CN116650648A - 靶向cd36在促进糖尿病创面愈合以及降低苯丙酮酸诱导的促炎作用中的应用 - Google Patents

靶向cd36在促进糖尿病创面愈合以及降低苯丙酮酸诱导的促炎作用中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医学技术领域，公开了靶向CD36在促进糖尿病创面愈合以及降低苯丙酮酸诱导的促炎作用中的应用，具体公开了苯丙酮酸抑制剂在制备治疗或辅助糖尿病足溃疡的药物中的应用。本发明通过代谢组学分析，发现糖尿病足溃疡中有显著的苯丙酮酸积聚，增加苯丙酮酸损害伤口愈合和增强炎症反应。首次提出靶向苯丙酮酸，以防止糖尿病伤口的过度炎症，通过饮食苯丙氨酸限制减少苯丙酮酸则缓解失控的炎症并有利于糖尿病伤口。

Description

靶向CD36在促进糖尿病创面愈合以及降低苯丙酮酸诱导的促 炎作用中的应用
技术领域
本发明属于医学技术领域，具体涉及靶向CD36在促进糖尿病创面愈合以及降低苯丙酮酸诱导的促炎作用中的应用。
背景技术
糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病最常见和最具挑战性的慢性并发症之一，其发病时间长，治疗周期难治。在过去的几十年里，DFU一直是一个严重的全球医疗问题，并且仍然是非创伤性下肢丧失的主要原因。此外，DFU与糖尿病致残和死亡风险的增加密切相关，DFU患者的5年生存率比最常见的癌症患者差。正在进行的关于DFUS的一个令人兴奋的研究领域集中在巨噬细胞的异常极化上，巨噬细胞在糖尿病伤口的慢性炎症中起着关键作用。具体地说，从促炎表型到促进愈合表型的受损转换会导致炎症介质的聚集，并阻碍糖尿病伤口的愈合。因此，探索糖尿病创面慢性炎症的致病因素，为个体化防治提供新的治疗方法具有重要的科学意义。
核苷酸结合的寡聚化结构域样受体(NLR)是一种含3个吡咯环的家族结构域(NLRP3)，它与含有半胱氨酸天冬氨酸酶招募结构域(ASC)和半胱氨酸天冬氨酸氨基转移酶-1(caspase-1)的接头蛋白凋亡相关的斑点样蛋白相互作用，形成一个称为NLRP3炎症体的细胞内蛋白复合体。在存在无菌危险信号或某些微生物产物时，它充当先天免疫触发器，启动炎症反应。当炎症小体被激活时，在Caspase-1的裂解下产生生物活性的IL-1β和IL-18，然后释放到微环境中，增强获得性免疫反应。NLRP3炎症小体的慢性激活强调了几种自身炎症性疾病的发病机制，包括类风湿性关节炎和痛风。新的证据表明，糖尿病患者体内NLRP3水平升高导致慢性炎症和氧化应激，从而损害伤口愈合。即便如此，还需要进一步的研究来充分了解糖尿病伤口中NLRP3的调节，并确定治疗这种疾病的最佳方法。
累积研究表明，糖尿病及其并发症中存在大量的代谢紊乱，可能是由高血糖引起的，也可能是独立发生的。代谢组的变化被认为反映了最接近个体表型的分子特征，因为它们整合了来自外源暴露的信息以及基因组、转录组和蛋白质组。代谢重新编程与适应性免疫和炎症调节密切相关。例如，谷氨酰胺分解产生的α-酮戊二酸(αKG)通过依赖于Jmjd3的M2基因的代谢和表观遗传重新编程来协调巨噬细胞的激活。衣康酸及其衍生物通过直接修饰JAK1上的半胱氨酸残基和抑制其磷酸化来削弱巨噬细胞的交替激。然而，DFU中的代谢扰动如何调节失控的局部适应性炎症反应尚未阐明。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供苯丙酮酸抑制剂在制备治疗或辅助治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。
本发明第二方面的目的，在于提供苯丙酮酸在构建延缓糖尿病足溃疡创面愈合的动物模型中的应用
本发明第三方面的目的，在于提供CD36抑制剂的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种RNA。
本发明第五方面的目的，在于提供与本发明第五方面的RNA相关的生物材料。
本发明第六方面的目的，在于提供检测苯丙酮酸和/或检测苯丙氨酸的物质在制备糖尿病足溃疡诊断或预后评估的产品中的应用。
本发明第七方面的目的，在于提供一种延缓糖尿病足溃疡创面愈合的动物模型。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，在于提供苯丙酮酸抑制剂在制备治疗或辅助治疗糖尿病足溃疡的药物中的应用。
在于提供苯丙酮酸抑制剂在制备用于抑制NLRP3炎症小体活化的产品中的应用。
在于提供苯丙酮酸抑制剂在制备用于促炎症巨噬细胞极化的产品中的应用。
优选地，所述苯丙酮酸抑制剂通过促进糖尿病伤口愈合和/或消除病理性炎症达到治疗糖尿病足溃疡的目的。
优选地，所述病理性炎症包括由NLRP3炎症小体的激活和/或巨噬细胞极化的不平衡而引起的炎症反应。
优选地，所述苯丙酮酸抑制剂通过抑制NLRP3、IL1β和TNFα的表达从而抑制NLRP3炎症小体的激活。
优选地，所述苯丙酮酸抑制剂通过调节糖尿病伤口中巨噬细胞转换而促进糖尿病伤口的愈合。
优选地，所述巨噬细胞转变表现为M1/M2巨噬细胞的比例降低。
优选地，所述苯丙酮酸抑制剂为降解苯丙酮酸的物质、减少苯丙酮酸生成的物质和减少苯丙酮酸积聚的物质中的至少一种。
本发明第二个方面，在于提供苯丙酮酸在构建延缓糖尿病足溃疡创面愈合的动物模型中的应用。
本发明第三个方面，在于提供CD36抑制剂在(4)～(9)中任一项中的应用：
(4)抑制NLRP3炎症小体的活化；
(5)制备用于抑制NLRP3炎症小体活化的产品；
(6)抑制NLRP3的表达上调；
(7)制备用于抑制NLRP3的表达上调的产品
(8)抑制IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α的分泌增加；
(9)制备用于抑制IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α的分泌增加的产品。
优选的，所述NLRP3炎症小体活化、NLRP3的表达上调和IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α的分泌增加均为由苯丙酮酸诱导而成。
优选地，所述CD36抑制剂抑制CD36活性的物质、降解CD36的物质和降低CD36表达水平的物质中的至少一种。
