CN107216281A - 一种含氰基双光子荧光染料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含氰基双光子荧光染料及其制备方法和应用，其结构通式如(I)所示，其中R表示氢、烷基、羟烷基或醚基，先将咔唑卤代反应在氮上引入R基生成取代咔唑，再使取代咔唑与N,N‑二甲基甲酰胺发生维尔斯迈尔反应得到3,6‑二甲酰基‑9‑乙基咔唑中间体，将3,6‑二甲酰基‑9‑乙基咔唑中间体与(4‑氰基苄基)亚磷酸二乙酯发生迈克尔加成反应制得。本发明含氰基双光子荧光染料能应用在对活细胞染色进行荧光成像中，不仅具备不错的双光子荧光活性吸收截面和优良的细胞膜通透性，同时还具有显色强、光稳定性好、毒性低的特点。

Description

一种含氰基双光子荧光染料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种荧光染料，特别涉及一种含氰基双光子荧光染料，可用于活细胞成像。
背景技术
近年来，双光子显微镜的发展已经彻底改变了对组织器官特别是厚的或高散射标本的观测。双光子荧光显微成像兼具诸如近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高分辨率、降低生物组织吸光系数及自发荧光干扰等特点而显著地优于单光子荧光显微成像。双光子荧光成像技术具有近红外激光激发、光毒性小和光漂白、自发荧光干扰弱及组织穿透深度大等优点，在生命科学研究领域应用前景广阔。然而，传统有机荧光染料双光子吸收截面(Two-photon absorption cross-sections，σ)小、双光子激发发光亮度(Two-photon excitation brightness,σ×φ,其中φ为发光量子产率)低，难以实现活细胞或深层组织高质量双光子荧光成像，这大大阻碍了双光子荧光显微成像技术的发展。开发双光子激发作用截面大、双光子激发发光亮度高、生物相容性好的新型高效双光子荧光探针，是提高双光子荧光成像质量、拓展双光子荧光成像应用范围的关键。因此，双光子荧光染料的结构设计与合成已逐渐成为当前研究的焦点。
目前，用于细胞成像的双光子荧光染料日益丰富，但含有双氰基的双光子荧光染料的开发却相对滞后。在已报道的含双氰基的荧光染料中多为苯乙烯衍生物其双光子性能依然存在诸多不足，例如专利CN101037541A报道了一类以二苯乙烯为母体的双氰基双光子荧光染料，但专利中并未阐述其在活细胞成像方面的应用。因此，在活细胞荧光成像检测方面，依然缺乏优良的双氰基荧光染料。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足而提供一种含氰基双光子荧光染料，该染料具有膜通透性好、显色强、光稳定性好、毒性低的特点。
本发明还提供该种含氰基双光子荧光染料的制备方法和应用。
本发明采取的技术方案为：
一种含氰基双光子荧光染料，其结构通式如(I)所示：
其中：上述R表示氢、烷基、羟烷基或醚基。
上述结构通式中，R优选氢、C1-12的烷基、C1-12的羟烷基或乙醚基。
上述的R最优选乙基，即含氰基双光子荧光染料为3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑。
上述含氰基双光子荧光染料的制备方法，包括步骤如下：
先将咔唑卤代反应在氮上引入R基生成取代咔唑，再使取代咔唑与N,N-二甲基甲酰胺发生vilsmeier(维尔斯迈尔)反应得到3,6-二甲酰基-9-乙基咔唑中间体，将3,6-二甲酰基-9-乙基咔唑中间体与(4-氰基苄基)亚磷酸二乙酯发生Michael(迈克尔)加成反应生成氰基双光子荧光染料。
上述的维尔斯迈尔反应是先在0℃向部分N,N-二甲基甲酰胺中滴加三氯氧磷搅拌至待有白色沉淀生成后，将溶解在另一部分N,N-二甲基甲酰胺中的取代咔唑加入到其中，升温至100℃，搅拌反应20-35h。N,N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷及取代咔唑的物质的量比为36～39:18～19.5:1。前后两部分所用N,N-二甲基甲酰胺的物质的量比在1～1.1：1。
