CN104450901B

CN104450901B - 快速诊断川崎病的核酸标记物及其试剂盒

Info

Publication number: CN104450901B
Application number: CN201410709423.0A
Authority: CN
Inventors: 贾红玲; 张弓; 刘超武; 张丽; 陈杰; 曾宏彬; 余旻斐
Original assignee: GUANGZHOU SAGENE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Hunan Saizhe Zhizao Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2016-09-21
Anticipated expiration: 2034-11-27
Also published as: CA2982486A1; WO2016082272A1; US20160333408A1; JP2017500894A; US9732388B2; CA2982486C; CN104450901A; JP6097457B2

Abstract

本发明公开了快速诊断川崎病的核酸标记物及其试剂盒，该核酸标记物为4种miRNAs，所述试剂盒中含有针对这4种miRNAs进行荧光定量PCR检测的引物；诊断川崎病就只需定量分析血清中exosome里的这4种miRNA含量，然后对这4种miRNA的Ct值进行特定的分析即可。本发明具有取材方便、操作简单、特异性强、时间花费少、快速准确、结果稳定等优点，能及时、快速、客观、准确诊断川崎病患儿，尤其是通过一次实验即可将川崎病与常见易混淆症状的病毒感染分开，有传统诊断方法所不具备的优势。因此，本发明对川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速诊断试剂盒提供了方向性。

Description

快速诊断川崎病的核酸标记物及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种快速诊断川崎病的核酸标记物及其试剂盒。

背景技术

川崎病( Kawasaki disease KD) 是一种病因不明的急性发热性全身性血管炎综合征，该病最早于1961年由日本学者Tomisaku Kawasaki在日本首次发现，并于1967年首先报道。自1970年以来，KD在世界绝大多数国家或地区被陆续报道，以亚裔人发病率为最高。近年来KD己成为小儿常见病之一，KD主要影响5岁以下婴幼儿，临床特征为发热、黏膜炎、皮疹、颈淋巴结肿大和肢端改变，病理变化主要为全身性中小动脉血管炎，尤其易造成冠状动脉炎性损伤及其所引起的血栓性梗塞、狭窄、扩张和动脉瘤的形成。其中有些患儿形成巨大冠状动脉瘤，巨大冠状动脉瘤长期存在，后期发展为冠状动脉狭窄与闭塞，导致缺血性心脏病，甚至引起死亡。此外，该病还可以导致心肌细胞肥大、局灶性心肌缺血，心肌纤维化及成人期的心肌梗死，重者可导致猝死。即使对形成冠状动脉瘤的KD患者进行了及时有效的针对性治疗，但仍有患者因形成巨大冠状动脉瘤造成死亡。有文献表明，冠状动脉扩张的发生率为18.6%～26.0%，冠状动脉瘤发生率为3.1%～5.2%，而且，冠状动脉瘤的发生率呈逐年上升趋势。冠状动脉瘤是KD最严重的并发症，冠状动脉瘤发生时血管内膜易形成血栓、血管内皮增生，造成临近冠状动脉管腔的狭窄。瘤内血液滞留，易形成血栓，从而导致邻近冠状动脉血流量减少，发生心肌梗死及猝死。若瘤的直径≥8 mm，则成为巨大瘤，消退就更加困难，且发生狭窄的几率随时间延长而明显增加。给患儿带来很大的风险并严重的影响了患儿的生活质量。而目前针对KD致冠状动脉瘤的主要治疗手段包括：长期抗凝治疗、溶栓治疗、外科冠状动脉搭桥术、心脏移植以及介入治疗，但都属于事后补救性的治疗措施，效果均不理想，除治疗费用昂贵外，治疗后患儿的生存质量亦无法保证。

报道显示，在日本和美国等发达国家或地区，KD所致的冠状动脉并发症已取代风湿热成为儿童获得性心脏病的第一位病因，并且成为成人后缺血性心脏病的主导因素之一。在我国，KD的发病率也很高，成为仅次于日本、韩国之后的第三大高发国，并且也已经取代风湿热成为我国小儿后天性心脏病最主要的病因，近年来亦呈现逐年上升的趋势，给我国儿童的心脏及血管健康带来很大的风险，造成巨大的经济和社会负担。