优选地，所述降低CD36表达水平的物质为(a1)～(a3)中至少一种：
(a1)靶向CD36的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA；
(a2)编码(a1)的核酸分子；
(a3)包含(a2)的表达盒、载体或转基因细胞系。
所述CD36抑制剂为(b1)～(b3)中至少一种：
(b1)靶向CD36的siRNA；
(b2)编码(b1)的核酸分子；
(b3)包含(b2)的表达盒、载体或转基因细胞系。
优选的，所述siRNA为反向互补的双链RNA，其中的一条链的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
本发明第四个方面，在于提供一种RNA，为siRNA，所述siRNA为反向互补的双链RNA，其中的一条链的序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
本发明第五个方面，在于提供与本发明第四方面的RNA相关的生物材料，所述生物材料为：
(c1)编码本发明第四方面的RNA的核酸分子；或
(c2)包含(c1)的表达盒、载体或转基因细胞系。
本发明第六个方面，在于提供检测苯丙酮酸和/或检测苯丙氨酸的物质在制备糖尿病足溃疡诊断或预后评估的产品中的应用。
本发明第七个方面，在于提供一种延缓糖尿病足溃疡创面愈合的动物模型，包括以下步骤：(1)选用糖尿病模型小鼠，并创建伤口；(2)喂食苯丙酮酸和/或苯丙氨酸，即得到延缓糖尿病足溃疡创面愈合的动物模型。
本发明的有益效果是：
本发明通过代谢组学分析，发现糖尿病足溃疡中有显著的苯丙酮酸积聚，增加苯丙酮酸损害伤口愈合和增强炎症反应。首次提出靶向苯丙酮酸，以防止糖尿病伤口的过度炎症，通过饮食苯丙氨酸限制减少苯丙酮酸则缓解失控的炎症并有利于糖尿病伤口。
CD36是巨噬细胞摄取苯丙酮酸的中介物，苯丙酮酸处理会上调细胞表面CD36的表达，而CD36的敲除则会减轻苯丙酮酸诱导的促炎巨噬细胞表型。实验结果表明，在通过siRNA下调CD36表达后，苯丙酮酸处理没有增加NLRP3的表达水平或激活炎症小体。降低CD36的表达逆转了苯丙酮酸诱导的IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α分泌的增加。
附图说明
图1为代谢组学概况确定DFU中苯丙酮酸的积累，会损害伤口愈合并延长炎症；其中，A为显示通过OPLS-DA(n＝12)在NDW组和DFU组之间进行配对分裂的代谢分离的分数图；B为显示DFU与NDW比较中的差异代谢物的火山图；C为差异代谢物代谢富集分析中前25个代谢物结果图；D为DFU和NDW之间差异代谢物的通路富集分析结果，纵坐标表示通路富集分析的P值(负对数)，横坐标代表通路拓扑分析的影响因素，圆圈越大，影响因子越高，更深的红色表示更大的log(P)值，表示更多的富集；E为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的示意图；F为由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径中差异代谢物的相对倍数变化生成的直方图和热图；图中，*代表P<0.05，**代表P<0.01。
图2为代谢组学概况确定DFU中苯丙酮酸的积累；其中，A为DFU组和NDW组中NLRP3的代表性IHC染色图像；B为苯丙酮酸水平与DFU中NLRP3表达的相关性分析(n＝12)；C为通过手术切除生成伤口模型后第0、3、6、9和12天年龄匹配的C57BL/6JGpt小鼠皮肤伤口的代表性图像(n＝12)；D为伤口大小的比率通过使用Image J软件进行量化，并通过与第0天伤口大小相比的伤口闭合百分比计算；E为对皮肤伤口切片进行H&E和Masson的三色染色以及IHC染色结果，伤口模型生成后6天收集样品(n＝3)，比例尺：100μm；F为显示相对表皮厚度的组织学染色分析；G为皮肤伤口中NLRP3染色的统计分析；H为第6天皮肤伤口中的巨噬细胞浸润的代表性免疫荧光图像(n＝3)，比例尺：20μm；I为第6天皮肤伤口中的巨噬细胞浸润的代表性免疫荧光图像的结果统计图；J为第6天皮肤伤口巨噬细胞浸润的流式细胞术分析，代表性直方图显示了这些组的皮肤伤口中F4/80+CD86+细胞的水平，统计分析表明CD86的平均荧光强度(MFI)(n＝3)；K为第9天皮肤伤口巨噬细胞浸润的流式细胞术分析结果图，代表性直方图显示了这些组的皮肤伤口中F4/80+CD86+细胞的水平，统计分析表明CD86的平均荧光强度(n＝3)；L为蛋白质印迹图像和分析显示来自这些组的皮肤伤口中的NLRP3蛋白表达水平(n＝3)；图中，*代表P<0.05，**代表P<0.01。
图3为苯丙酮酸与伤口愈合延迟和炎症延长有关；其中，A为苯丙氨酸生物合成途径中差异代谢物与DFU中NLRP3表达的相关性分析(n＝12)；B为4-羟基苯乙酸生物合成途径中差异代谢物与DFU中NLRP3表达的相关性分析(n＝12)；C为酪氨酸生物合成途径中差异代谢物与DFU中NLRP3表达的相关性分析(n＝12)；D为Dopamine content生物合成途径中差异代谢物与DFU中NLRP3表达的相关性分析(n＝12)；E为糖尿病伤口和非糖尿病伤口靶向代谢物分析的示意图；F为苯丙氨酸途径代谢物的靶向分析，数字表示糖尿病伤口与非糖尿病伤口相比的倍数变化，大于1的值表明上调，而小于1的值表明糖尿病伤口下调，白色表示未检测到；G为皮肤伤口胶原体积分数染色的统计分析；H为皮肤伤口Ki-67染色的统计分析；I为皮肤伤口αSMA染色的统计分析；J为皮肤伤口CD31染色的统计分析；K为第6天皮肤伤口中的炎症因子IL1β的ELISA分析结果；L为第6天皮肤伤口中的炎症因子TNFα的ELISA分析结果；图中，*P代表<0.05，**代表P<0.01。
