CN111718417B

CN111718417B - 含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途

Info

Publication number: CN111718417B
Application number: CN201910210102.9A
Authority: CN
Inventors: 查若鹏; 吴松; 张振山; 刘慧玲; 陈卫
Original assignee: Ningbo Kunpeng Biotech Co Ltd
Current assignee: Ningbo Kunpeng Biotech Co Ltd
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: EP3950719A4; US20220162282A1; JP7266325B2; BR112021018686A2; CN113614113A; CN111718417A; EP3950719A1; CA3134167A1; JP2022528151A; WO2020187270A1; CN113614113B; AU2020242472A1

Abstract

本发明涉及含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途。具体地，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有(P1‑L1)s‑A1‑(X)n‑A2‑(L2‑P2)t所示的结构。所述融合蛋白中的(X)n或A1‑(X)n，可促进融合目的肽的折叠和表达，并且可提高融合蛋白的溶解性并降低融合蛋白的分子间相互作用，从而使融合目的肽能够在具有商业意义的高浓度下折叠。并且所述融合蛋白中(X)n或A1‑(X)n可以被酶切成多个长度远小于目的肽长度的短肽，更有利于其与目的肽分离，从而使目的肽的纯化更方便。

Description

含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途。

背景技术

肽是一类生物分子，其被广泛地在许多生物医学研究领域中用作试剂、在疾病的治疗中用作治疗性药物、在检测病原菌中用作诊断剂以及用作生物标记物。合成肽通常有两种方法，一种是化学合成，另外一种是重组表达。化学合成已被用于制备多种治疗性肽，包括可的瑞林、甲状旁腺素(PTH)、胰高血糖素样肽(GLP-1)及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁肽、恩夫韦肽、降血钙素、比伐卢定、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽和胰岛素。该方法需要氨基酸片段的多步缩合而形成肽，同时也需要繁琐的保护、去保护和纯化等步骤。到目前为止，大多数低于50个氨基酸残基的商业化肽是用这种方法生产。由于制药行业和生物医学研究中肽的需求在不断增加，用于化学合成的氨基酸片段的价格也在持续攀升。因此，日常使用的治疗性肽药物比如GLP-1类似物，在未来将难以保持可以承受的价格。尽管化学合成小于50个氨基酸残基的肽在技术上是可行的，但较低的产量以及合成过程中产生的大量的有机废物是相当不合算的。现在，大多数超过50个氨基酸残基的肽是在细菌、酵母、昆虫、哺乳动物等细胞宿主中重组表达的。多年来，使用融合蛋白表达多肽一直是比较常用的方法。但是，用于肽表达的现在可用的融合蛋白方法存在许多技术上的问题，尤其是对于产生小于50个氨基酸残基的肽。例如现有技术中的融合蛋白分子量大，疏水性强，很难分离，目标蛋白的比重低，融合比低，结构稳定，难以酶切，上样离子柱、疏水柱死体积很多。

因此，非常有必要研发一种新的用于表达目的肽的融合蛋白，克服现有融合蛋白的限制，同时能够提高插入非天然氨基酸蛋白的产生，如提高带有BOC-赖氨酸蛋白等非天然氨基酸蛋白的产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的用于表达目的肽的融合蛋白，同时能够提高插入非天然氨基酸蛋白的产生，如提高带有BOC-赖氨酸蛋白等非天然氨基酸蛋白的产量。

本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括式I所示的结构：

(P1-L1)s-A1-(X)n-A2-(L2-P2)t (I)

式中，

“-”为肽键或连接肽，

各个P1各自独立地为第一目的肽；

各个P2各自独立地为第二目的肽；

各个L1各自独立地为无或第一连接肽；

各个L2各自独立地为无或第二连接肽；

A1为无或信号肽；

A2为无或信号肽；

各X独立地为荧光蛋白的单个β-折叠单元；

n为1-8的正整数；

s为0、1、或2；

t为0、1、或2；以及

附加条件是s和t不同时为0。

在另一优选例中，s为0，而t为1。

在另一优选例中，s为1，而t为0。

在另一优选例中，所述n为1-6，较佳地，n为2-4。

在另一优选例中，所述A1为信号肽，A2为无。

在另一优选例中，所述的β-折叠单元选自下组：荧光蛋白的β-折叠单元u1、u2、u3、u4、u5、u6、u7、u8、u9、u10和u11。

在另一优选例中，所述的各X的长度为10-14aa。

在另一优选例中，各X是不同的。

在另一优选例中，各X是相同的。

在另一优选例中，所述的荧光蛋白选自下组：绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白基因(CFP)、或其组合。

在另一优选例中，所述的荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。

在另一优选例中，所述GFP具有如SEQ ID NO.:13所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的任意两个β-折叠单元之间具有或不具有柔性接头I。

