BR112020022294A2 - composição e uso de uma composição - Google Patents

Abstract

A invenção se refere a uma composição que compreende um RNA de fita dupla (dsRNA) possuindo duas fitas complementares, compreendendo pelo menos um bloco de poli A e o bloco complementar de poli U, cada fita possuindo um comprimento entre 50 e 200 bases, preferivelmente entre 55 e 200 bases, e um veículo, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável, para uso em um método de tratamento de um câncer que expressa um receptor TLR3.

Description

“COMPOSIÇÕES”

[001] A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo RNA de fita dupla curto e definido (dsRNA) possuindo duas fitas complementares, compreendendo uma fita que compreende pelo menos um bloco de um Poli A e uma fita complementar que compreende o bloco complementar de Poli U, e possivelmente formas quiméricas com outros nucleotídeos entre A, U, G, I ou C. Também se refere a tal composição para uso no tratamento de um câncer TLR3 positivo e a métodos de tratamento relacionados. Relaciona-se especificamente com dsRNA que atua como ligantes de TLR3 e ativa células epiteliais e mielóides.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O TLR3 é um receptor de reconhecimento de padrão expresso principalmente em endo-lisossomas que parece ser dedicado à detecção de infecção viral por meio da ligação de dsRNA. De fato, foi demonstrado que o dsRNA produzido por vírus como seu material genômico (vírus de dsRNA) ou como intermediários de seu ciclo de vida (vírus de ssRNA, vírus de DNA) ativa o TLR3. Além disso, verificou-se que vários dsRNA endógenos de vertebrados liberados durante a destruição do tecido ativam o TLR3. Além disso, o dsRNA sintético foi projetado para ativar o TLR3 também.

Eles incluem o Poli(I:C), Poli (A:U) e variantes dos mesmos, tais como PoliI: PoliC12U (Ampligen®).

[003] Experimentos extensivos com dsRNA, incluindo ensaios de ligação de TLR3 e ensaios de sinalização dependente de TLR3 com tipo selvagem e mutantes de TLR3, estudos de cristalografia com TLR3 ligado a dsRNA e análise in vivo de resposta de dsRNA em camundongos do tipo selvagem e TLR3-/- todos contribuíram para definir as características estruturais necessárias para ativar o TLR3 (Botos, I. et al., Biochim. Biophys. Acta 1789, 667-674, 2009). Ligantes agonistas para TLR3 são dsRNA com as seguintes características: (1) o dsRNA deve ser composto de ribose não modificada, que pode incluir inosinas; (2) a sequência exata não parece ser crucial; (3) um comprimento mínimo de aproximadamente 50 pb (48 Å) parece ser imposto pela distância entre os sítios de ligação de RNA nos domínios extracelulares de TLR3 nos homodímeros que representam as unidades de sinalização; (4) RNAs de fita simples que se dobram e formam a estrutura haste-alça também podem ativar o TLR3; (5) dsRNA deve primeiro ser internalizado de forma eficiente dentro das células, ou seja, através da ligação de receptores scavenger, antes de desencadear a dimerização de TLR3, que representa a primeira etapa de sinalização. Em contraste com Poli(A:U) que parece ser altamente específico para TLR3 em humanos, Poli(I:C) também se liga e ativa os receptores dsRNA citosólicos RIG-I, MDA5 e PKR.

[004] O benefício de direcionar TLR3 no câncer e outras doenças provavelmente resultará da ativação combinada de diferentes tipos de células, incluindo as células epiteliais, mielóides, mesenquimais e endoteliais. Embora as células humanas imunes e não imunes tenham demonstrado produzir citocinas inflamatórias, ou não, em resposta a Poli(I:C), presumiu-se que isso dependia, em humano, do tipo de célula em vez do próprio ligante de TLR3.

[005] São comercializadas composições compreendendo dsRNA direcionado a TLR3. Por exemplo, existem composições comerciais de Poli(A:U) que são misturas de dsRNA de comprimentos diferentes, e os comprimentos são normalmente da ordem de 200 a 8000 pares de bases.

[006] Um objetivo da invenção é produzir um dsRNA curto que seja eficiente na ativação de células mielóides e epiteliais e conduza à morte de células cancerosas. Mais particularmente, o objetivo é ter dsRNAs tão curtos capazes de ativar células mielóides e desencadear a morte de células cancerosas epiteliais.

[007] Outro objetivo é propor uma composição de dsRNA em que todas, senão todas as moléculas de dsRNA, tenham uma constituição predeterminada e sejam ativas, de modo que os requisitos de regulação da autoridade sejam mais facilmente alcançados do que com misturas indeterminadas, e as doses de dsRNA possam ser melhoradas.

[008] Ainda outro objetivo é propor dsRNA que não precise necessariamente de um agente de transfecção para penetrar nas células-alvo.

[009] Em um esforço para desenvolver novos ligantes de TLR3 clínicos para terapia, os inventores examinaram dsRNA definido, quanto à sua capacidade de ativar células mielóides e desencadear a morte de células cancerosas epiteliais, e foram capazes de delinear dsRNA capaz de responder a esses objetivos e outros.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[010] A presente invenção se refere a uma composição que compreende um dsRNA compreendendo pelo menos um bloco ou homopolímero de poli A e o bloco complementar de poli U de comprimento curto e determinado, em particular um dsRNA em que cada fita possui de 50 a 200 nucleotídeos ou bases. De preferência, o comprimento de cada fita está entre cerca de 55 e cerca de 100, 150 ou 200 bases, especialmente entre cerca de 60 e cerca de 70, 80, 90 ou 100 bases. Vantajosamente, todas as fitas ou substancialmente todas as fitas na composição têm o comprimento predeterminado. De preferência, as fitas e os dsRNAs são sintéticos.

[011] A síntese é o modo privilegiado de produção das fitas de dsRNA de comprimento curto e determinado. As fitas de dsRNA da invenção podem ser fitas de dsRNA sintéticas, digamos obtidas por síntese. Por convenção, as fitas e o dsRNA assim obtidos são qualificados de sintéticos.

Diferentes métodos de síntese são descritos em outras partes do pedido. O comprimento curto e determinado das fitas, de acordo com a invenção, pode ser controlado por métodos padrão, tais como eletroforese, como aqui exemplificado em gel de acrilamida.

[012] Os métodos de síntese podem permitir produzir, vantajosamente, as fitas de dsRNA curtas e definidas da invenção. Estes métodos permitem que se produza, vantajosamente, fitas de dsRNA com o comprimento exato desejado. Estes métodos permitem que se produza, vantajosamente, uma composição em que todas as fitas são do mesmo comprimento e/ou em que todos os dsRNA são feitos de fitas com o mesmo comprimento. No entanto, uma certa e limitada variação do comprimento de algumas fitas pode ser aceitável e abrangida nas composições de acordo com a invenção, quer as fitas sejam produzidas por síntese ou por outro método. Em particular, essa variação é autorizada e abrangida assim que isso não altere substancialmente a função ou a eficácia da composição. Em uma forma de realização, a composição variante ainda ativa células mielóides e desencadeia a morte de células cancerosas epiteliais. Em outra forma de realização, a composição variante ainda ativa células mielóides e desencadeia a morte de células cancerosas epiteliais substancialmente no mesmo nível do que a composição em que todas as fitas são do mesmo comprimento e/ou em que todos os dsRNA são feitos de fitas possuindo o mesmo comprimento. De preferência, as composições da invenção compreendem uma proporção significativa e eficiente, especialmente uma proporção igual ou superior a 95, 96, 97, 98, 99 ou 99,5, ou de cerca de 100%, de fitas possuindo o comprimento determinado. Pode-se dizer que a composição compreende o princípio ativo de dsRNA consistindo essencialmente na proporção significativa e eficiente de fitas possuindo o comprimento determinado, incluindo aquelas porcentagens.