图4为苯丙酮酸被BMDMs吸收并触发促炎巨噬细胞表型；其中，A为BMDMs用苯丙酮酸和LPS处理后Nos的相对mRNA表达的RT-qPCR检测结果图，ACTB为对照基因；B为BMDMs用苯丙酮酸和LPS处理后Tnf的相对mRNA表达的RT-qPCR检测结果图，ACTB为对照基因；C为BMDMs用苯丙酮酸和LPS处理后Il6的相对mRNA表达的RT-qPCR检测结果图，ACTB为对照基因；D为用苯丙酮酸和LPS处理后BMDMs中Nos的免疫染色和统计分析，比例尺：150μm；E为苯丙酮酸和LPS处理后BMDMs中M1表面标记CD86的流式细胞分析结果图，显示平均荧光强度(MFI)(左)和CD86的代表性直方图(右)；F为苯丙酮酸、LPS和ATP依次处理BMDMs后BMDMs上清液中的炎症因子IL1β的ELISA测定结果图；G为苯丙酮酸、LPS和ATP依次处理BMDMs后BMDMs上清液中的炎症因子IL18的ELISA测定结果图；H为苯丙酮酸、LPS和ATP依次处理BMDMs后BMDMs上清液中的炎症因子TNFα的ELISA测定结果图；I为苯丙酮酸、LPS和ATP依次处理BMDMs后BMDMs上清液(SN)和BMDM细胞提取物(裂解物，Ly)的免疫印迹结果图；J为用苯丙酮酸、LPS(100ng/mL)和尼日利亚菌素(10μM)处理BMDM后的上清液(SN)和细胞提取物(裂解物，Ly)的免疫印迹结果图；K为免疫染色显示苯丙酮酸摄取到BMDM中，FITC抗体表示苯丙酮酸，脂筏抗体表示质膜，比例尺：50μm；L为BMDMs用苯丙酮酸(400μM)、有或没有细胞松弛素D(10μM)、LPS(100ng/mL)、ATP(3mM)作用后其上清液和细胞提取物(裂解物)的免疫印迹结果图；图中，*代表P<0.05，**代表P<0.01。
图5为苯丙酮酸对巨噬细胞的影响；其中，A为巨噬细胞采集和极化的实验图；B为BMDMs用苯丙酮酸和IL4处理后Arg1的相对mRNA表达的RT-qPCR检测结果图，黑色三角形表示从左侧开始增加的苯丙酮酸浓度：200、400和800μM，ACTB为对照基因；C为BMDMs用苯丙酮酸和IL4处理后Chil3的相对mRNA表达的RT-qPCR检测结果图，黑色三角形表示从左侧开始增加苯丙酮酸的浓度(200、400和800μM)，ACTB为对照基因；D为BMDMs用苯丙酮酸和IL4处理后Retnla的相对mRNA表达的RT-qPCR检测结果图，黑色三角形表示从左侧开始增加苯丙酮酸的浓度(200、400和800μM)，ACTB为对照基因；E为苯丙酮酸预处理和IL4刺激后BMDM中Mrc1的免疫染色和统计分析，比例尺：150μm；F为苯丙酮酸和IL4处理后BMDMs中M2表面标记CD163的流式细胞分析结果图，显示平均荧光强度(MFI)(左)和CD163的代表性直方图(右)；G为RT-qPCR分析显示苯丙酮酸处理后NLRP3 mRNA的相对表达；H为用苯丙酮酸、培养基或LPS和识别磷酸化p65、总p65、磷酸化ERK1/2、总ERK1/2、磷酸化Akt、总Akt、磷酸化p38抗体刺激的BMDM的免疫印迹分析结果图，以GAPDH和ACTB作为对照；I为BMDM摄取苯丙酮酸的免疫染色和统计分析结果图，比例尺：50μm；图中，*代表P<0.05，**代表P<0.01，ns代表没有显著性差异。
图6为反映了映射到每个亚细胞位置的差异表达的多肽依赖性蛋白质比例的玫瑰图。
图7为CD36介导巨噬细胞摄取苯丙酮酸；其中，A为LiP-SMap测定中鉴定的质膜蛋白的气泡图，圆圈的颜色表示p值；B为显示BMDM中苯丙酮酸的摄取的免疫染色和统计分析结果图，FITC抗体表示苯丙酮酸，脂筏抗体表示质膜，比例尺：50μm；C为用苯丙酮酸处理的BMDM中CD36和LRP1的相对mRNA表达的RT-qPCR检测结果；D为用苯丙酮酸处理的BMDM中总CD36蛋白表达的免疫印迹分析结果图，黑色三角形表示从左侧开始增加苯丙酮酸的浓度(200、400和800μM)；E为显示了用苯丙酮酸处理的BMDM表面上的CD36蛋白表达的流式细胞术数据的统计分析和代表性直方图；F为处理后的BMDM(敲低或不敲低CD36，用苯丙酮酸处理4h、LPS处理24h，然后用ATP刺激45min)中的上清液和细胞提取物的免疫印迹分析结果图；G为处理后的BMDM(敲低或不敲低CD36，用苯丙酮酸处理4h、LPS处理24h，然后用ATP刺激45min)的上清液中炎症因子IL1β的ELISA检测结果；H为处理后的BMDM(敲低或不敲低CD36，用苯丙酮酸处理4h、LPS处理24h，然后用ATP刺激45min)的上清液中炎症因子IL-18的ELISA检测结果；I为处理后的BMDM(敲低或不敲低CD36，用苯丙酮酸处理4h、LPS处理24h，然后用ATP刺激45min)的上清液中炎症因子TNFα的ELISA检测结果；J为CD36(全长)示意图；K为苯丙酮酸自动对接至CD36蛋白胞外部分的代表性图像；图中，*代表P<0.05，**代表P<0.01，ns代表没有显著性差异。
图8为巨噬细胞中CD36介导的苯基丙酮酸摄取的鉴定；其中，A为CD36和LRP1在BMDM中的相对mRNA表达的RT-qPCR检测结果图；B为分别在敲低CD36和LRP1的情况下对BMDM中CD36和LRP1表达的免疫印迹分析结果图；C为在LRP1敲低或不敲低的BMDM中苯基丙酮酸的摄取的免疫染色和统计分析，FITC抗体指示苯基丙酮酸盐，脂质筏抗体指示质膜，比例尺：50μm；D为用苯基丙酮酸盐处理的BMDM中总LRP1蛋白表达的免疫印迹分析结果图，黑色三角形表示从左侧开始增加苯丙酮酸的浓度(200、400和800μM)；图中，*代表P<0.05，**代表P<0.01，ns代表没有显著性差异。
图9为限制饮食苯丙氨酸可以减少苯丙酮酸的积累，促进糖尿病伤口愈合；其中，A为喂食不同苯丙氨酸饮食的糖尿病伤口模型小鼠的示意图，每组n＝12；B为通过代谢质谱法检测来自不同组的皮肤伤口中的指定代谢物；C为在伤口模型生成之前，糖尿病小鼠喂食苯丙氨酸限制饮食一周的体重；D为糖尿病小鼠皮肤伤口在手术切除伤口模型生成后第0、4、8、12和16天的代表性图像；E为使用ImageJ软件量化伤口大小的百分比；F为对来自不同组的皮肤伤口切片进行H&E和Masson的三色染色以及使用Ki-67、α-SMA、CD31和NLRP3抗体进行IHC染色的结果图，比例尺：100μm；G为相对表皮厚度的组织学染色分析结果图；H为不同组别皮肤创面NLRP3染色的统计分析结果图；I为第8天皮肤伤口中的巨噬细胞浸润(n＝3)代表性免疫荧光图像，比例尺：20μm；J为第8天皮肤伤口中的巨噬细胞浸润(n＝3)代表性免疫荧光的结果统计图；K为第8天不同组皮肤伤口巨噬细胞浸润的流式细胞术分析结果图，代表性直方图显示这些组皮肤伤口中F4/80+CD86+细胞的水平，统计分析表明CD86(n＝3)的平均荧光强度；L为第12天不同组皮肤伤口巨噬细胞浸润的流式细胞术分析结果图，代表性直方图显示这些组皮肤伤口中F4/80+CD86+细胞的水平，统计分析表明CD86(n＝3)的平均荧光强度；M为喂食不同苯丙氨酸饮食的糖尿病小鼠的NLRP3的表达水平检测结果图；图中，*代表P<0.05，**代表P<0.01，ns代表没有显著性差异。
