CN119464455B - 用于5hmC-DNA前处理的试剂盒和前处理方法、用于检测5hmC-DNA的光电化学传感器和5hmC-DNA的检测方法 - Google Patents

用于5hmC-DNA前处理的试剂盒和前处理方法、用于检测5hmC-DNA的光电化学传感器和5hmC-DNA的检测方法

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Abstract

本发明涉及生物传感技术领域，尤其涉及一种用于5hmC‑DNA前处理的试剂盒和前处理方法、用于检测5hmC‑DNA的光电化学传感器和5hmC‑DNA的检测方法。本发明利用叠氮化反应对5hmC靶标特异性反应形成Y型支架结构，结合等温放大技术对Y型支架实现信号转化输出；在此基础上构建三元异质结光催化剂Cu2O@CuO@Ag的光电化学分析策略，利用信号转化输出结构及催化介质放大原理，实现光电化学响应信号的双重放大，进而提高检测的灵敏度。通过光电化学信号响应与目标序列之间的量效关系，建立不同丰度DNA羟甲基化与电化学响应信号数学模型，达到5hmC‑DNA羟甲基化定量分析的目的。

Description

用于5hmC-DNA前处理的试剂盒和前处理方法、用于检测5hmC- DNA的光电化学传感器和5hmC-DNA的检测方法
技术领域
本发明涉及生物传感技术领域，尤其涉及一种用于5hmC-DNA前处理的试剂盒和前处理方法、用于检测5hmC-DNA的光电化学传感器和5hmC-DNA的检测方法。
背景技术
5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)是表观遗传修饰的一种模式，主要是由TET(ten-eleven translocation，TET)蛋白酶催化5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)产生，是继5mC之后发现的“第六种碱基”。迄今，国内外已有大量研究表明，在乳腺癌HOXA、LZTS1、TNFA基因，结肠癌CA2、FMN2、PDCD4、PKIB基因，肺癌SOD3基因等多种癌症基因中5hmC的整体含量均有显著降低；而在良性子宫平滑肌瘤、急性髓系白血病和胶质母细胞瘤中，5hmC总体水平呈升高趋势；此外，骨髓增生异常综合征、亨廷顿病和阿尔茨海默病中也发现异常的5hmC分布。所以，5hmC不仅是去甲基化过程的关键中间体，同时还充当着独立的表观遗传标记，而且是疾病诊断和预后的重要生物标志物。由于表观修饰调控基因表达发生在肿瘤发生发展的早期阶段，而肿瘤的影像学阳性结果的发现，往往在肿瘤中晚期，同时蛋白类肿瘤标志物的检测也是在肿瘤形成之后的生化检测，所以，对5hmC修饰水平的检测属于更早期的检测。同时，对肿瘤的特征性靶基因的检测，与现今实验室开展的蛋白类肿瘤标志物的检测比较，在方法学上具有更好的特异性。因此，表观遗传DNA羟甲基化水平已成为肿瘤早期特异性诊断的新靶标，而特定序列DNA羟甲基化的定量分析可为理解疾病发展的表观遗传规律及肿瘤早期特异性诊断提供有力支持。
目前报道的DNA羟甲基化分析方法主要有以下几种：①基于液相色谱-质谱联用的分析技术(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)，LC-MS分析主要将色谱的分离能力与质谱的定性检测相结合，通过将DNA样品酶解成单核苷酸后，进样到色谱柱内，测得各个峰值后绘制质谱图。该技术尽管特异性高，且可提供各个组分组成占比，但无法实现单碱基分辨率，且单次检测样品量少。②基于糖基化标记原理的分析技术，主要指通过放射性标记的葡萄糖通过酶促反应，将放射性物质特异性标记到目的基因的5hmC碱基，进而进行富集纯化靶基因。该方法虽灵敏度较高，费用较低且操作方便，但存在放射性污染和酶促反应不彻底的问题。③基于单分子测序技术，单分子DNA测序即通过光信号、电信号等手段来区分不同的碱基。该技术碱基识别错误率高达18～20％，准确性差，此外检测后庞大的数据处理和对检测设备的特殊要求导致其难以在临床实验室推广。
综上，如何从大量的C(胞嘧啶，Cytosine，C)和5mC位点中，在单碱基分辨率水平获得准确和特定的5hmC，仍面临重大挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于5hmC-DNA前处理的试剂盒和前处理方法、用于检测5hmC-DNA的光电化学传感器和5hmC-DNA的检测方法。使用本发明的前处理方法对5hmC-DNA进行处理后再进行检测，能够在单碱基分辨率水平特异性检测5hmC，检测灵敏度高，操作简单，成本低，不存在放射性污染。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于5hmC-DNA前处理的试剂盒，包括NE缓冲液、尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖溶液、T4噬菌体β-葡萄糖转移酶、DBCO修饰的引物Yc、DNA链Ya、DNA链Yb、DNA链H1、DNA链H2、DNA链S1、脱氧核苷酸三磷酸盐溶液、DNA聚合酶和切刻内切酶；
所述引物Yc的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA链Ya的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述DNA链Yb的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述DNA链H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述DNA链H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述DNA链S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明提供了一种5hmC-DNA的前处理方法，利用上述方案所述的试剂盒对5hmC-DNA进行处理，包括以下步骤：