目前对KD的诊断包括临床指征、超声影像和实验室检查。临床上诊断KD，主要依照患儿的临床表现，待一系列典型体征出现后，并排除其他可能的疾病，方能诊断，时效性不佳。超声影像学检查方面，主要借助于超声心动图确诊冠状动脉病变，而对于KD患儿早期轻微冠状动脉病变，超声诊断则存在局限性。实验室检查主要采用全身炎性指标来辅助诊断小儿KD：急性期外周血白细胞及中性粒细胞增高、轻度贫血、血小板进行性增高、C反应蛋白明显增加及红细胞沉降率明显增快等。由于这些实验室指标是通过炎性指标来间接辅助诊断KD，故特异性和指向性均不理想。许多其他疾病尤其是感染性疾病也会产生全身炎症，故此传统诊断方案常与其他感染性疾病相混淆，贻误治疗时机。

近年来不典型KD临床诊断较为困难，不典型KD发生率约为10%～36%，且发病率逐年攀升，不典型KD临床表现也常呈多样性及复杂性，易误诊为呼吸道感染、败血症、药物疹、猩红热、麻疹、淋巴结炎、幼年型类风湿等疾病，易由于误诊或漏诊而错过最佳的治疗时间。因此，许多儿童在确诊KD时，冠状动脉损伤就已经形成了。

近年来，学者们一直在努力寻找KD早期诊断的标志物，因受KD病因和致病机制不清楚的限制，学者们大多数是从基因，细胞因子，炎性因子等入手，找到的生物标记物无法用来作为特异性的指标诊断KD，虽然，有些研究报道心肌型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、N端脑利钠肽原（NT-pro BNP）等一些蛋白和基因有可能作为诊断川崎病的分子标记物，但其灵敏度和特异性难以同时满足，且与检验者的取材手法、操作水平等相关，易造成误差，因此都未能得到较大临床队列的证实。到目前为止，仍未有一个公认指标和方法。因此，找到一种能快速准确诊断川崎病的分子标记物是非常重要的，能为临床治疗指明方向，可以避免冠状动脉病变的发生，改善预后，提高川崎病患儿的生存质量。

Exosome 是活细胞分泌的来源于晚期核内体( 也称为多囊泡体) 的囊泡,当多囊泡体与质膜融合就会把内含的囊泡释放到胞外。研究表明, 来源于不同细胞的exosome 含有源细胞最关键的功能分子。Exosome 是一种直径为30～100 nm 的小囊泡，可由多种细胞分泌，内含蛋白质、脂质以及微RNA 等成分。不同细胞来源的exosome 所含的蛋白质及微RNA不同，其生物学功能也有所差异，血液中的exosome 是一种密度很低的固相成分，被认为携带有丰富的生物标志物信息，因此，近年来受到普遍关注，在人体体液如血清、尿液、组织液等中被exosome的膜所包裹的RNA不会被核酸酶降解，而且不受白蛋白，IgG等高丰度蛋白的影响。由于来源于细胞，exosome所含的物质表征着细胞中的部分物质，也就给检测细胞内的某些蛋白质与核酸的变化带来了可能性。近年来，体液中的exosome在临床诊断中的意义日益被人们所重视,如癌症患者的血清中存在的能作为早期诊断数种癌症的microRNA分子标志物。此外，组学手段对病因未知的疾病寻找特异性分子标记提供了最佳的平台和技术。目前常用的组学范畴有基因组、转录组、蛋白组等，可以用一定的实验手段和数据分析方法研究样品中DNA、RNA或蛋白质的全体，通过对比来自正常个体和病人的样品数据，可望找到疾病特异性的分子标记物，为疾病早期诊断、病因分析、后续深入研究和治疗等提供重要基础。目前，这些方法已经在研究细胞的增殖、分化、异常转化、肿瘤形成等方面进行了有力的探索，涉及到肝癌、乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、前列腺癌、肺癌、肾癌和神经母细胞瘤等，鉴定了一批肿瘤相关蛋白，为肿瘤的早期诊断、药靶的发现、疗效判断和预后提供了重要依据。某些核酸分子亦可作为疾病诊断的分子标志物,临床诊断实践中，检测核酸标记物具有灵敏度高、特异性好、可精确定量的特点，很适合作为早期诊断的标志物。

成熟microRNA（miRNA）是一类长约17～25 个核苷酸的小分子非编码RNA，主要通过与靶mRNA的3’-非翻译区（UTR）、5’-UTR 和编码区域的碱基互补配对抑制靶mRNA 翻译，在转录后水平调控靶基因表达。生物信息学研究表明，每一个miRNA 可以调控多个靶基因,反之, 1 个靶基因也可以同时被多个miRNAs 调节。因此, 据保守估计, 约60%～70%的人类蛋白编码基因受到miRNAs 的调控,单个miRNA 分子能够与数百个功能各异的靶mRNA 相结合而发挥调节作用，参与了哺乳动物几乎所有的病理和生理活动，如个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等，与许多疾病的发生、发展存在着紧密的联系。