图10为限制饮食苯丙氨酸可促进伤口愈合，但对体内一般生理状况无明显影响；其中，A为喂食不同苯丙氨酸饮食的糖尿病小鼠的外周血糖水平；B为喂食不同苯丙氨酸饮食的糖尿病小鼠的食物摄入量；C为不同组皮肤伤口胶原体积分数的染色统计结果图；D为不同组皮肤伤口Ki-67的染色统计结果图；E为不同组皮肤伤口αSMA的染色统计结果图；F为不同组皮肤伤口CD31的染色统计结果图；G为第8天皮肤伤口中的炎症因子IL1β的ELISA检测结果图；H为第8天皮肤伤口中的炎症因子TNFα的ELISA检测结果图；I为喂食不同苯丙氨酸饮食的小鼠的各种器官的H&E染色的代表性图像；图中，*代表P<0.05，**代表P<0.01，ns代表没有显著性差异。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例中所用的抗体如下：NLRP3(for immunblot)(Cell SignalingTechnology，Cat#15101)；Cleaved-IL-1β(Cell Signaling Technology，Cat#63124)；IL-1β(Cell Signaling Technology，Cat#31202)；Cleaved Caspase-1(Cell SignalingTechnology，Cat#89332)；Caspase-1(Cell Signaling Technology，Cat#24232)；β-Actin(Cell Signaling Technology，Cat#3700)；GAPDH(Cell Signaling Technology，Cat#5174)；p-p65(Abcam，Cat#ab76302)；p65(Abcam，Cat#ab32536)；p-ERK1/2(Abcam，Cat#ab201015)；ERK1/2(Abcam，Cat#ab184699)；p-AKT(Abcam，Cat#4060T)；AKT(Abcam，Cat#60203-2-Ig)；p-p38(Abcam，Cat#ab195049)；p38(Abcam，Cat#ab170099)；CD36(Abcam，Cat#ab252923)；LRP1(Abcam，Cat#ab92544)；Ki-67(Cell Signaling Technology，Cat#9129S)；α-SMA(Proteintech，Cat#14395-1-AP)；CD31(Abcam，Cat#ab182981)；HSC70(Proteintech，Cat#10654-1-AP)；Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjugate(Promega，Cat#W4011)；Anti-Mouse IgG(H+L),HRP Conjugate(Promega，Cat#W4021)；APC anti-mouse CD86,clone GL-1(Biolegend，Cat#105012)；PE anti-mouse CD163,clone S15049F(Biolegend，Cat#156704)；APC anti-mouse CD36,clone HM36(Biolegend，Cat#102611)；Brilliant Violet421TManti-mouse F4/80,clone BM8(Biolegend，Cat#123137)；APC anti-mouse/humanCD11b,clone M1/70(Biolegend，Cat#101212)；TruStain FcXTM(anti-mouse CD16/32),clone 93(Biolegend，Cat#101319)；NLRP3(for IHC staining，Affinity，Cat#DF7438)；Anti-F4/80Rabbit pAb(Servicebio，Cat#GB11027)；Anti-Mannose Receptor/CD206Rabbit pAb(Servicebio，Cat#GB113497)；NOS(D6B6S)Rabbit mAb(Cell SignalingTechnology，Cat#13120)；CD206/MRC1(E6T5J)Rabbit mAb(Cell SignalingTechnology，Cat#24595)；Cholera Toxin Subunit B(Recombinant),AlexaFluorTM555Conjugate(Thermo Fisher Scientific，Cat#C22843)；Hoechst 33342Solution(Thermo Fisher Scientific，Cat#62249)；Lyso-Tracker Red(Beyotime，C1046)；LysoSensorTMGreen DND-189(Yeasen，Cat#40767ES50)；ABfloTM555-conjugated GoatAnti-Mouse IgG(H+L)(Abclonal，Cat#AS057)；Alexa Fluor 647-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Abclonal，Cat#AS060)Fluorescein(FITC)–conjugated AffinipureGoat Anti-Rat IgG(H+L)(Proteintech，Cat#SA00003-11)。
实施例1糖尿病足溃疡(DFU)创面与非糖尿病(NDW)创面的非靶向代谢组学分析
人体伤口组织收集
所有患者均在中山大学附属第一医院烧伤整形外科就诊。本研究由中山大学附属第一医院研究医学伦理委员会根据《赫尔辛基宣言》(文号：[2023]040)批准。所有受试者均获得知情同意。收集糖尿病足溃疡(n＝12)和非糖尿病足部溃疡(n＝12)的活检标本，伤口使用无菌的3毫米穿孔器取样。按照下面的描述收集非糖尿病伤口样本：无菌3mm穿孔活检用于在非糖尿病参与者的手臂腋后区域建立统一的全厚度活检，三天后，再次对伤口进行活组织检查并收集标本。采集的活检样品，在-80℃下保存待用。
