CN103182076B - 一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽医生物新医药技术领域，涉及一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法。该疫苗所用菌种免疫原性好，采用1次单剂量2.0ml肌肉注射，免疫持续期可达6个月，能够有效预防猪肺炎支原体疾病发生。本发明解决了国内弱毒活疫苗操作复杂不易推广的问题，填补了国内自主研发猪支原体肺炎灭活疫苗的空白。

Description

一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于兽医生物新医药技术领域，涉及一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

猪支原体肺炎，又称猪喘气病或猪地方流行性肺炎，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病。患病猪的主要临床症状为咳嗽和气喘，体温基本正常，生长迟缓，饲料转化率低。剖检时，以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。该病存在于世界各地，其死亡率虽然不高，但由于流行的广泛性、长期性和消耗性，可使饲料转化率降低，并引起猪的多种并发病，是造成养猪业经济损失的最重要的疾病之一。

目前，该病的控制有改善饲养条件、药物治疗和疫苗免疫3种方式。改善饲养条件和药物治疗都不能根除该病的发生，且抗生素治疗存在耐药性问题，疫苗免疫是首选、有效的控制方式。国内自主研发的疫苗只有弱毒活疫苗，包括中国兽医药品监察所研制的兔肺冻干苗、乳兔肌肉冻干苗及鸡胚卵黄囊冻干苗，南京天邦和江苏省农科院共同研制的猪支原体肺炎168株活疫苗。弱毒活疫苗由于需要胸腔接种，所以不易于推广普及；国外已有多家兽药公司研发生产了猪支原体肺炎灭活疫苗，如梅里亚有限公司、美国先灵葆雅动物保健公司和美国富道公司等，均通过肌肉注射进行接种，易于操作，但其价格较 高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪支原体肺炎灭活疫苗，该疫苗免疫效果显著，能够有效预防猪肺炎支原体疾病发生，填补了国内自主研发猪支原体灭活疫苗空白，解决了弱毒活疫苗操作复杂、不易推广的问题。

本发明的另一目的是提供该猪支原体肺炎灭活疫苗的制备方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种猪支原体肺炎灭活疫苗，该疫苗所用的菌种为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株，菌种的保藏号为CGMCC No.4545，上述菌种经灭活后作为水相，佐剂作为油相，水相与油相按配比乳化而成。

其中，所述的佐剂为矿物油佐剂。

进一步，矿物油佐剂为白油、206佐剂、50V佐剂(即MontanideISA 50V佐剂)中的任一种。

本发明的猪支原体肺炎灭活疫苗中水相与油相按1∶1～1∶3体积配比进行乳化。

进一步，水相与油相按1∶1体积配比进行乳化。

本发明制备的疫苗每头份疫苗抗原含量不小于100ug。

进一步，每头份疫苗抗原含量为100～500ug。

更进一步，每头份疫苗抗原含量为300ug。

本发明免疫接种方式为每头猪1次肌肉注射2.0毫升，免疫期为 6个月；种猪群每半年重复接种一次。

本发明还提供了该猪支原体肺炎灭活疫苗的制备方法，其制备步骤如下：

(1)制备猪肺炎支原体DJ-166株菌液，培养至菌液pH值降至6.5～7.0；

A.菌液培养

按培养基量的8％～10％接种菌液，置37±1℃培养5～9日，待培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH值降至6.50～7.00之间收获菌液。

B.纯粹检验

按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。

C.CCU测定

将收获菌液接种液体培养基，并进行10倍系列稀释至10^-12，置37±1℃培养14日，活菌滴度应≥10⁸CCU/mL。

(2)将步骤(1)得到的菌液进行浓缩、纯化，并进行灭活；

A.浓缩、纯化

将菌液以10000r/min离心30分钟，弃掉上清液，沉淀菌体用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液悬浮，配制成为原培养物体积1/100菌悬液，-40℃保存。

B.灭活

经浓缩的菌液加入1.0％的硫柳汞溶液使其终浓度为0.01％，混合均匀，2～8℃放置12～24小时，期间振摇1～3次，然后在冰水浴上超声波裂解4～6次，每次1分钟，功率250～300W，超声5～8秒，间 歇5～8秒。

(3)将灭活后的菌液进行半成品检验，包括：无菌检验，灭活检验和蛋白浓度测定；

A.灭活检验

取5.0ml灭活菌液接种于45ml液体培养基，置37℃培养14日，观察培养基颜色变化。同时设未灭活菌液为阳性对照，液体培养基为阴性对照。培养5～7日，取出0.2ml接种固体培养基，置5％CO₂环境，37℃培养10日。液体培养基应无颜色变化，固体培养基上应无菌落生长为灭活完全。