[013] No dsRNA, os blocos poli A e poli U podem ser combinados com uma ou mais bases entre A, U, G, I, C, poli A, poli U, poli G, poli I ou poli C, e os nucleotídeos complementares ou blocos. Estruturas exemplificativas são para uma fita (então há a complementar): poli A - poli I, poli A - poli C, poli I - poli

A, poli C - poli A, poli I - poli A - poli I, poli C - poli A - poli C, poli A - poli I - poli A, poli A - poli C - poli A.

[014] “Homopolímero” significa uma sequência de pelo menos duas bases idênticas e contíguas.

[015] Poli A/I ou A/C e uma fita complementar feita de blocos de Poli U/C ou U/I são assim incluídos. Eles também podem ser designados como poli A/I: poli U/C ou Poli A/C: Poli U/I. De acordo com uma característica, uma fita poli A/I ou poli U/C tem um comprimento predeterminado de mais de 50 a cerca de 200 bases. De preferência, o comprimento da referida fita está entre cerca de 55 e cerca de 200 bases, especialmente entre cerca de 60 e cerca de 100 bases.

[016] As fitas podem compreender, em particular, um ou mais blocos (de preferência um ou dois) de A ou U compreendendo pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, A, respectivamente U; tal bloco pode conter opcionalmente menos de 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% de outra base entre A (quando Q = A)/U (quando Q = A), G, I e C.

[017] A invenção faz uso, em particular, de dsRNA de um comprimento compreendido entre 50 pb e cerca de 200 pb (melhor cerca de 55 a cerca de 100, 150 ou 200, de preferência cerca de 60 a cerca de 120, de preferência entre cerca de 70 e cerca de 100, por exemplo, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90) possuindo pelo menos uma fita compreendendo pelo menos um bloco de A ou U, e a fita complementar (assim com o bloco complementar de U, respectivamente A), de acordo com a seguinte fórmula (I) (apenas um fita é representada), em que o dsRNA compreende pelo menos 20%, de preferência pelo menos 25%, mais preferencialmente pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 70 ou 75%, (ou mesmo pelo menos 80, 85, 90 ou 95%) de A e U: (I) [P]a [Q]b [R]c

- Q representa um homopolímero de A ou U, b é um número inteiro de pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou mais; tal bloco pode conter, opcionalmente, menos de 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4,

3, 2, 1% de outra base entre A (quando Q = A)/U (quando Q = A), G, I e C;

- a, b e c representam um número de bases ou nucleotídeos, então a + b + c representa o comprimento da fita ou do dsRNA;

- a e c podem ser, independentemente, 0 ou um número inteiro tal que a + b + c = 50 a 200, preferencialmente entre 60 e 120, mais preferencialmente entre 70 e 100; a, b e c podem ser iguais ou diferentes;

- se a = 1, no caso Q = A, P é feito de uma base entre U, G, I e C;

como resultado da complementaridade, no caso Q = U, P é feito de uma base entre A, G, I e C;

- se a > 1, P é feito de pelo menos uma ou duas bases entre A, U,

G, I e C, sob uma destas configurações: combinação aleatória de pelo menos duas dessas bases, um bloco de uma base entre A, U, G, I e C, pelo menos dois blocos de bases diferentes entre A, U, G, I e C, ou uma mistura de pelo menos um bloco de base entre A, U, G, I e C e pelo menos uma outra base entre A, U,

G, I e C;

- se c = 1, no caso R = A, R é feito de uma base entre U, G, I e C;

como resultado da complementaridade, no caso R = U, P é feito de uma base entre A, G, I e C;

- se c > 1, R é feito de pelo menos uma ou duas bases entre A, U,

G, I e C, sob uma destas configurações: combinação aleatória de pelo menos duas dessas bases, um bloco de uma base entre A, U, G, I e C, pelo menos dois blocos de bases diferentes entre A, U, G, I e C, ou uma mistura de pelo menos um bloco de base entre A, U, G, I e C e pelo menos uma outra base entre A, U, G, I e C;

- P e R podem ser idênticos ou diferentes em termos de bases e/ou comprimento de sequência.

[018] Em uma variante, na fórmula (I), b é um número inteiro de pelo menos 10.

[019] Na Fórmula (I), em que Q = A ou U, b pode ser, em particular, cerca de 35 a cerca de 200, em particular cerca de 50 a cerca de 200, melhor cerca de 55 a cerca de 100, 150 ou 200, de preferência cerca de 60 a cerca de 120, de preferência entre cerca de 70 e cerca de 100, por exemplo cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90. O bloco de poli A pode conter menos de 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% de outra base entre U, G, I e C. O bloco de poli U será complementar a ele e compreenderá os correspondentes A, G, I e/ou C.

[020] Em uma forma de realização desta fórmula (I) acima e suas formas de realização abaixo, o bloco de poliA ou os blocos de poliA podem conter menos de 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% de outra base entre U, G, I e C. Assim, o bloco correspondente de poliU ou os blocos de poli U seriam complementares e teriam as bases de emparelhamento entre A, G, I e.

[021] Em uma forma de realização, a fórmula (I) forma um poliA: poliU. Nesse caso, é suficiente ter, por exemplo, a = c = 0, Q = A e b de pelo menos 50, ou pelo menos cerca de 50, em particular cerca de 50 a cerca de 200, melhor cerca de 55 a cerca de 100, 150 ou 200, de preferência cerca de 60 a cerca de 120, de preferência entre cerca de 70 e cerca de 100, por exemplo cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90.

[022] A invenção também abrange o uso de nucleotídeos modificados de A, U, I, G, C, tais como os nucleotídeos O-metilados, os nucleotídeos fosforotioatos etc.

[023] Em outra forma de realização, a fórmula (I) forma um poliP- poliA-poliR. A fita complementar seria poliP’-poliU-poliR’, com P’ e R’ sendo a base ou bases complementares de P, respectivamente R, na posição.

[024] Em outra forma de realização, a fórmula (I) forma um poliA- poliX-poliA, em que X pode representar U, G, I, C, poli U, poli G, poli I, poli C ou qualquer combinação dos mesmos e possivelmente com inserções de A ou poli A. A fita complementar seria poliU-poliY-poliU, sendo Y a base ou bases complementares de X na posição.

[025] Em outra forma de realização, a fórmula (I) forma um poliP- poliA. A fita complementar seria poliP'-poliU, P' sendo a base ou bases complementares de P na posição.

[026] Em outra forma de realização, a fórmula (I) forma um poliA- poliR. A fita complementar seria poliU-poliR', R' sendo a base ou bases complementares de R na posição.

[027] Nas seguintes fórmulas de forma de realização, a, b e c podem ter o mesmo significado que acima. A e U designam as bases A e U.

[028] Em uma primeira forma de realização, o dsRNA é de fórmula (II): [A]b [U]b

[029] Em particular, b = 50 a 200, melhor cerca de 55 a cerca de 100, 150 ou 200, de preferência cerca de 60 a cerca de 120, de preferência entre cerca de 70 e cerca de 100, por exemplo, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90.

[030] Em uma segunda forma de realização, o dsRNA é de fórmula (III): [P]a [A]b [R]c [Y]a [U]b [Z]c P e R são escolhidos, independentemente, entre G, I e /ou C, e Y e Z são as bases complementares.

[031] Em particular,

b = é um número inteiro entre 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; a e c independentemente = cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40.

[032] Em particular, b = é um número inteiro entre 10, 15, 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; a e c independentemente = cerca de 5 a cerca de 50, em particular cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40.

[033] Em particular, b = é um número inteiro entre 10 e 100; a e c independentemente = cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40.

[034] Em particular, b = é um número inteiro entre 10, 15, 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; a e c independentemente = cerca de 10 a cerca de 50.