将NE缓冲液、尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖溶液、T4噬菌体β-葡萄糖转移酶和待处理5hmC-DNA样品混合，将所得混合液在37℃进行叠氮化反应，得到叠氮化标记的5hmC溶液；
将所述叠氮化标记的5hmC溶液与DBCO修饰的引物Yc混合，在37℃进行点击化学反应，得到5hmC-Yc；
将所述5hmC-Yc、DNA链Ya和DNA链Yb混合，在37℃进行杂交反应，得到Y形支架；
将所述Y形支架与DNA链H1、DNA链H2混合，在37℃进行组装，形成含发卡Y形支架；
将所述含发卡Y形支架与DNA链S1混合，在37℃进行链置换反应，将所得反应液与脱氧核苷酸三磷酸盐、DNA聚合酶和切刻内切酶混合，在37℃进行第一孵育。
优选的，所述5hmC-Yc、DNA链Ya和DNA链Yb的摩尔比为1:1:1；
所述Y形支架与DNA链H1、DNA链H2的摩尔比为1:1:1。
本发明提供了一种用于检测5hmC-DNA的光电化学传感器，包括负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极、NH3修饰的DNA链H3、乙硫醇、上述方案所述的试剂盒ALP-H4溶液；
所述DNA链H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述ALP-H4溶液中的ALP-H4为Biotin-H4-Biotin，其中，所述H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选的，所述负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极的制备方法包括：将Cu2O@CuO@Ag分散到水中，得到Cu2O@CuO@Ag悬浮液；将所述Cu2O@CuO@Ag悬浮液滴加到导电基底表面后进行干燥和煅烧，得到负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极。
优选的，还包括MES缓冲液和Tris缓冲液；
所述MES缓冲液中含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；
所述Tris缓冲液含有L-抗坏血酸-2-磷酸三钠。
一种利用上述方案所述的光电化学传感器非疾病诊断目的的检测5hmC-DNA的方法，包括以下步骤：
将NH3修饰的DNA链H3进行加热后冷却，形成发夹结构的H3；
在负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极表面加入发夹结构的H3，进行结合，形成H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；
在所述H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面加入乙硫醇进行第二孵育，形成HT层，得到HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；所述HT为乙硫醇；
利用所述试剂盒按照上述方案所述的前处理方法对待检样品进行前处理，得到序列P溶液；
将所述序列P溶液加入到HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面，进行第三孵育，形成P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；
将ALP-H4溶液加入到P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面进行第四孵育，形成光电化学传感器；
将所述光电化学传感器置于含有L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐的Tris-HCl缓冲液中进行光电流测试，测得光电流强度，根据光电流强度与5hmC-DNA浓度对数的线性关系计算得到待检样品中5hmC-DNA的含量。
优选的，在负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极表面加入发夹结构的H3前，还包括利用MES缓冲液对负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极进行活化。
优选的，完成所述第四孵育后，还包括在形成的ALP-H4/P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面加入Tris缓冲液。
优选的，所述结合的温度为37℃，时间为1.5h。
本发明的检测原理为：Cu2O@CuO@Ag三元复合材料作为PEC(光电化学传感器)的基础光电流，利用叠氮化反应对5hmC靶标特异性反应形成Y型支架结构，结合自触发等温放大技术对Y型支架实现信号扩增策略，从而将5hmC位点转化为大量的序列P(具体的，S1启动自触发等温放大技术，S1与发卡H1结合打开，H1茎段内的自引物域暴露并重排，H1的延伸不断重复延伸和酶切反应，从而将5hmC位点转化为大量的序列P)。在电极上引入序列P与H3结合，打开发卡H3后，随之与带有ALP的H4探针(即ALP-H4)识别，ALP催化Tris-HCl缓冲液中AAP(L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐)水解，产生更多的AA(抗坏血酸)电子供体，用于PEC检测。
本发明利用叠氮化反应对5hmC靶标特异性反应形成Y型支架结构，结合自触发等温放大技术对Y型支架实现信号转化输出；在此基础上构建三元异质结光催化剂Cu2O@CuO@Ag的光电化学分析策略，利用信号转化输出结构及催化介质放大原理，实现光电化学响应信号的双重放大，进而实现5hmC的特异性检测，并提高检测的灵敏度。通过光电化学信号响应与目标序列之间的量效关系，建立不同丰度DNA羟甲基化与电化学响应信号数学模型，达到5hmC-DNA羟甲基化定量分析的目的。
实施例的结果表明，本发明对5hmC的检测限为0.42fM(信噪比S/N＝3)。
附图说明
图1为本发明5hmC-DNA前处理的流程示意图；
图2为检测5hmC-DNA的方法流程示意图；
图3为Cu2O@CuO@Ag的SEM图；