DFUS纳入标准为：(1)糖尿病>1年；(2)足部溃疡大于0.5cm2；(3)神经病变；(4)伤口持续时间>1个月；(5)血红蛋白A1c：≤13.0％；(6)不做手术。
DFUS的排除标准为：(1)活动性蜂窝组织炎；(2)坏疽；(3)骨髓炎；(4)血管功能不全；(5)在活检前4周内在伤口上应用任何实验性药物。
代谢组学分析
代谢物提取：活检样品在液氮中均质成粉，并用冷提取溶剂旋转。为了在靶向代谢组学中对代谢物进行绝对定量，还在提取溶剂中同时加入稳定同位素内标物的原液。旋转后，混合物在冰上孵育20min，然后在4℃下14000×g离心20min，然后收集上清液，流经96孔蛋白质沉淀板，洗脱液收集并在4℃真空离心机中干燥，用于UHPLC-HRMS分析，样品用100μL乙腈/水溶剂(1:1)重新溶解并转移到液相小瓶中。
UHPLC-HRMS分析：用四极飞行时间质谱仪通过电喷雾电离与亲水作用层析联用来分析活检提取液。在ACQUITY UPLC BEH酰胺柱上，采用溶剂A(25mM醋酸铵、25mM氢氧化铵的水溶液)和溶剂B(乙腈)的梯度洗脱。质谱仪在正离子和负离子两种模式下工作。在MS采集中，仪器设置为在m/z范围60～1000Da范围内采集，飞行时间(TOF)MS扫描的累积时间设置为0.20s/光谱。产品离子扫描采用信息依赖获取(IDA)，并选择高灵敏度模式。
数据处理：原始数据在导入XCMS软件之前由ProteoWizard MSConvert转换为MzXML文件。在提取的离子特征中，只保留至少一组中非零测量值的50％以上的变量。代谢物的化合物鉴定是通过根据现有的可信标准建立的内部数据库进行的。在归一化到总峰值强度后，对处理后的数据进行多变量数据分析。在OPLS-DA模型中，确定了投影中的变量重要性(VIP)值来表示对分类的贡献。使用非配对的t检验来计算显著性。VIP值>1和P<0.05的代谢物被认为具有统计学意义。
为了探索代谢模式并区分糖尿病足溃疡伤口和非糖尿病伤口，在DFU组和NDW组(n＝12)都进行了基于UHPLC-HRMS的代谢组学分析。正交投影到潜伏结构判别分析(OPLS-DA)模型在正离子和负离子模型中都能有效区分组别(图1中A)。与NDW组相比，DFU组被发现有许多改变的代谢物。在人工过滤后确定的226个代谢物中，发现162个代谢物在DFU中增加，其余的减少(图1中B)。根据代谢富集分析，差异表达的代谢物主要涉及氨基酸代谢，包括精氨酸的生物合成，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸的代谢，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成(图1中C)。在代谢途径分析中，考虑到P值和途径影响值，选择了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成途径进行进一步研究(图1中D)。
苯丙氨酸是人类营养所必需的一种氨基酸。当苯丙氨酸被消耗时，它通常通过羟化作用进入酪氨酸代谢池。当苯丙氨酸的羟化作用发生障碍时，苯丙氨酸及其有害的代谢产物(如苯丙酮酸)的积累会导致一系列的病变，如苯丙酮尿症(PKU)(图1中E)。在本发明的代谢组学分析中，发现DFU伤口中的苯丙氨酸水平略有增加，同时伴随着苯丙酮酸水平的明显升高(图1中F)。惊讶的是，在DFU组观察到NLRP3水平和苯丙酮酸水平之间呈现正相关(图2中B)，但对于苯丙氨酸代谢途径中其他代谢物却没有明显关系(图3中A～D)。综上，非靶向代谢组学分析显示，苯丙酮酸在DFU伤口中明显累积，这与炎症蛋白NLRP3的水平呈正相关。
实施例2苯丙酮酸(PPA)对伤口愈合的影响
动物体内创面模型构建：动物实验得到了中山大学附属第一医院动物研究委员会的批准，并按照既定的《实验动物使用和护理指南》进行。选择8周大的C57BL/6J雌性小鼠和BKS-DB雌性小鼠(GemPharmatech，南京，中国)用来构建体内创面模型。所有小鼠都在特定的无病原体条件下生活。对小鼠进行麻醉，去除背上的毛发，用无菌水冲洗该区域。用10毫米的打孔活检法做两个全厚的背部伤口，有无伤口夹板，构建得到动物体内创面模型。
为了阐明苯丙酮酸盐对伤口愈合动态的影响，将所有模型小鼠被随机分成三组(对照组、注射300μg/g的PPA、注射600μg/g的PPA)，每组12只小鼠。用微型针筒将不同浓度的苯丙酮酸沿模型小鼠伤口边缘的四个点进行局部注射，使用ImageJ软件对第0天、第3天、第6天、第9天和第12天后小鼠伤口进行拍照以及对其面积进行分析，并以初始面积的百分比进行归一化。结果显示，在接受苯丙酮酸治疗的小鼠中，以苯丙酮酸剂量依赖的方式观察到伤口愈合延迟(图2中C和D)。
伤口模型生成后的第6天对小鼠进行安乐死(n＝3只小鼠在指定时间点进行采样)，对小鼠皮肤伤口进行切片以及H&E和Masson的三色染色，并使用Ki-67、α-SMA、CD31和NLRP3抗体进行IHC染色(将小鼠皮肤组织切片去掉石蜡，重新水化，并进行抗原检索。具体如下：用6％的山羊血清加0.1％的Triton X-100和3％的H2O2在PBS中阻断皮肤组织，然后用适当的抗体在4℃下孵育过夜。用辣根过氧化物酶(HRP)结合物进行IHC染色，使用3,3'二氨基联苯胺(DAB)检测)，IHC染色的评估是由两位独立的病理学家进行的。切片的图像在显微镜下采集(EVOS FL自动细胞成像系统，美国)。持续的NLRP3炎症体活动被发现有助于糖尿病伤口的慢性炎症，IHC染色显示NLRP3在DFU伤口的表达水平高于NDWs(图2中A)。此外，小鼠伤口模型的靶向代谢物分析也显示，与非糖尿病小鼠的伤口边缘相比，糖尿病小鼠伤口边缘的苯丙酮酸水平强劲增长(图3中E和F)。与对照组相比，苯丙酮酸处理组的表皮更薄(图2中E和F)。同时，观察到，注射苯丙酮酸后，胶原蛋白体积分数下降，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)积累减少(图3中G和I)。在苯丙酮酸处理组中还发现较低的Ki-67阳性细胞比例和较少的血管生成(图3中H和J)。上述结果表明，苯丙酮酸可以大大抑制伤口愈合。