CN116925215A - 抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物 - Google Patents

抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及特异性结合血清白蛋白的纳米抗体或其抗原结合片段，含有所述纳米抗体或其抗原结合片段的衍生物，编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，此发明涉及这些抗体或其抗原结合片段，或所述衍生物的治疗用途。

Description

抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物
技术领域
本发明涉及特异性结合血清白蛋白的纳米抗体或其抗原结合片段，含有所述纳米抗体或其抗原结合片段的衍生物，编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，此发明涉及这些抗体或其抗原结合片段，或所述衍生物的治疗用途。
背景技术
随着技术的发展，抗体药物早已成为独立于化药，细胞治疗等之外的重要疾病疗法。在抗体药物研发中，药代动力学(pharmacokinetics,PK)是描述机体对抗体作用的重要领域，包括吸收、分布及清除等，其中半衰期就是PK的一个重要参数。通常，较长的体内半衰期可以提高抗体的药效，但也可能增加毒性，而对某些靶点的紧密结合可以导致抗体被快速内吞至胞内降解，缩短体内的半衰期。
延长大分子药物体内的半衰期可以在提高药物本身作用时间的基础上减少给药频率，降低病人的医疗负担。目前提高药物长效化的设计包括聚乙二醇(PEG)修饰、融合转铁蛋白等，但这些化学方法存在一些弊端，比如PEG可能会屏蔽或阻挡抗体的抗原结合位点，降低抗体或治疗蛋白的药效，甚至可能导致抗体活性丧失。
人血清白蛋白(HSA)是人体血浆中含量最丰富的蛋白质，约占血清蛋白的一半，可溶于水并以单体形式存在。血清白蛋白在体内的半衰期大约为21天，其由585个氨基酸组成，分子量约66.5KD。人血清白蛋白在体内稳定、安全无毒、免疫原性低，是理想的药物载体。对于抗体药物，可以通过人血清白蛋白修饰从而提高药物半衰期，以提高患者顺应性。
HSA的回收机制和IgG类似，都是通过FcRn介导完成的。HSA和IgG通过胞饮作用内化到血管内皮细胞，内体的pH为6.0左右，促进膜结合的FcRn与HSA结合，之后经过再循环至内皮细胞顶端或底部，通过胞吐作用在血液pH7.4条件下，膜结合的FcRn与HSA快速解离进行再循环。
发明内容
本申请的发明人经过大量的研究，筛选获得了系列抗血清白蛋白的纳米抗体，所述纳米抗体与血清白蛋白具有高结合活性，并且具备与人、猴和/或小鼠血清白蛋白的交叉反应活性。特别地，本发明的纳米抗体与血清白蛋白的结合是非pH依赖性的，其能有效参与FcRn介导的血清白蛋白循环，从而延长所述纳米抗体的体内半衰期。因此，可通过将本申请的纳米抗体与药物分子(例如，多肽药物)进行偶联(例如，融合)，从而延长所述药物分子在体内的半衰期。
此外，所述纳米抗体还具有分子量小，稳定性好等特点，在药物研发等方面相比于传统常见的正常抗体有着组织浸润性好、给药方式灵活、人源化程度高、容易重组蛋白改造等诸多优势。
基于此，本申请还提供了含有所述纳米抗体或其抗原结合片段的组合物，编码所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。
纳米抗体及其抗原结合片段
因此，在一方面，本申请提供了能够特异性结合血清白蛋白的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有选自以下的结构：SX1X2X3LX4YYX5(式I，SEQ ID NO:72)，SGSIWGIYH(SEQ ID NO:37)，SGFTFSIYS(SEQ ID NO:31)，SGSIFTFYR(SEQ ID NO:33)；
(b)CDR2，其具有选自以下的结构：IX6SSGGX7X8(式II，SEQ ID NO:73)，ITVDGST(SEQ ID NO:46)，ISSGGSP(SEQ ID NO:40)，ITTDTST(SEQ ID NO:42)；
(c)CDR3，其具有选自以下的结构：AAAX9LECRTX10X11X12X13YX14Y(式III，SEQ ID NO:74)，AAATX15ECRGRSSSYDY(式IV，SEQ ID NO:75)，AAALLECRVRSWPSDN(SEQ ID NO:49)，AAAVLECRAAEYVNS(SEQ ID NO:54)，DIRNVGGDY(SEQ ID NO:57)，SPITSIFKA(SEQ ID NO:48)，NVRNVERDY(SEQ ID NO:50)；
其中，
X1选自(i)氨基酸残基G，R和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X2选自(i)氨基酸残基F，A，S，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X3选自(i)氨基酸残基T，Q和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X4选自(i)氨基酸残基D，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X5缺失或者选自(i)氨基酸残基A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X6选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X7选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X8缺失或者选自(i)氨基酸残基T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X9选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X10选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X11选自(i)氨基酸残基V，I，L和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X12选自(i)氨基酸残基R，V，T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X13选自(i)氨基酸残基G，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X14选自(i)氨基酸残基D，A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X15选自(i)氨基酸残基L，F和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NOs:30-38任一项所示的CDR1；如SEQ ID NOs:39-46任一项所示的CDR2；以及，如SEQ ID NOs:47-59任一项所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有如SX1X2X3LX4YYX5(式I，SEQ ID NO:72)所示的结构；
(b)CDR2，其具有如IX6SSGGX7X8(式II，SEQ ID NO:73)所示的结构；
(c)CDR3，其具有选自以下的结构：AAAX9LECRTX10X11X12X13YX14Y(式III，SEQ ID NO:74)，AAATX15ECRGRSSSYDY(式IV，SEQ ID NO:75)，AAALLECRVRSWPSDN(SEQ ID NO:49)，AAAVLECRAAEYVNS(SEQ ID NO:54)；
其中，
X1选自(i)氨基酸残基G，R和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X2选自(i)氨基酸残基F，A，S，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X3选自(i)氨基酸残基T，Q和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X4选自(i)氨基酸残基D，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X5缺失或者选自(i)氨基酸残基A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X6选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X7选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X8缺失或者选自(i)氨基酸残基T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X9选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X10选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X11选自(i)氨基酸残基V，I，L和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X12选自(i)氨基酸残基R，V，T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X13选自(i)氨基酸残基G，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X14选自(i)氨基酸残基D，A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X15选自(i)氨基酸残基L，F和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基。
在某些实施方案中，X1选自氨基酸残基G或R；X2选自氨基酸残基F，A，S或E；X3选自氨基酸残基T或Q；X4选自氨基酸残基D或E；X5缺失或者为氨基酸残基A；X6选自氨基酸残基A或S；X7选自氨基酸残基A或S；X8缺失或者为氨基酸残基T；X9选自氨基酸残基T或V；X10选自氨基酸残基T或V；X11选自氨基酸残基V，I或L；X12选自氨基酸残基R，V或T；X13选自氨基酸残基G或E；X14选自氨基酸残基D或A；X15选自氨基酸残基L或F。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ IDNOs:30、32、34-36、38任一项所示的CDR1；如SEQ ID NOs:39、41、43-45任一项所示的CDR2；以及，如SEQID NOs:47、49、51-56、58-59任一项所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有如SX1X2X3LX4YYX5(式I，SEQ ID NO:72)所示的结构；
(b)CDR2，其具有如IX6SSGGX7X8(式II，SEQ ID NO:73)所示的结构；
(c)CDR3，其具有选自以下的结构：AAAX9LECRTX10X11X12X13YX14Y(式III，SEQ ID NO:74)，AAATX15ECRGRSSSYDY(式IV，SEQ ID NO:75)，AAALLECRVRSWPSDN(SEQ ID NO:49)，AAAVLECRAAEYVNS(SEQ ID NO:54)；
其中，
X1选自(i)氨基酸残基G，R和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X2选自(i)氨基酸残基F，E，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X3选自(i)氨基酸残基T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X4选自(i)氨基酸残基D和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X5缺失或者选自(i)氨基酸残基A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X6选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X7选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X8缺失或者选自(i)氨基酸残基T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X9选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X10选自(i)氨基酸残基V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X11选自(i)氨基酸残基V，I和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X12选自(i)氨基酸残基R，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X13选自(i)氨基酸残基G，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X14选自(i)氨基酸残基D和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X15选自(i)氨基酸残基L，F和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基。
在某些实施方案中，X1选自氨基酸残基G或R；X2选自氨基酸残基F，S或E；X3为氨基酸残基T；X4为氨基酸残基D；X5缺失或者为氨基酸残基A；X6选自氨基酸残基A或S；X7选自氨基酸残基A或S；X8缺失或者为氨基酸残基T；X9选自氨基酸残基T或V；X10为氨基酸残基V；X11选自氨基酸残基V或I；X12选自氨基酸残基R或V；X13选自氨基酸残基G或E；X14为氨基酸残基D；X15选自氨基酸残基L或F。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NOs:30、32、34-36任一项所示的CDR1；如SEQ ID NOs:39、41、43-45任一项所示的CDR2；以及，如SEQ IDNOs:47、49、51、52、54-56、58任一项所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有如SX1X2X3LX4YYX5(式I，SEQ ID NO:72)所示的结构，其中，X1为氨基酸残基G；X2选自(i)氨基酸残基F或E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；X3为氨基酸残基T；X4为氨基酸残基D；X5为氨基酸残基A；