图4为不同已知浓度的5hmC-DNA的光电流强度曲线；
图5为光电流强度与5hmC-DNA浓度的对数之间的标准曲线；
图6为不同光化学传感器的电化学阻抗谱；
图7为特异性检测实验结果。
具体实施方式
本发明提供了一种用于5hmC-DNA前处理的试剂盒，包括NE缓冲液、尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖溶液、T4噬菌体β-葡萄糖转移酶、DBCO修饰的引物Yc、DNA链Ya、DNA链Yb、DNA链H1、DNA链H2、DNA链S1、脱氧核苷酸三磷酸盐溶液、DNA聚合酶和切刻内切酶。
在本发明中，未经特殊说明，所用原料均为本领域熟知的市售商品。
在本发明中，所述NE缓冲液优选由Tris-HCl、MgCl2和二硫苏糖醇(DTT)组成，所述NE缓冲液的pH值优选为6.0.。
本发明对所述尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖(UDP-6-N3-Glu)溶液的浓度没有特殊要求，在本发明的实施例中，具体为200nM。
本发明对所述T4噬菌体β-葡萄糖转移酶(T4-β-GT)的活力没有特殊要求，在本发明的实施例中，所述T4噬菌体β-葡萄糖转移酶的单位活力优选为20U/mL。
在本发明中，所述引物Yc的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为G GACAGACGGATTTCCTCTAGTACTCCTGTGTGACTCCA，所述DBCO修饰的引物Yc具体为：GGACAGACGGATTTCCTCTAGTACTCCTGTGTGACTCCA-DBCO，其中，DBCO为二苯并环辛烯。在本发明中，所述DBCO修饰的引物Yc由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
在本发明中，所述DNA链Ya的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；具体为GAATGCTGCGTGTAATCCGTCTGTCCACTGGCTACTGTC。
在本发明中，所述DNA链Yb的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；具体为GAGTACTAGAGGAACACGCAGCATTCACCTGTCTGTCGT。
在本发明中，所述DNA链H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；具体为TGGAAAATCTCTAGCAGTACGTACACTGCTAGAGGCCGTGTAGGATCCG AATTTTTTTTGACAGTAGCCAGT。
在本发明中，所述DNA链H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；具体为ACTGCTAGAGATTTTCCACGGCCTCTAGCAGTGTACGTTTTTTTTTTTAC GACAGACAGGT。
在本发明中，所述DNA链S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；具体为GAGATTTTCCA。
在本发明中，上述各DNA链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
在本发明中，所述脱氧核苷酸三磷酸盐(dNTP)溶液的浓度优选为500μM。
在本发明中，所述DNA聚合酶优选为KF DNA聚合酶；所述DNA聚合酶的活力优选为100U/mL。
在本发明中，所述切刻内切酶(Nicking Endonuclease，Nt.BbvCI)的活力优选为500U/mL。
本发明提供了一种5hmC-DNA的前处理方法，利用上述方案所述的试剂盒对5hmC-DNA进行处理，包括以下步骤：
将NE缓冲液、尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖溶液、T4噬菌体β-葡萄糖转移酶和待处理5hmC-DNA样品混合，将所得混合液在37℃进行叠氮化反应，得到叠氮化标记的5hmC溶液；
将所述叠氮化标记的5hmC溶液与DBCO修饰的引物Yc混合，在37℃进行点击化学反应，得到5hmC-Yc；
将所述5hmC-Yc、DNA链Ya和DNA链Yb混合，在37℃进行杂交反应，得到Y形支架；
将所述Y形支架与DNA链H1、DNA链H2混合，在37℃进行组装，形成含发卡Y形支架；
将所述含发卡Y形支架与DNA链S1混合，在37℃进行链置换反应，将所得反应液与脱氧核苷酸三磷酸盐、DNA聚合酶和切刻内切酶混合，在37℃进行第一孵育。
本发明将NE缓冲液、尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖溶液、T4噬菌体β-葡萄糖转移酶和待处理5hmC-DNA样品混合，将所得混合液在37℃进行叠氮化反应，得到叠氮化标记的5hmC溶液。
在本发明中，所述尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖溶液的用量优选满足混合液中尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖(UDP-6-N3-Glu)的浓度为6～7nM为宜；T4噬菌体β-葡萄糖转移酶(T4-β-GT)的用量优选满足所述混合液中T4-β-GT的浓度为0.06～0.07U/mL为宜。
本发明对所述待处理5hmC-DNA样品没有特殊要求，在本发明的实施例中，具体采用生工生物工程(上海)股份有限公司合成的5hmC-DNA。在本发明中，所述5hmC的核苷酸序列为将SEQ ID NO.9所示序列的第18位C替换为5hm C。在本发明中，所述NE缓冲液与待处理5hmC-DNA样品的体积比优选为9:20。
在本发明中，所述叠氮化反应的时间优选为2h。本发明在所述叠氮化反应过程中，T4-β-GT在葡萄糖供体UDP-6-N3-Glu存在的情况下，将5-羟甲基胞嘧啶糖基化生成β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶(β-glucosyl-5-hydroxymethylcytosine，5-ghmC)，实现叠氮化标记。