既往对miRNAs的研究主要集中于它们在细胞内的活动。2008年，Mitchell等通过分离健康人血浆中的18～24个核苷酸的RNA，构建了小RNA文库，对得到的125个DNA克隆进行测序分析，在所采用的血浆样本中克隆到包括let-7a、miR-16和miR-15b等在内的37种miRNA分子，并发现miRNAs能以一种非常稳定的形式存在于人体血浆中，以保护其免受内源性RNase的降解。同一时间，Chen 等通过高通量测序技术对血清中miRNA进行了分析，在男、女性健康人血清中分别发现了超过100和91种血清miRNA，且在恶劣的条件下（如高温、极低或极高的pH环境、多次冻融）仍能保持稳定，而此时大多数RNA 都会降解。此外，对正常人和不同疾病患者血清／血浆中miRNA检测结果发现miRNA广泛存在于正常人和患者的血清／血浆中，并且随着生理状况、疾病种类和病程的不同，miRNA的表达谱将发生特异性变化。最近有研究表明，不同的肿瘤显示出特异性的microRNA表达谱，肿瘤来源的microRNA能被释放到循环系统中，进入血液组织。而在血液组织中，microRNA能避免被RNase降解，具有良好的稳定性。因此，血清血浆中的microRNA有成为肿瘤生物标志物的潜力。例如，最近的研究发现在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的血清中miR-21的含量比正常人群高。由于研究发现在人类血清血浆中存在大量稳定的microRNA。血液中的Exosome被认为携带有丰富的生物标记物信息，来源于不同细胞的exosome 含有源细胞最关键的功能分子，因此，近年来，体液中的exosome在临床诊断中的意义日益被人们所重视。如癌症患者的血清中存在的能作为早期诊断数种癌症的microRNA分子标志物，这些现象表明，我们可以寻找川崎病患者血清exosome中表达量发生明显改变的microRNA，以此作为生物标记物进行川崎病的早期诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速诊断川崎病的核酸标记物。

本发明的另一目的在于提供一种快速诊断川崎病的试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

小分子RNA miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p联合作为川崎病快速检测的生物标记物的应用。

优选的，上述小分子RNA miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p为血清中Exosome小体内的miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p。

一种快速诊断川崎病的试剂盒，该试剂盒含有对血清中Exosome小体内miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p表达量进行定量检测的试剂。

优选的，上述试剂盒中含有针对miR-1246、 miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p进行荧光定量PCR检测的引物SEQ ID NO:9~16。

优选的，上述试剂盒中含有针对miR-1246、 miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p进行反转录的引物SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

本发明的有益效果是：

1）相对于传统川崎病的诊断如临床指征、超声影像和实验室检查等，本发明具有取材方便、操作简单、特异性强、时间花费少、快速准确、结果稳定等优点，能及时、快速、客观、准确诊断川崎病患儿，尤其是可以通过一次实验将川崎病与常见易混淆症状的病毒感染分开，有传统诊断方法所不具备的优势。因此，本发明对于川崎病患儿的快速诊断具有极大的临床应用价值，为进一步研制出在川崎病患儿上使用的快速诊断试剂盒提供了方向性。

2）本发明检测血浆/血清中的稳定的miRNA，而传统潜在分子诊断方案检测蛋白质，在定量测定方面，miRNA的定量精度和灵敏度非常高，使用qPCR技术甚至可以达到单分子检测的能力；而传统方法检测蛋白质，灵敏度较低，且定量精度较差。

3）传统潜在分子诊断方案是测定某蛋白质的绝对含量，与参考范围或标准品相比来得出检测结论。但绝对含量势必因为取样方法、提取效率、操作人员实验精准度等问题而产生偏差，影响检验的效果。本发明采用多个miRNA而并非单一指标来进行检验，比检测单一指标的可靠性高很多。而且本发明的检验方案是使用样品中几种miRNA进行自对照，完全消除了因为取样方法、提取效率、操作人员操作熟练程度等因素带来的误差，因而稳健性比传统方法好很多，便于低成本大规模推广应用。