所述的3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的制备反应式如图1所示。
本发明含氰基双光子荧光染料在对活细胞染色进行荧光成像中的应用。所述的活细胞优选活性Hela细胞。
利用本发明所述含氰基双光子荧光染料标记后的双光子荧光图像显示，染料能很好的穿透活Hela细胞的胞膜进入细胞从而使细胞质呈现出明亮的绿色荧光，证明了本发明所述双光子荧光染料具有优良的细胞膜通透性和双光子荧光成像性能。本发明制备的含氰基双光子荧光染料具备不错的双光子荧光活性吸收截面(12.56GM)和优良的细胞膜通透性，同时还具有显色强、光稳定性好、毒性低的特点，实现了活细胞的双光子成像。与此同时，它还可以在不影响其共轭结构的前提下对其进行具有靶向性的双光子生物探针改造，从而可进一步开发为相应的生理、病理学研究用生物检测试剂。
附图说明
图1为3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的制备反应式；
图2为3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑在不同溶剂中的紫外吸收光谱图；
图3为3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑在不同溶剂中的单光子荧光光谱图；
图4为3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑在不同溶剂中的双光子荧光光谱图；
图5为3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑对活性Hela细胞进行染色在800纳米激光辐照下得到的双光子荧光照片，a为染料在细胞内的荧光成像，b是细胞的微分干涉(DIC)成像，c为a和b的叠加图像(共定位图)。
具体实施方式
下面结合优选的具体实施例进一步说明。
实施例1
含氰基双光子荧光染料(3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑)的制备：
(1)9-乙基咔唑的合成
室温下，将氢氧化钾28g 500mmol溶解在60ml的丙酮中，搅拌反应30min，咔唑13.2g80mmol加入到上述反应液中，继续搅拌反应4h。将溴乙烷120mmol缓慢滴加到上述反应液中，搅拌反应过夜。将反应液倒入200ml的冰水中，有黄色沉淀析出，过滤，乙醇重结晶得到白色针状产品8.2g，产率52.6％。1HNMR(400MHZ)：8.11(d,J＝7.2,2H),7.48-7.41(m,4H),7.24(d,J＝9.2,2H),4.38(d,J＝6.8,2H),1.52-1.42(m,3H)；
(2)3,6-二甲酰基-9-乙基咔唑的合成
将22ml 0.3mol DMF加入到250ml的三口瓶中，降温至0℃，三氯氧磷28ml 0.3mol逐滴加入到上述反应液中，搅拌30min，待有白色沉淀生成后将溶解在20ml DMF中的3.15g16mmol N-乙基咔唑加入到反应液中，升温至100℃，搅拌反应30h后冷却至室温，将反应液倒入200ml的冰水中，氢氧化钠调节pH至8，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，硅胶担载柱分离，得淡黄色固体2.1g产率52.3％。1HNMR(400MHZ)：10.11(s,2H)8.92(s,2H)8.08(d,J＝8.0,2H)7.91(d,J＝8.0,2H)4.59(d,J＝6.4,2H)1.37(s,3H)；
(3)3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的合成
无水无氧的条件下，取1.0g 3.98mmol 3,6-二甲酰基-9-乙基咔唑及(4-氰基苄基)亚磷酸二乙酯2.5g 9.88mmol置于50ml的三口瓶中，加入20ml的无水THF溶解，然后将1.6g叔丁醇钾溶解在10ml无水THF中，缓慢滴加到上述反应液中，室温下搅拌反应24h，将反应液倒入100ml水中，乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，硅胶担载柱分离，得黄绿色固体1.2g产率67.2％。1HNMR(400MHZ)：8.48(s,2H)7.81-7.86(m,10H)7.66(t,J＝9.2,4H)7.38(d,J＝16.4,2H)4.47(d,J＝6.8,2H)1.35(t,J＝6.4,3H)。