在另一优选例中，所述的(X)n作为蛋白表达促进元件。

在另一优选例中，所述的(X)n的总长度Ln为荧光蛋白总长度L0的15-70％，较佳地20-60％，更佳地25-50％。

在另一优选例中，所述的X选自下组：

uj，其具有SEQ ID NO.:j所示的氨基酸序列；

其中，j为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11。

在另一优选例中，所述的X选自下组：

X	氨基酸序列
		u1	VPILVELDGDVNG(SEQ ID NO.:1)
u2	HKFSVRGEGEGDAT(SEQ ID NO.:2)
		u3	KLTLKFICTT(SEQ ID NO.:3)
u4	YVQERTISFKD(SEQ ID NO.:4)
		u5	TYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO.:5)
u6	TLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO.:6)
		u7	HNVYITADKQ(SEQ ID NO.:7)
u8	GIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO.:8)
		u9	VQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO.:9)
u10	HYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO.:10)
		u11	HMVLLEFVTAAGI(SEQ ID NO.:11)

在另一优选例中，所述X还包括如SEQ ID NO.:1-11中任一所示序列中的R、K、H相互替换产生的氨基酸序列；和/或

所述X还包括如SEQ ID NO.:1-11中任一所示的序列中的P、Q相互替换形成的氨基酸序列；和/或

所述X还包括如SEQ ID NO.:1-11中任一所示的序列中的T、S相互替换形成的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述X选自下组：

(A)具有SEQ ID NO:1-11任一所示氨基酸序列的多肽；

(B)具有与SEQ ID NO:1-11任一所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地≥85％，更优选地≥90％，更优选地≥95％，最优选地≥97％的同源性)且保留所述特性的多肽；

(C)将SEQ ID NO:1-11任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述特性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述(X)n为u8、u9、u2-u3、u4-u5、u8-u9、u1-u2-u3、u2-u3-u4、u3-u4-u5、u5-u6-u7、u8-u9-u10、u9-u10-u11、u3-u5-u7、u3-u4-u6、u4-u7-u10、u6-u8-u10、u1-u2-u3-u4、u2-u3-u4-u5、u3-u4-u3-u4、u3-u5-u7-u9、u5-u6-u7-u8、u1-u3-u7-u9、u2-u2-u7-u8、u7-u2-u5-u11、u3-u4-u7-u10、u1-I-u2、u1-I-u5、u2-I-u4、u3-I-u8、u5-I-u6、或u10-I-u11。

在另一优选例中，所述A1或A2具有如SEQ ID NO.:12(MVSKGEELFTGV)所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述A1-(X)n具有如SEQ ID NO.:14、15、16、17、22、23、24、26、27、28、29或30所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，第一连接肽含有第一酶切位点(如TEV酶切位点)。

在另一优选例中，第二连接肽含有第二酶切位点。

在另一优选例中，所述的柔性接头I中含有第三酶切位点。

在另一优选例中，所述第三酶切位点为肠激酶(较佳地为EK酶)酶切位点，较佳地为DDDDK(SEQ ID NO.:25)。

在另一优选例中，所述(X)n为u1-EK-u2、u1-EK-u5、u2-EK-u4、u3-EK-u8、u5-EK-u6、或u10-EK-u11,其中EK为EK酶酶切位点。

在另一优选例中，所述的第一、第二和第三酶切位点是各不相同的。

在另一优选例中，所述的第一、第二和第三酶切位点中有两个或三个是相同的。

在另一优选例中，在P1和P2中均不存在所述的第一、第二和第三酶切位点。

在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽还含有不同于第一、第二和第三酶切位点的酶切位点。

在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽含有胰蛋白酶酶切位点，较佳地，所述第一连接肽和/或第二连接肽含有至少一个精氨酸(R)或赖氨酸(K)。

在另一优选例中，所述第一连接肽的C末端的氨基酸为Arg或Lys。

在另一优选例中，所述第二连接肽的N末端的氨基酸为Arg或Lys。

在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽还含有烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列。

在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽具有如SEQ ID NO.:18所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽还含有协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述标签序列为组氨酸标签，较佳地为6×HIS标签。

在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地选自：人胰岛素前体蛋白、赖脯胰岛素的前体蛋白、甘精胰岛素的前体蛋白、甲状旁腺素、可的瑞琳、降血钙素、比伐卢定、胰高血糖素样肽及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁肽、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽、水蛭素、生长激素、生长因子、生长激素释放因子、促肾上腺皮质激素、释放因子、德舍瑞林、去氨加压素、依降钙素、胰高血糖素、亮丙瑞林、促黄体激素释放激素、生长激素抑制素、促甲状腺激素释放激素、曲普瑞林、血管活性肠肽、干扰素、甲状旁腺激素、BH3肽、淀粉样变肽、或上述各肽的片段、或其组合，优选于但不限于上述多肽。

在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地为带有非天然氨基酸的蛋白。

在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地具有长度10-200个氨基酸的序列，较佳地，具有长度10-80个氨基酸的序列。