[035] Em uma terceira forma de realização, o dsRNA é de fórmula (IV):

[A]b [R]c [U]b [Z]c R é escolhido entre G, I e/ou C, Z é a base complementar.

[036] Em particular, b = é um número inteiro entre 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; c = cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40, de preferência cerca de 30 a cerca de 40, por exemplo, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45.

[037] Em particular, b = é um número inteiro entre 10, 15, 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; c = cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40, de preferência cerca de 30 a cerca de 40, por exemplo, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45.

[038] Em particular, b = é um número inteiro entre 10 e 100, ou entre cerca de 35 e cerca de 100; c = cerca de 30 a cerca de 50, de preferência cerca de 30 a cerca de 40, por exemplo, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45.

[039] Em particular, b = é um número inteiro entre 10, 15, 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; c = cerca de 10 a cerca de 50.

[040] Em uma quarta forma de realização, o dsRNA é de fórmula (V): [P]a [A]b [Y]a [U]b P é escolhido entre G, I e/ou C, Y é a base complementar.

[041] Em particular, b = é um número inteiro entre 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; a = cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40, de preferência cerca de 30 a cerca de 40, por exemplo, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45.

[042] Em particular, b = é um número inteiro entre 10 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; a = cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40, de preferência cerca de 30 a cerca de 40, por exemplo, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45.

[043] Em particular, b = é um número inteiro entre 10 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100; a = cerca de 30 a cerca de 50, de preferência cerca de 30 a cerca de 40, por exemplo, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45.

[044] Em particular, b = é um número inteiro entre 10 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; a = cerca de 10 a cerca de 50.

[045] Em uma forma de realização, o dsRNA é de fórmula (VI): [P]a [A]b [R]c [Y]a [U]b [Z]c P e R são escolhidos independentemente entre I e C, e Y e Z são as bases complementares; b = é um número inteiro entre cerca de 20, 25 ou 30 e cerca de 100; um dentre a ou c pode ser 0, e a e c não sendo iguais a 0 ao mesmo tempo, são cerca de 10 a cerca de 50.

[046] Em uma forma de realização destas fórmulas (II), (III), (IV), (V), (VI), o bloco ou homopolímero de poli A ou os blocos ou homopolímeros de poli A podem conter menos de 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% de outra base entre U, G, I e C. O(s) bloco(s) complementar(es) de U irão, é claro, integrar as bases complementares.

[047] Em uma forma de realização preferida, a composição compreende uma fita poli A/I e uma fita poli U/C, em que ambas as fitas têm o mesmo comprimento predeterminado de mais de 50 a cerca de 200 bases. De preferência, o comprimento de ambas as fitas está entre cerca de 55 e cerca de 200 bases, especialmente entre cerca de 60 e cerca de 100 bases. Por exemplo, ambas as fitas têm cerca de 60, 70, 80, 90 ou 100 bases cada.

[048] O termo “fita dupla” significa uma parte onde os ribonucleotídeos são ligados por hidrogênio (emparelhados com base) a ribonucleotídeos complementares para formar uma estrutura de fita dupla. Pode- se falar de sobreposição onde ambas as fitas estão emparelhadas. De preferência, todas as fitas são emparelhadas (100% das fitas complementares são emparelhadas). No entanto, a invenção abrange dsRNA possuindo pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% do comprimento da fita emparelhado (conformação de fita dupla). Em uma mesma composição, é possível ter dsRNA de % variável de emparelhamento. A determinação de qual porcentagem do agonista de TLR3 dsRNA está em uma conformação de fita dupla é obtida dividindo o número de nucleotídeos que são emparelhados com base pelo número total de nucleotídeos em uma molécula.

Assim, uma molécula emparelhada com 21 bases contendo 2 saliências de nucleotídeos nas extremidades 3' e 5' teria 42 nucleotídeos que são emparelhados com base e 4 nucleotídeos que não são emparelhados com base, tornando-a 42/46 ou 91,3% de fita dupla ou emparelhada.

[049] A conformidade de um lote de dsRNA pode ser controlada por meios conhecidos. Um exemplo é o método descrito nos Exemplos 1 e 10 com géis de acrilamida.

[050] De preferência, as composições da invenção compreendem um conjunto de tal dsRNA possuindo mais de 95, 96, 97, 98, 99 ou 99,5% de emparelhamento ou de dsRNA totalmente emparelhado (cerca de 100%), por exemplo, o dsRNA compreende uma fita Poli A/I e uma fita Poli U/C, em que ambas as fitas têm o mesmo comprimento predeterminado de mais de 50 a cerca de 200 bases, de preferência, o comprimento de ambas as fitas está entre cerca de 55 e cerca de 200 bases, especialmente entre cerca de 60 e cerca de 100 bases. Por exemplo, ambas as fitas têm cerca de 60, 70, 80, 90 ou 100 bases cada.

[051] A composição pode compreender ainda um veículo, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização, a composição é estéril.

[052] Na invenção, o termo “compreender” pode ser substituído por “consistir essencialmente em” ou “consistir em”.

[053] Outro objetivo da invenção é essa composição como um medicamento.

[054] Outro objetivo da invenção é essa composição para uso em um método de tratamento de um câncer humano ou animal que expressa receptor TLR3.

[055] Outro objetivo da invenção é essa composição para uso como um medicamento.

[056] Outro objetivo é o uso desta composição para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer humano ou animal que expressa o receptor TLR3.

[057] O dsRNA contido na composição serve como um agonista do receptor TLR3.

[058] Em uma forma de realização, a composição induz inflamação em células mielóides humanas ou animais.

[059] Em uma forma de realização, a composição induz, por exemplo, a produção de TNF-alfa e/ou interferon tipo I pelas células mielóides humanas ou animais.

[060] Em uma forma de realização, a composição desencadeia a morte de células cancerosas epiteliais.

[061] Em uma forma de realização, a composição induz inflamação e morte de células cancerosas.

[062] Outro objetivo da invenção é essa composição como um medicamento que ativa células mielóides humanas ou animais, em particular com produção de TNF-alfa e ativação do gene repórter ISRE, e desencadeia a morte de células cancerosas epiteliais.

[063] Outro objetivo da invenção é essa composição como um medicamento que ativa especificamente TLR3 expresso por células mielóides (macrófagos e células dendríticas), induz a secreção de citocinas inflamatórias e desencadeia ativação dependente de TLR3 de inflamação e morte em células cancerosas humanas ou de mamíferos.

[064] Outro objetivo é uma composição farmacêutica compreendendo um dsRNA de acordo com a invenção e uma droga quimioterápica, para uso em um método de tratamento de um câncer que expressa TLR3, com uma administração simultânea, separada ou sequencial do dsRNA de acordo com a invenção e uma droga quimioterápica a um mamífero ou humano.

[065] Outro objetivo da invenção é um método para tratar um câncer em um paciente em necessidade do mesmo. O método compreende a administração de uma quantidade suficiente de uma composição como aqui descrita.

[066] Em uma forma de realização, o método ativa células mielóides.

[067] Em uma forma de realização, o método induz a produção de TNF-alfa pelas células mielóides.

[068] Em uma forma de realização, o método desencadeia a via de sinalização dependente de NF-Kb e ISRE a jusante de TLR3.

[069] Em uma forma de realização, o método desencadeia a morte de células cancerosas epiteliais.

[070] Em uma forma de realização, o método ativa células mielóides, em particular com produção de TNF-alfa, e desencadeia a morte de células cancerosas epiteliais.

