CN112585280A - 微小rna-134生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于微小RNA活性的二级标志物领域，并且具体地，本发明涉及对作为在神经元细胞中被微小RNA‑134抑制的mRNA的Serpine1的鉴定以及Serpine1mRNA或蛋白作为用于微小RNA‑134调节的生物标志物的用途，所述生物标志物如用于微小RNA‑134的反义寡核苷酸抑制剂的生物标志物。

Description

微小RNA-134生物标志物
技术领域
本发明涉及用于微小RNA活性的二级标志物领域，并且具体地，本发明涉及对作为在神经元细胞中被微小RNA-134抑制的mRNA的Serpine1的鉴定以及Serpine1 mRNA或蛋白作为用于微小RNA-134调节的生物标志物的用途，所述生物标志物如用于微小RNA-134的反义寡核苷酸抑制剂的生物标志物。Serpine 1也称为Serpin E1；PLANH1；PAI-1。
背景技术
微小RNA(miRNA)是在转录后调节基因表达的一类非编码RNA，并且微小RNA可以调节数百种mRNA的表达。
Davis等人,《核酸研究(Nucleic Acid Research)》2009,第37卷,doi:10.1093/nar/gkn904讨论了评估次要终点的重要性，因为这对于解释miRNA抑制研究至关重要。
如WO2013/045652中所描述的，基于颞叶癫痫(TLE)与miRNA-134表达增加之间的紧密联系以及在啮齿动物模型中靶向微小RNA-134的LNA抗miR遏制了由癫痫引起的癫痫发作活动和海马活动的实验证据，微小RNA-134已被提示为治疗癫痫的治疗性靶标(Jimenez-Mateos等人,2012；Jimenez-Mateos等人,2015以及Reschke等人,2017)。值得注意的是，大鼠中癫痫持续状态后沉默miR-134使穿质通路刺激模型(后天性癫痫的无毒素模型)中的自发性癫痫发作的发生减少86％(Reschke等人,2017)。微小RNA-134被提示为用于治疗脑缺血性损伤的治疗药剂(Khoshnam等人,《中风杂志(Journal of Stroke)》2017；19(2):166-187)。
WO2007/112754公开了LNA抗miR，包含靶向hsa-miR-134如5'TgGtcAAccAgTcAC3'的LNA抗miR，其中大写字母为β-D-氧基-LNA核苷，小写字母为DNA核苷，LNA胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。靶向微小RNA-134的LNA抗miR在实例中用作胆固醇缀合物或非缀合化合物。WO2009043353中公开了靶向微小RNA-134的短的完全LNA硫代磷酸酯寡核苷酸。
因此，开发用于治疗癫痫的靶向微小RNA-134的治疗剂是有益的。这就引起了一个主要问题，因为尽管微小RNA-134抑制降低了癫痫病状的严重程度，但对所涉及的潜在机制知之甚少，尤其是哪些mRNA受miR-134调节或疾病调节中涉及其亚组。此知识是提供必要的生物标志物所需的，所述生物标志物将允许鉴定和开发有效的微小RNA-134抑制剂治疗剂并监测其对体外和体内微小RNA-134活性的影响。Serpine-1mRNA在3'UTR中具有许多推定的微小RNA靶结合位点，包含参见TargetScanHuman，其示出了微小RNA-134的保守性较差的位点注释(http://www.targetscan.org/cgi-bin/vert_72/view_gene.cgi？rs＝ ENST00000223095.4&taxid＝9606&members＝&subset＝1&showcnc＝1&shownc＝1& shownc_nc＝1&showncf1＝0#miR-134-5p)。
本发明基于对作为针对原代神经元中微小RNA-134的稳健mRNA靶标的Serpine1(PAI-1)的鉴定以及其作为用于微小RNA-134抑制的生物标志物的用途。
发明内容
本发明提供了一种用于测定如神经元细胞的细胞中的微小RNA-134调节剂的活性[效力或功效、抑制水平]的方法，所述方法包括测定微小RNA-134调节剂所添加到的所述细胞中的Serpine 1生物标志物水平的步骤。
本发明提供了一种用于鉴定患有神经系统疾病的受试者的方法，所述神经系统疾病如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病，所述受试者可能受益于施用包括微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂，所述方法包括以下步骤：
a)测量从所述受试者获得的样品中的Serpine 1生物标志物的水平；
b)与所述Serpine 1生物标志物的至少一个参考水平进行比较；
c)以鉴定所述受试者是否可能受益于施用包括微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂。
本发明提供了一种用于确定微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂在受试者中的疗效的方法，所述方法包括以下步骤：
a)测量从先前已被施用微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂的受试者获得的样品中的Serpine 1生物标志物的水平；
b)与所述Serpine 1生物标志物的至少一个参考水平进行比较；
c)以鉴定所述微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂的疗效。
本发明提供了一种诊断神经系统疾病的方法，所述神经系统疾病如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病，所述神经系统疾病适合用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗，所述方法包括以下步骤：
a.测量从所述受试者获得的样品中的Serpine 1生物标志物的水平；
b.与所述Serpine 1生物标志物的至少一个参考水平进行比较；
c.以鉴定所述受试者是否患有适合用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的神经系统疾病，如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病)相关的神经系统疾病。
上述方法可以是体外方法。
本发明提供了一种治疗需要用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的受试者的神经系统疾病的方法，所述神经系统疾病如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病，所述方法包括本发明的上述方法(或本文公开或要求保护的方法)之一、其后是向所述受试者施用有效剂量的所述微小RNA-134拮抗剂治疗剂的步骤。在一些实施例中，所述神经系统疾病是癫痫。在一些实施例中，所述神经系统疾病是脑缺血性损伤。
本发明提供了一种治疗需要用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的受试者的神经系统性癫痫发作的方法，所述方法包括本发明的上述方法(或本文公开或要求保护的方法)之一、其后是向所述受试者施用有效剂量的所述微小RNA-134拮抗剂治疗剂的步骤。
本发明提供了一种治疗需要用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的受试者的脑缺血性损伤的方法，所述方法包括本发明的上述方法(或本文公开或要求保护的方法)之一、其后是向所述受试者施用有效剂量的所述微小RNA-134拮抗剂治疗剂的步骤。
本发明提供了一种预防性地治疗需要用微小RNA-134拮抗剂预防性治疗剂治疗的受试者的神经系统疾病的方法，所述神经系统疾病如与癫痫发作相关的神经系统疾病，所述方法包括本发明的上述方法(或本文公开或要求保护的方法)之一、其后是向需要预防性治疗的所述受试者施用有效剂量的所述微小RNA-134拮抗剂治疗剂的步骤。在一些实施例中，所述神经系统疾病是癫痫。在一些实施例中，所述神经系统疾病是脑缺血性损伤。
本发明提供了一种预防性地治疗需要用微小RNA-134拮抗剂预防性治疗剂治疗的受试者的神经系统性癫痫发作的方法，所述方法包括本发明的上述方法(或本文公开或要求保护的方法)之一、其后是向需要预防性治疗的所述受试者施用有效剂量的所述微小RNA-134拮抗剂治疗剂的步骤。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物测定的体外用途，其用于测量微小RNA-134调节，如微小RNA-134抑制。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物测定用作微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂例如微小RNA-134拮抗剂治疗剂用于在治疗神经系统疾病时使用的伴随诊断的体外用途，所述神经系统疾病如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物的体外用途，其用于确定患有神经系统疾病的受试者对包括微小RNA-134调节剂的治疗药剂的可能应答，所述神经系统疾病如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物测定用作微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂例如微小RNA-134拮抗剂治疗剂用于在治疗神经系统性癫痫发作和/或脑缺血性损伤时使用的伴随诊断的体外用途。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物的体外用途，其用于确定受试者对包括微小RNA-134调节剂的治疗药剂的可能应答，所述受试者患有神经系统性癫痫发作例如癫痫如癫痫性脑病或与脑缺血性损伤相关的癫痫发作。
本发明提供了一种用于测定细胞中外源施用的微小RNA-134调节剂的活性的方法，所述方法包括测定微小RNA-134调节剂已被施用到的细胞中的Serpine 1 mRNA、Serpine 1蛋白或Serpine 1活性的水平的步骤。将理解的是，在一些实施例中，在从所述细胞获得的提取物中测量所述活性。
本发明提供了一种Serpine 1 mRNA测定、Serpine 1蛋白测定或Serpine 1活性测定的用途，其用作用于微小RNA-134调节如微小RNA-134抑制的生物标志物。
本发明提供了一种Serpine 1 mRNA、Serpine 1蛋白或Serpine 1活性用作微小RNA-134拮抗剂治疗剂例如微小RNA-134拮抗剂治疗剂用于在治疗神经系统疾病时使用的伴随诊断的用途，所述神经系统疾病如与癫痫发作(如癫痫或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病。
本发明提供了一种Serpine 1 mRNA、Serpine 1蛋白或Serpine 1活性用作微小RNA-134拮抗剂治疗剂例如微小RNA-134拮抗剂治疗剂用于在治疗神经系统性癫痫发作时使用的伴随诊断的用途。
本发明提供了一种Serpine 1抗体的用途，其用于测定从受试者获得的样品中的Serpine 1蛋白水平，所述受试者正在经历用微小RNA-134调节剂如微小RNA-134拮抗剂进行的治疗或正在被评估对用微小RNA-134调节剂如微小RNA-134拮抗剂进行治疗的适合性。
本发明提供了一种Serpine 1 mRNA检测探针的用途，其用于测定从受试者获得的样品中的Serpine 1 mRNA水平，所述受试者正在经历用微小RNA-134调节剂、微小RNA-134拮抗剂进行的治疗或正在被评估对用微小RNA-134调节剂如微小RNA-134拮抗剂进行治疗的适合性。
本发明提供了一种Serpine 1 mRNA RT-PCR测定的用途，其用于测定从受试者获得的样品中的Serpine 1 mRNA水平，所述受试者正在经历用微小RNA-134调节剂、微小RNA-134拮抗剂进行的治疗或正在被评估对用微小RNA-134调节剂如微小RNA-134拮抗剂进行治疗的适合性。
本发明提供了一种Serpine 1活性测定的用途，其用于测定从受试者获得的样品中的Serpine 1活性水平，所述受试者正在经历用微小RNA-134调节剂、微小RNA-134拮抗剂进行的治疗或正在被评估对用微小RNA-134调节剂如微小RNA-134拮抗剂进行治疗的适合性。