在另一优选例中，所述的P1和P2各自独立地为胰岛素原或胰岛素，较佳地为人胰岛素原或人胰岛素。

在另一优选例中，所述的胰岛素包括长效或速效胰岛素。

在另一优选例中，所述的胰岛素原的第29位的赖氨酸为炔基氧羰基赖氨酸衍生物、BOC-赖氨酸(叔丁氧羰基-L-赖氨酸)衍生物、脂肪酰化赖氨酸、或其组合。

在另一优选例中，所述的胰岛素原具有SEQ ID NO:19或20所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述目的肽P2位于(或连接至)所述(X)n的C端。

在另一优选例中，所述的融合蛋白经酶切后，形成第一目的肽和/或第二目的肽。

在另一优选例中，所述的第一目的肽和第二目的肽是相同或不同的。

在另一优选例中，所述的融合蛋白经酶切后，形成第一目的肽和/或第二目的肽，并且所述的(X)n被切割成长度Lx远小于第一目的肽和/或第二目的肽的长度Lp的短肽。

在另一优选例中，所述的各Lx为1-25个氨基酸。

在另一优选例中，所述的长度Lx与长度Lp的之比为1/2至1/10，较佳地1/3至1/8。

在另一优选例中，所述长度Lp与长度Lx的之差为大于1.3KD。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有选自下组的结构：A1-u8-L2-P2、A1-u9-L2-P2、A1-u2-u3-L2-P2、A1-u4-u5-L2-P2、A1-u8-u9-L2-P2、A1-u3-u5-u7-L2-P2、A1-u1-u2-u3-L2-P2、A1-u1-u2-u3-u4-L2-P2、A1-u3-u4-u6-L2-P2、A1-u4-u7-u10-L2-P2、A1-u3-u4-u7-u10-L2-P2、或A1-u5-EK-u6-L2-P2。

在另一优选例中，所述的融合蛋白具有如SEQ ID NO.:21所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体包括本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为质粒，较佳地，所述的载体为pBAD-HisA载体和/或pEvol-pBpF载体。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体、或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸、或表达本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其组合。

在另一优选例中，所述的宿主细胞均不含有所述的第一、第二和第三酶切位点对应的蛋白酶。

本发明的第五方面，提供了一种制备蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(a)培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到本发明第一方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(b)纯化步骤(a)中得到的融合蛋白。

在另一优选例中，所述方法还包括对本发明第一方面所述的融合蛋白进行蛋白水解消化，以从所述融合蛋白释放所述目的肽。

在另一优选例中，所述步骤(c)中用蛋白酶对本发明第一方面所述的融合蛋白进行酶切，从而获得酶切产物；和任选地

(d)从酶切产物中分离或纯化出所述的目的肽。

在另一优选例中，所述纯化包括对所述的目的肽通过凝胶过滤或HPLC进一步纯化。

本发明的第六方面，提供了如本发明第一方面所述的融合蛋白、或本发明第二方面所述的多核苷酸、或本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的宿主细胞的用途，所述融合蛋白用于表达制备目的肽。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了正确形成二硫键的成熟胰岛素的结构。

图2显示了重组人胰岛素融合蛋白表达质粒图谱。

图3显示了重组人胰岛素融合蛋白示意图。

图4显示了BOC-赖氨酸结构。

图5显示了重组融合蛋白表达。泳道1，A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达，分子量11.2kD；泳道2，A1-u4-u5-TEV-R-GLP1融合蛋白的表达，分子量8.7kD；泳道3，A1-u8-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达，分子量10.0kD；泳道4，A1-u3-u5-u7-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达，分子量12.2kD；泳道5，A1-u5-EK-u6-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达，分子量12.0kD；M为蛋白质分子质量标准。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次获得了一种新的适用于表达目的肽的融合蛋白。本发明的融合蛋白中(X)n或A1-(X)n，可促进融合目的肽的折叠和表达，并且可提高融合蛋白的产率和溶解性并降低融合蛋白的分子间相互作用，从而使融合目的肽能够在具有商业意义的高浓度下折叠。并且所述融合蛋白中(X)n或A1-(X)n可以被酶切成多个长度远小于目的肽长度的短肽，更有利于其与目的肽分离，从而使目的肽的纯化更方便。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。

本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％,100％。

融合蛋白

如本文所用，“本发明融合蛋白”、“重组融合蛋白”或“多肽”均指本发明第一方面所述的融合蛋白。

具体地，本发明所述融合蛋白包括式I所示的结构：

(P1-L1)s-A1-(X)n-A2-(L2-P2)t (I)