延迟愈合和病理性炎症是糖尿病伤口的主要特征，而糖尿病伤口治疗的现有方案有限。巨噬细胞的可塑性在损伤后的正常组织修复中起着关键作用。然而，在各种内在和外在因素的刺激下，糖尿病伤口存在着表型转化受损，导致促炎症的M1表型持续激活。因此，探索调节糖尿病伤口巨噬细胞转换的关键致病因素是很有希望的，因此，本申请进一步采用免疫荧光染色以探索巨噬细胞在伤口组织中的浸润。小鼠BMDM(骨髓来源的巨噬细胞)的分离和细胞培养：用上述伤口模型生成后的第六天和第九天的BKS-DB雌性小鼠(n＝3)获得BMDMs，用25号针头通过股骨和胫骨冲刷DMEM；用70微米的细胞过滤器过滤细胞悬液，并在1000转/分的转速下离心5min；随后将细胞颗粒重新悬浮在红细胞裂解缓冲液(Beyotime，中国)中3min；离心重悬后，将细胞置于含有1％ L-谷氨酰胺、30mM葡萄糖、10％胎牛血清(FBS，Gibco)、1％青霉素-链霉素(Sigma-Aldrich)和20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(PeproTech)的DMEM中，于37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养，在第3天，更换一半培养基，在第5天，所有的培养基被替换为新鲜培养基，得到鼠BMDM。在培养第7天进行免疫荧光染色、流式细胞仪检测、免疫印迹以及细胞因子水平的测量。
免疫荧光染色：将BMDMs孵化在35毫米的共聚焦盘上，并由指定的试剂刺激，用PBS清洗细胞，用4％多聚甲醛固定15min，然后在室温下用0.3％ Triton X-100透化10min；用PBS洗三次后，用6％的胎儿山羊血清(Solarbio)阻断细胞1h，然后用相应一抗和随后的荧光标记的二抗孵育；用共聚焦显微镜(蔡司LSM880)观察共聚焦图像；图像用Zen 2.6或ImageJ软件进行分析。
流式细胞仪检测：在用抗体进行表面染色之前，用抗小鼠CD16/32抗体(Biolegend)孵育样品10min来阻断Fc-γ受体；然后用在FACS缓冲液中稀释的适当的氟色素结合的表面蛋白抗体对细胞进行染色，在冰上进行20min；洗涤细胞并使用FACS CantoII细胞分析仪(BD Biosciences)进行分析；获得的数据用FlowJo 10软件进行分析。
免疫印迹试验：处理后的全细胞提取物与Protein A/G珠子(Pierce)孵育过夜，用指定的抗体或兔IgG预处理3h，在4℃下轻轻摇动。将珠子在冰上清洗5次，并在样品缓冲液中煮沸进行SDS-PAGE。蛋白质被分离并转移到PVDF膜上(Merck Millipore)，在350mA和4℃下保存1h。阻断后，用适当的一抗在4℃下孵育过夜，然后用HRP结合的二抗在室温下孵育1h。ECL检测试剂(EpiZyme)在MiniChrome Chemiluminescence成像仪(SAGECREA TION，北京)中用于蛋白质检测。
细胞因子水平的测量：根据说明书使用小鼠定量因子ELISA试剂盒(MEIMIAN)测量组织和上清液中的IL1β、IL18和TNFα水平。
结果显示，注射苯丙酮酸后，代表促炎症"M1"表型的F4/80+CD86+细胞数量增加，代表促愈合"M2"表型的F4/80+CD206+细胞数量减少，导致M1/M2巨噬细胞的比例升高(图2中H和I)。正如预期的那样，流式细胞仪检测显示，苯丙酮酸处理在第6天和第9天促进了促炎症巨噬细胞的持续极化(图2中J和K)。此外，还发现注射苯丙酮酸后，伤口中的NLRP3表达水平明显增加(图2中G和L)，并诱发了炎症因子水平的升高，包括IL1β和TNFα(图3中K和L)。上述结果表明，苯丙酮酸能引发巨噬细胞极化的不平衡，导致炎症增加和伤口愈合受损。
实施例3苯丙酮酸对巨噬细胞摄取以及其表型的影响
根据体内观察，苯丙酮酸对巨噬细胞极化有调节作用。在糖尿病创面，早期巨噬细胞是从浸润性的骨髓来源的单核细胞分化而来的。为了研究苯丙酮酸如何调节巨噬细胞的激活，本申请首先考察了苯丙酮酸对糖尿病小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的影响。将实施例2获得的BMDMs用DMSO(对照组)或不同浓度苯丙酮酸(终浓度分别为200μM、400μM和800μM)预处理4h后，在含高糖(30mM葡萄糖)培养液中用细菌脂多糖(LPS，终浓度为100ng/mL)或白细胞介素4(IL4，终浓度为20ng/mL)处理24h后(图5中A)，使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取BMDM的总RNA，cDNA合成试剂盒(Vazyme，R111)逆转录得到cDNA，最后使用ABI7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems,CA,USA)、实时荧光定量PCR试剂盒(Vazyme，Q321)进行RT-qPCR，采用2-△△Ct方法计算相对mRNA表达量，以检测BMDM中M1特征基因NOS、TNF和IL6的表达以及M2特征基因Arg1、Chil3和Retnla的表达，以Actb作为内源性对照。RT-qPCR所使用的引物序列见表1。
表1引物序列
结果显示，苯丙酮酸处理以剂量依赖的方式增加了LPS诱导的BMDM中M1特征基因NOS、TNF和IL6的表达(图4中A～C)。相反，苯丙酮酸处理没有显著改变IL4诱导的M2特征基因(Arg1、Chil3和Retnla)的表达(图5中B～D)。
通过对上述处理后的细胞进行免疫荧光染色和流式细胞分析(具体过程同实施例2)，结果显示，苯丙酮酸处理上调了脂多糖处理的BMDM中NOS的表达(图4中D)，但对IL4处理的BMDM中MRc1的表达没有影响(图5中E))。此外，M1标记CD86蛋白在BMDM表面明显升高(图4中E)，而M2表面标记CD163无变化(图5中F)。