本发明提供了一种组织纤溶酶原激活物(tPA)测定的用途，其用于测定从受试者获得的样品中的Serpine 1活性水平，所述受试者正在经历用微小RNA-134调节剂如微小RNA-134拮抗剂进行的治疗或正在被评估对用微小RNA-134调节剂如微小RNA-134拮抗剂进行治疗的适合性。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物的用途，其用于确定受试者对包括微小RNA-134调节剂的治疗药剂的可能应答，其中所述生物标志物是从所述受试者获得的生物样品中的Serpine 1 mRNA、蛋白或活性的水平与从参考样品获得的水平相比有所改变，所述参考样品如来自健康受试者的样品、患病受试者的样品或从所述受试者获得的一个或多个先前的样品。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物的用途，其用于接受利用例如用于治疗神经系统疾病的微小RNA-134拮抗剂进行的治疗的受试者的患者监测以便监测微小RNA-134拮抗剂的有效性，所述神经系统疾病如与癫痫发作(如癫痫或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物的用途，其用于接受利用用于治疗神经系统性癫痫发作的微小RNA-134拮抗剂进行的治疗的受试者的患者监测。
在一些实施例中，所述神经系统疾病是癫痫性脑病。
附图说明
图1.RNA测序分析鉴定了在用0.1μM miR-134抗miR处理原代小鼠皮层神经元6天后表达水平明显不同的基因。火山图示出了对照模拟处理的原代皮层神经元与用0.1μMmiR-134LNA抗miR处理的原代皮层神经元之间的基因表达差异(右侧为上调基因，并且左侧为下调基因)。实例1中描述了实验和数据分析。每个点对应于一个基因。在多次测试调整后的P-值<0.05的情况下在这两种条件下表达水平不同的基因标记有基因名称。
图2.通过RNA测序鉴定的候选miR-134靶标的验证。靶基因Syt6(图2A)、Peg10(图2B)和Serpine 1(图2C)的ddPCR在从用miR-134抑制剂LNA抗miR处理5天的原代皮层神经元分离的RNA上进行。Gpr36低于检测水平(数据未示出)。miR-134的LNA抗mir抑制剂以剂量依赖的方式显着上调了Serpine1。实验在实例2中描述。
图3.miR-134种子序列与Serpine1的小鼠3'UTR区域的杂交的图示。
图4.在转染前miR-134和模拟(PBS)、LNA抗miR或LNA对照后48小时，人MDA-MB-231细胞(n＝3)中Serpine1 mRNA表达。LNA抗miR处理相对于模拟(PBS)处理的细胞(p<0.01，学生T检验)和LNA对照处理的细胞(p<0.05，学生T检验)均显著上调了Serpine1。
具体实施方式
方法A：本发明提供了一种用于测定如神经元细胞的细胞中的微小RNA-134调节剂的活性如效力或功效或抑制水平的方法，所述方法包括测定微小RNA-134调节剂所添加到的所述细胞中的Serpine 1生物标志物水平的步骤。所述方法可以是体外方法。
所述细胞可以是原代细胞，例如原代神经元细胞。
活性可以例如是指微小RNA-134的效力、功效或抑制水平，并且可以与一个或多个参考样品或值进行比较。
方法B：本发明提供了一种用于鉴定患有神经系统疾病的受试者的方法，所述受试者可能受益于施用包括微小RNA-134拮抗剂的治疗剂，所述方法包括以下步骤：
a)测量从所述受试者获得的样品中的Serpine 1生物标志物的水平；
与所述Serpine 1生物标志物的至少一个参考水平进行比较；
b)以鉴定所述受试者是否可能受益于施用包括微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂。
方法C：本发明提供了一种用于确定微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂在受试者中的疗效的方法，所述方法包括以下步骤：
a)测量从先前已被施用微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂的受试者获得的样品中的Serpine 1生物标志物的水平；
b)与所述Serpine 1生物标志物的至少一个参考水平进行比较；
以鉴定所述微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂的疗效。
方法D：本发明提供了一种诊断神经系统疾病(如与癫痫发作相关的神经系统疾病，如癫痫或脑缺血性损伤)的方法，所述神经系统疾病适合用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗，所述方法包括以下步骤：
a)测量从所述受试者获得的样品中的Serpine 1生物标志物的水平；
b)与所述Serpine 1生物标志物的至少一个参考水平进行比较；
以鉴定所述受试者是否患有适合用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的神经系统疾病。
方法E：本发明提供了一种治疗需要用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的受试者的神经系统疾病如癫痫的方法，所述方法包括根据权利要求1到4中任一项所述的方法、其后是向所述受试者施用有效剂量的所述微小RNA-134拮抗剂治疗剂的步骤。所述治疗可以是预防性的——即，对面临罹患神经系统疾病的风险的受试者的预防性治疗，所述神经系统疾病如与癫痫发作相关的神经系统疾病如癫痫或与脑缺血性损伤相关的癫痫发作。所述治疗可以是治疗性的——即，在已经诊断出疾病症状(如癫痫发作如癫痫)后的治疗。
所述神经系统疾病可以是与风险相关或以癫痫发作如癫痫或脑缺血性损伤为特征的神经系统疾病。
所述参考水平可以是例如
a.与疾病相关的Serpine 1生物标志物的水平，
b.Serpine 1生物标志物的正常水平，
c.a)和b)两者。
在一些实施例中，Serpine-1生物标志物如Serpine-1 mRNA、蛋白或Serpine-1活性的水平降低提示微小RNA-134活性升高，或者Serpine-1生物标志物的水平较高提示微小RNA-134活性降低。(Serpine-1的直接生物标志物的增加与微小RNA抑制和Serpine-1脱抑制相关)。
间接Serpine-1生物标志物：由于Serpine 1(PAI-1)是tPA-1的抑制剂，所以由于微小RNA-134抑制而引起的PAI-1升高将使tPA活性降低并使纤溶酶原向纤溶酶的转化(凝块)降低。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物测定的用途，其用于测量微小RNA-134调节，如微小RNA-134抑制。所述用途可以例如是体外用途。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物测定用作微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂例如微小RNA-134拮抗剂治疗剂用于在治疗神经系统疾病时使用的伴随诊断的用途，所述神经系统疾病如与癫痫发作(如癫痫或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病。所述用途可以例如是体外用途。
本发明提供了一种Serpine 1生物标志物的用途，其用于确定患有神经系统疾病的受试者对包括微小RNA-134调节剂的治疗药剂的可能应答。所述用途可以例如是体外用途。
所述Serpine 1生物标志物测定可以选自由以下项组成的组：
a.Serpine 1 mRNA的测量
b.Serpine 1蛋白的测量
c.Serpine 1活性的测量
d.组织纤溶酶原激活物(tPA)活性的测量
e.纤溶酶原转化成纤溶酶或血液凝块的测量。
a)、b)和c)是Serpine-1生物标志物的直接测定，其中d.和e.是间接Serpine-1生物标志物。在一些实施例中，Serpine 1生物标志物测定是直接Serpine-1生物标志物测定。在一些实施例中，Serpine 1生物标志物测定是间接Serpine-1生物标志物测定。
在一些实施例中，所述受试者患有与微小RNA-134相关的疾病或病症，如神经系统疾病，特别是与癫痫发作相关的神经系统疾病，如癫痫或脑缺血性损伤，或者所述受试者可能罹患与微小RNA-134相关的疾病或病症，如神经系统疾病，特别是与癫痫发作相关的神经系统疾病，如癫痫或脑缺血性损伤。
在一些实施例中，所述受试者先前已经历例如针对血栓形成的tPA(组织纤溶酶原激活物)治疗。
在一些实施例中，在从所述受试者获得的样品中测定所述Serpine 1生物标志物，所述样品选自由脑脊髓液样品、血液样品或血浆样品组成的组。
在一些实施例中，在从所述受试者获得的脑脊髓样品中测定所述Serpine 1生物标志物。
在一些实施例中，所述微小RNA-134调节剂是微小RNA-134的反义寡核苷酸抑制剂，所述反义寡核苷酸抑制剂包括与微小RNA-134如hsa-miR-134如SEQ ID NO 1或2互补如完全互补的至少7个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述微小RNA-134拮抗剂是LNA反义寡核苷酸，如LNA硫代磷酸酯反义寡核苷酸。
微小RNA-134(也称为miR-134)
微小RNA-134在Lagos-Quintana等人,《当代生物学(Curr Biol.)》12:735-739(2002)中首次被报道为组织特异性微小RNA。小鼠miR-134前-miRNA，mmu-mir-134MI0000160具有以下序列：
AGGGUGUGUGACUGGUUGACCAGAGGGGCGUGCACUCUGUUCACCCUGUGGGCCACCUAGUCACCAACCCU
小鼠成熟的mmu-miR-134-5p MIMAT0000146具有序列UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG(SEQ ID NO 1)
人微小RNA-134(基因ID：406924)编码在14号染色体上，位置NC_000014.9(101054687..101054759)——注释版本109(组合件GRCh38.p12-GCF_000001405.38)。
hsa-mir-134 MI0000474前-mRNA序列(茎环)：
CAGGGUGUGUGACUGGUUGACCAGAGGGGCAUGCACUGUGUUCACCCUGUGGGCCACCUAGUCACCAACCCUC(SEQ ID NO 2)
hsa-miR-134-5p成熟微小RNA序列MIMAT0000447：
UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG(SEQ ID NO 1)
人和小鼠中的微小RNA-134种子序列为GUGACU或GUGACUG。
通常，miR-134，特别是成熟的微小RNA-134序列在小鼠、灵长类动物以及人类和哺乳动物之间是高度保守的。
微小RNA-134调节剂
微小RNA-134调节剂是调节细胞中的微小RNA-134活性水平的化合物。如微小RNA-134抑制剂等微小RNA-134调节剂有利地是人造化合物、合成产生的化合物、分离的化合物或纯化的化合物。在一些实施例中，微小RNA-134调节剂是或包括以合成的方式合成的寡核苷酸。以合成的方式合成的寡核苷酸有利地包括至少一个经修饰的核苷或至少一个经修饰的核苷间键。
在一些实施例中，微小RNA-134调节剂是或包括合成的微小RNA——即，合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸在施用于细胞时模拟微小RNA-134的活性。
在一些实施例中，微小RNA-134调节剂是或包括合成抑制剂或微小RNA-134，如靶向微小RNA-134的反义寡核苷酸。
在一些实施例中，Serpine-1生物标志物可以用于鉴定微小RNA调节剂——微小RNA-134模拟将增强Serpine-1的微小RNA-134抑制，而微小RNA-134拮抗剂将引起Serpine-1的脱抑制。
在一些实施例中，用于本发明的miR-134调节剂是微小RNA-134抑制性反义寡核苷酸，如LNA抗miR，其包括与微小RNA-134靶序列如SEQ ID NO 1或2完全互补的至少7个核苷酸的连续核苷酸序列。合适的是，miR-134抑制性反义寡核苷酸具有药物活性。在本发明的上下文中，药物活性化合物表示基于临床前数据如体外(例如，基于细胞的测定)或体内(例如，动物数据如小鼠数据)可以具有向受试者提供益处的潜力的化合物。
微小RNA-134拮抗剂
在本文中称为微小RNA-134拮抗剂/拮抗作用的一种调节类型是化合物例如通过以下来抑制、下调、减少、遏制、去除、停止、阻断、预防、减轻、降低、避免或终止微小RNA-134的表达的能力：微小RNA-134RNA的降解或细胞中的微小RNA-134活性的失活，例如通过与微小RNA-134RNA靶标结合(例如，杂交)，从而防止微小RNA-134RNA与细胞中的mRNA相互作用。靶向微小RNA的高亲和力修饰的寡核苷酸如LNA抗miR被认为与其靶微小RNA形成高度稳定的双链体，从而有效地降低了微小RNA活性。
寡核苷酸