式中，

“-”为肽键或连接肽，

各个P1各自独立地为第一目的肽；

各个P2各自独立地为第二目的肽；

各个L1各自独立地为无或第一连接肽；

各个L2各自独立地为无或第二连接肽；

A1为无或信号肽；

A2为无或信号肽；

各X独立地为荧光蛋白的单个β-折叠单元；

n为1-8的正整数；

s为0、1、或2；

t为0、1、或2；以及

附加条件是s和t不同时为0。

在另一优选例中，所述荧光蛋白为GFP，较佳地，所述GFP的氨基酸序列具有如SEQID NO.:13所示的氨基酸序列(241个AA)。

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYAGS(SEQ ID NO.:13)

其中，上述序列中，下划线部分依次为荧光蛋白的β-折叠单元u1、u2、u3、u4、u5、u6、u7、u8、u9、u10和u11。

在另一优选例中，所述(X)n中的各X(uj)之间具有或不具有柔性接头I，较佳地具有柔性接头I。

在另一优选例中，所述的柔性接头I中含有第三酶切位点。

在另一优选例中，所述的柔性接头I含有EK酶酶切位点(DDDDK)。

在另一优选例中，所述A1-(X)n为A1-u8、A1-u9、A1-u2-u3、A1-u4-u5、A1-u8-u9、A1-u3-u5-u7、A1-u1-u2-u3、A1-u1-u2-u3-u4、A1-u3-u4-u6、A1-u4-u7-u10、A1-u3-u4-u7-u10、或A1-u5-EK-u6。

A1-u8序列：

MVSKGEELFTGVGIKANFKIRHNVED(SEQ ID NO.:23)

A1-u9序列：

MVSKGEELFTGVVQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO.:17)

A1-u2-u3序列：

MVSKGEELFTGVHKFSVRGEGEGDATKLTLKFICTT(SEQ ID NO.:24)

A1-u4-u5序列：

MVSKGEELFTGVYVQERTISFKDTYKTRAEVKFEGD(SEQ ID NO.:16)

A1-u3-u5-u7序列：

MVSKGEELFTGVKLTLKFICTTTYKTRAEVKFEGDHNVYITADKQ(SEQ ID NO.:15)

u8-u9序列(A1为无)：

GIKANFKIRHNVEDVQLADHYQQNTPIG(SEQ ID NO.:14)

A1-u5-EK-u6序列：

MVSKGEELFTGVTYKTRAEVKFEGDDDDDKTLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO.:22)

A1-u1-u2-u3序列：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATKLTLKFICTT(SEQ ID NO.:26)

A1-u1-u2-u3-u4序列：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATKLTLKFICTTYVQERTISFKD(SEQ IDNO.:27)

A1-u3-u4-u6序列：

MVSKGEELFTGVKLTLKFICTTYVQERTISFKDTLVNRIELKGIDF(SEQ ID NO.:28)

A1-u4-u7-u10序列：

MVSKGEELFTGVYVQERTISFKDHNVYITADKQHYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO.:29)

A1-u3-u4-u7-u10序列：

MVSKGEELFTGVKLTLKFICTTYVQERTISFKDHNVYITADKQHYLSTQSVLSKD(SEQ ID NO.:30)

在另一优选例中，所述第一连接肽和/或第二连接肽具有如SEQ ID NO.:18(ENLYFQGR)所示的氨基酸序列。

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO.:19)

FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO.:20)

MVSKGEELFTGVYVQERTISFKDTYKTRAEVKFEGDENLYFQGRFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN(SEQ ID NO.:21)

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

此外，还可以对本发明融合蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

术语“编码本发明融合蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或融合蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的融合蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的融合蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。

本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

表达载体

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的融合蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码融合蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

胰岛素的合成

胰岛素是一种已知氨基酸序列和结构特征的明确定义的肽，是一种具有两条氨基酸链的共51个氨基酸残基的蛋白。该激素含有A链(21个氨基酸)和B链(30个氨基酸)两种独立的肽链，两条氨基酸链上共有6个半胱氨酸残基，每条链上各有两个半胱氨酸残基通过二硫键相互连接。从统计学角度来看，一个人胰岛素分子内形成的二硫键有15种可能性。但这15种可能性中只有一种存在于具有生物活性的人胰岛素中，其二硫键如下:1)A6-A11；2)A7-B7；3)A20-B19。胰岛素原是胰岛素的生物前体，它是由C肽将A链和B链连接起来形成的单一链肽。胰岛素的两条肽链通过二硫键相结合(图1)。

胰岛素是由胰岛细胞受内源性物质如葡萄糖的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛细胞首先分泌的是由84个氨基酸组成的长链多肽-胰岛素原。胰岛素原经专一性蛋白酶-胰岛素原转化酶PC1和PC2以及羧肽酶E(CPE)的作用，将胰岛素原中间部分(C链)切下，而胰岛素原的羧基部分(A链)和氨基部分(B链)通过二硫键结合在一起形成胰岛素。成熟的胰岛素储存在胰岛细胞内的分泌囊泡中，与锌离子配位形成六聚体。在外界的刺激下，胰岛素随分泌囊泡释放至血液内并发挥其生理作用。具有1型糖尿病的病人由于自身的胰岛细胞产生胰岛素的能力遭到破坏导致其自身血糖调节能力的丧失。

