-21 2025-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for integrated in situ spatial assay
CA3178970A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Sinan ARSLAN Methods for paired-end sequencing library preparation
US11198121B1 (en) 2020-06-10 2021-12-14 Element Biosciences, Inc. Flow cell systems and devices
EP4153606A4 (en) 2020-07-13 2024-10-02 Singular Genomics Systems, Inc. METHODS FOR SEQUENCING COMPLEMENTARY POLYNUCLEOTIDES
WO2022026891A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Element Biosciences, Inc. Multiplexed covid-19 padlock assay
US12359193B2 (en) 2022-03-04 2025-07-15 Element Biosciences, Inc. Single-stranded splint strands and methods of use
US11200446B1 (en) 2020-08-31 2021-12-14 Element Biosciences, Inc. Single-pass primary analysis
IL302207A (en) 2020-10-21 2023-06-01 Illumina Inc Sequencing templates comprising multiple inserts and compositions and methods for improving sequencing throughput
GB2617481B (en) 2020-10-30 2025-07-02 Element Biosciences Inc Reagents for massively parallel nucleic acid sequencing
WO2022140291A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 Singular Genomics Systems, Inc. Systems and methods for multicolor imaging
US20230193354A1 (en) 2021-06-17 2023-06-22 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
US11859241B2 (en) 2021-06-17 2024-01-02 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
WO2022266470A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
US11220707B1 (en) 2021-06-17 2022-01-11 Element Biosciences, Inc. Compositions and methods for pairwise sequencing
KR20240063107A (ko) 2021-07-21 2024-05-10 엘리먼트 바이오사이언스, 인크. 핵산 시퀀싱을 위한 광학 시스템 및 이의 방법
EP4419709A4 (en) 2021-11-23 2025-02-26 Pleno, Inc. MULTIPLEXED DETECTION OF TARGET BIOMOLECULES
US12006518B2 (en) 2022-02-18 2024-06-11 Element Biosciences, Inc. Engineered polymerases with reduced sequence-specific errors
AU2023258027A1 (en) 2022-04-20 2024-12-05 Element Biosciences, Inc. Reiterative short read sequencing inside a cellular sample
AU2023325064A1 (en) 2022-08-15 2025-03-06 Element Biosciences, Inc. Spatially resolved surface capture of nucleic acids
JP2025528823A (ja) 2022-08-15 2025-09-02 エレメント バイオサイエンシズ，インコーポレイティド コンパクト化オリゴヌクレオチドを使用して核酸ナノ構造を調製するための方法
IL321227A (en) 2022-12-07 2025-07-01 Element Biosciences Inc Cyanines dissolved in water and their use in nucleic acid sequencing methods
CN117025838A (zh) 2023-06-02 2023-11-10 重庆医科大学国际体外诊断研究院 一种靶向纳米磁珠特异性提取新型冠状病毒核酸的方法
WO2025165512A1 (en) 2024-02-02 2025-08-07 Element Biosciences, Inc. Amplification-free probe complexes for detection of target analytes
WO2025166157A1 (en) 2024-02-02 2025-08-07 Element Biosciences, Inc. Three-dimensional base calling in next generation sequencing analysis

Also Published As

Publication number Publication date
US20240052398A1 (en) 2024-02-15
JP2025528821A (ja) 2025-09-02
IL318890A (en) 2025-04-01
US12540350B2 (en) 2026-02-03
AU2023325064A1 (en) 2025-03-06
CA3264896A1 (en) 2024-02-22
WO2024040068A1 (en) 2024-02-22
EP4573213A1 (en) 2025-06-25
KR20250070619A (ko) 2025-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN120019162A (zh) 核酸的空间分辨表面捕获
US12421545B2 (en) Compositions and methods for preparing nucleic acid nanostructures using compaction oligonucleotides
US12606819B2 (en) PCR-free library preparation using double-stranded splint adaptors and methods of use
CN119487205A (zh) 单链夹板链和使用方法
KR102607124B1 (ko) 핵산 분석을 위한 다가 결합 조성물
CN120380144A (zh) 具有通用长夹板链的双链夹板衔接子及其使用方法
CN119173640A (zh) 双链夹板衔接子和使用方法
US20230392144A1 (en) Compositions and methods for reducing base call errors by removing deaminated nucleotides from a nucleic acid library
US20250019760A1 (en) Compositions and methods for sequencing multiple regions of a template molecule using enzyme-based reagents
CN119585800A (zh) 下一代测序中的碱基判读的落后和前出校正
CN120345030A (zh) 下一代测序分析中的三维碱基识别
CN119630954A (zh) 初步分析中的图像配准
WO2025120579A1 (en) Compositions and methods for sequencing multiple regions of a template molecule using read-capping nucleotide analogs
WO2025212655A1 (en) Multiple priming for on-support nucleic acid amplification
HK40124222A (zh) 用於通过从核酸文库中移除脱氨基核苷酸来减少碱基识别误差的组合物和方法
KR20260058236A (ko) 고정화된 핵산 콘카테머 분자를 생성하기 위한 지지체상 원형화 및 증폭
HK40128283A (zh) 用於使用压实寡核苷酸制备核酸纳米结构的组合物和方法
HK40122940A (zh) 单链夹板链和使用方法
CN118696133A (zh) 用于成对测序的组合物和方法
WO2025235016A1 (en) Sequencing method with spatial flexibility
HK40129261A (zh) 具有通用长夹板链的双链夹板衔接子及其使用方法
HK40117539A (zh) 用於成对测序的组合物和方法
HK40067679A (zh) 用於核酸分析的多价结合组合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40126330

Country of ref document: HK