(b)CDR2，其具有如IASSGGST(SEQ ID NO:43)所示的结构；
(c)CDR3，其具有如AAAVLECRTVVRGYDY(SEQ ID NO:52)所示的结构。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:32或34所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQ ID Ns:52所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:37所示的序列，或与SEQ ID NO:37所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:46所示的序列，或与SEQ ID NO:46所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及
(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:57所示的序列，或与SEQ ID NO:57所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:37所示的CDR1、如SEQ ID NO:46所示的CDR2、如SEQ ID NO:57所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:31所示的序列，或与SEQ ID NO:31所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:40所示的序列，或与SEQ ID NO:40所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及
(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:48所示的序列，或与SEQ ID NO:48所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:31所示的CDR1、如SEQ ID NO:40所示的CDR2、如SEQ ID NO:48所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:33所示的序列，或与SEQ ID NO:33所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:42所示的序列，或与SEQ ID NO:42所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及
(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:50所示的序列，或与SEQ ID NO:50所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:33所示的CDR1、如SEQ ID NO:42所示的CDR2、如SEQ ID NO:50所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(1)如SEQ ID NO:30所示的CDR1；如SEQ ID NO:39所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:47所示的CDR3；
(2)如SEQ ID NO:31所示的CDR1；如SEQ ID NO:40所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:48所示的CDR3；
(3)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:49所示的CDR3；
(4)如SEQ ID NO:33所示的CDR1；如SEQ ID NO:42所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:50所示的CDR3；
(5)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:51所示的CDR3；
(6)如SEQ ID NO:32或34所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQID NO:52所示的CDR3；
(7)如SEQ ID NO:35所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:52所示的CDR3；
(8)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:53所示的CDR3；
(9)如SEQ ID NO:36所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:54所示的CDR3；
(10)如SEQ ID NO:35所示的CDR1；如SEQ ID NO:44所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:55所示的CDR3；
(11)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:45所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:56所示的CDR3；
(12)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:52所示的CDR3；
(13)如SEQ ID NO:37所示的CDR1；如SEQ ID NO:46所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:57所示的CDR3；
(14)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:58所示的CDR3；或
(15)如SEQ ID NO:38所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:59所示的CDR3。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含选自下列的氨基酸序列：
(i)如SEQ ID NOs:1-3、7-9、14-24、28-29任一项所示的序列；
(ii)与SEQ ID NOs:1-3、7-9、14-24、28-29任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NOs:1-3、7-9、14-24、28-29任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段是人源化的。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含选自下列的氨基酸序列：
(i)如SEQ ID NOs:4-6、10-13、25-27、78任一项所示的序列；
(ii)与SEQ ID NOs:4-6、10-13、25-27、78任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NOs:4-6、10-13、25-27、78任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述血清白蛋白选自人血清白蛋白(HSA)，鼠血清白蛋白(MSA)和/或食蟹猴血清白蛋白(CSA)。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段与所述血清白蛋白的结合是非pH依赖性的。
在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段能与所述血清白蛋白在pH5-8(例如pH 5.5-7.4)的范围内特异性结合。
多肽构建体
在另一方面，本申请还提供了特异性结合血清白蛋白的多肽构建体，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段，以及免疫球蛋白Fc结构域。
在本文中，所述Fc结构域也称为Fc区，是指包含CH2和CH3的重链恒定区的一部分。在一些实施方案中，Fc结构域包含铰链、CH2和CH3。当Fc结构域包含铰链时，铰链调节两个含Fc的多肽之间的二聚作用。Fc结构域可为任何抗体重链恒定区同型。在一些实施方案中，Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域是天然Fc区，其包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。例如，所述Fc结构域可以是天然序列人类IgG1Fc区、天然序列人类IgG2Fc区、天然序列人类IgG3Fc区或天然序列人类IgG4Fc区。天然Fc区可具有效应子功能。示例性“效应子功能”包括与Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；对细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化等。可以通过将天然Fc区中的至少一个氨基酸残基替换为不同残基或化学修饰，产生功能改变，例如，改变抗体对效应子配体(如FcR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能(例如降低或增强)。
因此，在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域也可以是变异Fc区，其与天然Fc区相比可以包含一个或多个(例如1-10个，例如1-5个)氨基酸突变或化学修饰以改变本发明抗体的下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能等。
在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域具备ADCC活性。在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域不具备ADCC活性。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端(例如C端)。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG的Fc结构域(例如IgG1的Fc结构域)。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO：68所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述血清白蛋白选自人血清白蛋白(HSA)，鼠血清白蛋白(MSA)和/或食蟹猴血清白蛋白(CSA)。
在某些实施方案中，所述多肽构建体与所述血清白蛋白的结合是非pH依赖性的。
在某些实施方案中，所述多肽构建体能与所述血清白蛋白在pH 5-8(例如pH 5.5-7.4)的范围内特异性结合。
融合蛋白
在另一方面，本申请还提供了融合蛋白，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体，以及，另外的肽结构域。
在某些实施方案中，所述另外的肽结构域选自具有治疗效应的多肽结构域。
在某些实施方案中，所述另外的多肽结构域任选地通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段或所述多肽构建体的N端和/或C端。
分离的核酸分子
在另一方面，本申请还提供了分离的核酸分子，其编码如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段，如上所述的多肽构建体，或如上所述的融合蛋白。
载体
在另一方面，本申请还提供了载体，其包含如上所述的核酸分子。在某些实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。
宿主细胞
在另一方面，本申请还提供了宿主细胞，其包含如上所述的核酸分子或如上所述的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞)，以及真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞)，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。
制备方法
本发明的纳米抗体或多肽构建体或融合蛋白可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明纳米抗体或多肽构建体或融合蛋白的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体或多肽构建体或融合蛋白。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的纳米抗体分子获得(参见Morimotoet al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
在另一方面，本申请还提供了制备如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段，如上所述的多肽构建体，或如上所述的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段或所述多肽构建体。
双特异性或多特异性抗体
在另一方面，本申请还提供了双特异性或多特异性抗体，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体特异性结合血清白蛋白，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体包含：
(i)如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体(例如，含有如SEQ ID NOs:10、4、78任一项所示的序列的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体)作为第一抗原特异性结合结构域；
(ii)包含如SEQ ID NO:79所示的轻链和如SEQ ID NO:80所示的重链的第二抗原特异性结合结构域(如Fab)；
以及，
(iii)如SEQ ID NO:81所示的第三抗原特异性结合结构域(例如，纳米抗体VHH)。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链，其中，所述第一多肽链包含(例如从N端至C端)：所述第二抗原特异性结合结构域的轻链或重链(如VH和CH1)，所述第三抗原特异性结合结构域，所述第一抗原特异性结合结构域；并且，所述第二多肽链包含(例如从N端至C端)：所述第二抗原特异性结合结构域的重链(如VH和CH1)或轻链，所述第三抗原特异性结合结构域；其中，所述第一多肽链与第二多肽链配对形成完整的所述第二抗原特异性结合结构域。在某些实施方案中，所述第一多肽链和/或第二多肽链中的各个结构域通过接头(例如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)连接。