实施例2
含氰基双光子荧光染料(3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙醚基咔唑)的制备：
(1)9-乙醚基咔唑的合成
室温下，将氢氧化钾28g 500mmol溶解在60ml的丙酮中，搅拌反应30min，咔唑13.2g 80mmol加入到上述反应液中，继续搅拌反应4h。将2-溴乙基乙基醚120mmol缓慢滴加到上述反应液中，搅拌反应过夜。将反应液倒入200ml的冰水中，有黄色沉淀析出，过滤，乙醇重结晶得到白色针状产品9.8g，产率51.3％。1HNMR(400MHZ)：8.38(d,J＝1.6,1H)8.19(d,J＝7.6,1H)7.54-7.63(m,3H)7.45-7.49(m,1H)7.22(t,J＝7.2,2H)4.52(t,J＝5.6,2H)3.71(t,J＝5.2,2H)3.29-3.35(m,2H)0.93(t,J＝6.8,3H)
(2)3,6-二甲酰基-9-乙醚基咔唑的合成
将22ml 0.3mol DMF加入到250ml的三口瓶中，降温至0℃，三氯氧磷28ml 0.3mol逐滴加入到上述反应液中，搅拌30min，待有白色沉淀生成后将溶解在20ml DMF中的3.82g16mmol N-乙醚基咔唑加入到反应液中，升温至100℃，搅拌反应30h后冷却至室温，将反应液倒入200ml的冰水中，氢氧化钠调节pH至8，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，硅胶担载柱分离，得淡黄色固体2.8g产率59.3％。1HNMR(400MHZ)：10.06(s,2H)8.82(d,J＝0.8,1H)8.55(d,J＝1.6,1H)7.99-8.02(m,1H)7.81(d,J＝8.8,1H)7.64-7.72(m,2H)4.63(t,J＝4.8,2H)3.75(t,J＝5.2,2H)3.31-3.36(m,2H)0.92(t,J＝6.8,3H)；
(3)3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙醚基咔唑的合成
无水无氧的条件下，取1.17g 3.98mmol 3,6-二甲酰基-9-乙醚基咔唑及(4-氰基苄基)亚磷酸二乙酯2.5g 9.88mmol置于50ml的三口瓶中，加入20ml的无水THF溶解，然后将1.6g叔丁醇钾溶解在10ml无水THF中，缓慢滴加到上述反应液中，室温下搅拌反应24h，将反应液倒入100ml水中，乙酸乙酯萃取，硫酸镁干燥，硅胶担载柱分离，得黄绿色固体1.6g产率81.5％。
光学性质的测定试验：
本发明所述含氰基双光子荧光染料在二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EA)、乙醇(EtOH)、乙腈(ACN)、二甲亚砜(DMSO)和磷酸缓冲盐溶液(PBS)等不同溶剂中的光学性质。在测定3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑的紫外吸收、单光子荧光及双光子荧光光谱的过程中，染料分子在不同溶剂DCM、EA、EtOH、ACN、DMSO和PBS中的浓度均为1×10-5mol/L；参比溶液为pH＝13的荧光素水溶液，浓度为2×10-6mol/L；测试结果见表1和附图2-4。
(1)染料的紫外吸收性质
染料在不同溶剂中的紫外吸收都同时呈现出两个相似的特征吸收带。首先在330nm左右的吸收，可能源于探针分子中的取代咔唑通过双键与苯环相连形成的共轭大π键，在光的照射下所产生的π→π*跃迁；而在390nm左右的吸收带，则源于氰基氮原子上的孤电子对与苯环π电子共轭形成的n→π*跃迁。