本文所用的术语“寡核苷酸”的定义如同本领域技术人员通常所知，是指包括两个或多个共价连接核苷的分子。此类共价键结的核苷还可称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化的方式制备。提及寡核苷酸的序列时，是指共价连接核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸为人造的，并且为化学合成的，并且通常经过纯化或分离。本发明的寡核苷酸可包括一个或多个经修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
本文所用的术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是靶核酸上的连续序列杂交而调节靶基因的表达的寡核苷酸。LNA抗miR是用于在体外和体内抑制微小RNA的示例性反义寡核苷酸。
用于本发明的反义寡核苷酸包括与微小RNA-134靶序列如SEQ ID NO 1或2完全互补的至少7个连续核苷酸。有利地，本发明的反义寡核苷酸与微小RNA-134种子序列互补。人中的微小RNA-134种子序列为GUGACU或GUGACUG。在一些实施例中，本发明中提及的反义寡核苷酸包括微小RNA种子序列的互补序列，如核苷酸序列AGTCAC或AGUCAC或CAGTCAC或CAGUCAC。请注意，对于沃森克里克碱基配对，T和U可以互换使用。有利地，反义寡核苷酸内的种子序列的互补物包括至少1个高亲和力修饰的核苷，如至少1个LNA或至少1个2'O-MOE核苷。在一些实施例中，反义寡核苷酸内的种子序列的互补物包括至少2个高亲和力修饰的核苷，如至少2个LNA或至少2个2'O-MOE核苷。在一些实施例中，反义寡核苷酸内的种子序列的互补物包括至少3个高亲和力修饰的核苷，如至少3个LNA或至少3个2'O-MOE核苷。
在一些实施例中，本发明中提及的反义寡核苷酸包括长度为7-26个核苷酸，如长度为7-12个核苷酸，例如长度为8、9、10、11或12个核苷酸，或长度为12-26个核苷酸，如长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个连续核苷酸的连续核苷酸序列。
有利地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。应理解的是，只要序列内或序列间自身互补的程度低于跨寡核苷酸全长的50％，本发明的单链寡核苷酸便可形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)。
LNA-抗miR
LNA-抗miR是反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包括与靶微小RNA例如hsa-miR-134互补的连续核苷酸序列，其包括至少一个LNA核苷。LNA-抗miR描述于WO2007/112754和WO2009043353中，所述文献通过引用特此并入。还参见本文所述的混聚物和全聚物化合物。
WO2007/027775、WO07027894、WO2015/061536、WO2017035319、WO2018/106566、EP2841579和WO18106568中公开了其它LNA-抗miR设计。
优选地，反义寡核苷酸微小RNA-134拮抗剂包括序列5'agtcac 3'或5'cagtcac3'——这些序列是或包括hsa-miR-134种子区域的互补物。在一些实施例中，本文所提及的反义寡核苷酸微小RNA-134拮抗剂包括序列5'agtcac 3'，其中5'agtcac 3'中的核苷中的至少1个如2、3、4、5或6个核苷是LNA核苷。
一种示例性LNA-抗miR是反义寡核苷酸5'TgGtcAAccAgTcAC 3'(SEQ ID NO 8)，其中大写字母是β-D-氧基-LNA核苷，小写字母是DNA核苷，LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。
在有利的实施例中，调节剂包括反义LNA寡核苷酸。在一个特别优选的实施例中，调节剂包括长度介于7与25个核苷酸之间的寡核苷酸并包括至少一个LNA。在一些实施例中，微小RNA调节剂包括长度介于7与25个核苷酸之间的寡核苷酸并包括至少一个LNA，并且进一步包括至少一个其它增加亲和力的核苷酸类似物。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸包括硫代磷酸酯键。
在一些实施例中，抗miR-134寡核苷酸是LNA抗miR(例如参见WO2007/112754)。LNA抗miR是与成熟的微小RNA靶标互补的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸包括LNA核苷并且可以进一步包括硫代磷酸酯核苷酸间键。LNA抗miR可以进一步包括其它核苷酸，如DNA和/或2'-O-甲氧基乙基(MOE)核苷(例如参见EP1931780)。抗miR-134寡核苷酸不募集RNaseH1对靶向成熟的微小RNA是有利的，并且由此有利的是，抗miR-134寡核苷酸如LNA抗miR不含有4个或更多个连续DNA核苷的区域。
可以从凯杰公司(Qiagen)订购抗微小RNA LNA硫代磷酸酯(https://www.qiagen.com/dk/shop/pcr/primer-sets/mircury-lna-mirna-inhibitors/#orderinginf ormation)。可以从此来源获得用于本文所述实验中的化合物C(Exiqonantagomir)。
有利的是，靶向成熟的微小RNA-134靶核酸的抗miR-134寡核苷酸包括与微小RNA-134种子区域(来自hsa-miR-134的5'末端的2-7个核苷酸)的互补物。在一些实施例中，抗miR 134寡核苷酸包括至少1个如至少2个或至少3个LNA核苷酸，其位于与微小RNA-134种子区域互补的位置(例如，抗miR-134寡核苷酸包括序列CAGTCAC或AGTCAC)。
LNA抗miR可以是完全硫代磷酸酯或可以是部分硫代磷酸酯。对于全身施用，高比例的完全硫代磷酸酯反义寡核苷酸可以是优选的，然而对于向CNS的局部施用，可能期望使用部分硫代磷酸酯。
在一些实施例中，抗miR-134寡核苷酸的长度为7-10个连续的LNA核苷酸(也称为极小LNA，参见Obad等人,《自然遗传学(Nat Genet.)》2011年3月20日；43(4):371-8和WO2009043353)并且包括微小RNA-134种子区域的互补物。hsa-miR-134的极小LNA抑制剂的实例包含：ACCAGTCAC、CCAGTCAC和CAGTCAC，其中每个核苷酸是LNA核苷，如β-D-氧基LNA，并且所有核苷间键是硫代磷酸酯。也可以使用部分硫代磷酸酯，例如末端核苷酸之间的核苷间键可以是硫代磷酸酯，而其余的核苷间键可以是磷酸二酯。
在一个实施例中，药物组合物包括具有以下序列的抗miR-134寡聚物：5'-TgGtcAAccAgTcAC-3'(SEQ ID NO:8)，其在本文中也称为化合物A，其中大写字母表示β-D-氧基LNA，小写字母表示DNA并且LNA C是5甲基C，并且其中此化合物为完全硫代磷酸酯主链。此寡聚物可以如W0 2007/112754中所述制备。根据本发明可以使用W0 2007/112754的其它寡聚物，所述文献的内容通过引用特此并入。
在一些实施例中，微小RNA-134抑制剂是LNA反义寡聚物，所述LNA反义寡聚物包括表1所列序列中的任何一个序列或由其组成。
表1.可以在本发明的方法中如在疾病的治疗中使用的以下具体序列或化合物，所述疾病如提示miR-134的表达/过表达的疾病，如表1中所展示的那些疾病。化合物优选地是完全硫代磷酸酯，并且每个核苷酸是LNA核苷酸，如β-D-氧基LNA。LNA胞嘧啶可以是5'甲基胞嘧啶。可以通过匹配成熟微小RNA的-2至-8/-9或-10位置(对于7聚体、8聚体或9聚体)(从微小RNA的末端5'核苷酸(即，在-1位置处)开始计数)来设计等效的抗miR。
表1
序列 SEQ ID
CCCCTCTGGTCAACCAGTCACA 4
CCTCTGGTCAACCAGTCAC 5
5'-TgGtcAAccAgTcAC-3'* 6
*其中大写字母表示β-D-氧基LNA，小写字母表示DNA并且LNA C是5甲基C，并且其中此化合物为完全硫代磷酸酯主链。
抗微小RNA寡核苷酸的许多其它化学方法和设计是本领域已知的。
为了体内抑制微小RNA，本领域已使用了许多化学方法和设计，包含靶向成熟微小RNA靶标的非RNaseH募集性反义寡核苷酸，例如：
如WO2005013901,Esau等人,《细胞代谢(Cell Metab.)》2006年2月；3(2):87-98和Davis等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》2006年5月11日；34(8):2294-304中报道的完全2'-O-甲氧基乙基硫代磷酸酯。
2'-O-甲氧基乙基/2'氟代混聚物硫代磷酸酯——参见Davis等人,《核酸研究》2009年1月；37(1):70-7。
2'-O-甲基AntagomiR——成熟的微小RNA的完全2'-O-甲基修饰的完全互补物，其中5'和3'区域是具有磷酸二酯的内部区域的并入有胆固醇缀合物的硫代磷酸酯(Krutzfeldt等人,《自然(Nature)》.2005年12月1日；438(7068):685-9)。
对于靶向前-微小RNA靶标，据报道RNaseH募集设计是有功能的，参见WO2005013901，其公开了靶向前-miRNA靶序列的2'-O-甲氧基乙基缺口聚物(gapmer)。
微小RNA-134拮抗剂治疗剂
微小RNA-134拮抗剂治疗剂是一种微小RNA-134抑制剂，其已被发现、开发或已获得市场认可或进行市场销售用于抑制微小RNA-134，以预防或治疗微小RNA-134相关疾病或病症，如与癫痫发作如癫痫或脑缺血性损伤相关的神经系统疾病。
Serpine 1生物标志物
Serpine 1生物标志物是细胞或样品中Serpine 1表达或活性的直接或间接生物标志物。
Serpine 1表达的直接生物标志物包含：
Serpine 1 mRNA的测量，例如使用基于杂交的测定(例如，northern印迹杂交(northern blot)、RT-PCR、探针杂交、微阵列分析、RNA保护测定或RNA测序)。
Serpine1前-mRNA编码在人类染色体7:101、127、089-101、139、266正向链(GRCh38:CM000669.2)处，如在本文中通过实例被提供为SEQ ID NO 3(SERPINE1-201)。
Serpine 1蛋白水平的测定，例如使用Serpine 1特异性抗体。许多Serpine 1特异性抗体是可商购获得的。Serpine-1抗体测定可以用于例如使用Elisa测定来测量Serpine1蛋白水平，所述Elisa测定也可商购获得，例如购自艾博抗(abcam)的人PAI1 ELISA试剂盒(SERPINE1)(ab184863)。人Serpine1蛋白序列的实例被提供为SEQ ID NO 7。
Serpine 1是组织纤溶酶原激活物(tPA)的调节剂。tPA是将纤溶酶原转化成纤溶酶的丝氨酸蛋白酶，所述纤溶酶是引起凝块分解的主要酶。
Serpine 1表达的间接生物标志物包含tPA活性的测定，其可从例如AnaSpec商购获得——
Figure BDA0002946969410000141
AMC tPA活性测定试剂盒*Fluorimetric*。用于tPA的Elisa测定也可商购获得。此外，由于Serpine-1抑制tPA，并且tPA将纤溶酶原转化成纤溶酶，因此纤溶酶原转化成纤溶酶(如凝块测定)也可以用作Serpine-1生物标志物。
参考水平
在本发明的使用方法中，可以将Serpine-1生物标志物的水平与至少一个参考水平进行比较。参考水平可以例如是与疾病相关的Serpine 1生物标志物的水平和/或Serpine1生物标志物的正常水平。Serpine-1生物标志物的水平可以例如根据受试者群体来测定，所述受试者群体例如被诊断出患有疾病的受试者群体和/或被认为未患有疾病的受试者群体。
另外或可替代地，Serpine-1参考可以是来自受试者的历史性Serpine-1生物标志物水平，其例如用于对已经被施用微小RNA-134拮抗剂治疗剂的受试者进行患者/受试者监测。因此，本发明可以用于监测患者的有效微小RNA-134抑制，并且从而优化个体受试者/患者的剂量方案。
受试者
受试者可以是哺乳动物，如啮齿动物例如大鼠或小鼠，或灵长类动物如猴子(例如，食蟹猴)。
受试者可以是用于微小RNA-134相关疾病的非人类动物模型。在一些实施例中，动物模型是基于化学(红藻氨酸)诱导的癫痫发作的小鼠模型。
受试者可以是人，如需要用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的人或正在经历用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的人。
受试者可以是患有与癫痫发作相关的神经系统疾病(例如，以癫痫发作为特征或面临癫痫发作的危险)的人。
受试者可以是患有脑缺血性损伤的人。