在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体包含:
(1)序列如SEQ ID NO:69所示的第一肽，和，序列如SEQ ID NO:76所示的第二肽；
(2)序列如SEQ ID NO:70所示的第一肽，和，序列如SEQ ID NO:76所示的第二肽；
或者,
(3)序列如SEQ ID NO:71所示的第一肽，和，序列如SEQ ID NO:76所示的第二肽。
在某些实施方案中，所述第一肽存在于第一肽链，所述第二肽存在于第二肽链；在某些实施方案中，所述第一肽链与所述第二肽链形成复合物。
缀合物
在另一方面，本申请还提供了缀合物，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体，以及与所述纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体连接的治疗剂。
在某些实施方案中，所述治疗剂选自抗肿瘤药物，例如细胞毒剂、激素类药物、生物反应调节剂、另外的抗体或其抗原结合片段。
药物组合物
在另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段、多肽构建体、融合蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、双特异性或多特异性抗体或缀合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段、多肽构建体、或编码所述纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体的核酸分子、载体或宿主细胞。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含如上所述的融合蛋白、或编码所述融合蛋白的核酸分子、载体或宿主细胞。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含如上所述的双特异性或多特异性抗体、或编码所述双特异性或多特异性抗体的核酸分子、载体或宿主细胞。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含如上所述的缀合物。
用途
在另一方面，本申请还提供了如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段、多肽构建体、融合蛋白、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、双特异性或多特异性抗体或缀合物、或药物组合物用于制备药物的用途。
在某些实施方案中，所述药物在受试者体内能直接或间接参与FcRn介导的血清白蛋白循环。
在某些实施方案中，所述药物显示相对于缺少所述纳米抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述药物是蛋白质类药物。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人，小鼠或食蟹猴。
延长药物的体内半衰期的方法
在另一方面，本申请还提供了一种延长药物的体内半衰期的方法，其包括：将如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体与所述药物进行连接。
在某些实施方案中，所述体内半衰期的延长是相对于缺少所述纳米抗体或其抗原结合片段时所述药物的体内半衰期。
在某些实施方案中，所述药物选自大分子药物(例如多肽类药物)。
在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人，小鼠或食蟹猴。
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。
除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。
如本文中所使用的，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domainantibody,sdAb)，两者可互换使用。
如本文中所使用的，术语纳米抗体的“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，RavenPress,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。在本文中，纳米抗体的CDR优选地通过IMGT编号系统确定。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，术语“Fc结构域”或“Fc区”意指，包含CH2和CH3的重链恒定区的一部分。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。由Fc区介导的“效应子功能”包括Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；对细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化等。在一些实施方案中，Fc区包含铰链、CH2和CH3。当Fc区包含铰链时，铰链调节两个含Fc的多肽之间的二聚作用。Fc区可为任何抗体重链恒定区同型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
Fc结构域既可以包括天然Fc区，也可以包括变异Fc区。天然Fc区包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列，例如天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人类IgG2Fc区；天然序列人类IgG3Fc区；及天然序列人类IgG4Fc区，以及其天然存在的变异体。变异Fc区包含因至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，变异Fc区可具备相比于天然Fc区改变的效应子功能(例如Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。在某些实施方案中，人源化抗体的CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性等。在本申请中，供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)的驼源抗体。为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将免疫动物的CDR区插入人源框架序列。在纳米抗体的语境下，人源化抗体可指人源化VHH，即其中一或多个骨架区已基本上由人类骨架区替换的VHH。在一些情形中，人类免疫球蛋白的某些骨架区(FR)由相应非人类残基替换。此外，人源化VHH可包含在初始VHH或人类骨架序列中均未发现、但被包括在内以进一步改进和优化VHH或含VHH的多肽的性能的残基。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的将序列进行比对(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置上是同一的。两个序列之间的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的数目的函数(即，百分比同一性＝同一重叠位置的数目/位置的总数×100％)。在某些实施方案中，两个序列长度相同。
两个序列之间的百分比同一性的测定还可使用数学算法来实现。用于两个序列的比较的数学算法的一个非限制性实例是Karlin和Altschul的算法，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268，如同Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877中改进的。将这样的算法整合至Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数KD(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量KD、kon和kdis值。在某些实施方案中，可以使用表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量解离常数。除此以外还可用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量解离常数。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“体内半衰期”具有本领域技术人员公知的含义，通常可以定义为分子在体内的血清浓度减少50％(例如由于通过天然机制导致配体的降解和/或配体的清除或螯合)所需要的时间。测定体内半衰期的方法是本领域技术人员所熟知的，例如可通过药物代谢动力学分析进行测定。
发明的有益效果
本发明提供了与血清白蛋白具有高结合活性的纳米抗体，其具备与人、猴和/或小鼠血清白蛋白的交叉反应活性。特别地，本发明的纳米抗体与血清白蛋白的结合是非pH依赖性的，其能有效参与FcRn介导的血清白蛋白循环，从而延长所述纳米抗体的体内半衰期。因此，可通过将本申请的纳米抗体与药物分子(例如，多肽药物)进行偶联(例如，融合)，从而延长所述药物分子在体内的半衰期。
此外，所述纳米抗体还具有分子量小，稳定性好等特点，在药物研发等方面相比于传统常见的正常抗体有着组织浸润性好、给药方式灵活、人源化程度高、容易重组蛋白改造等诸多优势。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了Bi-340-352、Bi-340-353、Bi-340-354及Bi-340-356在小鼠血清中的浓度随时间的变化。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：抗HSA纳米抗体筛选
1.1纳米抗体文库的构建
动物免疫
将l mg人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)抗原(购自AcroBiosystems)与弗氏佐剂等体积混合，免疫2只羊驼，每周一次，共免疫4次，剌激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。4次免疫结束后，提取50ml羊驼外周血，采用淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞。采用RNA提取试剂Trizol(购自Invitrogen)提取总RNA。使用cDNA合成试剂盒(购自Invitrogen)反转录获得羊驼淋巴细胞总cDNA。
纳米抗体基因扩增
进行第一轮PCR，从上一步骤获得的cDNA中扩增出IgG2、IgG3序列，扩增用引物如表1所示：
表1.第一轮PCR引物
名称 序列编号 序列(5’到3’)
上游引物 SEQ ID NO:60 GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
下游引物 SEQ ID NO:61 GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
将第一轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收750bp处的片段用于第二轮VHH序列扩增。第二轮PCR扩增引物如表2所示：
表2.第二轮PCR引物
以第二轮PCR产物为模板，进行第三轮PCR，为VHH基因加上与展示载体同源的同源臂序列。第三轮PCR扩增引物如表3所示：
表3.第三轮PCR引物
利用PCR纯化试剂盒(购自QIAGEN)回收目的片段。
文库构建
将线性化的酵母展示载体(人工合成)和第三轮的PCR产物混合后电转化入酿酒酵母(购自ATCC)中，构建来自两个动物的抗HSA纳米抗体文库并测定库容，库容大小分别为2.1×107和3.2×107。
1.2HSA纳米抗体的筛选
HSA蛋白的生物素化标记
取适量体积的双蒸水溶解HSA蛋白(购自AcroBiosystems，货号：HSA-H5220)，按照生物素标记试剂盒(购自Thermo)产品说明书，将生物素溶解后与蛋白溶液混合，于4℃孵育2小时。用脱盐柱(购自Thermo)去除多余的生物素，脱盐柱预处理及样品收集操作均参考产品说明书步骤进行。
MACS富集能与HSA特异性结合的酵母
将上述步骤1.1中构建的VHH文库接种于SD-CAA扩增培养基(1LSD-CAA扩增培养基中含6.7g YNB、5g酪氨基酸、13.62g Na2HPO4·12H2O、7.44g NaH2PO4和2％葡萄糖)中，30℃，225rpm培养过夜。取适量酵母细胞，3000rpm×5min离心(以下离心操作的参数与此处相同)去除培养基，用SD-CAA诱导培养基重悬酵母细胞，诱导过夜。测定诱导后的文库浓度，取适量酵母细胞，离心去除培养基。用50ml PBS重悬酵母细胞，离心去除上清。用10ml PBS重悬酵母细胞。
加入如上述步骤获得的生物素标记的HSA蛋白(终浓度100mM)，室温孵育30min，离心收集酵母细胞，并用50ml PBS洗涤酵母3遍。用5ml清洗液重悬酵母细胞，并加入200μl SA磁珠(购自美天旎)，颠倒孵育10min。用PBS洗涤酵母和磁珠混合物3遍，将混合物加入LS纯化柱(购自美天旎)中。将LS纯化柱放在磁力架上，用PBS洗涤去除非特异性结合的酵母细胞。将纯化柱从磁力架上取出，加入PBS洗脱酵母。洗脱下来的酵母离心后转入SD-CAA扩增培养基中进行扩增。
流式细胞分选获得高亲和力酵母细胞
将经过MACS富集的酵母细胞接种于SD-CAA扩增培养基中。30℃，225rpm摇瓶培养过夜。用SD-CAA诱导培养基重悬酵母细胞，诱导过夜。加入抗c-Myc鼠源抗体(购自Thermo，货号：MA1-980)和100nM生物素标记的HSA抗原，孵育10min。加入PBS清洗酵母3遍，加入羊抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor Plus 488荧光抗体(购自Invitrogen，货号：A32723)和链霉亲和素APC结合物荧光抗体(购自Invitrogen，货号：SA1005)，孵育15min。加入PBS重悬细胞，使用BD FACSAriaII仪器进行分选获得可与HSA抗原有较高结合能力的酵母。
HSA纳米抗体候选分子抗体基因的调取
通过MACS和FACS富集得到的能与HSA抗原有较高结合能力的酵母菌液，在SD-CAA扩增培养基中30℃，225rpm培养过夜，按照酵母质粒抽提试剂盒(购自天根)操作抽提酵母质粒。质粒通过电转化入Top10感受态细胞(购自天根)，涂布氨苄抗性平板，于37℃培养过夜。挑取单克隆测序获得VHH氨基酸序列，并根据IMGT编号系统确定CDR区序列。所获得的单克隆纳米抗体的序列信息如表4所示。