溶剂对染料吸收光谱的影响较为复杂，一方面在非质子性有机溶剂DCM、EA、和ACN中，最大吸收波长λamax随着溶液极性的增加而逐渐蓝移，对于这种反溶剂化效应有的研究者认为当极性增大到一定程度时，溶质和溶剂分子相互作用在局域内形成电场，使得基态相对稳定，从而相对增大了基态和激发态间的能量，使吸收峰蓝移，而在DMSO中可能由于DMSO(V＝2.24cp)的高粘度使得探针的最大吸收峰与DCM(V＝0.44cp)相比出现了轻微的红移；在质子性溶剂乙醇中，由于探针分子中的氰基CN能与乙醇中的羟基OH形成氢键CN┈H–O，从而导致探针最大吸收峰的红移现象的发生。另一方面，与在DMSO(λamax＝398nm)等有机溶剂中的最大吸收峰相比，探针分子在PBS水相中最大吸收峰(λamax＝327nm)出现较大蓝移，而且吸收带变平滑，同时伴有明显的减色效应。
(2)染料的单光子荧光性质
对比染料在不同溶剂中的单光子荧光光谱可以看出，在EA中染料分子的最大发射波长λemax出现在449nm处，与极性相对较弱的DCM相比轻微的蓝移，而荧光强度则达到最大值。另一方面，在DCM、EtOH、ACN、DMSO和PBS中，染料的最大发射峰位置呈现出相同的变化趋势，即随着溶剂极性的增加，最大发射波长轻微红移，而荧光强度基本上随着溶剂极性的增加逐渐减弱，其中染料在DMSO中荧光强度反常的增强可能是由于DMSO的高粘度提高了Franck-Condon(夫兰克-康登)垂直跃迁的几率所致，随着粘度的增加，扭曲变化程度变小，热能损耗变小，从而使得荧光强度变大。染料在PBS水相中荧光量子产率最低只21.88％，在DMSO中荧光量子产率达到最大值86.02％，而在DCM(72.82％)、EA(68.72％)、EtOH(61.33％)和ACN(62.17％)等溶剂中的荧光量子产率却相差不大，并且随着溶剂极性的增加荧光量子产率基本呈现出降低的趋势。
(3)染料的双光子荧光性质
染料在不同溶剂中的双光子荧光峰与单光子荧光峰相比略微红移，这种红移现象可以用再吸收效应解释。由于染料分子的线性吸收峰的长波段区域与发射光谱短波段区域的重叠，染料在该区域发射的荧光有一部分会被它自身的基态分子所吸收，使其双光子荧光的最大吸收峰发生红移。另一方面，染料在DCM、EA、EtOH和ACN中的活性吸收截面分别为4.62GM、3.69GM、6.10GM和5.88GM，水相PBS中的双光子荧光强度最低，其活性吸收截面只有0.86GM；而在DMSO中染料分子具有最强的双光子荧光，相应的活性吸收截面约为在水相PBS中的15倍达到12.56GM。
表1 本发明染料在不同溶剂中的光谱数据
λamax为最大吸收波长；λemax为单光子最大发射波长；Фs为单光子量子产率；δS为双光子吸收截面；Фs*δS为双光子活性吸收截面。
毒性试验和成像观察：
(1)HeLa细胞培养
首先将HeLa细胞注入到含有双抗(青霉素和链霉素)和10％的小牛血清的伊格尔培养基(Eagle minimal essential medium)中，然后置于含有5％CO2的恒温(37℃)细胞培养箱中培养。当HeLa细胞在培养瓶中生长到对数期，再接片培养：用铬酸洗液浸泡盖玻片半小时，再依次分别用清水、超纯水冲洗三遍后，烘干，灭菌后放到无菌一次性培养皿中。将培养瓶中的培养液倒出后，细胞用PBS缓冲液冲洗三遍，再用1毫升浓度为0.25wt％的胰酶溶液消化3分钟，倒掉胰酶溶液，再加入少量培养基溶液，然后用移液枪鼓气吹打均匀，细胞计数，留取适当密度的细胞后，加入培养基，再次吹打均匀，然后将细胞加入到提前准备好的含有载玻片的培养皿中，把接种好的培养皿放到细胞培养箱中，待其贴壁生长。在CO2恒温细胞培养箱中培养12-36小时，待细胞密度达到50％-70％，即可用于细胞染色实验。
(2)3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑对HeLa细胞的染色。
将准备好的活细胞用4wt％的多聚甲醛溶液浸泡半小时，然后在室温下用0.5％Triton X-100溶液再处理2-3分钟，将细胞固定。
先将染料3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑配成1mM的DMSO母液，用5微摩尔染料染色HeLa细胞在恒温细胞培养箱中孵育30分钟，然后用D-Hans溶液洗去未进入细胞的多余的染料溶液，再加入几滴PBS溶液，把载玻片的细胞生长面朝下盖在培养皿的底片上，即可将培养皿放到荧光显微镜上进行荧光成像。