[071] Em uma forma de realização, o método ativa especificamente TLR3 expresso por células mielóides (macrófagos e células dendríticas), induzindo a secreção de citocinas inflamatórias e desencadeia a inflamação dependente de TLR3 e morte em células cancerosas humanas ou de mamíferos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[072] Os inventores examinaram uma série de dsRNA sintético com várias composições de bases, distribuição de nucleotídeos nas duas fitas e sequências, quanto à sua capacidade de desencadear a produção de TNF-alfa pela linhagem celular de macrófagos de camundongo RAW. As sequências dos primeiros 47 dsRNA testados são apresentadas na Tabela 1. A análise de Poli(A:U) comercial e 9 sequências 345, 397, 398, 415, 418, 405, 411, 412, 413 no gel de acrilamida nativo mostra que, ao contrário do Poli(A:U) comercial que é uma mistura de dsRNA de diferentes comprimentos, uma única banda principal é detectável no tamanho esperado para cada dsRNA de 50 pb sintético (Figura 1). Quando os 47 dsRNA sintéticos foram testados quanto à sua capacidade de ativar a produção de TNF-alfa por células Raw de macrófagos de camundongo, nenhum foi eficaz, mas a sequência de Poli(A:U) de 50 pb (doravante denominada sequência 412) (Figura 2), que foi tão eficiente quanto Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Assim, a sequência 412 foi internalizada de forma eficiente por macrófagos e capaz de desencadear a via de sinalização de NF-Kb a jusante de TLR3. Notavelmente, quando o As e Us de um Poli(A:U) de 50 pb foram distribuídos nas duas fitas, (sequência 413) não foi observada secreção de TNF-alfa. Inesperadamente, Poli(I:C) de 50 pb (sequência 411) foi incapaz de desencadear a produção de TNF-alfa.

[073] Os inventores avaliaram, em seguida, a capacidade da sequência 412 de desencadear a morte de células epiteliais de câncer de células não pequenas humanas TLR3 WT e TLR3 KO NCI-H292. Na ausência de reagente de transfecção, a sequência 412 não pode ativar a resposta inflamatória (Figura 3) nem a morte de células NCI-H292 (Figura 4). Portanto, em contraste com os macrófagos, a sequência 412 não foi internalizada ou não pôde ativar a via de sinalização de NF-kB TLR3 nem a morte em células cancerosas epiteliais.

[074] Poli(A:U) de 70 pb (sequência 432) e de 90 pb (sequência 452) foram então usados. Novamente, ambas as sequências sintéticas mostraram uma única banda principal quando analisadas em gel de poliacrilamida nativo (Figura 5). As sequências 432 e 452 foram tão eficientes quanto a sequência 412 para desencadear a resposta inflamatória de células Raw, conforme ilustrado pela produção de TNF-alfa (Figura 6) e a ativação do gene repórter ISRE-luciferase (Figura 7). Além disso, as sequências 432 e 452 desencadearam inesperadamente a resposta inflamatória dependente de TLR3 (Figura 8) e apoptótica (Figura 9) de células cancerosas humanas NCI-H292 sem reagente de transfecção.

[075] Os inventores testaram ainda Poli(A:U) de 60 pb (sequência 422) e 80 pb (sequência 442), 3 PoliA/I:U/C quimérico de 70 pb: uma sequência de 10 Poli(I:C) seguido por 50 Poli(A:U) seguido por 10 Poli(I:C) (sequência I10A50I10) (532), uma sequência de 35 Poli(A:U) seguido por 35 Poli(I:C) (sequência A35I35) (533), uma sequência de 10 Poli(A:U) seguido por 50 Poli(I:C) seguido por 10 Poli(A:U) (sequência A10I50A10) (534), e uma sequência de 70 pb de Poli(I:C) (535) (Tabela 2). Novamente, o gel de acrilamida nativo mostra uma única banda principal no tamanho esperado para cada dsRNA sintético (Figura 10).

[076] Observou-se que: (1) os quiméricos 532 e 533 de 70 pb foram os mais poderosos para induzir a secreção de mTNFa por células Raw (Figura 11) e (2) que ambos foram muito eficazes para desencadear a secreção de IL-6 por células NCI-H292 (Figura 12); (3) além disso, eles foram tão eficazes quanto o Poli(A:U) de 70 pb (432) para matar células NCI-H292 (Figura 13).

Visivelmente, nem o Poli(I:C) de 70 pb (535) nem o dsRNA de 70 pb quimérico rico em I:C (534) ativaram significativamente a secreção de TNF-alfa por células Raw (Figura 11).

[077] Assim, o Poli(A:U) sintético bem definido, de acordo com a invenção, por exemplo, de 70 pb e 80 pb e a sequência quimérica rica em A:U de 70 pb, tal como 532 e 533, têm a capacidade única de ativar células mielóides para induzir a secreção de citocinas inflamatórias e desencadear a ativação dependente de TLR3 de inflamação e morte em células cancerosas.

[078] Os dsRNAs 422, 432, 442, 452, 532 e 533 são exemplos preferidos de dsRNAs de acordo com a invenção. Outros exemplos são (com a fita complementar C ou I, respectivamente U ou A): 5’ (I)10 – (U)50 - (I)10 3’ 5’ (A)60 – (I)10 3’ 5’ (A)50 – (I)20 3’ 5’ (A)20 – (I)50 3’ 5’ (I)5 – (A)60 - (I)5 3’ 5’ (I)15 – (A)40 - (I)15 3’ 5’ (I)20 – (A)30 - (I)20 3’ 5’ (I)25 – (A)20 - (I)25 3’ 5’ (I)5 – (A)50 - (I)15 3’ 5’ (I)13 – (A)64 - (I)13 3’ 5’ (I)10 – (A)70 - (I)10 3’

[079] Ainda outros exemplos são (com a fita complementar C ou I, respectivamente U ou A:

5’ (A)10 – (I)60 3’ 5’ (I)30 – (A)10 - (I)30 3’

[080] A invenção, portanto, diz respeito a composições compreendendo um destes dsRNAs específicos como a população única de dsRNAs contidos na referida composição, ou em uma proporção significativa e eficiente, especialmente uma proporção igual ou superior a 95, 96, 97, 98, 99 ou 99,5 dos dsRNAs totais compreendidos na composição.

DEFINIÇÕES

[081] “TLR3”, “proteína TLR3” e “receptor TLR3”, usados de forma intercambiável, são usados aqui para se referir ao Receptor Toll Like 3, um membro da família de receptores Toll-like (TLRs). Sua sequência de aminoácidos é mostrada no gene NCBI ID 7098. O receptor Toll Like 3 é um membro da família de receptores Toll-like (TLR) que desempenha um papel fundamental no reconhecimento de patógenos e na ativação da imunidade inata.

Esse receptor é mais abundantemente expresso na placenta e no pâncreas e está restrito à subpopulação dendrítica de leucócitos. Ele reconhece o dsRNA associado à infecção viral e induz a ativação do NF-κB e a produção de interferons do tipo I.

[082] Por “câncer” entende-se o crescimento, divisão ou proliferação de células anormais no corpo. Em particular, os cânceres abrangidos são aqueles que expressam TLR3. A determinação da expressão de TLR3 em células cancerosas está bem dentro da capacidade do técnico no assunto e pode ser medida por qualquer método disponível para o técnico no assunto, tal como imuno-histoquímica, Western Blot ou PCR quantitativa (por exemplo, usando o sistema LightCycler® da Roche Molecular Diagnostics) etc.

Ainda particularmente, os cânceres abrangidos pela presente invenção são escolhidos a partir de: cânceres epiteliais, tais como câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinomas de pulmão, hepatocarcinoma, neuroblastoma, cânceres de cabeça e pescoço, de ovário, renal, de bexiga, de próstata, de mama, de colo do útero, de pâncreas, do esôfago, gástrico, de intestino delgado, de cólon ou melanoma e cânceres mesenquimais, tais como mesotelioma ou sarcoma e, mais particularmente, câncer de pulmão de células não pequenas.