实施例2.重链抗体的构建及表达纯化
2.1.抗体基因构建入pCDNA3.1表达载体
将VHH基因序列和人IgG1(LALA突变)Fc段(氨基酸序列如SEQ IDNO:68所示)相连，利用同源重组酶(购自Vazyme，货号：c115-02)构建在和EcoR I/Not I双酶切线性化的pCDNA3.1载体中，流程按照商品说明书。同源重组产物化转入Top10感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃培养过夜，挑取单克隆测序，并抽提质粒。
SEQ ID NO:68序列如下：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
2.2.细胞转染及蛋白纯化
采用ExpiCHOTM表达系统试剂盒(购自Thermo)，将上述步骤获得的抽提质粒转入Expi-CHO细胞中，转染方法按照商品说明书，细胞培养5天后收集上清利用蛋白A磁珠(购自金斯瑞)分选法纯化目的蛋白。将磁珠用适当体积(1-4倍磁珠体积)的结合缓冲液(PBS+0.1％吐温20，pH 7.4)重悬后加入至待纯化样品中，室温孵育1小时，期间温柔振荡。样品置于磁力架上(购自海狸)，弃去上清，磁珠用结合缓冲液清洗3遍。按照磁珠体积的3-5倍体积加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠,pH3.2)室温振荡5-10min，置回磁力架上，收集洗脱缓冲液，转移至已加入中和缓冲液(1M Tris，pH8.54)的收集管中混匀，获得目的蛋白。
实施例3.HSA抗体亲和力测定
ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，基于高通量法的抗体-抗原亲和力和表位结合的测定.MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30min，然后线上检测60s建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器上。再将传感器放入100nM的HSA抗原(购自AcroBiosystems，货号：HSA-H5220)中作用5min，之后将传感器转移至PBS中解离5min。使用1:1结合模型进行动力学的分析。亲和力数据如表5所示。
表5.候选分子与HSA的亲和力
编号 KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
HSA-30 1.54E-09 1.40E+05 2.15E-04
HSA-59 2.91E-08 5.55E+04 1.62E-03
HSA-76 7.97E-07 8.73E+03 6.96E-03
HSA-M-16 3.81E-08 1.65E+05 6.28E-03
HSA-M-27 1.61E-08 2.44E+05 3.93E-03
HSA-M-29 2.33E-08 2.51E+05 5.85E-03
HSA-W-20 2.24E-08 1.93E+05 4.31E-03
HSA-PH-8 2.152E-08 1.23E+05 2.65E-03
HSA-PH-11 4.43E-08 2.21E+05 9.79E-03
本实施例进一步检测了候选分子与不同种属血清白蛋白的交叉反应，包括鼠血清白蛋白(Mouse Serum Albumin，MSA，购自AcroBiosystems，货号：MSA-M52H8)，食蟹猴血清白蛋白(Cynomolgus Serum Albumin，CSA，购自AcroBiosystems，货号：CSA-C52H4)。亲和力数据如表6所示。
表6.候选分子与MSA/CSA的亲和力
实施例4.抗HSA抗体人源化构建
为了减少单克隆抗体在人体内产生免疫原性，将HSA-59,HSA-M-27和HSA-PH-8三个抗体进行人源化。人源化方法采用VHH人源化通用框架移植法，同时根据文献(Vincke,C.,等人，人源化骆驼单域抗体和鉴定通用人源化纳米抗体支架的一般策略.J Biol Chem284(5):3273-3284)报道的方法对抗体框架2(framework2)的部分氨基酸进行突变完成。人源化抗体的序列信息如表7所示。
本研究利用IMGT(http://www.imgt.org)对HSA-59,HSA-M-27和HSA-PH-8及人源化序列进行了人源化水平评估，结果如表8所示，所有人源化后的样品人源化水平均有所提高，符合后期药物开发要求。
表8.HSA人源化序列和人的同源性
编号 种系 同源性
HSA-59 GHV3-23*04 79.4％
HSA-M-27 IGHV3-23*01 79.4％
HSA-PH-8 IGHV3-64*04 69.8％
Hu-HSA-59-1 IGHV3-23*04 83.5％
Hu-HSA-59-2 IGHV3-23*04 85.6％
Hu-HSA-59-3 IGHV3-23*04 85.6％
Hu-HSA-M-27-1 IGHV3-23*01 83.5％
Hu-HSA-M-27-2 IGHV3-23*01 85.6％
Hu-HSA-M-27-3 IGHV3-23*01 85.6％
Hu-HSA-PH-8-1 IGHV3-64*04 76％
Hu-HSA-PH-8-2 IGHV3-64*04 78.1％
Hu-HSA-PH-8-3 IGHV3-64*04 78.1％
Hu-HSA-PH-8-5 IGHV3-64*04 78.1％
Hu-HSA-M-27-1-2 IGHV3-23*01 82.5％
蛋白构建及表达纯化方法同实施例2，利用HPLC检测获得蛋白的纯度，纯度检测结果如表9所示。HPLC方法如下，流动相：150mM Na2HPO4·12H2O,pH7.0。色谱条件：检测波长：280nm，柱温：25℃，流速：0.35ml/min，检测时间：20min，Zenix-C SEC-300色谱柱(SEPAX4.6×300mm,3μm)。
表9.Anti-HSA人源化抗体的纯度检测结果
编号 单体比例(％)
Hu-HSA-59-1 98.30
Hu-HSA-59-2 98.60
Hu-HSA-59-3 99.50
Hu-HSA-M-27-1 97.60
Hu-HSA-M-27-2 97.90
Hu-HSA-M-27-3 98.60
Hu-HSA-PH-8-1 97.30
Hu-HSA-PH-8-2 80.10
Hu-HSA-PH-8-3 97.40
Hu-HSA-PH-8-5 96.40
Hu-HSA-M-27-1-2 98.10
实施例5.抗HSA人源化样品亲和力测定
5.1.人源化抗体的亲和力测定
本实施例检测纯化获得的抗HSA人源化样品与HSA结合亲和力，实验方法同实施例3，实验结果如表10所示，结果表明抗HSA人源化样品与HSA蛋白有很好的结合活性。
表10.人源化分子与HSA的亲和力
编号 KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
Hu-HSA-59-1 1.59E-07 8.22E+04 1.30E-02
Hu-HSA-59-2 1.74E-06 1.24E+04 2.15E-02
Hu-HSA-59-3 4.54E-07 3.29E+04 1.49E-02
Hu-HSA-M-27-1 5.20E-08 1.38E+05 7.15E-03
Hu-HSA-M-27-2 4.23E-08 1.34E+05 5.66E-03
Hu-HSA-M-27-3 4.09E-08 1.69E+05 6.92E-03
Hu-HSA-PH-8-1 7.28E-08 1.02E+05 7.44E-03
Hu-HSA-PH-8-2 2.13E-07 5.32E+04 1.13E-02
Hu-HSA-PH-8-3 6.06E-08 1.26E+05 7.64E-03
Hu-HSA-PH-8-5 5.28E-08 1.19E+05 6.27E-03
Hu-HSA-M-27-1-2 3.48E-08 1.92E+05 6.66E-03
本实施例同时检测了纯化获得的抗HSA人源化样品与MSA/CSA结合亲和力，实验方法同实施例3，实验结果如表11所示。
表11.人源化分子与MSA/CSA的亲和力
5.2.人源化抗体在不同pH下的亲和力测定
HSA的回收机制与IgG类似，通过胞饮作用内化到血管内皮细胞，内体的pH为6.0左右，促进膜结合的FcRn与HSA结合。之后内体的复合物再循环到血液中，在pH7.4的条件下，膜结合的FcRn与HSA快速解离，HSA进行再循环。
本实施例检测纯化获得的抗HSA人源化样品与HSA在不同pH条件下的亲和力，实验方法同实施例3，实验结果如表12所示，结果表明抗HSA人源化样品与HSA蛋白在不同pH条件下均有很好的结合活性。
表12.人源化分子与HSA在不同pH条件下的亲和力
实施例6.抗HSA纳米抗体延长半衰期效果检测
6.1.分子构建和蛋白制备
为了证实抗HSA的纳米抗体的半衰期延长作用，在本实施例中，构建了多特异性抗体。多特异性抗体Bi-340-352、Bi-340-353及Bi-340-354各自独立地由肽链#1和肽链#2组成，共包含三个抗原结合结构域，分别为靶向第一抗原的Fab，靶向第二抗原的纳米抗体(VHH1)，以及靶向第三抗原的纳米抗体(VHH2)，所述VHH2为Hu-HSA-M-27-1、Hu-HSA-59-1、Hu-HSA-PH-8-5或作为对照的非HSA相关VHH。多特异性抗体的结构及序列如表13-1和13-2所示，其中，肽链#1和肽链#2中的各结构域通过包含GGGGS的接头连接。
表13-1多特异性抗体结构
表13-2多特异性抗体相关序列
分别编码Bi-340-352、Bi-340-353、Bi-340-354及Bi-340-356的肽链#1和肽链#2的基因序列由金维智公司合成。将所述编码基因序列分别利用同源重组酶(购自Vazyme)构建至EcoR I/Not I双酶切线性化的pCDNA3.1载体中，构建流程按照商品说明书。所述多特异性抗体各自的肽链#1同源重组产物和肽链#2同源重组产物共转化入Top10感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，37℃培养过夜，挑取单克隆测序。
采用ExpiCHOTM表达系统试剂盒(购自Thermo)，将质粒转入Expi-CHO细胞中，转染方法按照商品说明书，细胞培养5天后收集上清利用KappaSelect(GE)亲和层析柱进行纯化。具体方法如下：样品用注射器通过0.2um无菌针头式过滤器PES进行样品过滤。用5倍柱体积的平衡缓冲液(20mM PB+0.15M NaCl，pH 7.4)平衡层析柱，至流出液电导和pH不变。流速0.5ml/分钟上样。上样完毕后继续用平衡缓冲液冲洗层析柱，冲洗至穿透完全，UV值不再下降。用洗脱缓冲液(0.1M glycine-HCl，pH 3.0)洗脱，收集流出液。洗脱后，应立刻用碱性缓冲液(如1M Tris/HCl,pH 8.0)将收集到的抗体溶液中和到抗体稳定的pH。
利用HPLC检测获得蛋白的纯度。HPLC方法如下，流动相：150mM Na2HPO4·12H2O，pH7.0。色谱条件：检测波长：280nm，柱温：25℃，流速：0.35ml/min，检测时间：20min，Zenix-C SEC-300色谱柱(SEPAX 4.6×300mm，3μm)。
6.2.蛋白半衰期检测
小鼠注射剂量为10mg/Kg。取血时间点：给药后3分钟、30分钟、2小时、6小时、24小时、48小时、96小时、168小时静脉采血。全血样品2-8℃放置30分钟，12000rpm离心5min收集血清，所得血清再于2-8℃，12000rpm离心5min，-80℃保存，ELISA检测血清中游离抗体分子量。结果如图1所示，结果表明带有抗HSA纳米抗体的分子在小鼠体能的半衰期约为23.7小时、24.2小时及10.9小时；而带有非HSA相关的纳米抗体的分子半衰期约为1.4小时。结果显示，抗HSA纳米抗体可以显著提高分子的体内半衰期。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 普米斯生物技术（珠海）有限公司
<120> 抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物
<130> IDC210435
<160> 82
<170> PatentIn version 3.5
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<223> VHH 氨基酸序列
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<223> VHH 氨基酸序列
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<223> VHH 氨基酸序列
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<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asn Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Val Leu Glu Cys Arg Thr Val Val Arg Gly Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ala Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Val Leu Glu Cys Arg Thr Val Val Arg Gly Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Val Leu Glu Cys Arg Thr Val Val Arg Gly Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 24
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Trp Gly Ile Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Val Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Ala Asn Met Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ala Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ile Arg Asn Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Ser Ile Trp Gly Ile Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Val Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ile Arg Asn Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Ser Ile Trp Gly Ile Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Val Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ile Arg Asn Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Ser Ile Trp Gly Ile Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Val Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ile Arg Asn Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Thr Leu Glu Cys Arg Thr Val Ile Arg Gly Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 123