完成所述叠氮化反应后，本发明优选将反应后体系用DNA纯化试剂盒进行纯化，去除UDP-6-N3-Glu和T4噬菌体β-葡萄糖转移酶，得到叠氮化标记的5h mC溶液。
得到叠氮化标记的5hmC溶液后，本发明将所述叠氮化标记的5hmC溶液与DBCO修饰的引物Yc混合，在37℃进行点击化学反应，得到5hmC-Yc。
在本发明中，所述叠氮化标记的5hmC溶液中叠氮化标记的5hmC与DBC O修饰的引物Yc的摩尔比优选为1:1。
在本发明中，所述点击化学反应的时间优选为24h。
得到5hmC-Yc后，本发明将所述5hmC-Yc、DNA链Ya和DNA链Yb混合，在37℃进行杂交反应，得到Y形支架。
在本发明中，所述5hmC-Yc、DNA链Ya和DNA链Yb的摩尔比优选为1:1:1。在本发明中，所述杂交反应的时间优选为2h。本发明在所述杂交反应过程中Ya、Yb、Yc两两相互杂交反应。
得到Y形支架后，本发明将所述Y形支架与DNA链H1、DNA链H2混合，在37℃进行组装，形成含发卡Y形支架。
在本发明中，所述Y形支架与DNA链H1、DNA链H2的摩尔比优选为1:1:1。在本发明中，所述组装的时间优选为2h。
形成含发卡Y形支架后，本发明将所述含发卡Y形支架与DNA链S1混合，在37℃进行链置换反应，得到反应液。
在本发明中，所述含发卡Y形支架与DNA链S1的摩尔比优选为1:1。
在本发明中，所述链置换反应的时间优选为2h。本发明利用DNA链S1打开发卡H1，随后H1与H2发生杂交反应。
得到反应液后，将所述反应液与脱氧核苷酸三磷酸盐、DNA聚合酶和切刻内切酶混合，在37℃进行第一孵育。
在本发明中，所述反应液与脱氧核苷酸三磷酸盐、DNA聚合酶和切刻内切酶的体积比优选为2000：50：4：25。
在本发明中，所述第一孵育的时间优选为2h。本发明通过第一孵育产生大量信号识别-转换元件P序列。
完成所述第一孵育后，本发明优选还包括将所得溶液进行灭活，灭活后得到的溶液记为P溶液。本发明对所述灭活的条件没有特殊要求，能够达到灭活效果即可。在本发明的实施例中，具体是在80℃灭活20min。
图1为本发明5hmC-DNA前处理的流程示意图。
本发明利用叠氮化反应对5hmC靶标特异性反应形成Y型支架结构，结合自触发等温放大技术对Y型支架实现信号转化输出，实现光电化学信号的放大。
本发明提供了一种用于检测5hmC-DNA的光电化学传感器，包括负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极、NH3修饰的DNA链H3、乙硫醇、上述方案所述的试剂盒和ALP-H4溶液。
在本发明中，所述负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极的制备方法优选包括：将Cu2O@CuO@Ag分散到水中，得到Cu2O@CuO@Ag悬浮液；将所述Cu2O@CuO@Ag悬浮液滴加到导电基底表面后进行干燥和煅烧，得到负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极。
下面先对Cu2O@CuO@Ag进行说明。
在本发明中，所述Cu2O@CuO@Ag优选包括Cu2O@CuO和负载在所述Cu2O@CuO表面的Ag粒子。所述Ag粒子的质量优选为Cu2O@CuO质量的9～10％。
在本发明中，所述Cu2O@CuO@Ag采用本领域熟知的方法制备得到；所述Cu2O@CuO@Ag的制备方法优选包括以下步骤：
将Cu2O分散到水中，向所得分散液中加入硝酸盐，固液分离，得到Cu2O@CuO；
将所述Cu2O@CuO分散到水-乙醇混合溶液中，将所得分散液与硝酸银溶液混合，进行光照反应，固液分离，得到Cu2O@CuO@Ag。
本发明将Cu2O分散到水中，向所得分散液中加入硝酸盐进行氧化反应，固液分离，得到Cu2O@CuO。
在本发明中，所述Cu2O可以采用市售商品或采用本领域熟知的方法制备得到。在本发明的实施例中，所述Cu2O为自制得到，具体的，将0.375g CuSO4·5H2O加入浓度为0.5mM无水柠檬酸钠80mL中，在剧烈搅拌下形成浅蓝色溶液；然后，向上述溶液中加入浓度1.25M20mLNaOH，得到深蓝色悬浮液；随后，将0.03M 50mL的抗坏血酸溶液逐滴加入悬浮液中，并以恒定速度搅拌30min，静置1h后离心，获得砖红色颗粒，并用去离子水和无水乙醇分别洗涤三次；最后，将颗粒在60℃的真空烘箱中干燥过夜，得到Cu2O。
在本发明中，所述水优选为去离子水；本发明对所述水的用量没有特殊要求，能够将Cu2O分散均匀即可。在本发明中，所述硝酸盐优选为硝酸钾；所述Cu2O与硝酸盐的质量比优选为2:1。本发明优选在搅拌条件下将硝酸盐加入到分散液中。在本发明中，所述氧化反应的时间优选为1h；所述氧化反应优选在搅拌条件下进行。所述氧化反应的方程式为3Cu2O+2NO3 -→6CuO+2NO↑+O2-。
在本发明中，所述固液分离优选为离心。完成所述固液分离后，本发明优选将所得沉淀用去离子水和无水乙醇洗涤三次，随后在60℃下真空干燥过夜，得到Cu2O@CuO。
得到Cu2O@CuO后，本发明将所述Cu2O@CuO分散到水-乙醇混合溶液中，将所得分散液与硝酸银溶液混合，进行光照反应，固液分离，得到Cu2O@CuO@Ag。
在本发明中，所述水-乙醇混合溶液中水和乙醇的体积比优选为1:1；本发明对所述水-乙醇混合溶液的用量没有特殊要求，能够将Cu2O@CuO分散均匀即可。在本发明中，所述分散优选在超声条件下进行。本发明对所述硝酸银溶液的浓度没有特殊要求，优选满足硝酸银溶液中Ag的质量为Cu2O@CuO质量的9～10％，更优选为10％。
在本发明中，所述光照反应优选在光反应器中进行；所述光照反应优选由300WXe灯提供光源，所述光照反应优选为在搅拌条件下照射1h。本发明优选在整个光照过程中通过循环水使反应温度保持在10～20℃。本发明通过光沉积将银粒子附着到Cu2O@CuO上。
在本发明中，所述固液分离优选为离心。完成所述固液分离后，本发明优选将所得沉淀洗涤，随后在60℃下真空干燥过夜，经过研磨，得到Cu2O@CuO@Ag粉体。