受试者可以是已经被诊断出患有微小RNA-134相关疾病或病症如癫痫的人，或者已经被诊断出面临罹患微小RNA-134相关疾病或病症如癫痫的风险的人。
受试者可能先前已经历了例如针对血栓形成的tPA(组织纤溶酶原激活物)治疗(此类受试者可能面临罹患癫痫的风险)。在此类情况下，本发明的方法或用途可以诊断性地使用——即，用于鉴定面临罹患癫痫发作(如癫痫)的风险较高的那些受试者，和/或治疗性地使用——即，用于预防或治疗癫痫发作(如癫痫)。癫痫发作可以与神经系统疾病如脑缺血性损伤相关。
微小RNA-134相关疾病或病症
微小RNA-134是与神经元微结构有关的大脑特异性miRNA，并且微小RNA-134过表达与脊髓体积减少、树突长度减少以及长时程增强的消除有关。因此，微小RNA-134是治疗各种神经系统疾病的有趣靶标。最近的证据表明，miRNA在某些形式的癫痫中可能起关键作用。由爱尔兰皇家外科医学院(Royal College of Surgeons in Ireland，RCSI)的DavidHenshall教授领导的研究鉴定了颞叶癫痫(TLE)与已知在促进树突分枝和负面调节脊柱成熟中起关键作用的miRNA(mir-134)的表达增加之间存在密切联系。此外，还表明，通过使用锁定核酸(LNA)抗miR-134寡核苷酸(例如antagomir(Ant-134))在癫痫持续状态的成年小鼠模型中沉默mir-134，能够强烈地遏制由癫痫持续状态引起的癫痫发作活动和海马损伤。具体地，证明了在杏仁体内红藻氨酸(KA)诱导的癫痫持续状态前24小时通过ICV注射用针对mir-134的antagomir进行处理，能够显著降低通过EEG记录的癫痫持续状态的严重程度以及海马损伤的组织学测量结果(Jimenez-Mateos等人,2012)。用ICV注射抗miR-134进行的小鼠预处理还有效遏制了化学惊厥剂毛果芸香碱(Jimenez-Mateos等人,2015)和PTZ(Reschke等人,2017)诱导的癫痫发作。此外，在杏仁体内KA注射后1小时进行的antagomir(ICV)处理未降低急性癫痫持续状态活动，但通过EEG遥测技术历经2周所监测的，自发性癫痫发作的发病明显延迟并且总数减少(Jimenez-Mateos等人,2012)。值得注意的是，大鼠中癫痫持续状态后沉默miR-134使穿质通路刺激模型(后天性癫痫的无毒素模型)中的自发性癫痫发作的发生减少86％(Reschke等人,2017)。
微小RNA-134相关疾病或病症可以是神经系统疾病，如与癫痫发作如癫痫或脑缺血性损伤相关的神经系统疾病。
其它可能需要用微小RNA-134调节剂如拮抗剂治疗的神经系统疾病包含中风、CNS感染相关癫痫发作、脑瘤、外伤性脑损伤、神经退行性疾病、引起癫痫发作的代谢性疾病(包含但不限于低血糖症、糖原贮积病、丙酮酸脱氢酶缺乏症、获得性甲状旁腺功能减退症、腺苷琥珀酸裂合酶(ADSL)缺乏症和引起癫痫发作的自身免疫性疾病(多发性硬化症、糖尿病和系统性红斑狼疮)。术语“可能立即引发癫痫或癫痫发作或引起或已经引起脑损害的脑损伤”应理解为意指中风、创伤或其它类型的急性神经系统损伤。微小RNA-134调节剂可以用于治疗或预防与神经系统疾病相关的癫痫发作。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指寡核苷酸的与靶核酸互补的区域。在本文中，此术语可与“连续核碱基序列”和“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施例中，所述寡核苷酸的全部核苷酸构成所述连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包括连续核苷酸序列，并且可以任选地包括另外的一个或多个核苷酸，例如可以用于将官能团附接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。所述核苷酸接头区域可与靶核酸互补或不互补。有利地，连续核苷酸序列与靶核酸(微小RNA-134RNA，如SEQ ID NO 1或2)100％互补。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的组成部分，并且出于本发明的目的，包含自然产生的及非自然产生的核苷酸。在本质上，如DNA及RNA核苷酸的核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分以及一个或多个磷酸基团(核苷中则无磷酸基团)。核苷及核苷酸还可互换称为“单元”或“单体”。
经修饰的核苷
本文中所用的术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”意指通过引入糖部分或(核)碱基部分的一个或多个修饰，与等同的DNA或RNA核苷相比，经修饰的核苷。在一个优选的实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语经修饰的核苷在本文中还可与“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”等术语互换使用。本文中将具有未经修饰的DNA或RNA糖部分的核苷称为DNA或RNA核苷。在DNA或RNA核苷的碱基区域中包含修饰的核苷，若允许沃森克里克碱基配对，则大体上仍称为DNA或RNA。
经修饰的核苷间键
术语“经修饰的核苷间键”，如本领域技术人员通常所知的定义，是指除磷酸二酯(PO)键以外，可将两个核苷共价偶联在一起的键。因此本发明的寡核苷酸可包括经修饰的核苷间键。在一些实施例中，所述经修饰的核苷间键可使寡核苷酸的核酸酶抗性相较于磷酸二酯键增加。就自然产生寡核苷酸而言，核苷间键包含在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定寡核苷酸供体内使用，并且可以在本发明寡核苷酸中的DNA核苷或RNA核苷区域(例如在缺口聚物寡核苷酸的缺口区域内部)以及在修饰的核苷区域(例如，区域F和区域F')起到保护免受核酸酶剪切的作用。
在一个实施例中，寡核苷酸包括一个或多个由天然磷酸二酯修饰的核苷间键，例如一个或多个修饰的核苷间键，其例如对核酸酶的攻击更具抗性。核酸酶抗性可通过将所述寡核苷酸温育在血清中或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))而确定，两者均为本技术领域中已知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键被称为抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键被修饰，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部所述核苷间键均为抗核酸酶核苷间键。应当认识到的是，在一些实施例中，将本发明的寡核苷酸连接至如缀合物等非核苷酸官能基团的核苷可为磷酸二酯。
优选的经修饰的核苷间键是硫代磷酸酯。
硫代磷酸酯核苷间键由于具有核酸酶抗性、优良药代动力学且易于制造，因此特别适用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。
核碱基
术语核碱基包含存在于核苷及核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤及鸟嘌呤)和嘧啶(例如脲嘧啶、胸腺嘧啶及胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的上下文内，术语核碱基还涵盖与自然产生核碱基不同但在核酸杂交过程中具有功能性的经修饰的核碱基。在此上下文中，“核碱基”是指如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、脲嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤等自然产生核碱基以及非自然产生变体。此类变体例如是Hirao等人(2012)《化学研究述评(Accounts of Chemical Research)》第45卷第2055页以及Bergstrom(2009)《现代核酸化学实验指南(Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry)》增刊37 1.4.1中所描述的变体。
在一些实施例中，所述核碱基部分通过如下方式进行修饰：将嘌呤或嘧啶改变为经修饰的嘌呤或嘧啶，如经取代的嘌呤或经取代的嘧啶，如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-脲嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-噻唑并-脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、2'硫胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤及2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可用每一对应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中各字母可任选地包含对等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA寡核苷酸，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
样品
Serpine-1生物标志物的测量可以在细胞提取物中进行，例如在本发明的体外方法中，或者可以在从受试者获得的生物提取物中进行。
生物提取物包含例如脑脊髓液样品、血液样品或血浆样品。有利地，样品可以是从受试者获得的脑脊髓液样品。
应当理解，在测定Serpine-1生物标志物之前，可以对细胞提取物或样品进行处理，例如针对例如Serpine-1 mRNA测定而纯化的生物标志物分子RNA可以从提取物或样品中提取。
经修饰的寡核苷酸
术语经修饰的寡核苷酸描述包括一个或多个糖修饰的核苷和/或经修饰的核苷间键的寡核苷酸。术语“嵌合的寡核苷酸”是在文献中使用来描述具有经修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
互补性
术语“互补性”是用来形容核苷/核苷酸的沃森克里克碱基配对能力。沃森克里克碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)及腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/脲嘧啶(U)。应当理解的是，寡核苷酸可包括具有经修饰的核碱基的核苷，例如5-甲基胞嘧啶经常用来取代胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未经修饰的核碱基与经修饰的核碱基之间的沃森克里克碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)《化学研究述评》第45卷第2055页以及Bergstrom(2009)《现代核酸化学实验指南》增刊37 1.4.1)。
如本文所用，术语“互补性％”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列内核苷酸的比例，其中在给定位置，所述核苷酸与不同的核酸分子(例如靶核酸或靶序列)在给定位置处的连续核苷酸序列互补(即与之形成沃森克里克碱基对)。通过以下方式计算百分比：(与靶序列5'-3'和寡核苷酸序列从3'-5'对齐时)计数两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。在此类比对中，未对齐(形成碱基对)的核碱基/核苷酸称为错配。优选地，计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。
术语“完全互补性”意指具有100％互补性。
同一性
本文所用的术语“同一性”意指核酸分子(例如寡核苷酸)中的连续核苷酸序列中与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸所占的比例(以百分比表示)，所述核酸分子横跨所述连续核苷酸序列。因此，通过计算两个序列(例如，在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同的对齐碱基(匹配)数，将所述数除以对齐区域的核苷酸总数再乘以100来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数×100)/对齐区域(例如连续核苷酸序列)长度。计算连续核苷酸序列的同一性百分比时不允许进行插入和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要核碱基形成沃森克里克碱基配对的功能留存，即可不考虑核碱基的化学修饰(例如在计算％同一性时，5'-甲基胞嘧啶与胞嘧啶视为相同)。