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ala Gln Leu Glu Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asn Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Thr Leu Glu Cys Arg Thr Val Leu Thr Gly Tyr Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 氨基酸序列
<400> 30
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
1 5
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 氨基酸序列
<400> 31
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 氨基酸序列
<400> 32
Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 氨基酸序列
<400> 33
Ser Gly Ser Ile Phe Thr Phe Tyr Arg
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 氨基酸序列
<400> 34
Ser Gly Glu Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 氨基酸序列
<400> 35
Ser Arg Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 氨基酸序列
<400> 36
Ser Gly Ser Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 氨基酸序列
<400> 37
Ser Gly Ser Ile Trp Gly Ile Tyr His
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR1 氨基酸序列
<400> 38
Ser Gly Ala Gln Leu Glu Tyr Tyr Ala
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 氨基酸序列
<400> 39
Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 氨基酸序列
<400> 40
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Pro
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 氨基酸序列
<400> 41
Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 氨基酸序列
<400> 42
Ile Thr Thr Asp Thr Ser Thr
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 氨基酸序列
<400> 43
Ile Ala Ser Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 氨基酸序列
<400> 44
Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ala Thr
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 氨基酸序列
<400> 45
Ile Ala Ser Ser Gly Gly Ala Thr
1 5
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR2 氨基酸序列
<400> 46
Ile Thr Val Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 47
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 47
Ala Ala Ala Thr Leu Glu Cys Arg Thr Val Val Val Gly Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 48
Ser Pro Ile Thr Ser Ile Phe Lys Ala
1 5
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 49
Ala Ala Ala Leu Leu Glu Cys Arg Val Arg Ser Trp Pro Ser Asp Asn
1 5 10 15
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 50
Asn Val Arg Asn Val Glu Arg Asp Tyr
1 5
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 51
Ala Ala Ala Val Leu Glu Cys Arg Thr Val Val Arg Glu Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 52
Ala Ala Ala Val Leu Glu Cys Arg Thr Val Val Arg Gly Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 53
Ala Ala Ala Thr Leu Glu Cys Arg Thr Thr Leu Thr Gly Tyr Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 54
Ala Ala Ala Val Leu Glu Cys Arg Ala Ala Glu Tyr Val Asn Ser
1 5 10 15
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 55
Ala Ala Ala Thr Leu Glu Cys Arg Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 56
Ala Ala Ala Thr Phe Glu Cys Arg Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 57
Asp Ile Arg Asn Val Gly Gly Asp Tyr
1 5
<210> 58
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 58
Ala Ala Ala Thr Leu Glu Cys Arg Thr Val Ile Arg Gly Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CDR3 氨基酸序列
<400> 59
Ala Ala Ala Thr Leu Glu Cys Arg Thr Val Leu Thr Gly Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第一轮PCR 上游引物序列
<400> 60
gtcctggctg ctcttctaca agg 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第一轮PCR 下游引物序列
<400> 61
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 62
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第二轮PCR 上游引物序列
<400> 62
ctagtgcggc cgcctggaga cggtgacctg ggt 33
<210> 63
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第二轮PCR 下游引物序列
<400> 63
cgcggatccc aggtgcagct gcaggagtct ggrggagg 38
<210> 64
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第三轮PCR 上游引物序列
<400> 64
atttttactg ctgttttatt cgcagcatcc tccgcattag ctaaaagaga ggctgaagca 60
caggtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 89
<210> 65
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 第三轮PCR 下游引物序列
<400> 65
agttgtcagt tcctgtgccc cccctcctcc cgcgccacct ccgcccgcac ctccgccacc 60
actggagacg gtgacctggg t 81
<210> 66
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游同源臂序列
<400> 66
atttttactg ctgttttatt cgcagcatcc tccgcattag ctaaaagaga ggctgaagca 60
<210> 67
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游同源臂序列
<400> 67
agttgtcagt tcctgtgccc cccctcctcc cgcgccacct ccgcccgcac ctccgccacc 60
<210> 68
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 人IgG1(LALA突变)Fc段 氨基酸序列
<400> 68
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 69
<211> 501
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bi-352 氨基酸序列
<400> 69
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala
20 25 30
Arg Thr Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
245 250 255
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ala Asn Ile Phe
260 265 270
Ser Phe Ala Ser Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
275 280 285
Glu Leu Val Ser Val Ile Thr Ser Ala Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Asp
290 295 300
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Asn Val Asp Tyr Leu Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
385 390 395 400
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg
405 410 415
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Ala Ser Ser
420 425 430
Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
435 440 445
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
450 455 460
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Val Leu Glu
465 470 475 480
Cys Arg Thr Val Val Arg Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser
500
<210> 70
<211> 501
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bi-353 氨基酸序列
<400> 70
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala
20 25 30
Arg Thr Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
245 250 255
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ala Asn Ile Phe
260 265 270
Ser Phe Ala Ser Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
275 280 285
Glu Leu Val Ser Val Ile Thr Ser Ala Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Asp
290 295 300