将BMDM用不同浓度苯丙酮酸(终浓度分别为200、400和800μM)预处理4h后，然后用LPS(100ng/mL)刺激24h，然后用ATP(3mM)或尼日利亚菌素(NIG，10μM)刺激45min，使用小鼠定量因子ELISA试剂盒(MEIMIAN)测定上清液以及细胞裂解物中的炎症因子IL1β、IL18和TNFα。结果显示，用苯丙酮酸处理后的巨噬细胞经过内毒素和三磷酸腺苷共同刺激，其上清液中IL 1β、IL 18和TNFα的分泌增加(图4中F～H)。同时，用ATP或尼日利亚菌素(NIG)刺激内毒素诱导的BMDM，观察到苯丙酮酸处理以剂量依赖的方式增加NLRP3的蛋白水平，以及增加培养上清液中切割的半胱氨酸天冬氨酸酶-1和成熟的IL-1β的水平(图4中I～J)。然而，RT-qPCR分析表明，NLRP3的RNA表达水平仍然不受苯丙酮酸处理的影响(图5中G)。对经过苯丙酮酸预处理4h以及LPS(100ng/mL)和/或识别磷酸化p65(p-p65)、总p65、磷酸化ERK(p-ERK1/2)、总ERK1/2、磷酸化Akt(p-Akt)、总Akt、磷酸化p38(p-p38)的抗体刺激24h的BMDM进行免疫印迹分析，以GAPDH和ACTB作为内参蛋白。结果显示，NLRP3炎性小体激活的上游蛋白没有显著差异(图5中H)。
为了阐明苯丙酮酸是作为细胞间还是细胞内信号转导分子，本申请研究了苯丙酮酸是否可以进入巨噬细胞。首次通过化学合成的方法合成了苯丙酮酸偶联的FITC络合物，并将该络合物(浓度设置为200、400、800μM)用于处理BMDM，并进行免疫染色和免疫印迹，结果显示，苯丙酮酸大部分进入巨噬细胞并均匀分布在细胞质中，少量苯丙酮酸残留在细胞膜上(图4中K)。当使用细胞松弛素D(CyD，10μM)阻断BMDM的吞噬作用(BMDM用苯丙酮酸(400μM)和/或细胞松弛素D(10μM))时，其可显著减少苯丙酮酸的摄取(图5中I)。此外，将BMDM用苯丙酮酸(400μM)和/或细胞松弛素D(10μM)预处理，然后用LPS(100ng/mL)刺激24h，用ATP(3mM)刺激45min，对处理后的BMDM进行免疫印迹，结果显示，阻断吞噬作用可以阻止苯丙酮酸增加NLRP3蛋白水平以及裂解的caspase-1和成熟的IL-1β的分泌(图4中L)。上述结果表明苯丙酮酸可被巨噬细胞摄取并促进促炎巨噬细胞表型。
实施例4苯丙酮酸以CD36依赖的方式进入巨噬细胞
进一步为了探究苯丙酮酸以何种方式进入巨噬细胞，本申请采用了遵循LIP-小分子图谱(LIP-SMAP)工作流程的化学蛋白质组学筛选，使用BMDM细胞裂解物(由实施例2中分离培养七天的BMDM细胞经过细胞蛋白裂解液得到)来探索可能与苯丙酮酸结合的细胞蛋白质(参考Piazza I,et al.A Map of Protein-Metabolite Interactions RevealsPrinciples of Chemical Communication.Cell.2018.172,358-372e323进行)。
结果如图6所示，注意到定位在质膜上的潜在结合蛋白，这导致了探索参与BMDM摄取苯丙酮酸的关键因素。两个清道夫受体CD36和LRP1被鉴定为潜在的苯丙酮酸结合蛋白(图7中A)。
进一步利用小干扰RNA(SiRNA)敲除了两个清道夫受体CD36和LRP1(图8中A和B)，siRNA寡核苷酸(siCD36-1:5’-GACCUUACAUUGUACCUAUTT-3’(SEQ ID NO:1)；siCD36-2:5’-GAUCUGAAAUCGACCUUAATT-3’(SEQ ID NO:2)；siLRP1-1:5’-GCUCACACCGAGAUAUCUUTT-3’(SEQ ID NO:3)；siLRP1-2:5’-GCAGCGAGCCAACAAGUAUTT-3’(SEQ ID NO:4))由GenePharmaCo.,Ltd.(中国苏州)合成。siRNA(50nM)与5μL Lipofectamine RNAi Max转染试剂(Invitrogen)混合，随后加入100μL Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)并孵育20min。将制备的混合物加入到铺有BMDM细胞的6孔板中，培养，用不同苯丙酮酸浓度处理。利用免疫染色分析BMDM中苯丙酮酸的摄取情况，利用RT-qPCR、免疫印迹、流式细胞分析检测BMDM细胞中CD36和LRP1的mRNA表达。免疫染色结果发现只有CD36的敲除才能显著减少BMDM对苯丙酮酸的摄取(图7中B和图8中C))。RT-qPCR结果表明，苯丙酮酸处理可显著提高CD36基因的表达水平，但不能提高LRP1的表达水平(图7中C)。此外，免疫印迹分析和流式细胞仪分析结果表明，苯丙酮酸处理与BMDM表面CD36受体的表达上调有关，而与LRP1的表达无关(图7中D～E和图8中D)。此外，在通过siRNA下调CD36表达后，苯丙酮酸处理没有增加NLRP3的表达水平或激活炎症小体(图7中F)。还发现，降低CD36的表达逆转了苯丙酮酸诱导的IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α分泌的增加(图7中G～I)。
CD36蛋白具有一个包含配体结合位点的大的胞外区，两个跨膜结构域，在每个末端都有一个短细胞质尾巴(图7中J)。发明人使用Autodock进行了分子对接，计算了苯丙酮酸和CD36之间的相互作用。具体如下：CD36的晶体结构来自UniProt(https://www.uniprot.org/)，使用Autodock(https://autodock.scripps.edu/)对苯丙酮酸与CD36上的每个潜在结合点进行诱导拟合对接。根据对接数据，预测了最佳对接构型、结合能值、潜在构象、相互作用的类型和键距。对接数据中能量最低的结合构型被选为进一步分析的代表性结合构型。分子对接分析表明，苯丙酮酸与CD36胞外区的结合位点位于残基Thr314、Glu315和Asp329上，结合能最小(-6.28kcal/M)(图7中K)。总之，CD36在巨噬细胞摄取苯丙酮酸及其促炎作用中起关键作用。
实施例5限制饮食苯丙氨酸对糖尿病伤口愈合的影响