杂交
本文所用的术语“杂交”是指两条核酸链(例如寡核苷酸及靶核酸)在相对链上的碱基对之间形成氢键，从而形成双链体。两条核酸链之间的结合亲和力是指杂交的强度。其通常用解链温度(Tm)来描述，所述解链温度定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体时的温度。在生理条件下，Tm不与亲和力严格成正比(Mergny和Lacroix,2003,《寡核苷酸(Oligonucleotides)》13:515–537)。标准状态吉布斯自由能ΔG°更能准确代表结合亲和力，并且与反应的离解常数(Kd)之间具有ΔG°＝-RTln(Kd)的关系，其中R是气体常数，而T是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间反应的非常低的ΔG°体现所述寡核苷酸与靶核酸之间的强势杂交。ΔG°是与含水浓度为1M、pH为7、温度为37℃的反应关联的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发性反应，而自发性反应的ΔG°小于零。ΔG°可以通过实验来测量，例如，通过使用如Hansen等人,1965,《化学通讯(Chem.Comm.)》36–38及Holdgate等人,2005,《今日之药物发现(Drug Discov Today)》中所描述的等温滴定微量热(ITC)法。本领域技术人员将知道，市面上可购得用于测量ΔG°的商用设备。ΔG°还可采用数值方式进行估计，通过使用SantaLucia,1998,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》.95:1460–1465描述的最近邻居模型，使用Sugimoto等人,1995,《生物化学(Biochemistry)》34:11211–11216和McTigue等人,2004,《生物化学》43:5388–5405中描述的适当推导的热力学参数进行数值评估。为了能够经由杂交调节本发明的寡核苷酸的预期核酸靶，将本发明的寡核苷酸以对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸低于-10千卡的估计ΔG°值杂交至靶核酸。在一些实施例中，杂交的程度或强度是以标准状态吉布斯自由能ΔG°来测量。寡核苷酸可以对于长度为8至30个核苷酸的寡核苷酸低于-10千卡范围的估计ΔG°值杂交至靶核酸，如低于-15千卡，如低于-20千卡及如低于-25千卡。在一些实施例中，寡核苷酸以约-10至-60千卡，如-12至-40，如-15至-30千卡或-16至-27千卡如-18至-25千卡的估计ΔG°值与靶核酸杂交。靶向微小RNA-134的反义寡核苷酸能够杂交并抑制(拮抗)微小RNA-134活性。
靶核酸
根据本发明，靶核酸是哺乳动物或人微小RNA-134RNA，如SEQ ID NO 1或2。
靶序列
本文所用的术语“靶序列”意指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包括与本发明的寡核苷酸为互补的核碱基序列。在一些实施例中，所述靶序列由靶核酸上的一个区域组成，所述区域与本发明的寡核苷酸的连续核苷酸序列互补。
本发明的寡核苷酸包括与靶核酸如靶核酸的亚序列如本文所述的靶序列互补或杂交的连续核苷酸序列。
寡核苷酸包括与靶核酸分子中存在的靶序列互补的连续核苷酸序列。连续核苷酸序列(并且因此靶序列)包括至少7个连续核苷酸，如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸，如8-22个，如11-18个连续核苷酸。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷是一种经修饰的核苷，当并入所述寡核苷酸中时，可增强所述寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(Tm)所测定的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一经修饰的核苷的解链温度增加+0.5至+12℃，更优选地+1.5至+10℃，最优选地+3至+8℃。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包含例如许多2'取代的核苷以及锁定核酸(LNA)(参见例如Freier和Altmann；《核酸研究》,1997,25,4429-4443和Uhlmann；《当前药物开发意见(Curr.Opinion in Drug Development)》,2000,3(2),293-213)。
糖修饰
本发明的寡聚物可包括一个或多个具有经修饰的糖部分的核苷，即与DNA及RNA中发现的核糖糖部分相较时对糖部分的修饰。
目前已制成了众多具有对核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的特定特性，如亲和力和/或核酸酶抗性。
这些修饰包含对核糖环结构的修饰，例如替代为己糖环(HNA)，或通常在核糖环上的C2与C4碳原子之间具有双自由基桥的双环(LNA)，或通常在C2与C3碳原子之间无键的未连接的核糖环(例如UNA)。其它糖修饰的核苷包含，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷也包含将糖部分替代为非糖部分的核苷，例如肽核酸(PNA)或吗啉基核酸的情况。
糖修饰也包含经由将核糖环上的取代基团改变为除在DNA及RNA核苷中自然存有的氢或2'-OH基团以外的基团来进行的修饰。取代基可例如在2'、3'、4'或5'位置引入。
2'糖修饰的核苷。
2'糖修饰的核苷是在2'位置具有除H或–OH以外的取代基的核苷(2'取代的核苷)或包括能够在核糖环中的2'碳与第二碳之间形成桥的2'连接的双自由基的核苷，如LNA(2'–4'双自由基桥接的)核苷。
事实上，人们已花费很多精力开发2'取代的核苷，并且发现许多2'取代的核苷并入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可增强所述寡核苷酸的结合亲和力和/或增强所述寡核苷酸的核酸酶抗性。2'取代修饰的核苷的实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA及2'-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier和Altmann；《核酸研究》,1997,25,4429-4443和Uhlmann；《当前药物开发意见》,2000,3(2),293-213以及Deleavey和Damha,《化学与生物学(Chemistry and Biology)》2012,19,937。以下为一些2'取代修饰的核苷的示意图。
Figure BDA0002946969410000211
关于本发明，2'取代不包含2'桥接的分子如LNA。
锁定核酸(LNA)
“LNA核苷”是一种2'-修饰的核苷，其包括链接所述核苷的核糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷于文献中也称为桥接的核酸或双环核酸(BNA)。核糖的构象的锁定与在将LNA并入寡核苷酸中时对于互补RNA或DNA分子杂交的亲和力增强(双链体稳定化)相关。通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度，可对此进行常规的确定。
非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647,WO2008/150729、Morita等人,《生物有机化学与医药化学通讯(Bioorganic&Med.Chem.Lett.)》12,73-76、Seth等人《有机化学杂志(J.Org.Chem.)》2010,第75卷(5)第1569页-81和Mitsuoka等人,《核酸研究》2009,37(4),1225-1238以及Wan和Seth,《药物化学杂志(J.Medical Chemistry)》2016,59,9645-9667中。
其它非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。
方案1：
Figure BDA0002946969410000221
特定LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA，如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)及ENA。
特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。
非RNase H募集性反义寡核苷酸
WO2005/013901公开了用于抑制微小RNA的RNaseH募集性2'-O-MOE缺口聚物和完全2-O-MOE修饰的寡核苷酸。通常，在抑制微小RNA方面，RNAseH募集性缺口聚物寡核苷酸被认为比非RNaseH募集性空间嵌段反义寡核苷酸逊色(参见Davis等人2006《核酸研究》34-2294-304)。Krützfelt等人2005《自然》438 685-9公开了完全2'O-甲基修饰的反义寡核苷酸胆固醇缀合物，其不能募集有效抑制体内微小RNA-122的RNaseH。
如WO2007/112754中公开的，为了抑制微小RNA，有利的是使用非RNaseH募集性高亲和力反义寡核苷酸如LNA抗miR。
EP 1 222 309提供了用于确定RNaseH活性的体外方法，所述方法可以用于确定募集RNaseH的能力。使用EP 1 222 309的实例91-95提供的方法，如果寡聚体在提供有互补RNA靶标后，其初始速率(以pmol/l/min为单位测量)为同等DNA的至少1％如至少5％如至少10％或小于20％，则所述寡聚体被认为能够募集RNaseH，所述同等DNA仅为寡核苷酸、没有2'取代、在寡核苷酸的所有核苷酸之间存在硫代磷酸酯连接基团。
在一个实施例中在一些实施例中，使用EP 1 222 309的实例91-95提供的方法，如果寡聚体在提供有互补RNA靶标和RNaseH时，以pmol/l/min为单位测量的RNaseH初始速率小于1％如小于5％如小于10％或小于20％的使用同等DNA测定的初始速率，则认为所述寡聚体基本上不能募集RNaseH，所述同等DNA仅为寡核苷酸、没有2'取代、在寡核苷酸的所有核苷酸之间存在硫代磷酸酯连接基团。
全聚物
在一些实施例中，寡聚物或其连续核苷酸序列由核苷类似物如亲和力增强的核苷类似物——在本文中称为“全聚物”——的连续序列组成。
全聚物是单链寡聚物或其连续核苷酸序列，其不包括DNA或RNA核苷，并且因此仅包括核苷类似物核苷。寡聚体或其连续核苷酸序列可以是全聚物——实际上，各种全聚物设计都可以作为治疗性寡聚体非常有效，特别是在靶向微小RNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚体(SSO)时。
在一些实施例中，全聚物包括至少一个XYX或YXY序列基序如重复序列XYX或YXY或由其组成，其中X是LNA并且Y是替代(即非LNA)核苷酸类似物，如2'-OMe RNA单元和2'-氟DNA单元。在一些实施例中，以上序列基序可为例如XXY、XYX、YXY或YYX。
在一些实施例中，全聚物可包括介于8个与16个核苷酸之间如9、10、11、12、13、14或15个核苷酸如介于8个与12个核苷酸之间的连续核苷酸序列或由其组成。
在一些实施例中，全聚物的连续核苷酸序列包括至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如95％、如100％的LNA单元。剩余单元可选自本文中提及的非LNA核苷酸类似物，如选自由以下项组成的组中的那些：2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元和2'MOE RNA单元或2'-OMe RNA单元和2'-氟代DNA单元。
在一些实施例中，全聚物由仅由LNA单元组成的连续核苷酸序列组成或包括所述连续核苷酸序列。
在一些实施例中，全聚物可以靶向微小RNA(即，抗miR)，如美国临时申请60/979217和61/028062以及PCT/DK2008/000344中所提及的，所述文献全部通过引用特此并入。
混聚物
术语“混聚物”是指包括DNA核苷和核苷类似物核苷的寡聚体或其连续核苷酸序列，其中与缺口聚物、tailmer、headmer和blockmer相比，不存在大于4个或大于5个天然存在的DNA核苷的连续序列(即，足以实现RNaseH募集活性的DNA区域)。
寡聚体或其连续核苷酸序列可以是混聚物——实际上，各种混聚物设计都可以作为治疗性寡聚体非常有效，特别是在靶向微小RNA(抗miR)、mRNA上的微小RNA结合位点(Blockmir)或作为剪接转换寡聚体(SSO)时。
在一些实施例中，寡聚物可以是连续核苷酸序列，也可以是混聚物，并且实际上，由于混聚物有效且特异性地结合其靶标的能力，使用混聚物作为治疗性寡聚物被认为在减少靶RNA方面特别有效。