下面对负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极的制备方法进行说明。
本发明将Cu2O@CuO@Ag分散到水中，得到Cu2O@CuO@Ag悬浮液；将所述Cu2O@CuO@Ag悬浮液滴加到导电基底表面后进行干燥和煅烧，得到负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极。
在本发明中，所述Cu2O@CuO@Ag悬浮液的浓度优选为2mg/mL。
在本发明中，所述导电基底优选为ITO导电玻璃。将所述Cu2O@CuO@Ag悬浮液滴加到导电基底表面前，本发明优选先用丙酮、乙醇和去离子水依次超声清洗导电基底10min，氮气中干燥。
在本发明中，所述Cu2O@CuO@Ag悬浮液的用量优选满足Cu2O@CuO@Ag的负载量为0.05～0.1mg/cm2为宜，更优选为0.08mg/cm2。
在本发明中，所述干燥优选在室温条件下进行；所述煅烧的温度优选为180℃；所述煅烧的时间优选为40min。本发明通过煅烧将Cu2O@CuO@Ag负载到导电基底表面。
下面对本发明提供的用于检测5hmC-DNA的光电化学传感器进行说明。
在本发明中，所述用于检测5hmC-DNA的光电化学传感器，包括负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极、NH3修饰的DNA链H3、乙硫醇、上述方案所述的试剂盒和ALP-H4溶液。
所述负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极上面已经论述。
在本发明中，所述DNA链H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述N H3修饰的DNA链H3具体为CCTACCGGGAAGTCGCGTGTGTAGGATCCGAA TGCCTTT-NH3。在本发明中，所述NH3修饰的DNA链H3由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在本发明中，所述NH3修饰的DNA链H3的浓度优选为1μM。
在本发明中，所述ALP-H4溶液中的ALP-H4为Biotin-H4-Biotin，其中，所述H4的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，具体为ACACGCGACTTCCCG，ALP-H4代表Biotin-ACACGCGACTTCCCG-Biotin。
在本发明中，所述ALP-H4溶液优选由碱性磷酸酶标记链霉亲和素(1mg·mL-1)加入H4(1μM)缓冲液中在室温下孵育90min形成。
在本发明中，所述ALP-H4溶液的浓度优选为1μM。
在本发明中，所述光电化学传感器优选还包括MES缓冲液和Tris缓冲液；所述MES缓冲液中优选含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；所述MES缓冲液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度优选为2mg/mL，N-羟基琥珀酰亚胺的浓度优选为50mM；所述MES缓冲液的pH值优选为5～6，更优选为5.5。
在本发明中，所述Tris缓冲液优选含有L-抗坏血酸-2-磷酸三钠，所述Tris缓冲液中L-抗坏血酸-2-磷酸三钠的浓度优选为100mM；所述Tris缓冲液的pH值优选为7～8，更优选为7.3。
本发明提供了一种利用上述方案所述的光电化学传感器非疾病诊断目的的检测5hmC-DNA的方法，包括以下步骤：
将NH3修饰的DNA链H3进行加热，形成发夹结构的H3；
在负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极表面加入发夹结构的H3，进行结合，形成H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；
在所述H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面加入乙硫醇进行第二孵育，形成HT层，得到HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；所述HT为乙硫醇；
利用所述试剂盒按照上述的前处理方法对待检样品进行前处理，得到序列P溶液；
将所述序列P溶液加入到HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面，进行第三孵育，形成P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；
将ALP-H4溶液加入到P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面进行第四孵育，形成光电化学传感器；
将所述光电化学传感器置于含有L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐的Tris-HCl缓冲液中进行光电流测试，测得光电流强度，根据光电流强度与5hmC-DNA浓度对数的线性关系计算得到待检样品中5hmC-DNA的含量。
本发明将NH3修饰的DNA链H3进行加热后冷却，形成发夹结构的H3。
在本发明中，所述加热的温度优选为95℃，所述加热的时间优选为10min。在本发明中，所述冷却的速率优选为0.1℃·s-1；本发明优选冷却至37℃。本发明通过加热形成发夹结构。
形成发夹结构的H3后，本发明在负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极表面加入发夹结构的H3，进行结合，形成H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底。
加入发夹结构的H3前，本发明优选先利用MES缓冲液对负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极进行活化；所述活化的时间优选为2h。本发明对所述活化的具体操作没有特殊要求，直接将MES缓冲液滴加到负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极表面，2h后用PBS缓冲液冲洗干净即可。