[083] Tal como aqui utilizado, o termo “indivíduo” ou “paciente” refere-se a um animal de sangue quente, tal como um mamífero, animal ou humano, em particular um humano, que sofre de, ou tem o potencial de ser afetado por um ou mais doenças e condições aqui descritas.

[084] Os termos “tratar”, “tratando”, “tratado” ou “tratamento”, conforme usados neste documento, referem-se ao tratamento terapêutico em que o objetivo é eliminar ou diminuir os sintomas. Os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a, eliminação de sintomas, alívio de sintomas, diminuição da extensão da condição, estado estabilizado (ou seja, sem agravamento) da condição, atraso ou desaceleração da progressão da condição, para a prevenção do início, recorrência ou disseminação de uma doença ou distúrbio, ou de um ou mais sintomas dos mesmos. Em certas formas de realização, os termos se referem ao tratamento com ou administração de um composto fornecido neste documento antes do início dos sintomas. Os termos abrangem a inibição ou redução de um sintoma de uma doença específica. Os indivíduos com histórico familiar de uma doença em particular são candidatos a regimes de tratamento em certas formas de realização. Além disso, os indivíduos nos quais uma disposição genética para a doença específica foi mostrada, são candidatos a regimes de tratamento em certas formas de realização. Além disso, os indivíduos com histórico de sintomas recorrentes também são candidatos potenciais ao tratamento. A este respeito, o termo “tratamento” pode ser usado de forma intercambiável com o termo “tratamento profilático”.

[085] A identificação dos indivíduos que necessitam de tratamento das doenças e condições aqui descritas está bem dentro da capacidade e do conhecimento de um técnico no assunto. Um clínico da área pode facilmente identificar, pelo uso de testes clínicos, exame físico e histórico médico/ familiar, os indivíduos que precisam de tal tratamento.

[086] Tal como aqui utilizado, um “excipiente farmaceuticamente aceitável” refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação desfavorável quando administrado a um mamífero, especialmente um humano, conforme apropriado. Um excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a uma carga, diluente, material encapsulante ou auxiliar de formulação de qualquer tipo não tóxico sólido, semissólido ou líquido.

[087] Para os fins da presente invenção, a administração ao mesmo tempo (por exemplo, simultaneamente) refere-se à administração das drogas juntas na mesma formulação ou em formulações separadas em que a administração pode ser de alguns minutos a algumas horas de intervalo, mas não mais do que um dia. Tal como aqui utilizado, a administração em momentos diferentes (por exemplo, sequencialmente) refere-se à administração das drogas da terapia de combinação em algumas horas a dias, semanas e até meses de intervalo. Portanto, em certas formas de realização, um indivíduo em terapia de combinação pode receber ambas as drogas ao mesmo tempo (por exemplo, simultaneamente) ou em momentos diferentes (por exemplo, sequencialmente, em qualquer ordem, no mesmo dia ou em dias diferentes), desde que o efeito terapêutico da combinação de ambas as drogas seja causado no indivíduo em terapia. Em algumas formas de realização, a combinação de drogas será dada simultaneamente para uma dosagem, mas outra dosagem incluirá a administração sequencial, em qualquer ordem, no mesmo dia ou em dias diferentes. Quando as duas drogas são administradas simultaneamente, elas podem ser administradas como composições farmacêuticas separadas, cada uma compreendendo qualquer uma das drogas da combinação, ou podem ser administradas como uma única composição farmacêutica compreendendo ambas as drogas.

FORMULAÇÕES DE AGONISTA DE TLR3 E SISTEMAS DE DISTRIBUIÇÃO

[088] Por agonista de TLR3 entende-se, neste documento, um dsRNA de acordo com a invenção, a menos que haja indicação em contrário.

[089] De preferência, o agonista de TLR3 é formulado em uma composição farmaceuticamente aceitável. As composições farmaceuticamente aceitáveis aqui descritas compreendem adicionalmente carreadores, adjuvantes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os carreadores, adjuvantes e veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a, trocadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas de soro, tais como albumina de soro humano, substâncias tampão, tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeos parciais de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, polietilenoglicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol e lanolina.

[090] As composições farmacêuticas incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal ou parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica).

Em certas formas de realização, o composto das fórmulas aqui é administrado por via transdérmica (por exemplo, usando um emplastro transdérmico ou técnicas iontoforéticas). Outras formulações podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, comprimidos e cápsulas de liberação prolongada e em lipossomas, e podem ser preparadas por quaisquer métodos bem conhecidos na técnica de farmácia. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA (17ª ed. 1985). Tais métodos preparativos incluem a etapa de associar ingredientes à molécula a ser administrada, tais como o carreador que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as composições são preparadas associando uniformemente e intimamente os ingredientes ativos com carreadores líquidos, lipossomas ou carreadores sólidos finamente divididos incluindo nanopartículas, ou ambos, e então, se necessário, dando forma ao produto.

[091] Em certas formas de realização, a composição é administrada ao tumor. Pode ser aplicada na superfície, por exemplo, utilizando uma formulação apropriada tal como um gel ou um emplastro para contato prolongado com o local do tumor ou na massa do tumor, por exemplo, usando um implante, ou injetada no tumor, por exemplo, usando composições injetáveis conforme descrito neste documento.

[092] Em certas formas de realização preferidas, o composto é administrado por via oral. As composições adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas, sachês ou comprimidos, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou uma emulsão líquida água-em-óleo, ou embaladas em lipossomas e como um bolo etc. As cápsulas de gelatina mole podem ser úteis para conter tais suspensões, o que pode aumentar beneficamente a taxa de absorção do composto.

[093] Um comprimido pode ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios.

Comprimidos compactados podem ser preparados comprimindo em uma máquina adequada o ingrediente ativo em uma forma de fluxo livre, tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturado com um aglutinante, lubrificante, diluente inerte, conservante, agente tensoativo ou dispersante. Os comprimidos moldados podem ser feitos moldando em uma máquina adequada uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser opcionalmente revestidos ou marcados e podem ser formulados de modo a proporcionar uma liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo neles contido. Métodos de formulação de tais composições de liberação lenta ou controlada de ingredientes farmaceuticamente ativos, tais como aqueles aqui e outros compostos conhecidos na técnica, são conhecidos na técnica e descritos em várias patentes dos EUA emitidas, algumas das quais incluem, mas não estão limitadas a, US 4.369.172 e US 4.842.866. Os revestimentos podem ser usados para a distribuição de compostos ao intestino (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.638.534, 5.217.720 e 6.569.457, 6.461.631, 6.528.080,

6.800.663).

[094] No caso de comprimidos para uso oral, os carreadores que são comumente usados incluem lactose e amido de milho. Os agentes lubrificantes, tais como o estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados. Para administração oral na forma de cápsula, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando as suspensões aquosas são administradas por via oral, o ingrediente ativo é combinado com emulsionantes e/ou agentes de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes e/ou aromatizantes e/ou corantes podem ser adicionados. Tensoativos, tais como laurilsulfato de sódio, podem ser úteis para aumentar a dissolução e a absorção.

[095] Em certas formas de realização, a composição está ligada covalentemente, ou não, a outra molécula, tal como um anticorpo, outra proteína ou peptídeo, um lipídeo ou um açúcar ou outro ligante de receptor.

[096] As composições adequadas para administração oral incluem pastilhas expectorantes compreendendo os ingredientes em uma base aromatizada, normalmente sacarose e acácia ou tragacanto; e pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia.

[097] Em certas formas de realização, a composição está ligada covalentemente, ou não, com nanopartículas.

[098] As composições adequadas para administração parenteral incluem soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, agentes bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo, ampolas e frascos vedados, e podem ser armazenadas em uma condição de criodessecação (liofilizada) exigindo apenas a adição do carreador líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis. Essas soluções de injeção podem estar na forma, por exemplo, de uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com técnicas conhecidas na técnica usando agentes dispersantes ou umectantes adequados (tais como, por exemplo, Tween 80) e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol.

Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão manitol, água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Os ácidos graxos, tais como o ácido oleico e seus derivados glicerídeos, são úteis na preparação de injetáveis, assim como os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como o azeite de oliva ou o óleo de rícino, especialmente em suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões de óleo também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa.

[099] As composições farmacêuticas podem ser administradas na forma de supositórios para administração retal ou vaginal. Estas composições podem ser preparadas misturando um composto com um excipiente não irritante adequado que é sólido à temperatura ambiente mas líquido à temperatura retal e, portanto, derreterá no reto para liberar os componentes ativos. Esses materiais incluem, mas não estão limitados a, manteiga de cacau, cera de abelha e polietilenoglicóis.

[0100] A administração tópica das composições farmacêuticas é especialmente útil quando o tratamento desejado envolve áreas (incluindo mucosa e superfícies mesoteliais) ou órgãos facilmente acessíveis por aplicação tópica. Para aplicação tópica na pele, a composição farmacêutica será formulada com uma pomada adequada contendo os componentes ativos suspensos ou dissolvidos em um carreador. Os carreadores para administração tópica dos compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral, petróleo líquido, petróleo branco, propilenoglicol, composto de polioxietileno polioxipropileno, cera emulsionante e água. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser formulada com uma loção ou creme adequado contendo o composto ativo suspenso ou dissolvido em um carreador. Os carreadores adequados incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2- octildodecanol, álcool benzílico e água. Alternativamente, a composição farmacêutica pode ser formulada com um gel adequado. As composições farmacêuticas desta invenção também podem ser aplicadas topicamente ao trato intestinal inferior por formulação de supositório retal ou em uma formulação de enema adequada. Também são descritas administração iontoforética e de emplastros topicamente transdérmica.

[0101] As composições farmacêuticas podem ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica de formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorocarbonos e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes conhecidos na técnica. As formulações de aerossol que podem ser utilizadas nos métodos desta invenção também incluem aquelas descritas em US 6.811.767.

[0102] Os lipossomas que são sensíveis ao pH ou carregados negativamente, prendem o dsRNA em vez de complexá-lo. Uma vez que tanto o dsRNA quanto o lipídeo têm carga semelhante, ocorre repulsão em vez de formação de complexo. O dsRNA fica assim aprisionado no interior aquoso destes lipossomas. Um tipo principal de composição lipossomal inclui fosfolipídios além da fosfatidilcolina derivada naturalmente. As composições de lipossomas neutras, por exemplo, podem ser formadas a partir de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). As composições de lipossomas aniônicos geralmente são formadas a partir de dimiristoil fosfatidilglicerol, enquanto os lipossomas fusogênicos aniônicos são formados principalmente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossomal é formado a partir de fosfatidilcolina (PC), como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de fosfolipídios e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol. Os lipossomas que incluem ácidos nucleicos foram descritos, por exemplo, em WO 96/40062, US 5,264,221, US 5,665,710.

[0103] Também é descrito neste documento um dispositivo implantável de liberação de droga impregnado com ou contendo um agonista de TLR3 ou uma composição compreendendo um agonista de TLR3, de modo que o referido agonista de TLR3 seja liberado a partir do referido dispositivo e seja terapeuticamente ativo.

COMPOSIÇÕES DE COMBINAÇÃO DE AGONISTA DE TLR3

[0104] O tratamento com um agonista de TLR3, conforme descrito neste documento, pode ser opcionalmente vantajosamente combinado com um ou mais outros agentes terapêuticos úteis no tratamento de câncer. Assim, os agonistas de TLR3 descritos neste documento podem ser usados conjuntamente ou em combinação com outro agente terapêutico útil no tratamento de câncer.

As composições de agonista de TLR3 descritas acima podem, portanto, incluir adicionalmente outros agentes terapêuticos úteis no tratamento de câncer. O outro agente terapêutico pode estar no mesmo recipiente ou, de preferência, em um recipiente separado. Tais agentes incluem outros agonistas de TLR3 dsRNA de sequência de nucleotídeos diferente; citotoxinas, incluindo mas não se limitando àquelas citadas acima para uso em complexos de ligante de TLR3 citotóxicos e tumoricidas; complexos de ligante de TLR3 citotóxicos e tumoricidas; agentes que têm como alvo um antígeno tumoral ou uma proteína proliferativa tumoral; agentes de quimioterapia, incluindo, mas não se limitando a, cisplatina (CDDP), carboplatina, oxaliplatina, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalan, clorambucil, busulfan, nitrosureia, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etoposídeo (VP16), tarnoxifen, raloxifeno, agentes de ligação ao receptor de estrogênio, taxol, gemcitablen, navelbina, inibidores de famesil-proteína transferase, transplatina, 5-fluorouracil, vincristina, vinblastina e metotrexato, ou qualquer análogo ou variante derivado dos anteriores; agentes terapêuticos e combinação de agentes terapêuticos para o tratamento de cânceres específicos, tais como câncer de mama: doxorrubicina, epirrubicina, a combinação de doxorrubicina e ciclofosfamida (AC), a combinação de ciclofosfamida, doxorrubicina e 5-fluorouracil (espace ajouté) (CAF), a combinação de ciclofosfamida, epirrubicina e 5-fluorouracil (CEF), Herceptin™),

tamoxifen, a combinação de tamoxifen e uma citotoxina, taxanos incluindo docetaxel e Paclitaxel, a combinação de um taxano mais doxorrubicina e ciclofosfamida; para câncer de cólon: a combinação de 5-FU e leucovorina, a combinação de 5FU e levamisol, irinotecan (CPT-11) ou a combinação de irinotecan, 5-FU e leucovorina (IFL) ou oxaliplatina; para câncer de próstata: um radioisótopo (ou seja, paládio, estrôncio-89 e irídio), leuprolida ou outros agonistas de LHR, antiandrógenos não esteroidais (flutamida, nilutamida e bicalutamida), antiandrógenos esteroidais (acetato de ciproterona), a combinação de leuprolida e flutainida, estrógenos tais como DES,

clorotrianiseno, etinilestradiol, estrógenos conjugados U.S.P., DES-difosfato,

terapias hormonais de segunda linha, tais como aminoglutetimida,

hidrocortisona, retirada de flutamida, progesterona e cetoconazol, prednisona de baixa dosagem ou outros agentes quimioterápicos ou combinação de agente relatado para produzir melhora subjetiva dos sintomas e redução do nível de

PSA incluindo docetaxcl, paclitaxel, estramustina/ docetaxel, estramustina/

etoposídeo, estramustina/ vinblastina e estramustina/ Paclitaxel; para melanoma: dacarbazina (DTIC), nitrosoureias, como carmustina (BCNU) e lomustina (CCNU), agentes com atividade de agente único modesta, incluindo alcalóides de vinca, compostos de platina e taxanos, o regime de Dartmouth

(cisplatina, BCNU e DTIC), interferon alfa (IFN-A) e interleucina-2 (IL-2); para câncer de ovário: Paclitaxel, docetaxel, cisplatina, oxaliplatina,

hexametilmelamina, tamoxifen, ifosfamida, a combinação de paclitaxel (Taxol)

ou docetaxel (Taxotere) e cisplatina ou carboplatina, a combinação de ciclofosfamida e cisplatina, a combinação de ciclofosfamida e carboplatina, a combinação de 5-fluorouracil (5FU) e leucovorina, etoposídeo, doxorrubicina lipossomal, gerucitabina ou topotecan; para câncer de pulmão: cisplatina, vincristina, vinblastina, mitomicina, doxorrubicina e etoposídeo, sozinhos ou em combinação, a combinação de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina/ etoposídeo e cisplatina (CAV/EP), a combinação de cisplatina e vinorelbina, paclitaxel, docetaxel ou gemcitabina e a combinação de carboplatina e paclitaxel.