B.无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌生长。

C.蛋白浓度测定

用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm波长下的吸收值，计算：蛋白浓度(mg/mL)＝1.45×OD_280-0.74×OD₂₆₀，OD₂₆₀/OD₂₈₀＜1.4。

(4)将步骤(3)得到的灭活后的菌液与佐剂按比例配比乳化，得到猪支原体肺炎灭活疫苗。

A.水相制备

将灭活菌液用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液稀释，每头份疫苗蛋白抗原含量应不低于100μg。

B.油相制备

将矿物油佐剂装入灭菌瓶内，在121℃灭菌30分钟，冷却后备用。

C.乳化

将水相与油相按1∶1～1∶3的体积比配比乳化。先将油相加入剪切机内，在低速搅拌的同时缓缓加入水相后，以10000r/min搅拌5～8分钟，即成乳白色油乳剂灭活疫苗。

有益效果：本发明的疫苗采用1次单剂量2.0ml肌肉注射，操作简便；该疫苗所用菌种免疫原性好，免疫持续期可达6个月，能够有效预防猪肺炎支原体疾病发生。本发明疫苗解决了国内弱毒活疫苗操作复杂、不易推广的问题，填补了国内自主研发猪支原体肺炎灭活疫苗的空白。

本发明疫苗所用的菌种猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)DJ-166株为申请人从山西养猪场35日龄二元杂交病猪肺脏组织分离得到，其免疫原性好。本发明的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株申请人已于2011年01月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.4545。

附图说明

图1抗体消长曲线图

具体实施方式

实施例1猪支原体肺炎灭活疫苗的制备

(1)菌(CGMCC No.4545)液制备

A.菌液培养

按培养基量10％比例接种猪肺炎支原体CGMCC No.4545菌液，置37±1℃培养5日，培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH值降至7.00收获菌液。

B.纯粹检验

按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。

C.CCU测定

取收获的菌液接种液体培养基，并进行10倍系列稀释至10^-10，置37±1℃培养14日，活菌滴度为10¹⁰CCU/ml。

D.浓缩、纯化

将菌液以10000r/min离心30分钟，弃掉上清液，沉淀菌体用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液悬浮，配制成为原培养物体积1/100菌悬液，-40℃保存。

E.灭活

经浓缩的菌液加入1.0％的硫柳汞溶液使其终浓度为0.01％，混合均匀，2～8℃放置12小时，期间振摇1次，然后在冰水浴上超声波裂解4次，每次1分钟(功率250～300W，超声5秒，间歇5秒)。

(2)半成品检验

A.灭活检验

取5.0ml灭活菌液接种于45ml液体培养基，置37℃培养14日，观察培养基颜色变化。同时设未灭活菌液为阳性对照，液体培养基为阴性对照。培养5～7日，取出0.2ml接种固体培养基，置5％CO₂环境，37℃培养10日。液体培养基应无颜色变化，固体培养基上应无 菌落生长为灭活完全。

B.无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌、霉菌生长。

C.蛋白浓度测定

用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm波长下的吸收值，计算：蛋白浓度(mg/mL)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀，OD₂₆₀/OD₂₈₀＜1.4。

(3)油乳剂灭活疫苗的配制

A.水相制备

将灭活菌液用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液稀释至蛋白浓度300μg/ml。

B.油相制备

将注射用白油装入灭菌瓶内，在121℃灭菌30分钟，冷却后备用。

C.乳化

将水相成分与油相成分按1∶1的体积比配比乳化。先将油相加入剪切机内，在低速搅拌的同时缓缓加入水相后，以10000r/min搅拌5～8分钟，即成乳白色油乳剂灭活疫苗。

实施例2猪支原体肺炎灭活疫苗的制备

(1)菌液制备

A.菌液培养

按培养基量的8％接种猪肺炎支原体CGMCC No.4545菌液，置37±1℃培养9日，待培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH值降至6.50收获菌液。

B.纯粹检验

按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。

C.CCU测定

取收获的菌液接种液体培养基，并进行10倍系列稀释至10^-10，置37±1℃培养14日，活菌滴度为10¹⁰CCU/ml。

D.浓缩

将菌液以10000r/min离心30分钟，弃掉上清液，沉淀菌体用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液悬浮，配制成为原培养物体积1/100的菌悬液，-40℃保存。

E.灭活

经浓缩、纯化的菌液加入1.0％的硫柳汞溶液使其终浓度为0.01％，混合均匀，2～8℃放置24小时，期间振摇3次，然后在冰水浴上超声波裂解6次，每次1分钟(功率250～300W，超声8秒，间歇8秒)。