(3)3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑对HeLa细胞的细胞毒性实验。
首先采用细胞计数板来检测细胞浓度，滴一滴细胞培养液到含有四块16格1mm×1mm的大方格的计数板上，数一下每个方格上的细胞个数，取平均值n(细胞浓度为n/mm3)。将细胞的浓度控制在5000～50000个/mm3，然后对细胞培养液进行稀释，再放入96孔板培养。待96孔板中的细胞生长一天24h后，分别在2h、8h、12h和24h时在不同孔板中加入5微摩尔的染料3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑，然后在每个孔板中加入20微升浓度为5mg/ml的活细胞检测剂3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，再继续培养4小时。依次把孔板内的培养液吸去，再向每个空格中分别加入150微升DMSO，将孔板放到摇床上低速振荡使结晶物得到充分的溶解。最后在酶标仪上读取各孔的吸光值(OD490nm)进行计算。对照孔(培养液、细胞、浓度相同的药物溶解介质、二甲基亚砜和MTT)调零孔(二甲基亚砜、培养基和MTT)。
细胞毒性实验结果由表2可以看出：HeLa细胞在含有5μM染料的培养基中孵育2h、8h、12h和24h后细胞的存活率。在染色2h以内，HeLa细胞的存活率89％左右，随着孵育染色时间的增长，细胞的存活率也在下降，24h时细胞的存活率为51％。所以当染色浓度为5μM染色时间为30min时，可以认为染料对细胞没有明显毒性。
表2.染料毒性实验数据
(4)3,6-双(4-乙烯基苯腈)-9-乙基咔唑染色HeLa细胞双光子成像观察
用上述染色的HeLa细胞做双光子荧光图像，用800纳米激光持续辐照，在双光子荧光显微镜下观察、记录细胞中的荧光分布等，结果见附图5，本发明所述荧光染料染色HeLa细胞，在800纳米激光持续辐照后，得到清晰的双光子荧光成像照片，本发明所述的荧光染料在活细胞细胞质区域具有清晰的绿色荧光成像，这表明本发明所述的荧光染料具有好的膜通透性和双光子荧光成像性能。
以上是结合具体实施例对本发明的详细介绍，本发明的保护范围不限于此。

Claims (8)

1.一种含氰基双光子荧光染料，其结构通式如(I)所示：
其中：上述R表示氢、烷基、羟烷基或醚基。
2.根据权利要求1所述的一种含氰基双光子荧光染料，其特征是，R为氢、C1-12的烷基、C1-12的羟烷基或乙醚基。
3.根据权利要求2所述的一种含氰基双光子荧光染料，其特征是，R为乙基。
4.权利要求1所述的一种含氰基双光子荧光染料的制备方法，其特征是，包括步骤如下：
先将咔唑卤代反应在氮上引入R基生成取代咔唑，再使取代咔唑与N,N-二甲基甲酰胺发生维尔斯迈尔反应得到3,6-二甲酰基-9-乙基咔唑中间体，将3,6-二甲酰基-9-乙基咔唑中间体与(4-氰基苄基)亚磷酸二乙酯发生迈克尔加成反应生成氰基双光子荧光染料。
5.根据权利要求4所述的一种含氰基双光子荧光染料的制备方法，其特征是，所述的维尔斯迈尔反应是先在0℃向部分N,N-二甲基甲酰胺中滴加三氯氧磷搅拌至待有白色沉淀生成后，将溶解在另一部分N,N-二甲基甲酰胺中的取代咔唑加入到其中，升温至100℃，搅拌反应20-35h。
6.根据权利要求5所述的一种含氰基双光子荧光染料的制备方法，其特征是，N,N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷及取代咔唑的物质的量比为36～39:18～19.5:1。
7.权利要求1-3任一项所述的含氰基双光子荧光染料在对活细胞染色进行荧光成像中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的活细胞选活性Hela细胞。
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