[0105] Em um aspecto, o outro agente terapêutico é um inibidor do ponto de controle imunológico. Pode ser um agente terapêutico biológico ou uma molécula pequena. De preferência, o inibidor do ponto de controle é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado, um anticorpo totalmente humano, uma proteína de fusão ou uma combinação dos mesmos. O anticorpo pode ser direcionado contra qualquer proteína que esteja envolvida na via e, mais particularmente, contra o receptor ou o ligante. Como se sabe, um inibidor do ponto de controle imunológico é capaz de restaurar a resposta imunológica às células cancerosas. Em particular, o inibidor interrompe ou impede, ou inibe, a interação entre proteínas que interagem, e para permitir a resposta imune, em células T particulares matando as células tumorais. Em um outro aspecto, o inibidor do ponto de controle inibe uma proteína de ponto de controle que pode ser CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 ou uma combinação dos mesmos. Em um aspecto adicional, o inibidor do ponto de controle interage com um ligante de uma proteína de ponto de controle que pode ser CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 ou uma combinação dos mesmos.

[0106] A invenção compreende o uso combinado de um anticorpo que bloqueia, inibe ou reduz a via PD1/PD-L1 e/ou PD1/PD-L2. Existem atualmente pelo menos cinco agentes que bloqueiam a via que são comercializados ou estão em avaliação clínica, qualquer um deles pode ser útil em combinação com a invenção. Estes agentes são BMS-936558 (mAb anti-PD- L1, Nivolumab/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb, anteriormente MDX-1106 (anticorpo 5C4 em WO 2006/121168), MK-3475 (mAb anti-PD1, lambrolizumab ou pembrolizumab, Keytruda®, Merck), MPDL3280A/RG7446 (mAb anti-PD-L1, Roche/Genentech), AMP-224 (imunoadesina compreendendo um anti-PD-L2, Amplimmune e GSK), Pidlizumab (mAb anti-PD1, CT-011, CureTech/TEVA – WO 2009/101611).

[0107] Para os construtos de DNA MK-3475 que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve dos anticorpos humanizados h409All foram depositados no depositário de patentes American Type Culture Collection (10801 University Bld., Manassas, VA). O plasmídeo contendo o DNA que codifica a cadeia pesada de h409A-I 1 foi depositado em 9 de junho de 2008 e identificado como 081469_SPD-H e o plasmídeo contendo o DNA que codifica a cadeia leve de h409AI 1 foi depositado em 9 de junho de 2008 e identificado como 0801470_SPD-LI 1.

[0108] Outros anticorpos conhecidos de PD-1 e outros inibidores de PD-1 incluem AMP-224 (uma proteína de fusão B7-DC/IgG1 licenciada para GSK), AMP-514 descrito em WO 2012/145493, anticorpo MEDI-4736 (um anti- PD-L-1 desenvolvido pela AstraZeneca/ Medimmune) descrito em WO 2011/ 066389 e US 2013/034559, o anticorpo YW243.55.S70 (um anti-PD-L1) descrito em WO 2010/077634, MDX-1105, também conhecido como BMS-936559, é um anticorpo anti-PD-L1 desenvolvido pela Bristol-Myers Squibb descrito em WO 2007/005874, e anticorpos e inibidores descritos em WO 2006/121168, WO 2009/014708, WO 2009/114335 e WO 2013/019906. As divulgações de qualquer documento aqui referido são aqui incorporadas por referência. Outros exemplos de anticorpos anti-PD1 são revelados em WO 2015/085847 para exemplos de anticorpos com domínio variável da cadeia leve CDR1, 2 e 3 da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente, e anticorpo com domínio variável da cadeia pesada CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5, respectivamente, em que as referências de SEQ ID NO são a numeração de acordo com WO 2015/085847.

[0109] A invenção também compreende o uso combinado de um anticorpo contra CTLA-4 (proteína 4 associada aolinfócitos T citotóxicos), também conhecido como CD152, é outro membro inibidor da família CD28 de receptores e é expresso em células T. Os anticorpos que se ligam e inibem CTLA-4 são conhecidos na técnica. Em um exemplo, o anticorpo é ipilimumab (nome comercial Yervoy®, Bristol-Myers Squibb), um anticorpo IgG humano.

[0110] Em outra combinação, o ligante de TLR3 é um agonista das vias de ponto de controle estimulador, tais como OX40, ICOS, GITR, 4-1BB ou CD40.

[0111] Em outra combinação, o agente associado ao ligante de TLR3 é uma molécula que visa o microambiente tumoral, tal como um inibidor da via de sinalização do fator de crescimento de transformação beta (ou seja, galunisertib).

[0112] Os métodos de uso de uma composição de agonista de TLR3 aqui descritos também podem compreender o tratamento de combinação com um agente antiangiogênico. As composições de agonistas de TLR3 descritas acima também podem, portanto, incluir um agente antiangiogênico. A formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese) é um evento fundamental no processo de crescimento tumoral e disseminação metastática. A via do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) está bem estabelecida como um dos principais reguladores desse processo. O eixo VEGF/receptor VEGF é composto de vários ligantes e receptores com especificidades de ligação ligante-receptor,

expressão de tipo celular e função distintas e sobrepostas. A ativação da via de receptor VEGF desencadeia uma rede de processos de sinalização que promovem o crescimento, migração e sobrevivência das células endoteliais da vasculatura pré-existente. Além disso, o VEGF medeia a permeabilidade dos vasos e tem sido associado a derrames malignos. A família de genes relacionados ao VEGF compreende seis glicoproteínas secretadas referidas como VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E e o fator de crescimento placentário (PIGF)-1 e -2. Uma série de agentes antiangiogênicos exemplificativos que atuam na via VEGR são conhecidos, qualquer um dos quais pode ser usado de acordo com a invenção, incluindo inibidor de molécula pequena, estratégias antisense de anticorpos neutralizantes, aptâmeros de RNA e ribozimas contra família de genes relacionados a VEGF (por exemplo as proteínas VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E). Variantes de VEGF com propriedades antagonistas também podem ser empregadas, como descrito em WO 98/16551. Outros agentes antiangiogênicos exemplificativos que são úteis em conexão com a terapia combinada estão listados na Tabela D de US

6.524.583. Agentes antiangiogênicos particularmente preferidos inibem a sinalização por um receptor tirosina quinase incluindo, mas não se limitando a VEGFR1, VEGFR-2,3 PDGFR-beta, Flt-3, c-Kit, p38 alfa e FGFR-1. Outro agente antiangiogênico pode incluir agentes que inibem um ou mais dos vários reguladores da expressão e produção de VEGF, tais como EGFR, HER-2, COX- 2 ou HIF-1. Outra classe preferida de agentes inclui a talidomida ou o análogo CC-5013.