基于对糖尿病伤口中苯丙酮酸积累的鉴定，本申请进一步探讨了是否可以将其作为治疗靶点来改善糖尿病伤口的愈合。由于苯丙酮酸是苯丙氨酸的代谢产物，苯丙氨酸属于必需氨基酸，不能在人体内合成，这意味着体内的苯丙氨酸浓度取决于饮食摄入。目前饮食中限制苯丙氨酸一直是治疗苯丙酮尿症患者的主要方法，并取得了令人满意的效果。因此推测限制苯丙氨酸的饮食可能会减轻苯丙氨酸分解的负担，减少苯丙酮酸的积累，增加糖尿病伤口愈合，为此，本申请设计了一种在仅在苯丙氨酸比例上有所不同的食物喂食小鼠。根据之前的研究发现，苯丙氨酸的缺乏会导致BKS-DB小鼠体重下降，而补充0.2％至0.25％的苯丙氨酸可以消除这种影响，因此设置了3种含有不同浓度的苯丙氨酸的食物(表2)，由于一般小鼠饮食中的苯丙氨酸浓度接近1％，通过使用含有0.25％和2％苯丙氨酸的饮食来测试推测结论的可行性。在对BKS-DB小鼠进行创面建模之前，给小鼠喂食上述含有不同浓度的苯丙氨酸的食物(n＝12)，为期一周，一周后用10毫米的打孔活检法做两个全厚的背部伤口(同实施例3)，按上述模式继续喂食表2中的食物，并记录体重、血糖水平以及食物的摄入量(图9中A)。
通过对喂食不同浓度苯丙氨酸的食物的小鼠伤口皮肤组织进行代谢质谱分析(同实施例1)，结果显示限制苯丙氨酸的饮食减少了糖尿病伤口中苯丙酮酸的积累(图9中B)。通过对苯丙氨酸限制饮食一周后的小鼠的体重、血糖水平和食物摄入量的监测，结果显示，其体重、血糖水平和食物摄入量不受上述食物的影响(图9中C和图10中A、B)，在其小鼠心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、胰腺或脾脏中也没有观察到明显的组织学变化(图10中I)。观察并计算(使用ImageJ软件量化伤口大小的百分比，并通过与第0天伤口大小相比的伤口闭合百分比计算)小鼠创面模型生成后第0、4、8、12和16天的伤口愈合情况，结果显示饮食中的苯丙氨酸限制明显加速了糖尿病伤口的愈合(图9中D和E)。
对创面模型生成后第8天收集小鼠的创面皮肤样品(n＝3)，进行组织学检查(具体过程同实施例2)，结果显示，苯丙氨酸限制饮食组的表皮更厚，胶原蛋白体积分数增加，α-SMA积累更多，Ki-67阳性细胞比例更高，血管生成更多(图9中F～G和图10中C～F)。随后，免疫荧光染色发现，限制苯丙氨酸会减少促炎症巨噬细胞的数量，并在第8天增加促愈合巨噬细胞的数量，M1/M2巨噬细胞的比例更小(图9中I和J)，即限制苯丙氨酸的饮食有效地推进了M1/M2的转变，减少了炎症反应，并加速了伤口愈合。流式细胞仪检测表明，在第6天和第9天较高的苯丙氨酸摄入水平导致更多的促炎症巨噬细胞极化，但苯丙氨酸限制饮食则没有(图9中K和L)。此外，限制饮食苯丙氨酸在很大程度上降低了NLRP3的表达水平(图9中H和M)，并降低了IL1β和TNFα的水平(图10中G和H)。总的来说，饮食中限制苯丙氨酸的摄入可以减少糖尿病伤口的苯丙酮酸积累，减少过度炎症，促进伤口愈合，且对身体的一般状况没有明显的不良影响。
表2限制饮食苯丙氨酸的食物的组成
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.苯丙酮酸抑制剂在(1)～(3)中任一项中的应用：
(1)制备治疗或辅助治疗糖尿病足溃疡的药物；
(2)制备用于抑制NLRP3炎症小体活化的产品；
(3)制备用于促炎症巨噬细胞极化的产品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苯丙酮酸抑制剂通过促进糖尿病伤口愈合和/或消除病理性炎症达到治疗糖尿病足溃疡的目的；优选地，所述病理性炎症包括由NLRP3炎症小体的激活和/或巨噬细胞极化的不平衡而引起的炎症反应。
3.据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述苯丙酮酸抑制剂通过抑制NLRP3、IL1β和TNFα的表达从而抑制NLRP3炎症小体的激活；和/或，所述苯丙酮酸抑制剂通过调节糖尿病伤口中巨噬细胞转换而促进糖尿病伤口的愈合；和/或，所述巨噬细胞转变表现为M1/M2巨噬细胞的比例降低。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述苯丙酮酸抑制剂为降解苯丙酮酸的物质、减少苯丙酮酸生成的物质和减少苯丙酮酸积聚的物质中的至少一种。
5.苯丙酮酸在构建延缓糖尿病足溃疡创面愈合的动物模型中的应用。
6.CD36抑制剂在(4)～(9)中任一项中的应用：
(4)抑制NLRP3炎症小体的活化；
(5)制备用于抑制NLRP3炎症小体活化的产品；
(6)抑制NLRP3的表达上调；
(7)制备用于抑制NLRP3的表达上调的产品
(8)抑制IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α的分泌增加；
(9)制备用于抑制IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α的分泌增加的产品；
优选地，所述NLRP3炎症小体活化、NLRP3的表达上调和IL-1β、IL-18和肿瘤坏死因子α的分泌增加均为由苯丙酮酸诱导而成。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述CD36抑制剂抑制CD36活性的物质、降解CD36的物质和降低CD36表达水平的物质中的至少一种；
优选地，所述降低CD36表达水平的物质为(a1)～(a3)中至少一种：
(a1)靶向CD36的siRNA、dsRNA、miRNA、核酶或shRNA；
(a2)编码(a1)的核酸分子；
(a3)包含(a2)的表达盒、载体或转基因细胞系。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述CD36抑制剂为(b1)～(b3)中至少一种：(b1)靶向CD36的siRNA；
(b2)编码(b1)的核酸分子；
(b3)包含(b2)的表达盒、载体或转基因细胞系；
优选地，所述siRNA为反向互补的双链RNA，其中的一条链的序列如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示。
9.一种RNA，为siRNA，所述siRNA为反向互补的双链RNA，其中的一条链的序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示。
10.与权利要求9所述的RNA相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为：
(c1)编码权利要求9所述的RNA的核酸分子；或
(c2)包含(c1)的表达盒、载体或转基因细胞系。
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