目前，有两种路线用于生产各类商业重组人胰岛素—“连锁组合”路线和“胰岛素原”路线。在“连锁组合”路线中，组成胰岛素的两条肽链—A链和B链分别通过生物重组分别进行合成，然后再将A链和B链混合产生二硫键生成具有生物活性的人胰岛素。然而通过直接混合两条肽链来产生具有生物活性的人胰岛素的效率相对比较低，最终的产率只有7％左右。这种方法现在逐渐被第二种路线-“胰岛素原”路线所取代。对于“胰岛素原”路线，由胰岛素B链，C链和A链组成的胰岛素原首先在大肠杆菌或者酵母内表达，纯化后在体外进行复性。复性后的胰岛素原再用胰蛋白酶和羧肽酶B进行水解消化获得具有天然活性的人胰岛素。在“胰岛素原”路线中，胰蛋白酶特异性的识别蛋白质中的赖氨酸和精氨酸并裂解在赖氨酸和精氨酸C端的肽键。因为构象的原因，在胰岛素原B22位的精氨酸不被胰蛋白酶水解。但是，胰蛋白酶识别并水解在胰岛素的B29位的赖氨酸，从而不可避免的产生B30位苏氨酸消去的胰岛素副产物(DesB30-胰岛素)。为了减少DesB30-胰岛素的产生，胰蛋白酶的用量和反应时间必需严格的控制。尽管如此，还是会产生一定量的DesB30-胰岛素。因为DesB30-胰岛素和胰岛素之间只相差一个苏氨酸，他们之间的分离非常的困难。工业上普遍使用大型高效液相色谱分离的方法分离胰岛素，但是用这种方法分离胰岛素和DesB30-胰岛素会产生大量的工业废物，导致现有重组人胰岛素的生产成本较高。

本发明开发一种重组方法，用于获得具有正确连接的半胱氨酸桥的人胰岛素，该方法所需步骤较少，从而可获得较高产量的人胰岛素。

利用化学方法合成一种DNA片段，该DNA片段编码由SEQ ID NO.:21的氨基酸序列组成的2β-TEV-R-MiniINS。将该DNA片段克隆到araBAD启动子调控的细菌表达载体中。将含有2β-TEV-R-MiniINS的表达载体转化到大肠杆菌Top10菌株内，并将重组细胞培养于含有微量元素的LB培养基中。从包涵体内回收2β-TEV-R-MiniINS融合蛋白，并在一定条件下折叠，使折叠的2β-TEV-R-MiniINS融合蛋白中形成的二硫键与正确折叠的人胰岛素原中的二硫键相同，即形成的二硫键为A6-A11、A7-B7和A20-B19。用胰蛋白酶与羧肽酶B消化分离的正确折叠2β-TEV-R-MiniINS融合蛋白，以形成正确折叠的Boc-人胰岛素。通过疏水层析将Boc-人胰岛素纯化为至90％的纯度。然后酸脱保护除Boc，以形成正确折叠的人胰岛素，然后再通过反相HPLC纯化。利用N端序列分析、分子量测定以及肽图法确定如此产生的纯人胰岛素的性质。

与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：

1)本发明融合蛋白中的蛋白表达促进元件可促进融合蛋白的折叠。

2)本发明蛋白表达促进元件可提高可溶性融合蛋白的溶解性并降低融合蛋白的分子间相互作用，从而使融合蛋白能够在具有商业意义的高浓度下折叠。

3)制备目的肽过程中无需溴化氰裂解、氧化亚硫酸盐解以及相关纯化步骤。

4)制备目的肽过程中无需使用高浓度的硫醇或疏水性吸附树脂。

5)使目的肽免受微生物宿主的胞内降解。

6)目标蛋白的比重高(融合比增加)，融合蛋白中的(X)n或A1-(X)n可以被蛋白酶消化成小片段，和目的蛋白相比分子量差别大，容易分离。

7)本发明融合蛋白可促进目的肽的表达，目的肽的表达水平和产率显著提高。

8)本发明融合蛋白非常适合表达带有非天然氨基酸目的肽，可明显促进带有非天然氨基酸目的肽的折叠。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中以人胰岛素作为目的肽为例，但不限于此。

实施例1构建表达载体A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS

表达构建体A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS含有编码人胰岛素蛋白的基因，所述蛋白与A1-u4-u5的C末端融合。在A1-u4-u5和胰岛素蛋白MiniINS之间的连接肽是八肽Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly-Arg。该八肽既可以在Arg羧基端被胰蛋白酶水解，也可以在Gln-Gly之间被TEV蛋白酶水解。该八肽的DNA序列进行了密码子优化，可以实现功能蛋白在大肠杆菌中的高水平表达。