在本发明中，所述发夹结构的H3的与序列P溶液的体积比优选为1:1；所述发夹结构的H3的浓度优选为1μM。
在本发明中，所述结合的温度优选为37℃，所述结合的时间优选为1.5h。在本发明中，H3链上修饰有-NH3，-NH3可与Cu2O@CuO@Ag上的Ag粒子通过配位键相结合。
完成所述结合后，本发明优选用PBS缓冲液进行冲洗，形成H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底。
形成H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底后，本发明在所述H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面加入乙硫醇进行第二孵育，形成HT层，得到HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；所述HT为乙硫醇。
在本发明中，所述第二孵育的温度优选为37℃，时间优选为40min。本发明对所述乙硫醇的加入量没有特殊要求，能够起到阻断非特异性吸附的目的即可。
本发明对待检样品进行前处理，得到序列P溶液；所述前处理的方法上面已经论述，这里不再赘述。
本发明将所述序列P溶液加入到HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面，进行第三孵育，形成P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底。
在本发明中，所述P溶液的用量优选为35～45μL/cm2，更优选为40μL/cm2。在本发明中，所述第三孵育的温度优选为37℃，时间优选为1.5h。本发明在所述第三孵育中，P序列打开发卡H3序列，与H3链杂交互补配对。
完成所述第三孵育后，本发明优选用PBS缓冲液进行冲洗，洗掉未反应的物质，得到P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底。
得到P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底后，本发明将ALP-H4溶液加入到P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面进行第四孵育。
在本发明中，所述ALP-H4溶液的用量优选为35～45μL/cm2，更优选为40μL/cm2。在本发明中，所述第四孵育的温度优选为37℃，时间优选为1.5h。本发明在所述第四孵育中，H4链与H3链杂交互补配对。
完成所述第四孵育后，本发明优选还包括在形成的ALP-H4/P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面加入Tris缓冲液，以提高光电化学传感器的抗缓冲能力。
在本发明中，所述Tris缓冲液的用量优选为35～45μL/cm2，更优选为40μL/cm2。
形成光电化学传感器后，本发明将所述光电化学传感器置于含有L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐的Tris-HCl缓冲液中进行光电流测试，测得光电流强度，根据光电流强度与5hmC-DNA浓度对数的线性关系计算得到待检样品中5hmC-DNA的含量。
在本发明中，所述Tris-HCl缓冲液中L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(AALP)的浓度优选为100mM，所述Tris-HCl缓冲液中tris的浓度优选为0.1M；所述Tris-HCl缓冲液的pH值优选为7～7.5，更优选为7.3。
在本发明中，所述光电流强度的测试条件优选包括：偏置电压为0V，开关光间隔时间为10s。
在本发明中，所述光电流强度与5hmC-DNA浓度对数的线性关系的获得方法同检测5hmC-DNA的方法，不同之处仅在于将待检样品替换为已知5hmC-DNA浓度的标准样品。
在本发明中，所述光电流强度与5hmC-DNA浓度对数的线性关系优选以5hmC浓度的对数(Log C)为横坐标，以光电流强度为纵坐标。
在本发明中，所述利用上述方案所述的光电化学传感器非疾病诊断目的的检测5hmC-DNA的方法流程示意图如图2所示(导电基底以ITO导电玻璃为例)。
本发明通过构建三元异质结光催化剂Cu2O@CuO@Ag的光电化学分析策略，利用信号转化输出结构(P序列)及催化介质放大原理，实现光电化学响应信号的双重放大，进而提高检测的灵敏度。
实施例1
步骤1：基于叠氮化5hmC-DNA靶标构建信号转换元件
1)5hmC-DNA靶标叠氮化物-葡萄糖转移处理：5hmC标记反应在由9μL1×NE缓冲液，1μL 200nMUDP-6-N3-Glu，20μL2μM 5hmC-DNA和0.1μL 20U/mL T4-β-GT组成的30μL溶液中进行，在37℃下反应2h。随后用DNA纯化试剂盒，去除UDP-6-N3-Glu和酶。在叠氮化标记的5hmC溶液中加入20μL DBCO修饰的引物(Yc)，进行点击化学反应，在37℃孵育24h形成5hmC-Yc。
2)Y型支架的制备：将Ya、Yb和5hmC-Yc等浓度(混合前浓度均为5μM)的混合，各取35μL，37℃杂交反应2h，制备Y形支架。随后，加入100μL H1(5μM)和100μLH2(5μM)，在37℃下反应2h，组装形成含发卡Y形支架。
信号转换元件的输出：在100μL含发卡Y形支架中加入100μL 5μM S1，在37℃下反应2h发生链置换反应。随后，将含有0.4μLKF DNA聚合酶(100U/mL)、5μL 500μM脱氧核苷酸三磷酸盐(dNTP)和2.5μLNt.BbvCI(500U/mL)的混合物在37℃下孵育2h以产生大量信号识别-转换元件P序列，然后在80℃下灭活20min以获得所得P溶液供下一步使用。
步骤2：基于Cu2O@CuO@Ag复合物的光电化学传感器的设计