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Asn Val Asp Tyr Leu Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
385 390 395 400
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Ile Gly Trp Phe Arg
405 410 415
Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val Ser Cys Ile Ser Ser Ser
420 425 430
Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
435 440 445
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
450 455 460
Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Leu Leu Glu
465 470 475 480
Cys Arg Val Arg Ser Trp Pro Ser Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln
485 490 495
Val Thr Val Ser Ser
500
<210> 71
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bi-354 氨基酸序列
<400> 71
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala
20 25 30
Arg Thr Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
245 250 255
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ala Asn Ile Phe
260 265 270
Ser Phe Ala Ser Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
275 280 285
Glu Leu Val Ser Val Ile Thr Ser Ala Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Asp
290 295 300
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Asn Val Asp Tyr Leu Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Val Gln Leu Val Glu
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
385 390 395 400
Ser Ala Ser Gly Ser Ile Trp Gly Ile Tyr His Met Gly Trp Tyr Arg
405 410 415
Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Ser Ile Thr Val Asp
420 425 430
Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
435 440 445
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu
450 455 460
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp Ile Arg Asn Val Gly Gly
465 470 475 480
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
485 490
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 式I 氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa选自（i）Gly，Arg和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa选自（i）氨基酸残基Phe，Ala，Ser，Glu和（ii）相对于（i）是保守置换的氨
基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa选自（i）Thr，Gln和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa选自（i）Asp，Glu和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa选自（i）Ala和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<400> 72
Ser Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Tyr Tyr Xaa
1 5
<210> 73
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 式II 氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa选自（i）Ala，Ser和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa选自（i）Ala，Ser和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa选自（i）Thr和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<400> 73
Ile Xaa Ser Ser Gly Gly Xaa Xaa
1 5
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 式III 氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa选自（i）Thr，Val和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa选自（i）Thr，Val和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa选自（i）Val，Ile，Leu和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa选自（i）Arg，Val，Thr和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa选自（i）Gly，Glu和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa选自（i）Asp，Ala和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<400> 74
Ala Ala Ala Xaa Leu Glu Cys Arg Thr Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Tyr
1 5 10 15
<210> 75
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 式IV 氨基酸序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自（i）Leu，Phe和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基
<400> 75
Ala Ala Ala Thr Xaa Glu Cys Arg Gly Arg Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 76
<211> 365
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bi-340 氨基酸序列
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Leu Glu Glu Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Ala Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ala Tyr Gly Arg Tyr Phe Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala
260 265 270
Ser Gly Asn Ser Ala Asn Ile Phe Ser Phe Ala Ser Val Ala Trp Tyr
275 280 285
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val Ser Val Ile Thr Ser
290 295 300
Ala Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
305 310 315 320
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Val Asp Tyr Leu Gln
340 345 350
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
355 360 365
<210> 77
<211> 493
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Bi-356 氨基酸序列
<400> 77
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala
20 25 30
Arg Thr Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
245 250 255
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ala Asn Ile Phe
260 265 270
Ser Phe Ala Ser Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
275 280 285
Glu Leu Val Ser Val Ile Thr Ser Ala Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Asp
290 295 300
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
305 310 315 320
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
325 330 335
Tyr Cys Asn Val Asp Tyr Leu Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
340 345 350
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Glu Val Gln Leu Gln Glu
370 375 380
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
385 390 395 400
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Tyr Trp Leu Arg
405 410 415
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Asn Ser Asp
420 425 430
Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
435 440 445
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
450 455 460
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Pro Gly Gly
465 470 475 480
Tyr Ala Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
485 490
<210> 78
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH 氨基酸序列
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Ser Ile Trp Gly Ile Tyr
20 25 30
His Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ser Ile Thr Val Asp Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asp
85 90 95
Ile Arg Asn Val Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 79
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗第二抗原Fab轻链氨基酸序列
<400> 79
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala
20 25 30
Arg Thr Gly Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Ser Arg Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 80
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗第二抗原Fab重链氨基酸序列
<400> 80
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Leu Glu Glu Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Ala Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ala Tyr Gly Arg Tyr Phe Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr
225
<210> 81