在一些实施例中，混聚物包括核苷酸类似物和天然存在的核苷酸重复模式的连续核苷酸序列或一种类型的核苷酸类似物和第二类型的核苷酸类似物或由其组成。所述重复模式可例如为：每个第二或每个第三核苷酸为核苷酸类似物如LNA，并且剩余核苷酸为天然存在的核苷酸如DNA，或可以为2'取代的核苷酸类似物，如本文所提及的2'氟类似物的2'MOE，或在一些实施例中，选自本文中提及的核苷酸类似物群组。应当认识到，核苷酸类似物如LNA单元的重复模式可与固定位置处(例如5'或3'末端)的核苷酸类似物组合。
在一些实施例中，从3'末端开始计数，寡聚物或混聚物的第一核苷酸为核苷酸类似物，如LNA核苷酸。
在可以相同或不同的一些实施例中，从3'末端开始计数，寡聚物或混聚物的第二核苷酸为核苷酸类似物，如LNA核苷酸。
在可以相同或不同的一些实施例中，从3'末端开始计数，寡聚物或混聚物的第七和/或第八核苷酸为核苷酸类似物，如LNA核苷酸。
在可以相同或不同的一些实施例中，从3'末端开始计数，寡聚物或混聚物的第九和/或第十核苷酸为核苷酸类似物，如LNA核苷酸。
在可以相同或不同的一些实施例中，寡聚物或混聚物的5'末端为核苷酸类似物，如LNA核苷酸。
在一些实施例中，上述设计特征可以被并入到混聚物设计如抗miR混聚物中。
在一些实施例中，混聚物不包括多于4个连续DNA核苷酸单元或3个连续DNA核苷酸单元的区域。在一些实施例中，混聚物不包括多于2个连续DNA核苷酸单元的区域。
在一些实施例中，混聚物包括至少一个区域，所述区域由至少两个连续核苷酸类似物单元如至少两个连续LNA单元组成。
在一些实施例中，混聚物包括至少一个区域，所述区域由至少三个连续核苷酸类似物单元如至少三个连续LNA单元组成。
在一些实施例中，本发明的混聚物不包括多于7个连续核苷酸类似物单元如LNA单元的区域。在一些实施例中，本发明的混聚物不包括多于6个连续核苷酸类似物单元如LNA单元的区域。在一些实施例中，本发明的混聚物不包括多于5个连续核苷酸类似物单元如LNA单元的区域。在一些实施例中，本发明的混聚物不包括多于4个连续核苷酸类似物单元如LNA单元的区域。在一些实施例中，本发明的混聚物不包括多于3个连续核苷酸类似物单元如LNA单元的区域。在一些实施例中，本发明的混聚物不包括多于2个连续核苷酸类似物单元如LNA单元的区域。
在涉及从3'末端开始计数的位置3至8中核苷酸修饰的混聚物实施例中，LNA单元可以用其它核苷酸类似物如本文所提及的那些代替。因此，“X”可以选自由以下项组成的组：2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-氨基-DNA单元、2'-氟代-DNA单元、2'-MOE-RNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元。“x”优选地是DNA或RNA，最优选地DNA。
在一些实施例中，混聚物如抗miR混聚物在位置3至8中被修饰——即从3'末端开始计数，在位置3至8中包括至少一个核苷酸类似物。此序列的设计可以通过存在的非LNA单元的数量或通过存在的LNA单元的数量来定义。在前者的一些实施例中，从3'末端开始计数，位置三至八中的核苷酸中的至少一个核苷酸如一个核苷酸是非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，位置三至八中的核苷酸中的至少两个核苷酸如两个核苷酸是非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，位置三至八中的核苷酸中的至少三个核苷酸如三个核苷酸是非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，位置三至八中的核苷酸中的至少四个核苷酸如四个核苷酸是非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，位置三至八中的核苷酸中的至少五个核苷酸如五个核苷酸是非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，位置三至八中的核苷酸中的所有六个核苷酸是非LNA单元。
在一些实施例中，根据本发明的可替代地定义的混聚物如抗miR混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括至少一个LNA单元。在一些实施例中，混聚物如抗miR混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括一个LNA单元。从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式可以选自Xxxxxx、xXxxxx、xxXxxx、xxxXxx、xxxxXx和xxxxxX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。
在一些实施例中，混聚物如抗miR混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括至少两个LNA单元。在其一些实施例中，混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括两个LNA单元。从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式可以选自由以下项组成的组：XXxxxx、XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXXxxx、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXXxx、xxXxXx、xxXxxX、xxxXXx、xxxXxX和xxxxXX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一个实施例中，从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式选自由以下项组成的组：XxXxxx、XxxXxx、XxxxXx、XxxxxX、xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXxXx、xxXxxX和xxxXxX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式选自由以下项组成的组：xXxXxx、xXxxXx、xXxxxX、xxXxXx、xxXxxX和xxxXxX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式选自由以下项组成的组：xXxXxx、xXxxXx和xxXxXx，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式是xXxXxx，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。
在一些实施例中，混聚物如抗miR混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括至少三个LNA单元。在其一个实施例中，混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括三个LNA单元。从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式可以选自由以下项组成的组：XXXxxx、xXXXxx、xxXXXx、xxxXXX、XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX和XxXxXx，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式选自由以下项组成的组：XXxXxx、XXxxXx、XXxxxX、xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、XxXXxx、XxxXXx、XxxxXX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX、xXxXxX和XxXxXx，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式选自由以下项组成的组：xXXxXx、xXXxxX、xxXXxX、xXxXXx、xXxxXX、xxXxXX和xXxXxX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式是xXxXxX或XxXxXx，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式是xXxXxX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。
在一些实施例中，混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括至少四个LNA单元。在其一些实施例中，混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括四个LNA单元。从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式可以选自由以下项组成的组：xxXXXX、xXxXXX、xXXxXX、xXXXxX、xXXXXx、XxxXXX、XxXxXX、XxXXxX、XxXXXx、XXxxXX、XXxXxX、XXxXXx、XXXxxX、XXXxXx和XXXXxx，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。
在一些实施例中，根据本发明的混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括至少五个LNA单元。在其一些实施例中，混聚物从3'末端开始计数，在位置三至八中包括五个LNA单元。从3'末端开始计数，在位置三至八中核苷酸的取代模式可以选自xXXXXX、XxXXXX、XXxXXX、XXXxXX、XXXXxX和XXXXXx，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。
在一些实施例中，所述非LNA单元是另一个核苷酸类似物单元。
在一些混聚物实施例中，从3'末端到5'末端计数的位置11的核苷酸的取代模式可以包含核苷酸类似物单元(如LNA)或者也可以不包含所述核苷酸类似物单元。在一些实施例中，混聚物从3'末端到5'末端计数的位置11包括至少一个核苷酸类似物单元(如LNA)如一个核苷酸类似物单元。在一些实施例中，混聚物从3'末端到5'末端计数的位置11包括至少两个核苷酸类似物单元(如LNA单元)如两个核苷酸类似物单元。
在涉及寡核苷酸从寡聚体的位置11到5'末端的核苷酸中的核苷酸修饰的一些实施例中，LNA单元可以被其它核苷酸类似物如本文所提及的那些代替。因此，“X”可以选自由以下项组成的组：2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-氨基-DNA单元、2'-氟代-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元。“x”优选地是DNA或RNA，最优选地DNA。
在一些实施例中，混聚物具有以下取代模式，其从3'末端到5'末端计数，从核苷酸十一开始重复：xXxX或XxXx，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在另一个实施例中，混聚物具有以下取代模式，其从3'末端到5'末端计数，从核苷酸十一开始重复：XXxXxx、XXxxXx或XxXxxX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在又一个实施例中，混聚物具有以下取代模式，其从3'末端到5'末端计数，从核苷酸十一开始重复：XXXxXXXx、XXxXxXxX、XXXxxxXX或XXxXxxXX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。
从3'末端到5'末端计数，从位置11开始的核苷酸的具体取代模式取决于混聚物中核苷酸的数量。在优选实施例中，混聚物包括12个核苷酸并且从3'末端开始计数，位置11至12的取代模式选自xX和Xx，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置11至12的取代模式是xX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。可替代地，从3'末端计数，位置11至12中不存在LNA单元，即取代模式为xx。