所用融合重组蛋白片段均由金斯瑞公司合成并装入pUC57载体，使用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ将“A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS”从合成载体“pUC57-A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS”上切下，同时使用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ将表达载体“pBAD/His A(KanaR)”切开，酶切产物通过琼脂糖电泳进行分离，再使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行提取，最后使用T4DNA连接酶将两个DNA片段连接起来。将所述连接产物转化至大肠杆菌Top10细胞，将所述转化的细胞培养在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl，1.5％琼脂)上过夜。挑取3个活菌落，在5mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl)中过夜培养，使用质粒小量提取试剂盒进行质粒提取。然后，对所提取的质粒进行测序。最终得到的质粒被命名为“pBAD-A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS”，质粒图谱与融合蛋白示意图分别见图2与图3。

实施例2构建表达构建体A1-u4-u5-TEV-R-GLP1

如实施例1方法构建并合成pUC57-A1-u4-u5-TEV-R-GLP1，同时使用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ将表达载体“pBAD/His A(KanaR)”切开，酶切产物通过琼脂糖电泳进行分离，再使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行提取，最后使用T4DNA连接酶将两个DNA片段连接起来。将所述连接产物以化学法转化至大肠杆菌Top10细胞，将所述转化的细胞培养在含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl，1.5％琼脂)上过夜。挑取3个活菌落，在5mL含有50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基(10g/L酵母蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L NaCl)中过夜培养，使用质粒小量提取试剂盒进行质粒提取。然后，将所述提取的质粒使用测序寡核苷酸引物5’-ATGCCATAGCATTTTTATCC-3’进行测序，以确认正确插入。最终得到的质粒被命名为“pBAD-A1-u4-u5-TEV-R-GLP1”。

实施例3 A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达、分离与纯化

为了表达含有SEQ ID NO.:21的氨基酸序列的A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS的融合片段。将经测序确认的质粒pBAD-A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS和吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶质粒pEvol-pylRs-pylT(其中，吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶质粒pEvol-pylRs-pylT用来表达氨酰tRNA合成酶和tRNA，如专利申请号2011103886241的实施例1所示)一起转化到大肠杆菌菌株Top10中。将转化液在含有25μg/mL的卡那霉素和17μg/mL的氯霉素的LB琼脂培养基上中过夜。挑取单菌落，在含有25μg/mL的卡那霉素和17μg/mL的氯霉素的LB液体培养基中培养过夜。然后，将所述过夜培养物接种到含有25μg/mL的卡那霉素和17μg/mL的氯霉素的100mL TB培养基(液体TB培养基：12g/L酵母蛋白胨，24g/L酵母浸粉，4mL/L甘油，4％KPP，0.3‰消泡剂。KPP溶液：23.1g/L KH₂PO4，125.4g/L无水K₂HPO4)中，并于37℃培养，直到OD₆₀₀为2～4。然后，向所述培养基中加入25％的阿拉伯糖溶液至0.25％的终浓度，并加入0.1M的叔丁氧羰基赖氨酸(BOC-赖氨酸，BOC结构如图4所示)溶液至5mM的终浓度，以诱导所述融合蛋白的表达。将所述培养液继续培养16～20h，然后离心(10000rpm，5min，4℃)收集。

A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS融合蛋白是以不可溶的“包涵体”形式表达。为释放包涵体，用高压均质机将大肠杆菌细胞破碎。通过10000g离心法去除核酸、细胞碎片和可溶性蛋白。用纯水洗涤含有A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS融合蛋白的包涵体，所得的包涵体沉淀用作折叠的原材料。该融合蛋白的最终表达水平为14g/L发酵液。融合蛋白的SDS-PAGE图谱见图5。从图5中可以看出该融合蛋白所表达出的目的蛋白都能完整的表达出来，且没有断裂，插入非天然氨基酸目的蛋白的融合蛋也能完整的表达，没有断裂。

为了使融合蛋白重折叠，将包涵体溶解于pH 10.5并含有2～10mM巯基乙醇的7.5M脲溶液中，使溶解后总蛋白的浓度为10～25mg/mL。将样品稀释5～10倍，在4～8℃，pH为10.5～11.7的条件下进行常规折叠16～30小时。于18～25℃下,pH值维持在8.0～9.5，用胰蛋白酶和羧肽酶B将融合蛋白酶解10～20小时，然后加入0.45M硫酸铵终止酶解反应。反相HPLC分析结果表明，该酶解步骤的收率高于90％。胰蛋白酶与羧肽酶B酶解后获得的胰岛素类似物被命名为BOC-人胰岛素。Boc-人胰岛素在上述条件下不能被酶解。通过膜过滤澄清样品，以0.45mM硫酸铵作为缓冲液，经疏水层析初纯化Boc-人胰岛素，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度达90％。每1升发酵液最终得到的BOC-人胰岛素的产量约为2.1g。并且对获得的Boc-人胰岛素进行MALDI-TOF质谱分析，结果检测出其分子量与理论分子量5907.7Da相符合。经疏水层析洗脱收集样品，加入盐酸进行Boc-人胰岛素脱保护反应，加入氢氧化钠溶液控制pH为2.8～3.2以终止反应，再经两步高压反相层析，重组人胰岛素的得率高于85％。每1升发酵液最终得到的重组人胰岛素的产量约为700mg。