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 抗第三抗原纳米抗体VHH 氨基酸序列
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Asn Ser Ala Asn Ile Phe
20 25 30
Ser Phe Ala Ser Val Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Leu Val Ser Val Ile Thr Ser Ala Gly Gly Thr Lys Tyr Ser Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Asn Val Asp Tyr Leu Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 82
<211> 115
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 非HSA相关纳米抗体VHH 氨基酸序列
<400> 82
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Asn Ser Asp Ser Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Pro Gly Gly Tyr Ala Lys Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115

Claims (24)

1.能够特异性结合血清白蛋白的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有选自以下的结构：SX1X2X3LX4YYX5(式I，SEQ ID NO:72)，SGSIWGIYH(SEQID NO:37)，SGFTFSIYS(SEQ ID NO:31)，SGSIFTFYR(SEQ ID NO:33)；
(b)CDR2，其具有选自以下的结构：IX6SSGGX7X8(式II，SEQ ID NO:73)，ITVDGST(SEQ IDNO:46)，ISSGGSP(SEQ ID NO:40)，ITTDTST(SEQ ID NO:42)；
(c)CDR3，其具有选自以下的结构：AAAX9LECRTX10X11X12X13YX14Y(式III，SEQ ID NO:74)，AAATX15ECRGRSSSYDY(式IV，SEQ ID NO:75)，AAALLECRVRSWPSDN(SEQ ID NO:49)，AAAVLECRAAEYVNS(SEQ ID NO:54)，DIRNVGGDY(SEQ ID NO:57)，SPITSIFKA(SEQ ID NO:48)，NVRNVERDY(SEQ ID NO:50)；
其中，
X1选自(i)氨基酸残基G，R和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X2选自(i)氨基酸残基F，A，S，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X3选自(i)氨基酸残基T，Q和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X4选自(i)氨基酸残基D，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X5缺失或者选自(i)氨基酸残基A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X6选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X7选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X8缺失或者选自(i)氨基酸残基T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X9选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X10选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X11选自(i)氨基酸残基V，I，L和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X12选自(i)氨基酸残基R，V，T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X13选自(i)氨基酸残基G，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X14选自(i)氨基酸残基D，A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X15选自(i)氨基酸残基L，F和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NOs:30-38任一项所示的CDR1；如SEQ ID NOs:39-46任一项所示的CDR2；以及，如SEQ ID NOs:47-59任一项所示的CDR3。
2.权利要求1的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有如SX1X2X3LX4YYX5(式I，SEQ ID NO:72)所示的结构；
(b)CDR2，其具有如IX6SSGGX7X8(式II，SEQ ID NO:73)所示的结构；
(c)CDR3，其具有选自以下的结构：AAAX9LECRTX10X11X12X13YX14Y(式III，SEQ ID NO:74)，AAATX15ECRGRSSSYDY(式IV，SEQ ID NO:75)，AAALLECRVRSWPSDN(SEQ ID NO:49)，AAAVLECRAAEYVNS(SEQ ID NO:54)；
其中，
X1选自(i)氨基酸残基G，R和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X2选自(i)氨基酸残基F，A，S，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X3选自(i)氨基酸残基T，Q和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X4选自(i)氨基酸残基D，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X5缺失或者选自(i)氨基酸残基A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X6选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X7选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X8缺失或者选自(i)氨基酸残基T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X9选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X10选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X11选自(i)氨基酸残基V，I，L和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X12选自(i)氨基酸残基R，V，T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X13选自(i)氨基酸残基G，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X14选自(i)氨基酸残基D，A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X15选自(i)氨基酸残基L，F和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
优选地，X1选自氨基酸残基G或R；X2选自氨基酸残基F，A，S或E；X3选自氨基酸残基T或Q；X4选自氨基酸残基D或E；X5缺失或者为氨基酸残基A；X6选自氨基酸残基A或S；X7选自氨基酸残基A或S；X8缺失或者为氨基酸残基T；X9选自氨基酸残基T或V；X10选自氨基酸残基T或V；X11选自氨基酸残基V，I或L；X12选自氨基酸残基R，V或T；X13选自氨基酸残基G或E；X14选自氨基酸残基D或A；X15选自氨基酸残基L或F；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NOs:30、32、34-36、38任一项所示的CDR1；如SEQ ID NOs:39、41、43-45任一项所示的CDR2；以及，如SEQ ID NOs:47、49、51-56、58-59任一项所示的CDR3。
3.权利要求1或2的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有如SX1X2X3LX4YYX5(式I，SEQ ID NO:72)所示的结构；
(b)CDR2，其具有如IX6SSGGX7X8(式II，SEQ ID NO:73)所示的结构；
(c)CDR3，其具有选自以下的结构：AAAX9LECRTX10X11X12X13YX14Y(式III，SEQ ID NO:74)，AAATX15ECRGRSSSYDY(式IV，SEQ ID NO:75)，AAALLECRVRSWPSDN(SEQ ID NO:49)，AAAVLECRAAEYVNS(SEQ ID NO:54)；
其中，
X1选自(i)氨基酸残基G，R和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X2选自(i)氨基酸残基F，E，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X3选自(i)氨基酸残基T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X4选自(i)氨基酸残基D和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X5缺失或者选自(i)氨基酸残基A和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X6选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X7选自(i)氨基酸残基A，S和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X8缺失或者选自(i)氨基酸残基T和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X9选自(i)氨基酸残基T，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X10选自(i)氨基酸残基V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X11选自(i)氨基酸残基V，I和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X12选自(i)氨基酸残基R，V和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X13选自(i)氨基酸残基G，E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X14选自(i)氨基酸残基D和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
X15选自(i)氨基酸残基L，F和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；
优选地，X1选自氨基酸残基G或R；X2选自氨基酸残基F，S或E；X3为氨基酸残基T；X4为氨基酸残基D；X5缺失或者为氨基酸残基A；X6选自氨基酸残基A或S；X7选自氨基酸残基A或S；X8缺失或者为氨基酸残基T；X9选自氨基酸残基T或V；X10为氨基酸残基V；X11选自氨基酸残基V或I；X12选自氨基酸残基R或V；X13选自氨基酸残基G或E；X14为氨基酸残基D；X15选自氨基酸残基L或F；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NOs:30、32、34-36任一项所示的CDR1；如SEQ ID NOs:39、41、43-45任一项所示的CDR2；以及，如SEQ ID NOs:47、49、51、52、54-56、58任一项所示的CDR3。
4.权利要求1的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有如SX1X2X3LX4YYX5(式I，SEQ ID NO:72)所示的结构，其中，X1为氨基酸残基G；X2选自(i)氨基酸残基F或E和(ii)相对于(i)是保守置换的氨基酸残基；X3为氨基酸残基T；X4为氨基酸残基D；X5为氨基酸残基A；
(b)CDR2，其具有如IASSGGST(SEQ ID NO:43)所示的结构；
(c)CDR3，其具有如AAAVLECRTVVRGYDY(SEQ ID NO:52)所示的结构；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:32或34所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQ ID Ns:52所示的CDR3。
5.权利要求1的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:37所示的序列，或与SEQ ID NO:37所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:46所示的序列，或与SEQ ID NO:46所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及
(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:57所示的序列，或与SEQ ID NO:57所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:37所示的CDR1、如SEQ IDNO:46所示的CDR2、如SEQ ID NO:57所示的CDR3。
6.权利要求1的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:31所示的序列，或与SEQ ID NO:31所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:40所示的序列，或与SEQ ID NO:40所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及