附图说明

图1为健康孩子(Control)与KD患儿血清中exosome的特征:（A）透射电镜下所见健康孩子与KD患儿血清中exosome的形态特征；（B）电镜观察健康孩子与KD患儿血清中200 个exosome 的直径分布范围；（C）与血清（serum,S）相比，exosome(Ex)中三个标志性蛋白CD9，CD81和TSG101的含量检测(western blot)；

图2为5个健康孩子等量血清混合与5个KD患儿等量血清中exosome里microRNAMicroarray分析结果，仅列出上调或下调表达差异在200倍以上的miRNA，KD为KD患者，Control为正常者；

图3为5个合胞病毒感染患儿、5个腺病毒感染患儿与20个KD患儿和20个健康孩子血清中exosome里对microRNA Microarray结果进行荧光定量PCR验证，两两互作参照的t检验结果；(A) KD组与正常组对比；(B) 正常组与合胞病毒(RSV)感染组对比；(C) 正常组与腺病毒(ADV)感染组对比；

图4为检测效果的检验；采用荧光定量PCR方法检测8个合胞病毒感染患儿、2个腺病毒感染患儿和2个EB病毒感染患儿与30个KD患儿和30个健康孩子血清中exosome里4种microRNAs的含量，并以Ct(miR-1246)-Ct(miR-4436b-5p)差值和Ct(miR-197-3p) - Ct(miR-671-5p) 差值为两个轴向进行二维作图。黑点为健康孩子的数据，红叉为KD患儿数据，蓝色标记为各种病毒感染患儿的数据。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

在本发明中，KD患儿血清中exosome里的miR-1246表达量与miR-4436b-5p表达量的差值，及miR-197-3p表达量与miR-671-5p表达量的差值，与健康孩子相比，均发生了明显的改变，而且样本量越大，这种改变的趋势越明显，此外，由于川崎病最主要的症状是持续发烧，且体温超过39℃，所以为了能与其他发热性疾病区分开来，我们又把这两对miRNAs在发热性疾病（合胞病毒感染、腺病毒和EB病毒感染）患儿进行了特异性筛查，实验结果表明这两对miRNAs与发热性疾病的这两对miRNAs能明显区分，即说明这两对miRNAs：miR-1246与miR-4436b-5p，及miR-197-3p与miR-671-5p是川崎病特异性的分子标记物，通过分析血清中Exosome里Ct(miR-1246)-Ct(miR-4436b-5p)差值和Ct(miR-197-3p)- Ct(miR-671-5p)的差值情况，能快速准确诊断KD患儿，能将KD患儿与其他发热性疾病区分开来，这对KD患者的早期诊断具有显著的意义。

实施例1：快速诊断川崎病核酸标记物的筛选

一、初筛

（1）分别采集健康孩子和KD患儿血液500µl，4℃冰箱静置1-2 h，2000 rpm离心5min后，取出血清；

（2）按照exosome提取试剂盒(System Biosciences Inc,Mountain View,CA)说明，提取血清中的Exosome；

（3）在透射电镜下观察exosome的形态，确认其直径都在30-100nm之间（如图1A和图1B所示）。此外，用western Blot检测exosome的三个标志性蛋白CD9,CD81和TSG101的表达如图1C所示（Stamer WD,Hoffman EA, Luther JM, Hachey DL,,Schey K.L: Proteinprofile of exosomes from trabecular meshwork cells. J Proteomics 2011,74 (6):796-804和Street JM,

Barran PE, Mackay CL, Weidt S, Balmforth C, Walsh TS, Chalmers RT,Webb DJ, Dear JW: Identification and proteomic profiling of exosomes in humancerebrospinal fluid. J Transl Med 2012, 5;10:5. doi: 10.1186/1479-5876-10-5）；

（4）用Trizol试剂(Life Tech Inc,USA)提取exosome里的RNA，并对其进行浓度和纯度的测定；

（5）核酸标记物的初筛：通过上述分析方法，把5个健康孩子和5个川崎病患儿的等量混合血清中Exosome里的RNA进行microRNA Microarray分析，按照上调或下调表达差异＞200倍的标准，进行了microRNA的初筛，通过microRNA Microarray分析得到上调或下调表达差异明显的miRNAs（差异＞200倍），其中包括了miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p（见图2），该4种miRNA的核酸序列如表1所示。