实施例4 pBAD-A1-u8-TEV-R-MiniINS表达构建体的构建及A1-u8-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达、分离与纯化

实验方法同实施例1-3，将A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS中的A1-u4-u5(SEQ ID NO.:16)替换为A1-u8(SEQ ID NO.:23)，构建得到命名为pBAD-A1-u8-TEV-R-MiniINS的重组质粒，依法表达出A1-u8-TEV-R-MiniINS融合蛋白(图5)。最终得到的BOC-人胰岛素的产量约为1.9g/L。并且对获得的Boc-人胰岛素进行MALDI-TOF质谱分析，结果检测出其分子量与理论分子量相符合。

实施例5 pBAD-A1-u3-u5-u7-TEV-R-MiniINS表达构建体的构建及A1-u3-u5-u7-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达、分离与纯化

实验方法同实施例1-3，将A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS中的A1-u4-u5(SEQ ID NO.:16)替换为A1-u3-u5-u7(SEQ ID NO.:15)，构建得到命名为pBAD-A1-u3-u5-u7-TEV-R-MiniINS的重组质粒，依法表达出A1-u3-u5-u7-TEV-R-MiniINS融合蛋白。最终得到的BOC-人胰岛素的产量约为2.0g/L。并且对获得的Boc-人胰岛素进行MALDI-TOF质谱分析，结果检测出其分子量与理论分子量相符合。

实施例6 pBAD-A1-u5-EK-u6-TEV-R-MiniINS表达构建体的构建及A1-u5-EK-u6-TEV-R-MiniINS融合蛋白的表达、分离与纯化

实验方法同实施例1-3，将A1-u4-u5-TEV-R-MiniINS中的A1-u4-u5(SEQ ID NO.:16)替换为A1-u5-EK-u6(SEQ ID NO.:22)，其中EK为EK酶酶切位点DDDDK(SEQ ID NO.:25)。构建得到命名为pBAD-A1-u5-EK-u6-TEV-R-MiniINS的重组质粒，依法表达出A1-u5-EK-u6-TEV-R-MiniINS融合蛋白。最终得到的BOC-人胰岛素的产量约为1.9g/L。并且对获得的Boc-人胰岛素进行MALDI-TOF质谱分析，结果检测出其分子量与理论分子量相符合。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 宁波鲲鹏生物科技有限公司

<120> 含有荧光蛋白片段的融合蛋白及其用途

<130> P2018-1747

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe

1 5 10

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln

1 5 10

<210> 8

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp

1 5 10

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp

1 5 10

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val

1 5 10

<210> 13

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Ala Gly

225 230 235 240

Ser

<210> 14

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Val Gln

1 5 10 15

Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly

20 25

<210> 15

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Lys Leu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Phe Ile Cys Thr Thr Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe

20 25 30

Glu Gly Asp His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln

35 40 45

<210> 16

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Tyr Val Gln Glu

1 5 10 15

Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys

20 25 30

Phe Glu Gly Asp

35

<210> 17

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Gln Leu Ala

1 5 10 15

Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly

20 25

<210> 18

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Arg

1 5

<210> 19

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg

20 25 30

Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro

35 40 45

Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys

50 55 60

Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln

65 70 75 80

Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

85

<210> 20

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

1 5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly

20 25 30

Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu

35 40 45

Asn Tyr Cys Asn

50

<210> 21

<211> 96

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Tyr Val Gln Glu

1 5 10 15

Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys

20 25 30

Phe Glu Gly Asp Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Arg Phe Val Asn Gln

35 40 45

His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly

50 55 60

Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln

65 70 75 80

Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn

85 90 95

<210> 22

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Thr Tyr Lys Thr

1 5 10 15

Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Asp Asp Asp Asp Lys Thr Leu

20 25 30

Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe

35 40

<210> 23

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Gly Ile Lys Ala

1 5 10 15

Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp

20 25

<210> 24

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val His Lys Phe Ser

1 5 10 15

Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Lys Leu Thr Leu Lys Phe

20 25 30

Ile Cys Thr Thr

35

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 26

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr

35 40 45

Thr

<210> 27

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 27

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr

35 40 45

Thr Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp

50 55 60

<210> 28

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 28

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Lys Leu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Phe Ile Cys Thr Thr Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe

35 40 45

<210> 29

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 29

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Tyr Val Gln Glu

1 5 10 15

Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys

20 25 30

Gln His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp

35 40 45

<210> 30

<211> 55

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 30

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Lys Leu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Phe Ile Cys Thr Thr Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys

20 25 30

Asp His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln His Tyr Leu Ser Thr