(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:48所示的序列，或与SEQ ID NO:48所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:31所示的CDR1、如SEQ IDNO:40所示的CDR2、如SEQ ID NO:48所示的CDR3。
7.权利要求1的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：
(a)CDR1，其具有：如SEQ ID NO:33所示的序列，或与SEQ ID NO:33所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
(b)CDR2，其具有：如SEQ ID NO:42所示的序列，或与SEQ ID NO:42所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；以及
(c)CDR3，其具有：如SEQ ID NO:50所示的序列，或与SEQ ID NO:50所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
优选地，所述的置换是保守置换；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:33所示的CDR1、如SEQ IDNO:42所示的CDR2、如SEQ ID NO:50所示的CDR3。
8.权利要求1-7任一项的纳米抗体或其抗原结合片段，其包含：
(1)如SEQ ID NO:30所示的CDR1；如SEQ ID NO:39所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:47所示的CDR3；
(2)如SEQ ID NO:31所示的CDR1；如SEQ ID NO:40所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:48所示的CDR3；
(3)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:49所示的CDR3；
(4)如SEQ ID NO:33所示的CDR1；如SEQ ID NO:42所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:50所示的CDR3；
(5)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:51所示的CDR3；
(6)如SEQ ID NO:32或34所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQ IDNO:52所示的CDR3；
(7)如SEQ ID NO:35所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:52所示的CDR3；
(8)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:43所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:53所示的CDR3；
(9)如SEQ ID NO:36所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:54所示的CDR3；
(10)如SEQ ID NO:35所示的CDR1；如SEQ ID NO:44所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:55所示的CDR3；
(11)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:45所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:56所示的CDR3；
(12)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:52所示的CDR3；
(13)如SEQ ID NO:37所示的CDR1；如SEQ ID NO:46所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:57所示的CDR3；
(14)如SEQ ID NO:32所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:58所示的CDR3；或
(15)如SEQ ID NO:38所示的CDR1；如SEQ ID NO:41所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:59所示的CDR3。
9.权利要求1-8任一项的纳米抗体或其抗原结合片段，其包含选自下列的氨基酸序列：
(i)如SEQ ID NOs:1-3、7-9、14-24、28-29任一项所示的序列；
(ii)与SEQ ID NOs:1-3、7-9、14-24、28-29任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NOs:1-3、7-9、14-24、28-29任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，所述的置换是保守置换。
10.权利要求1-8任一项的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段是人源化的；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。
11.权利要求10的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含选自下列的氨基酸序列：
(i)如SEQ ID NOs:4-6、10-13、25-27、78任一项所示的序列；
(ii)与SEQ ID NOs:4-6、10-13、25-27、78任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(iii)与SEQ ID NOs:4-6、10-13、25-27、78任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，所述的置换是保守置换。
12.权利要求1-11任一项的纳米抗体或其抗原结合片段，其中，所述血清白蛋白选自人血清白蛋白(HSA)，鼠血清白蛋白(MSA)和/或食蟹猴血清白蛋白(CSA)；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段与所述血清白蛋白的结合是非pH依赖性的；
优选地，所述纳米抗体或其抗原结合片段能与所述血清白蛋白在pH 5-8(例如pH 5.5-7.4)的范围内特异性结合。
13.特异性结合血清白蛋白的多肽构建体，其包含权利要求1-12任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，以及免疫球蛋白Fc结构域；
优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端(例如C端)；
优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG的Fc结构域(例如IgG1的Fc结构域)；
优选地，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO：68所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
14.权利要求13的多肽构建体，其中，所述血清白蛋白选自人血清白蛋白(HSA)，鼠血清白蛋白(MSA)和/或食蟹猴血清白蛋白(CSA)；
优选地，所述多肽构建体与所述血清白蛋白的结合是非pH依赖性的；
优选地，所述多肽构建体能与所述血清白蛋白在pH 5-8(例如pH 5.5-7.4)的范围内特异性结合。
15.融合蛋白，其包含权利要求1-12任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求13或14所述的多肽构建体，以及，另外的肽结构域；
优选地，所述另外的肽结构域选自具有治疗效应的多肽结构域；
优选地，所述另外的多肽结构域任选地通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段或所述多肽构建体的N端和/或C端。
16.分离的核酸分子，其编码权利要求1-12任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，权利要求13或14所述的多肽构建体，或权利要求15的融合蛋白。
17.载体，其包含权利要求16所述的核酸分子；优选地，所述载体为克隆载体或表达载体。
18.宿主细胞，其包含权利要求16所述的核酸分子或权利要求17所述的载体。
19.制备权利要求1-12任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，权利要求13或14所述的多肽构建体，或权利要求15的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求18所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段或所述多肽构建体。
20.双特异性或多特异性抗体，其包含权利要求1-12任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求13或14所述的多肽构建体；
优选地，所述双特异性或多特异性抗体特异性结合血清白蛋白，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标；
优选地，所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体；
优选地，所述双特异性或多特异性抗体包含：
(i)如权利要求1-12任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如权利要求13或14所述的多肽构建体(例如，含有如SEQ ID NOs:10、4、78任一项所示的序列的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体)作为第一抗原特异性结合结构域；
(ii)包含如SEQ ID NO:79所示的轻链和如SEQ ID NO:80所示的重链的第二抗原特异性结合结构域(如Fab)；
以及，
(iii)如SEQ ID NO:81所示的第三抗原特异性结合结构域(例如，纳米抗体VHH)；
优选地，所述双特异性或多特异性抗体包含第一多肽链和第二多肽链，其中，所述第一多肽链包含(例如从N端至C端)：所述第二抗原特异性结合结构域的轻链或重链(如VH和CH1)，所述第三抗原特异性结合结构域，所述第一抗原特异性结合结构域；并且，所述第二多肽链包含(例如从N端至C端)：所述第二抗原特异性结合结构域的重链(如VH和CH1)或轻链，所述第三抗原特异性结合结构域；其中，所述第一多肽链与第二多肽链配对形成完整的所述第二抗原特异性结合结构域；优选地，所述第一多肽链和/或第二多肽链中的各个结构域通过接头(例如包含一个或多个甘氨酸和/或一个或多个丝氨酸的肽接头)连接；
优选地，所述双特异性或多特异性抗体包含:
(1)序列如SEQ ID NO:69所示的第一肽，和，序列如SEQ ID NO:76所示的第二肽；
(2)序列如SEQ ID NO:70所示的第一肽，和，序列如SEQ ID NO:76所示的第二肽；
或者,
(3)序列如SEQ ID NO:71所示的第一肽，和，序列如SEQ ID NO:76所示的第二肽；
优选地，所述第一肽存在于第一肽链，所述第二肽存在于第二肽链；优选地，所述第一肽链与所述第二肽链形成复合物。
21.缀合物，其包含权利要求1-12任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求13或14所述的多肽构建体，以及与所述纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体连接的治疗剂；
优选地，所述治疗剂选自抗肿瘤药物，例如细胞毒剂、激素类药物、生物反应调节剂、另外的抗体或其抗原结合片段。
22.药物组合物，其包含权利要求1-12任一项的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求13或14所述的多肽构建体、权利要求15的融合蛋白、权利要求16的分离的核酸分子、权利要求17的载体、权利要求18所述的宿主细胞、权利要求20所述的双特异性或多特异性抗体或权利要求21所述的缀合物；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂；
优选地，所述药物组合物包含权利要求1-12任一项的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求13或14所述的多肽构建体、或编码所述纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体的核酸分子、载体或宿主细胞；
优选地，所述药物组合物包含权利要求15所述的融合蛋白、或编码所述融合蛋白的核酸分子、载体或宿主细胞；
优选地，所述药物组合物包含权利要求20所述的双特异性或多特异性抗体、或编码所述双特异性或多特异性抗体的核酸分子、载体或宿主细胞；
优选地，所述药物组合物包含权利要求21所述的缀合物。
23.权利要求1-12任一项的纳米抗体或其抗原结合片段、权利要求13或14所述的多肽构建体、权利要求15的融合蛋白、权利要求16的分离的核酸分子、权利要求17的载体、权利要求18所述的宿主细胞、权利要求20所述的双特异性或多特异性抗体或权利要求21所述的缀合物、或权利要求22所述的药物组合物用于制备药物的用途；
优选地，所述药物在受试者体内能直接或间接参与FcRn介导的血清白蛋白循环；
优选地，所述药物显示相对于缺少所述纳米抗体或其抗原结合片段的相应的药物延长的体内半衰期；
优选地，所述药物是蛋白质类药物；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人，小鼠或食蟹猴。
24.一种延长药物的体内半衰期的方法，其包括：将权利要求1-12任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求13或14所述的多肽构建体与所述药物进行连接；
优选地，所述体内半衰期的延长是相对于缺少所述纳米抗体或其抗原结合片段时所述药物的体内半衰期；
优选地，所述药物选自大分子药物(例如多肽类药物)；
优选地，所述受试者为哺乳动物，例如人，小鼠或食蟹猴。
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