1)Cu2O的制备：首先将0.375g CuSO4·5H2O加入0.5mM无水柠檬酸钠80mL中，在剧烈搅拌下形成浅蓝色溶液。然后，向上述溶液中加入1.25M 20mL NaOH，得到深蓝色悬浮液。随后，将0.03M 50mL的抗坏血酸溶液逐滴加入悬浮液中，并以恒定速度搅拌30min，静置1h后离心，获得砖红色颗粒，并用去离子水和无水乙醇分别洗涤三次。最后，将颗粒在60℃的真空烘箱中干燥过夜。
2)Cu2O@CuO的制备：将100mg新制备的Cu2O分散在50mL去离子水中，然后在剧烈搅拌下将50mg硝酸钾溶解在上述悬浮液中，连续搅拌1h。通过离心收集沉淀，并用去离子水和无水乙醇洗涤三次。随后，在60℃下真空干燥过夜，得到暗红色粉末。
3)Cu2O@CuO@Ag的制备：在超声下将100mg Cu2O@CuO分散在去离子水和无水乙醇体积比为1:1的100mL混合物溶液中。然后，将157.4μLAgNO3溶液(0.1g/mL)加入上述悬浮液中，加入的Ag与Cu2O@CuO约为10％。将混合溶液转移到光反应器中，由300WXe灯提供光源，在整个过程中通过循环水使反应温度保持在15℃左右，在搅拌下开始照射反应1h。最后，通过离心收集沉淀，洗涤并在真空烘箱中在60℃下干燥过夜。最后，经过研磨得到Cu2O@CuO@Ag棕色粉末(SEM图如图3所示，可见Ag位于Cu2O@CuO表面)。
步骤3：基于三元异质结光催化剂Cu2O@CuO@Ag复合物光电化学传感器的组装
1)用丙酮、乙醇和去离子水依次超声清洗ITO导电玻璃10min，氮气中干燥，用绝缘胶布固定电极导电面积为5mm×5mm。称取2mg Cu2O@CuO@Ag粉末超声分散于1mL超纯水中，得到2mg/mL Cu2O@CuO@Ag悬浮液，取10μL Cu2O@CuO@Ag悬浮液滴加至ITO电极表面。室温干燥后，将电极置于马弗炉中180℃煅烧40min，得到Cu2O@CuO@Ag薄膜覆盖的ITO电极。将6μL的MES缓冲液(含有2mg/mL EDC和50mM NHS，pH 5.5))应用于电极表面活化2h。
2)利用10μL 0.1mM乙硫醇(HT)，孵育时间为40min，阻断非特异性吸附。将H3(1μM)在95℃下加热10min，并以0.1℃·s-1的速率冷却到37℃，形成了发夹结构。随后将10μLH3(1μM)加入到电极上(Cu2O@CuO@Ag/ITO)，37℃杂交1.5h，形成H3/Cu2O@CuO@Ag/ITO。随后，加入10μLP溶液在37℃中孵育1.5h，形成P/H3/Cu2O@CuO@Ag/ITO。将10μL 1μMALP-H4溶液加入到P/H3/Cu2O@CuO@Ag/ITO，在37℃中孵育1.5h，随后加入10μL含100mM L-抗坏血酸-2-磷酸三钠(ALP)的Tris缓冲液(pH 7.4)，即制得实验所用光电化学传感器(PEC)。
电化学阻抗使用CHI660E型电化学工作站进行测量，采用三电极体系，IT O电极为工作电极(将不同物质固定在ITO表面形成工作电极)、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl为参比电极。电化学阻抗在含有0.1M KCl的5mM K3Fe(C N)6/K4Fe(CN)6溶液中测量，频率范围为5×10-2至1×106Hz，开路电压幅度为10mV。结果如图6所示。图6中，a为ITO；b为Cu2O@CuO@Ag/ITO；c为H3/Cu2O@CuO@Ag/ITO；d为HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/ITO；e为P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/ITO；f为H4/P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/ITO。由图6可知，空白的ITO电极(曲线a)的电阻(Ret)是相对较小。当Cu2O@CuO@Ag固定在电极表面时(曲线b)，Ret的显著增加，随后，依次对H3、HT、P、H4进行添加，Ret逐渐增加(曲线c-f)，表明该传感器制备成功。
PEC在15mL的0.1M Tris-HCl缓冲液(含有100mM L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(AAP))中测量，偏置电压为0V，开关光间隔时间为10s。
参照上述测试方法测试不同已知浓度的5hmC-DNA的光电流强度，结果见图4，绘制的标准曲线见图5。图4中，曲线a到曲线j 5hmC浓度依次为1μM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、1pM、100fM、10fM和1fM，由图4可知，随着5hmC浓度从1μm降低到1fM，ECL强度逐渐降低(曲线a到曲线g)；标准曲线显示出ECL强度(I)与5hmC浓度的对数(Log C)之间存在线性关系，线性回归方程表示为I＝0.12LogC+2.24，检测限为0.42fM(S/N＝3)。
特异性实验：
将上述实验中的靶标5hmC-DNA替换成5mC-DNA和C-DNA，其中，C-D NA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，具体为：CGGATGTTGTGGGTCAGC GCATCATACTCTA，5hmC-DNA的核苷酸序列为将上述18位加粗C处替换为5hmC；5mC-DNA的核苷酸序列为将上述18位加粗C处替换为5mC；其余检测步骤不变。实验结果如图7所示。由图7可知，在叠氮化物DNA过程中，100nM的5hmC-DNA被相同浓度的不同DNA(5mC-DNA，C-DNA)所取代。电极的制作和检测步骤保持一致，以确保具有可比性的实验条件。通过比较不同DNA在电极上的光电流值，可以评估该检测方法对不同DNA分子的选择性。如图7所示，5hmC-DNA和混合物质(同时含有100nM 5hmC-DNA、100nM5mC-DNA和100nM DNA)的光电流明显高于其他DNA，表明该方法对5h mC-DNA具有良好的检测选择性(注：空白组不加任何物质)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于检测5hmC-DNA的光电化学传感器，其特征在于，包括负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极、NH3修饰的DNA链H3、乙硫醇、用于5hmC-DNA前处理的试剂盒和ALP-H4溶液；