35 40 45

Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp

50 55

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 31

atgccatagc atttttatcc 20

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的结构如式I所示：

A1-(X)n-(L2-P2)t (I)

式中，

“-”为肽键，

各个P2各自独立地为第二目的肽；

并且，所述的P2各自独立地选自：赖脯胰岛素的前体蛋白、甘精胰岛素的前体蛋白、胰高血糖素样肽、或胰岛素原；

各个L2各自独立地为无或第二连接肽；

A1为如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列；

各X独立地为荧光蛋白的单个β-折叠单元；

t为1或2；

并且其中，所述的X选自下组：

所述(X)n为u8、u2-u3、u4-u5、u8-u9、u1-u2-u3、u2-u3-u4、u3-u4-u5、u5-u6-u7、u8-u9-u10、u3-u5-u7、u3-u4-u6、u3-I-u8、u5-I-u6；

其中，所述(X)n中的各X之间具有或不具有柔性接头I；

或者，所述(X)n为u1-EK-u2、u1-EK-u5、u2-EK-u4、u3-EK-u8、u5-EK-u6、或u10-EK-u11,其中EK为EK酶酶切位点。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述(X)n为u2-u3、u4-u5、u8-u9、u1-u2-u3、u2-u3-u4、u3-u4-u5、u5-u6-u7、u8-u9-u10、u3-u5-u7、u3-u4-u6、u3-I-u8或u5-I-u6。

3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，第二目的肽为带有非天然氨基酸的蛋白。

4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的(X)n为u8、u2-u3、u4-u5、u1-u2-u3、u2-u3-u4、u3-u4-u5、u5-u6-u7、u3-u5-u7、u3-u4-u6、u3-I-u8或u5-I-u6。

5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述(X)n为u1-EK-u2、u1-EK-u5、u2-EK-u4、u3-EK-u8、u5-EK-u6、或u10-EK-u11,其中EK为EK酶酶切位点。

6.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述A1-(X)n的氨基酸序列如SEQ IDNO.:15、16、23、24、26、或28所示。

7.如权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述A1-(X)n的氨基酸序列如SEQ IDNO.:16、23、或15所示。

8.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，第二连接肽含有第二酶切位点。

9.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的任意两个β-折叠单元之间具有柔性接头I，且所述的柔性接头I中含有第三酶切位点。

10.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述EK酶酶切位点的氨基酸序列为DDDDK。

11.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二连接肽含有胰蛋白酶酶切位点。

12.如权利要求11所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二连接肽含有至少一个精氨酸或赖氨酸。

13.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二连接肽的C末端的氨基酸为Arg。

14.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二连接肽的N末端的氨基酸为Arg或Lys。

15.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二连接肽的氨基酸序列还含有烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列。

16.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二连接肽的氨基酸序列如SEQID NO.:18所示。

17.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二连接肽的氨基酸序列还含有协助表达和/或纯化的标签序列。

18.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的P2为：人胰岛素前体蛋白、赖脯胰岛素的前体蛋白、甘精胰岛素的前体蛋白。

19.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的P2为胰高血糖素样肽。

20.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的P2为胰岛素原。

21.如权利要求20所述的融合蛋白，其特征在于，所述的胰岛素原的第29位的赖氨酸为炔基氧羰基赖氨酸衍生物、BOC-赖氨酸衍生物或脂肪酰化赖氨酸。

22.如权利要求20所述的融合蛋白，其特征在于，所述的胰岛素原的氨基酸序列如SEQID NO:19或20所示。

23.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述目的肽P2位于所述(X)n的C端。

24.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白经酶切后，形成第二目的肽。

25.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的结构选自下组：A1-u8-L2-P2、A1-u4-u5-L2-P2、或A1-u3-u5-u7-L2-P2。

26.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.:21所示。

27.一种分离的寡聚核苷酸，其特征在于，所述寡聚核苷酸编码权利要求1所述的融合蛋白。

28.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求27所述的寡聚核苷酸。

29.如权利要求28所述的载体，其特征在于，所述的载体为质粒。

30.如权利要求29所述的载体，其特征在于，所述的载体为pBAD-HisA载体和/或pEvol-pBpF载体。

31.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求28所述的载体、或染色体中整合有外源的权利要求27所述的寡聚核苷酸；其中，所述的宿主细胞为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、或哺乳动物细胞。

32.一种制备蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)培养权利要求31所述的宿主细胞，从而得到权利要求1所述的融合蛋白。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：(b)纯化步骤(a)中得到的融合蛋白。

34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对如权利要求1所述的融合蛋白进行蛋白水解消化，以从所述融合蛋白释放所述目的肽。

35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述纯化包括对所述的目的肽通过凝胶过滤或HPLC进一步纯化。

36.如权利要求1所述的融合蛋白、或权利要求27所述的寡聚核苷酸、或权利要求28所述的载体、或权利要求31所述的宿主细胞的用途，其特征在于，用于表达制备目的多肽。