在一些实施例中，混聚物包括12个核苷酸并且从3'末端开始计数，位置10至12的取代模式选自由以下项组成的组：Xxx、xXx、xxX、XXx、XxX、xXX和XXX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在其一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置10至12的取代模式选自由以下项组成的组：xXx、xxX和xXX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。在一些实施例中，从3'末端开始计数，在位置10至12的取代模式是xxX，其中“X”表示LNA单元，并且“x”表示非LNA单元。可替代地，从3'末端计数，位置10至12中不存在LNA单元，即取代模式是xxx。
在一些实施例中，混聚物在5'末端处含有LNA单元。在一些实施例中，混聚物从5'末端开始计数，在前两个位置处含有LNA单元。混聚物还可以含有一个或多个在本文的抗miR的上下文中指定的结构特征——混聚物含有相似的模式和数量的核苷酸/核苷酸类似物(例如，X和x或X和Y)。
缀合物
本文所用的术语缀合物是指共价连接至非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸对一个或多个非核苷酸部分的缀合可例如通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄入或稳定性，来改善寡核苷酸的药理学。在一些实施例中，缀合物部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、通透性和/或细胞摄取来调节或增强寡核苷酸的药代动力学特性。具体地，缀合物可使寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，并且由此增强寡核苷酸在这种器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。
在一个实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下项组成的组：糖、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或它们的组合。
接头
键或接头是两个原子之间的连接，用以将一个目标化学基团或区段经由一个或多个共价键连接至另一个目标化学基团或区段。缀合物部分可直接或经由连接部分(例如接头或系链)附接至所述寡核苷酸。接头用于将第三区域如缀合物部分(区域C)与第一区域共价连接，所述第一区域例如与寡核苷酸或连续核苷酸序列或缺口聚物区域F-G-F'(区域A)。
在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可任选地包括接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)，其位在与所述靶核酸互补的所述寡核苷酸或所述连续核苷酸序列(区域A或第一区域)与缀合物部分(区域C或第三区域)之间。
区域B意指包含或由一个生理不稳定键的生物可切断型接头组成，所述生理不稳定键是在哺乳动物体内通常遇到的或与之类似的条件下可切断的键。生理不稳定接头经历化学转换(例如，切断)的条件包括化学条件，如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及哺乳动物细胞内所遇到的或与之类似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包含通常存在于哺乳动物细胞中的酵活性，如蛋白分解酶或水解酶或核酸酶的活性。在一实施例中，所述生物可切断型接头易感于S1核酸酶切断。含有DNA磷酸二酯的生物可裂解的接头详细描述于WO2014/076195(此处通过引用并入)中，也参见本文中的区域D'或D”。
区域Y是指不必为可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域A或第一区域)的接头。区域Y接头可以包括重复结构如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，接头(区域Y)为氨基烷基如C2-C36氨基烷基，包括例如C6至C12氨基烷基。在一优选的实施例中，所述接头(区域Y)是C6氨基烷基团。
治疗
本文所用的术语“治疗”意指治疗既有疾病(例如本文所提及的疾病或疾患)，或防范疾病，也就是预防。因此应知，本文中所称的治疗，在一些实施例中，是属于预防疾病性质。
实例
概述
miR-134在癫痫中具有重要的调节作用(Jimenez-Mateos等人,2012)，然而miR-134在癫痫中的作用机制仍不清楚。为了确定miR-134的潜在靶标，用miR-134的LNA-抗miR抑制剂处理原代皮层神经元并温育6天。在温育时间段后，从细胞中分离出RNA，并进行全局RNA测序分析，以鉴定其表达通过微小RNA-134抑制进行调节的mRNA。根据鉴定出的脱抑制的mRNA，基于3'UTR中存在的潜在微小RNA-134种子序列，鉴定被显著脱抑制并且还具有推定的微小RNA-134结合位点的基因。这些候选生物标志物转录物在另一个实验进行了实验验证，所述实验使用利用一系列浓度的LNA-抗miR-134处理的原代皮层神经元。在测试的候选转录物中，一种Serpine1已经过验证并以剂量依赖性方式被脱抑制和调节。Serpine1编码结合和抑制组织纤溶酶原激活物(tPA)的蛋白纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1)。已经显示tPA在癫痫中的因果作用是因为tPA敲除小鼠被保护免受化学诱导的癫痫(Tsirka等人,1995)。这表明微小RNA-134可以通过其调节癫痫的潜在机制是miR-134脱抑制Serpine1/PAI-1的抑制，从而抑制tPA。不仅是在如脑脊髓液等生物流体中的mRNA水平下，而且在蛋白水平和活性水平下，Serpine1/PAI-1或活性tPA是抑制miR-134的生物标志物。
Jimenez-Mateos等人,“沉默微小RNA-134产生神经保护性和延长的癫痫发作抑制作用(Silencing microRNA-134produces neuroprotective and prolonged seizure-suppressive effects)”.《自然医学(Nat Med.)》2012年7月；18(7):1087-94。
Tsirka SE等人表明，兴奋毒素诱导的神经元变性和癫痫发作是由组织纤溶酶原激活物介导的.《自然》.1995年9月28日；377(6547):340-4。
实例1：在用miR-134抑制剂抗miR处理6天后，从小鼠原代皮层神经元中分离的RNA的RNA测序分析鉴定了潜在的miR-134靶标。
在此实例中使用由Exiqon供应的胆固醇缀合的LNA抗miR。
小鼠神经元培养物的原代培养物是从P1幼崽中制备的，并按照所描述的(Chen等人,2007)铺在6孔板中。在体外(DIV)6天后，用模拟(n＝6)或0.1μM(n＝3)miR-134抑制剂抗miR(Exiqon，LNA修饰和3'胆固醇修饰的寡核苷酸)进一步处理小鼠原代神经元培养物6天。在PBS中添加了寡核苷酸的基础生长培养基中培养神经元细胞。根据制造商的说明，通过MagNA Pure 96、细胞RNA大容量试剂盒(罗氏公司(Roche)，ID：05469535001)纯化来自6孔设置的RNA，其中洗脱体积为50μL。通过Eurofins Genomics在核糖体耗竭后进行了RNA测序(1亿个配对末端读数)。
使用hisat2版本2.1.0(Kim、Langmead和Salzberg 2015)将从illumina测序实验获得的配对末端Fastq文件与小鼠基因组序列(UCSC基因组浏览器程序集ID：mm10)进行对齐，其中除了“--rna-strandness RF”之外，其余为默认设置。基于要求至少为10的映射质量(SAM文件的第5列)和其中属性“以适当的对映射的读数”必须为真的SAM标志(SAM文件的第2列)过滤映射的读数。映射的读数使用Rsubread R软件包版本1.28.1(Liao、Smyth和Shi2013)中的功能featureCounts、使用小鼠ENSEMBL基因注释版本92(仅使用“havana”和“ensenble或havana”基因；https://www.ensembl.org/)进行汇总，其中设置为“isPairedEnd＝TRUE,requireBothEndsMapped＝TRUE,strandSpecific＝2,juncCounts＝TRUE,allowMultiOverlap＝FALSE”。使用在以下中描述的limma R软件包3.34.9版(Law等人2014)的voom方法进行差异基因表达：limma R软件包用户指南(https:// bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/limma/inst/doc/ usersguide.pdf第一版：2002年12月2日,最新修订：2018年4月15日)。
微小RNA种子序列是微小RNA的6-8个核苷酸长的区域，所述区域需要与mRNA的3'非翻译区域(3'UTR)中的靶序列完美杂交(Ellwanger等人2011)。为了鉴定给定的基因是否具有miR-134种子序列匹配，对7聚体序列“CAGTCAC”的出现次数进行计数，所述序列在给定基因的3'UTR中从miRNA-134的位置2开始，与定义为7聚体的miR-134种子序列完全匹配(对于具有多个带注释的3'UTR的基因，呈现了最大计数)。
结果：在用0.1μM miR-134抗miR处理原代小鼠皮层神经元6天后，RNA测序分析鉴定出显著调节的基因。火山图(图1)示出了对照模拟处理的原代皮层神经元与用0.1μMmiR-134抗miR处理的原代皮层神经元之间的基因表达差异(顶部图区，右侧为上调基因，并且左侧为下调基因)。每个点对应于一个基因。在多次测试调整后的P-值<0.05的情况下在这两种条件下表达水平不同的基因标记有基因名称。
具有7个寡核苷酸miR-134种子序列的显著上调基因涵盖Serpine1、Gpr35、Syt6、Peg10、Olfr460——参见表1：
表1
Ensembl ID 基因名称 logFC AveExpr P.值 adj.P.Val 种子匹配
ENSMUSG00000037411 Serpine1 0.96 4.89 5.03E-07 0.00264181 1
ENSMUSG00000020447 Npc1l1 1.70 2.26 5.27E-07 0.00264181 0
ENSMUSG00000026271 Gpr35 1.19 3.46 1.42E-06 0.00465327 1
ENSMUSG00000027792 Bche 0.90 3.57 1.72E-06 0.00465327 0
ENSMUSG00000040152 Thbs1 0.67 6.26 1.86E-06 0.00465327 0
ENSMUSG00000026579 F5 0.77 3.28 6.60E-06 0.01102312 0
ENSMUSG00000027849 Syt6 0.38 5.70 1.01E-05 0.01383517 1
ENSMUSG00000031762 Mt2 0.71 4.24 2.35E-05 0.0252597 0
ENSMUSG00000049723 Mmp12 1.17 3.10 2.73E-05 0.02734967 0
ENSMUSG00000068587 Mgam 1.74 0.96 1.17E-05 0.01441299 0
ENSMUSG00000016356 Col20a1 0.62 4.81 3.47E-05 0.03068922 0
ENSMUSG00000067206 Lrrc66 1.84 0.61 1.25E-05 0.01441299 0
ENSMUSG00000092035 Peg10 0.55 6.87 5.30E-05 0.04167564 1
ENSMUSG00000036292 Gramd1c 1.00 2.47 7.58E-05 0.04559284 0
ENSMUSG00000045514 Olfr460 1.76 0.26 8.07E-05 0.04605006 1
ENSMUSG00000037577 Ephx3 2.49 -0.96 8.27E-05 0.04605006 0
实例2
在此实例中使用的化合物是序列：5'TgGtcAAccAgTcAC 3'(SEQ ID NO 8)的非缀合LNA抗miR，其中其中大写字母是β-D-氧基-LNA核苷，小写字母是DNA核苷，LNA胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶，并且所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。