(2)半成品检验

A.灭活检验

取5.0ml灭活菌液接种于45ml液体培养基，置37℃培养14日，观察培养基颜色变化。同时设未灭活菌液为阳性对照，液体培养基为阴性对照。培养5～7日，取出0.2ml接种固体培养基，置5％CO₂环境，37℃培养10日。液体培养基应无颜色变化，固体培养基上应无菌落生长为灭活完全。

B.无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌生长。

C.蛋白浓度测定

用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm波长下的吸收值，计算：蛋白浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀，OD₂₆₀/OD₂₈₀＜1.4。

(3)油乳剂灭活疫苗的配制

A.水相制备

将灭活菌液用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液稀释至蛋白浓度750μg/ml。

B.油相制备

将50V佐剂装入灭菌瓶内，在121℃灭菌30分钟，冷却后备用。

C.乳化

将水相成分与油相成分按1∶2的体积比配比乳化。先将油相加入剪切机内，在低速搅拌的同时缓缓加入水相后，以10000r/min搅拌5～8分钟，即成乳白色油乳剂灭活疫苗。

实施例3猪支原体肺炎灭活疫苗制备

(1)制苗用菌液制备

A.菌液培养

按培养基量的9％接种猪肺炎支原体CGMCC No.4545菌液，置37±1℃培养7日，培养基颜色变黄、呈轻度浑浊，pH值降至6.82收获菌液。

B.纯粹检验

按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。

C.CCU测定

取收获的菌液接种液体培养基，并进行10倍系列稀释至10^-10，置37±1℃培养14日，活菌滴度为10¹¹CCU/ml。

D.浓缩

将菌液以10000r/min离心30分钟，去掉上清液，沉淀菌体用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液悬浮，配制成为原培养物体积1/100菌悬液，-40℃保存。

E.灭活

经浓缩的菌液加入1.0％的硫柳汞溶液使其终浓度为0.01％，混合均匀，2～8℃放置18小时，期间振摇2次，然后在冰水浴上超声波裂解5次，每次1分钟(功率250～300W，超声6秒，间歇6秒)。

(2)半成品检验

A.灭活检验

取5.0ml灭活菌液接种于45ml液体培养基，置37℃培养14日，观察培养基颜色变化。同时设未灭活菌液为阳性对照，液体培养基为阴性对照。培养5～7日，取出0.2ml接种固体培养基，置5％CO₂环境，37℃培养10日。液体培养基应无颜色变化，固体培养基上应无菌落生长为灭活完全。

B.无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌、霉菌生长。

C.蛋白浓度测定

用紫外分光光度计检测样品在260nm和280nm波长下的吸收值，计算：蛋白浓度(mg/ml)＝1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀，OD₂₆₀/OD₂₈₀＜1.4。

(3)油乳剂灭活疫苗的配制

A.水相制备

将灭活菌液用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液稀释至蛋白浓度200μg/ml。

B.油相制备

将206佐剂装入灭菌瓶内，在121℃灭菌30分钟，冷却后备用。

C.乳化

将水相成分与油相成分按1∶3的体积比配比乳化。先将油相加入剪切机内，在低速搅拌的同时缓缓加入水相后，以10000r/min搅拌5～8分钟，即成乳白色油乳剂灭活疫苗。

实施例4疫苗成品检验

制备的3批疫苗，批号为20100901(实施例1制备)、20101005(实施例2制备)和20101106(实施例3制备)，进行性状检验、无菌检验、安全性检验、效力检验和硫柳汞残留量检验。

(1)性状检验

疫苗外观为油包水(O/W)型乳白色乳剂，久置后上层有少量油质，振摇后呈均匀乳状液。以3000r/min离心15分钟，管底部无水相析出，疫苗稳定性良好。

(2)无菌检验

制备的3批疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，均无细菌、霉菌生长。

(3)安全性检验

A.小白鼠安全性试验

制备的3批疫苗分别皮下注射18～22g小白鼠各8只，每只0.5ml，同时设对照组小白鼠8只，每只皮下注射生理盐水0.5ml，14日观察期内，小白鼠均全部健活，疫苗对非靶动物小白鼠使用安全。结果见表1。