所述DNA链H3的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述ALP-H4溶液中的ALP-H4为Biotin-H4-Biotin，其中，所述H4的核苷酸序列如SEQID NO.8所示；
所述用于5hmC-DNA前处理的试剂盒包括：NE缓冲液、尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖溶液、T4噬菌体β-葡萄糖转移酶、DBCO修饰的引物Yc、DNA链Ya、DNA链Yb、DNA链H1、DNA链H2、DNA链S1、脱氧核苷酸三磷酸盐溶液、DNA聚合酶和切刻内切酶；
所述引物Yc的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述DNA链Ya的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述DNA链Yb的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述DNA链H1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述DNA链H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述DNA链S1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，所述负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极的制备方法包括：将Cu2O@CuO@Ag分散到水中，得到Cu2O@CuO@Ag悬浮液；将所述Cu2O@CuO@Ag悬浮液滴加到导电基底表面后进行干燥和煅烧，得到负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极。
3.根据权利要求1所述的光电化学传感器，其特征在于，还包括MES缓冲液和Tris缓冲液；
所述MES缓冲液中含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺；
所述Tris缓冲液含有L-抗坏血酸-2-磷酸三钠。
4.一种利用权利要求1~3任一项所述的光电化学传感器非疾病诊断目的的检测5hmC-DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将NH3修饰的DNA链H3进行加热后冷却，形成发夹结构的H3；
在负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极表面加入发夹结构的H3，进行结合，形成H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；
在所述H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面加入乙硫醇进行第二孵育，形成HT层，得到HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；所述HT为乙硫醇；
利用5hmC-DNA前处理的试剂盒对待检样品进行前处理，得到序列P溶液；
将所述序列P溶液加入到HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面，进行第三孵育，形成P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底；
将ALP-H4溶液加入到P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面进行第四孵育，形成光电化学传感器；
将所述光电化学传感器置于含有L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐的Tris-HCl缓冲液中进行光电流测试，测得光电流强度，根据光电流强度与5hmC-DNA浓度对数的线性关系计算得到待检样品中5hmC-DNA的含量；
所述前处理包括以下步骤：
将NE缓冲液、尿苷二磷酸-6-叠氮-葡萄糖溶液、T4噬菌体β-葡萄糖转移酶和待处理5hmC-DNA样品混合，将所得混合液在37℃进行叠氮化反应，得到叠氮化标记的5hmC溶液；
将所述叠氮化标记的5hmC溶液与DBCO修饰的引物Yc混合，在37℃进行点击化学反应，得到5hmC-Yc；
将所述5hmC-Yc、DNA链Ya和DNA链Yb混合，在37℃进行杂交反应，得到Y形支架；
将所述Y形支架与DNA链H1、DNA链H2混合，在37℃进行组装，形成含发卡Y形支架；
将所述含发卡Y形支架与DNA链S1混合，在37℃进行链置换反应，将所得反应液与脱氧核苷酸三磷酸盐、DNA聚合酶和切刻内切酶混合，在37℃进行第一孵育，得到序列P溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述5hmC-Yc、DNA链Ya和DNA链Yb的摩尔比为1:1:1；
所述Y形支架与DNA链H1、DNA链H2的摩尔比为1:1:1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极表面加入发夹结构的H3前，还包括利用MES缓冲液对负载Cu2O@CuO@Ag层的基底电极进行活化。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，完成所述第四孵育后，还包括在形成的ALP-H4/P/HT/H3/Cu2O@CuO@Ag/导电基底表面加入Tris缓冲液。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述结合的温度为37℃，时间为1.5 h。
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