表1 miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p的核酸序列

二、复筛

核酸标记物的复筛：随机选择5个合胞病毒（RSVRespiratory Syncytial Virus,RSV）感染患儿、5个腺病毒（Adenovirus，ADV）感染患儿与20个KD患儿和20个健康孩子的血清，提取血清中的exosome，对上述初筛出的miRNAs进行荧光定量PCR检测。

按常规方法逆转录获取cDNA，然后进行荧光定量PCR反应，具体操作如下：

（1）逆转录获得cDNA：

1）提取上述exosome中的RNA，作为模板，在去RNase的PCR管中加入RNA模板1.0µg和RNA free H₂O至总体积为8µL；

2）将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构，随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；

3）逆转录：

逆转录过程中，初筛出的miRNAs的特异性逆转录RT引物序列如表2所示（只给出了miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p的引物序列，其他的未给出）：

表2 miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p的特异性逆转录引物序列

在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：

10mM dNTP (promega) 2.0µl

RNase inhibitor (promega) 0.5µl

miR-1246-RT 0.5µl

miR-4436b-5p-RT 0.5µl

miR-197-3p-RT 0.5µl

miR-671-5p-RT 0.5µl

5x buffer 4µl

M-MLV (promega) 0.5µl

总体积 9µl；

4）将3）中的溶液加入到1）的溶液中，混匀后42℃孵育60min；

5）85℃孵育10min灭活逆转录酶，即可获得cDNA。

（2）荧光定量PCR

在荧光定量PCR中，初筛出的miRNAs的荧光定量PCR引物序列如表3所示（只给出了miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p的引物序列，其他的未给出）：

表3 miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p的荧光定量PCR引物序列

1）按以下反应体系对初筛出的miRNAs分别进行荧光定量PCR：

cDNA（1:20） 5.0µl

上游引物 0.5µl

下游引物 0.5µl

2x SYBR Green qPCR SuperMix 10µl

ddH₂O 4.0µl

总体积 20µl；

2）荧光定量PCR反应条件：50℃ 2min； 95℃ 2min； 95℃ 15s，60℃ 32s读板40循环；融解曲线分析：温度60℃～95℃。

然后对初筛的这些miRNAs的Ct值进行两两比较，互作参照，以消除因取样方法、操作误差等带来的误差。在两两比较过程中，发现Ct(miR-1246)-Ct (miR-4436b-5p)的差值在健康组Normal和川崎病组KD中具有显著差异(P<0.01)（图3A）；而在健康组和其他发热性疾病组中，如健康组Normal和合胞病毒感染组RSV（图3B）、及健康组Normal和腺病毒感染组ADV（图3C）中Ct(miR-1246)- Ct (miR-4436b-5p)的差值没有明显的差异。虽然Ct(miR-1246)- Ct (miR-328)的差值也具有效果差异，但Ct(miR-1246)-Ct(miR-328)的差异比Ct(miR-1246)-Ct(miR-4436b-5p)要小，P值较大，故不选用。

另外，在两两比较过程中，还发现Ct(miR-197-3p)- Ct (miR-671-5p)的差值在健康组Normal和川崎病组KD中不具有显著差异（图3A）；而在健康组和其他发热性疾病组中，如健康组Normal和合胞病毒感染组RSV（图3B）、及健康组Normal和腺病毒感染组ADV（图3C）中Ct(miR-197-3p)- Ct (miR-671-5p)的差值均有显著的差异（P<0.01）。

综上所述，选用Ct(miR-1246)-Ct (miR-4436b-5p)的差值和Ct(miR-197-3p)- Ct(miR-671-5p)的差值同时作为川崎病诊断的指标，可增加川崎病诊断（尤其是早期诊断）的稳健性和判定的准确度。

实施例2：快速诊断川崎病核酸标记物的验证

为了进一步确认实施例1中筛选出的4种miRNAs（miR-1246、miR-328、miR-197-3p和miR-671-5p）是否与KD的快速准确诊断密切相关，分别提取了30个健康孩子、30个KD患儿、8个合胞病毒RSV患儿、2个腺病毒ADV患儿、2个EB病毒患儿新鲜血清中exosome的RNA，这几组血清中exosome的RNA通过实施例1所述的荧光定量PCR检测，检测各组中miR-1246、miR-328、miR-197-3p和miR-671-5p的Ct值，并进行两两比较，互作参照，以消除因取样方法、操作误差等带来的误差。计算每个样品的Ct(miR-1246)-Ct(miR-4436b-5p)差值和Ct(miR-197-3p) - Ct(miR-671-5p)差值，并以这两个差值分别为X,Y坐标进行绘图。