表1 3批疫苗注射小白鼠安全性试验

B.仔猪安全性试验

制备的3批疫苗分别以单剂量(2.0ml)、超剂量(4.0ml)和重复注射剂量(2.0ml)分别注射2周龄健康易感猪各5头，同时设健康对照组猪5头，同条件下饲养。14日观察期内，对照组猪和免疫组均未见异常反应；体温均在正常范围内，精神状态良好，采食及饮水均未见异常，注射部位未见红肿、硬结，剖检注射部位，免疫组可见黍粒样结节，实质性脏器未见异常。疫苗对靶动物猪使用安全，见表2。

表2 3批疫苗注射仔猪临床症状及注射局部

注：“-”表示未见异常。

(4)效力检验

制备的3批疫苗分别肌肉注射猪肺炎支原体血清抗体阴性健康易感猪各10头，每头2.0ml，另设10头作为对照猪，同条件下隔离饲养。注射后28日，连同条件相同对照猪进行攻毒，并于攻毒后28日剖杀，按28分计分法记录猪肺炎病变分数，按下列公式计算肺炎病变减少率，结果见表3。

表3 3批疫苗免疫攻毒保护结果

注：“/”表示无此项计算。

从表3可以看出，免疫组肺炎病变得分显著低于攻毒对照组，平均肺炎病变率减少84.2％，疫苗效力合格。

(5)硫柳汞残留量检验

制备的3批疫苗，每批随机抽检5瓶疫苗，按现在《中国兽药典》附录进行检验，硫柳汞残留量均小于0.01％，符合兽用生物制品通则规定。

实施例5免疫持续期试验

制备的3批疫苗分别颈部肌肉注射2周龄健康易感猪各10头，每头2.0ml，同时，设攻毒对照猪10头。注射后第7日、14日、28日、42日、2个月、3个月、4个月、5个月和6个月采血，用ELISA方法检测血清中猪肺炎支原体抗体水平(表4和图1)，并于免疫后6个月进行攻毒，攻毒结果见表5。

表4免疫后不同时间平均抗体水平(S/P值)

表5免疫后6个月攻毒结果

注：“/”表示无此项计算。

疫苗免疫后14日血清抗体均为阳性，猪肺炎支原体抗体S/P值分别平均为1.18、1.30和1.16，免疫后42日～3个月达到高峰，之后抗体呈下降趋势，至6个月时抗体仍为阳性，S/P值平均为1.32、1.50和1.23；免疫后6个月攻毒，免疫组平均肺炎病变率减少了71.9％。免疫组与对照组比较，肺炎病变有显著改善。疫苗免疫效果显著，免疫期为6个月。

实施例6与同类产品免疫效果比较

与国内市场上销售的进口苗，分别颈部肌肉注射2周龄健康易感猪各10头，每头2.0ml，免疫后28日进行攻毒，并于攻毒后28日剖杀，按28分计分法记录猪肺炎病变分数，按公式计算肺炎病变减少 率，结果见表6。

表6免疫原性效果比较

注：“/”表示无相关数据。

从表6可以看出，本产品平均肺炎病变减少率分别为86.2％、87.1％和82.8％，均高于进口疫苗平均肺炎病变减少情况。

Claims (10)

1.一种猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于，菌种为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)DJ-166株，菌种的保藏号为CGMCC No.4545，上述菌种经灭活后作为水相，佐剂作为油相，水相与油相按配比乳化而成。

2.如权利要求1所述的猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于，所述的佐剂为矿物油佐剂。

3.如权利要求2所述的猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于，所述的矿物油佐剂为白油、206佐剂、50V佐剂中的任一种。

4.如权利要求1所述的猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于，水相与油相按1∶1～1∶3体积配比进行乳化。

5.如权利要求4所述的猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于，水相与油相按1∶1体积配比进行乳化。

6.如权利要求1所述的猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于，每头份疫苗抗原含量不小于100ug。

7.如权利要求6所述的猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于，每头份疫苗抗原含量为100～500ug。

8.如权利要求7所述的猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于，每头份疫苗抗原含量为300ug。

9.一种权利要求1-8任一项所述的猪支原体肺炎灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)制备猪肺炎支原体DJ-166株菌液，培养至菌液pH值降至6.5～7.0；

(2)将步骤(1)得到的菌液进行浓缩、纯化，并进行灭活；

(3)将灭活后的菌液进行半成品检验，包括：无菌检验，灭活检

验和蛋白浓度测定；

(4)将步骤(3)得到的灭活后的菌液与佐剂按比例配比乳化，得到猪支原体肺炎灭活疫苗。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，灭活方式为浓缩、纯化后的抗原加入终浓度0.01％硫柳汞溶液，混匀后2～8℃放置12～24小时，期间振摇1～3次，然后在冰水浴上超声波裂解4～6次，每次1分钟，功率250～300W，超声5～8秒，间歇5～8秒。