用miR-134LNA抑制剂抗miR处理原代小鼠皮层神经元会诱导Serpine1 mRNA的表达，而不诱导Syt6、Gpr35或Peg10 mRNA的表达。小鼠神经元培养物的原代培养物是从P1幼崽中制备的，并按照所描述的(Chen等人,2007)铺在24孔板中。在体外(DIV)6天后，用模拟(n＝4)或0.04μM、0.11μM、0.33μM、1μM或3μM(n＝4)miR-134抑制剂LNA-抗miR进一步处理小鼠神经元培养物5天。根据制造商的说明，通过MagNA Pure 96细胞RNA大容量试剂盒(罗氏公司，ID：05469535001)纯化RNA，其中洗脱体积为50μL。根据制造商的说明，使用用于qPCR的iScript高级cDNA合成试剂盒(伯乐公司(BIO-RAD)，ID：1725038)合成cDNA。为了防止抑制cDNA的合成，在cDNA合成之前将RNA在90℃下变性一分钟。使用探针ddPCRTM Supermix(无dUTP)(伯乐公司(BIORAD)，ID：186-3024)进行ddPCR。FAM标记的探针和引物来自IDT(Serpine1Mm.PT.58.6413525；Syt6 Mm.PT.58.5412202；Peg10 Mm.PT.58.12887449；Gpr25Mm.PT.58.6713348)，而HEX标记的Tbp探针和引物来自伯乐公司(目录号：10031256)。循环条件为：95℃持续10分钟；在94℃下变性30秒；退火温度取决于测定，持续1分钟；重复变性和退火步骤42次。在42次循环后，使酶在98℃下失活持续10分钟。如果不直接使用样品，则将其储存在4℃下。使液滴流过液滴读取器QX200TM(伯乐公司)以进行荧光分析，并且对FAM着色的Serpine1液滴和HEX着色的Tbp液滴的数量进行计数。
实例3
使用TargetScanHuman 7.1鉴定了Serpine1中潜在的miR-134靶位点，并且在小鼠转录物中的位置345-352处和人转录物中的位置417-424的Serpine 3'UTR处鉴定了miR-134种子序列与3'UTR Serpine1 mRNA的潜在杂交(参见图3)。使用RNAStructure“预测双分子二级结构Web服务器”版本6.0.1(https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/ Servers/PredictBi/PredictBi.html)预测了微小RNA-134与3'UTR片段之间的相互作用(Reuter和Mathews 2010)。
实例4
在用前miR-134和LNA抗miR或LNA对照处理后，人乳腺癌MDA-MB-231细胞中的Serpine1 mRNA的表达分析。将MDA-MB-231接种到24孔板中，并在第二天根据制造商的说明，使用lipofectamine 2000(英杰公司(Invitrogen))用40nM前miR-134(Ambion前-miRmiRNA前体hsa-mir-134-5p，AM17100)或/和100nM LNA抗miR或100nM对照LNA转染。在转染后两天，根据制造商的说明，通过MagNA Pure 96、细胞RNA大容量试剂盒(罗氏公司(Roche)，ID：05469535001)纯化来自24孔设置的RNA，其中洗脱体积为50μL。使用一步式RT-ddPCR探针高级试剂盒(伯乐公司，ID：1864021)进行一步式ddPCR。FAM标记的探针和引物来自IDT(Serpine1Hs.PT.58.3938488.g)，而HEX标记的HPRT1探针和引物来自IDT(Hs.PT.58v.45621572)。循环条件为：95℃持续10分钟；在94℃下变性30秒；退火温度取决于测定，持续1分钟；重复变性和退火步骤42次。在42次循环后，使酶在98℃下失活持续10分钟。如果不直接使用样品，则将其储存在4℃下。使液滴流过液滴读取器QX200TM(伯乐公司)以进行荧光分析，并且对FAM着色的Serpine1液滴和HEX着色的HPRT1液滴的数量进行计数。结果在图4中示出。
另外的参考文献：
Chen Y.等人,《自然实验手册(Nat Protoc.)》2007；2(5):1044-51.
Ellwanger等人,2011.“MiRNA种子类型的足够最小集合(The SufficientMinimal Set of MiRNA Seed Types)”.《生物信息学(Bioinformatics)》(英国牛津(Oxford,England))27(10):1346–50.https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr149.
Kim等人,2015.“HISAT：存储器要求低的快速剪接对齐器(HISAT:A Fast SplicedAligner with Low Memory Requirements)”.《自然方法(Nature Methods)》12(4):357–60.https://doi.org/10.1038/nmeth.3317.
Law等人,2014.“Voom：用于RNA-Seq读取计数的精确权重解锁线性模型分析工具(Voom:Precision Weights Unlock Linear Model Analysis Tools for RNA-Seq ReadCounts)”.《基因组生物学(Genome Biology)》15(2):R29.https://doi.org/10.1186/gb-2014-15-2-r29.
Liao等人,2013年.“子读取对齐器：通过种子和投票进行快速、准确和可扩展的读取映射(The Subread Aligner:Fast,Accurate and Scalable Read Mapping by Seed-and-Vote)”.《核酸研究》41(10):e108.https://doi.org/10.1093/nar/gkt214.
Reuter、Jessica S.和David H.Mathews.2010.“RNAstructure：用于RNA二级结构预测和分析的软件(RNAstructure:Software for RNA Secondary Structure Predictionand Analysis)”.《BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)》11(3月):129.https://doi.org/10.1186/1471-2105-11-129.
Figure IDA0002946969450000011
Figure IDA0002946969450000021
Figure IDA0002946969450000031
Figure IDA0002946969450000041
Figure IDA0002946969450000051
Figure IDA0002946969450000061
Figure IDA0002946969450000071
Figure IDA0002946969450000081
Figure IDA0002946969450000091
Figure IDA0002946969450000101
Figure IDA0002946969450000111

Claims (17)

1.一种用于测定如神经元细胞的细胞中的微小RNA-134调节剂的活性的体外方法，所述方法包括测定微小RNA-134调节剂所添加到的所述细胞中的Serpine 1生物标志物水平的步骤。
2.一种用于鉴定患有神经系统疾病的受试者的体外方法，所述神经系统疾病如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病，所述受试者可能受益于施用包括微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂，所述方法包括以下步骤：
a)测量从所述受试者获得的样品中的Serpine 1生物标志物的水平；
b)与所述Serpine 1生物标志物的至少一个参考水平进行比较；
c)以鉴定所述受试者是否可能受益于施用包括微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂。
3.一种用于确定微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂在受试者中的疗效的体外方法，所述方法包括以下步骤：
d)测量从先前已被施用微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂的受试者获得的样品中的Serpine 1生物标志物的水平；
e)与所述Serpine 1生物标志物的至少一个参考水平进行比较；
f)以鉴定所述微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂的疗效。
4.一种诊断神经系统疾病的体外方法，所述神经系统疾病如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病，所述神经系统疾病适合用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗，所述方法包括以下步骤：
a.测量从所述受试者获得的样品中的Serpine 1生物标志物的水平；
b.与所述Serpine 1生物标志物的至少一个参考水平进行比较；
c.以鉴定所述受试者是否患有适合用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的神经系统疾病。
5.一种治疗需要用微小RNA-134拮抗剂治疗剂治疗的受试者的神经系统疾病的方法，所述神经系统疾病如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病，所述方法包括根据权利要求1到4中任一项所述的方法、其后是向所述受试者施用有效剂量的所述微小RNA-134拮抗剂治疗剂的步骤。
6.根据权利要求2到5中任一项所述的方法，其中所述参考水平是
a.与疾病相关的Serpine 1生物标志物的水平，
b.Serpine 1生物标志物的正常水平，
c.a)和b)两者。
7.一种Serpine 1生物标志物测定的体外用途，其用于测量微小RNA-134调节，如微小RNA-134抑制。
8.一种Serpine 1生物标志物测定用作微小RNA-134调节剂如拮抗剂的治疗剂例如微小RNA-134拮抗剂治疗剂用于在治疗如癫痫等神经系统疾病时使用的伴随诊断的体外用途。
9.一种Serpine 1生物标志物的体外用途，其用于确定患有神经系统疾病的受试者对包括微小RNA-134调节剂的治疗药剂的可能应答，所述神经系统疾病如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的神经系统疾病。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法或用途，其中所述Serpine 1生物标志物测定选自由以下项组成的组：
a.Serpine 1mRNA的测量
b.Serpine 1蛋白的测量
c.Serpine 1活性的测量
d.组织纤溶酶原激活物(tPA)活性的测量
e.纤溶酶原转化成纤溶酶的测量。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的用途方法，其中Serpine 1生物标志物的升高提示微小RNA-134的水平降低，或者其中Serpine 1生物标志物的降低提示微小RNA-134的水平增加。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者患有与微小RNA-134相关的疾病或病症，如神经系统疾病，如与癫痫发作(例如，癫痫，如癫痫性脑病或脑缺血性损伤)相关的疾病，或者可能罹患与微小RNA-134相关的所述疾病或病症，如癫痫发作，例如癫痫，如癫痫性脑病。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法或用途，其中所述受试者先前已经历了例如针对血栓形成的tPA(组织纤溶酶原激活物)治疗。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法或用途，其中在从所述受试者获得的样品中测定所述Serpine 1生物标志物，所述样品选自由脑脊髓液样品、血液样品或血浆样品组成的组。
15.根据权利要求1到13中任一项所述的方法或用途，其中在从所述受试者获得的脑脊髓样品中测定所述Serpine 1生物标志物。
16.根据权利要求1到14中任一项所述的使用方法，其中所述微小RNA-134调节剂是微小RNA-134的反义寡核苷酸抑制剂，所述反义寡核苷酸抑制剂包括与微小RNA-134如hsa-miR-134如SEQ ID NO 1互补如完全互补的至少7个连续核苷酸。
17.根据权利要求1到25中任一项所述的方法或用途，其中所述微小RNA-134调节剂是LNA反义寡核苷酸。
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