结果如图4所示，实验结果显示正常组（黑色圆点）、KD组（“×”号）和病毒感染发热组（EB为“◇”号，RSV为“+”号，ADV为蓝色圆点）可以完全区分开。并且根据样本的统计，可初步获得知以下结论：假设x = Ct(miR-1246)-Ct(miR-4436b-5p), y = Ct(miR-197-3p)- Ct(miR-671-5p)；

(1) 若y≤-4.9 且 y≤-x+5.6时，则患有KD疾病；

(2) 若y＞-4.9且x≤10.2时，则为病毒性感染；

(3)若x＞10.2且y＞-x+5.6时，则为正常。

综上所述，血清中exosome内的miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p可以作为快速准确诊断川崎病患儿的分子标记物，可制备一种快速诊断川崎病的试剂盒，该试剂盒含有对血清中Exosome小体内miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p表达量进行定量检测的试剂，如含有针对miR-1246、 miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p进行荧光定量PCR检测的引物SEQ ID NO:9~16，还可以含有这4种miRNAs进行反转录的引物SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

实施例3：临床样品检测

另取临床血清样品80份，对其进行川崎病的快速诊断：

1）提取样品血清中exosome内的RNA，具体操作同实施例1所述；

2）对上一步提取的RNA进行逆转录，并定量检测exosome里的miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和 miR-671-5p，获得4 miRNA的Ct值，具体操作同实施例1所述，并对每个样品所测得的Ct值进行两两比较，互作参照，以消除因取样方法、操作误差等带来的误差；

3）计算每个样品中的x、y值：x = Ct(miR-1246)-Ct(miR-4436b-5p), y = Ct(miR-197-3p) - Ct(miR-671-5p)；

4）结果分析：(1) 若y≤-4.9 且 y≤-x+5.6时，则患有KD疾病；

(2) 若y＞-4.9且x≤10.2时，则为病毒性感染；

(3)若x＞10.2且y＞-x+5.6时，则为正常。

根据上述结果分析，本实施例的80份样品中，有35份为正常样品，无KD疾病和发热性病毒感染；有28份为患有KD疾病；有17份为发热性病毒感染，本发明的检测结果与临床上的检测结果（临床指征、超声影像和实验室检查等的结果）完全吻合，可见本发明的准确性高。

本发明提供的分子标记物miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和 miR-671-5p在用于快速准确诊断川崎病患儿与目前所使用的各种临床诊断方法相比，它是一种客观的评价方法，具有取材方便、操作简单、特异性强等优点，尤其是采用自对照方式，无需标准品，可完全消除因操作熟练程度、提取效率差异等因素导致的误差，因此本发明具有极大的临床应用的可能。故可以制备一种可定量检测miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和 miR-671-5p试剂盒，即可用于川崎病的诊断，一次实验即可将正常的、患有KD疾病的和发热性病毒感染完全分开，既解决了KD患者与正常者之间的判定问题，又可以完全排除与KD症状相似的发热性疾病对KD诊断的干扰。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

<110> 广州赛哲生物科技有限公司

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<213> 人

<400> 2

guccacuucu gccugcccug cc 22

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人

<400> 3

uucaccaccu ucuccaccca g 21

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 人

<400> 4

aggaagcccu ggaggggcug gag 23

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagcctg ctcc 44

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

gtcgtatcca gtgctgggtc cgagtgattc gcactggata cgacggcagg 50

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 7

ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgagagaa gtag 44

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 8

gtcgtatcca gtgctgggtc cgagtgattc gcactggata cgacctccag 50

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 9

acactccagc tgggaatgga tttttggagc 30

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 10

ctcaactggt gtcgtgga 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 11

agcccgtcca cttctgcc 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 12

cagtgctggg tccgagtga 19

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 13

acactccagc tgggttcacc accttctcca cc 32

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 14

ctcaactggt gtcgtgga 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 15

gccgagagga agccctgg 18

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 16

cagtgctggg tccgagtga 19

Claims

1.一种快速诊断川崎病的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有对血清中Exosome小体内miR-1246、miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p表达量进行定量检测的试剂。

2.根据权利要求1所述的一种快速诊断川崎病的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有针对miR-1246、 miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p进行荧光定量PCR检测的引物SEQID NO:9~16。

3.根据权利要求2所述的一种快速诊断川崎病的试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有针对miR-1246、 miR-4436b-5p、miR-197-3p和miR-671-5p进行反转录的引物SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。