[0113] Em um aspecto, o outro agente terapêutico é um modulador imunológico incluindo inibidor de indolamina oxidase, inibidores VEGF/ VEGFR selecionados do anticorpo monoclonal (mAb) e classe de inibidor de tirosina quinase (TKI) que inclui bevacuzimabe (Avastin) (mAb, inibindo VEGF-A, Genentech); IMC-1121B (mAb, inibindo VEGFR-2, ImClone Systems); CDP-791

(DiFab Peguilado, VEGFR-2, Celltech); 2C3 (mAb, VEGF-A, Peregrine Pharmaceuticals); PTK-787 (TKI, VEGFR-1, -2, Novartis); AEE788 (TKI, VEGFR-2 e EGFR, Novartis); ZD6474 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, EGFR AstraZeneca); AZD2171 (TKI, VEGFR-1, -2, AstraZeneca); SU11248 (TKI, VEGFR-1, -2, PDGFR Pfizer); AG13925 (TKI, VEGFR-1, -2, Pfizer); AG013736 (TKI, VEGFR-1, -2, Pfizer); CEP-7055 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, Cephalon); CP- 547,632 (TKI, VEGFR-1, -2, Pfizer); VEGF-trap (receptor híbrido solúvel VEGF- A, P1GF (fator de crescimento placentário) Aventis/ Regeneron); GW786024 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, GlaxoSmithKline); Bay 93-4006 (TKI, VEGFR-1, -2, PDGFR Bayer/ Onyx); e AMG706 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, Amgen). Os mais preferidos são os inibidores de tirosina quinase que inibem um ou mais receptores tirosina quinase selecionados a partir do grupo que consiste em VEGFR1, VEGFR-2,3 PDGFR-beta, Flt-3, c-Kit, p38 alfa e FGFR-1. Os exemplos preferidos incluem SU11248 (Pfizer) e Bay 93-4006 (sorefanib, Bayer).

[0114] Os métodos de uso de uma composição de agonista de TLR3 aqui descritos também podem compreender o tratamento de combinação com um agente pró-apoptótico. As composições de agonistas de TLR3 descritas acima podem, assim, incluir também um agente pró-apoptótico. Várias proteínas úteis como alvos para a modulação por agentes farmacêuticos são conhecidas na técnica, incluindo qualquer uma das revistas em Green e Kroemer, J. (2005) Clin. Investig. 115(10):2610-2617. Exemplos de agentes farmacêuticos pró- apoptóticos incluem: drogas que induzem a permeabilização da membrana mitocondrial externa, como oblimirsen (oligonucleotídeo antisense Bcl-2, Genta), EGCG (molécula pequena direcionada a Bcl-2, Burnham Inst./Mayo Clinic), Gossypol (molécula pequena direcionada a Bcl-2, Univ. Michigan), LY2181308 (oligonucleotídeo antisense direcionado à survivina (Eli Lilly/ Isis) e trióxido de arsênio; drogas que regulam a atividade de p53, como Advexin INGN201 (adenovírus modulando p53, Introgen), SCH58500 (adenovírus modulando p53,

Schering-Plough), ONYX-015 (adenovírus mutado E1B modulando p53, Onyx Pharma.); drogas que modulam caspases e/ou inibidores endógenos ou caspases, tais como AEG35156 (oligonucleotídeo antisense direcionado a XIAP, Aegara/ Hybridon); drogas que modulam cIAP1-2, tais como birinapant; drogas que modulam receptores de morte e/ou seus ligantes, tais como polipeptídeos TNF-alfa, HGS-ETR1 (mAb agonístico direcionado a TRAIL-R1, Human Genome Sciences), HGS-ETR2 e HGS-TR2J ((dois mAbs agonísticos direcionados a TRAIL-R2, Human Genome Sciences); PRO1764 (ligantes TRAIN solúveis, Genentech/ Amgen); e drogas direcionadas a poli(ADP-ribose) polimerase (PARP), tal como AG014699 (molécula pequena, Cancer Res. Tech.); drogas direcionadas a proteossoma, tais como bortezomib (Velcade) (inibidor de proteossoma 26S, Millennium Pharma.); e inibidores de quinase, tais como herceptina (mAb direcionado a HER2, Roche), centuximabe (mAb direcionado a HER1, Imclone/ BMS), gefitinibe (Iressa) e erlotinibe (Tarceva) (inibidores de moléculas pequenas de HER1, AstraZeneca e Genentech/ OSI respectivamente, CCI-779 (molécula pequena atuando em mTOR, Novartis, Bay 43-9006 (inibidor de molécula pequena de quinases incluindo Raf e VEGFR e mesilato de imatinibe (Gleevec, STI-571) (inibidor de molécula pequena de cKit, PDGFR, Bcr-Abl, Novartis)

[0115] As composições de agonistas de TLR3 descritas acima também podem incluir outros agentes terapêuticos, tais como agentes imunomoduladores, tais como fator de necrose tumoral, interferon alfa, beta e gama, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, DNA de fita simples contendo CpG, agonistas de outros TLRs incluindo, por exemplo, BCG, outras citocinas e agentes de imunossupressão imunoestimulantes; F42K e outros análogos de citocinas; ou MIP-1, MIP-I beta, MCP-1, RANTES e outras quimiocinas; agentes que afetam a regulação positiva de receptores de superfície celular e junções GAP; agentes citostáticos e de diferenciação; ou inibidores da adesão celular.

[0116] Também é descrita uma composição de matéria compreendendo um agonista de TLR3 e outro agente terapêutico útil no tratamento de câncer em formas de dosagem separadas, mas associados um ao outro. O termo “associado um ao outro”, tal como aqui utilizado, significa que as formas de dosagem separadas são embaladas juntas ou de outra forma ligadas umas às outras de modo que seja prontamente aparente que as formas de dosagem separadas se destinam a ser vendidas e administradas como parte do mesmo regime. O agente e o agonista de TLR3 são preferencialmente embalados juntos em uma embalagem de blister ou outra embalagem de múltiplas câmaras, ou como recipientes conectados e vedados separadamente (tais como bolsas de alumínio ou semelhantes) que podem ser separados pelo usuário (por exemplo, rasgando linhas ponteadas entre os dois recipientes).

[0117] As composições de agonistas de TLR3 descritas acima também podem incluir outras modalidades terapêuticas, incluindo o uso de radiação ionizante, a injeção de células CAR-T e/ou o uso de vírus oncolíticos.

CÂNCER E MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[0118] O presente relatório descritivo abrange um agonista de TLR3 para uso na prevenção, controle, tratamento ou melhora de câncer ou de um ou mais sintomas do mesmo. A invenção também abrange o uso de um agonista de TLR3 para a fabricação de um medicamento para a prevenção, controle, tratamento ou melhora de câncer ou de um ou mais sintomas do mesmo.

Também abrange métodos para prevenir, controlar, tratar ou melhorar o câncer ou um ou mais sintomas do mesmo.

[0119] Exemplos de cânceres que podem ser prevenidos, controlados, tratados ou melhorados de acordo com os métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a, tumores sólidos e, particularmente, cânceres, tais como câncer de cabeça, pescoço, olhos, boca, garganta, esôfago, tórax, osso, pulmão, cólon, reto, estômago, próstata, mama, ovários, rim, fígado,

pâncreas e cérebro.

[0120] São descritos métodos para prevenir, controlar, tratar ou melhorar o câncer que tem o potencial de metástase ou que metastizou para um órgão ou tecido (por exemplo, osso) ou um ou mais sintomas do mesmo.

Também é descrito um agonista de TLR3 para uso na prevenção, controle, tratamento ou melhora de câncer que tem o potencial de metástase ou que metastizou para um órgão ou tecido (por exemplo, osso) ou um ou mais sintomas do mesmo.

[0121] Os referidos métodos e usos compreendem a administração a um indivíduo, em necessidade da mesma, de uma ou mais doses de uma quantidade profilática ou terapeuticamente de um agonista de TLR3 de acordo com a invenção. De preferência, o agonista de TLR3 é administrado mais de uma vez. Opcionalmente, o agonista de TLR3 é administrado em um intervalo de menos de um mês, menos de três semanas, menos de duas semanas ou menos de uma semana. Opcionalmente, tal tratamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, ou a cada 1, 2, 3, 4 e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses.

[0122] O presente relatório descritivo fornece métodos para prevenir, controlar, tratar ou melhorar o câncer ou um ou mais sintomas do mesmo, os referidos métodos compreendendo a administração a um indivíduo, em necessidade da mesma, de uma dosagem de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de um agonista de TLR3 em combinação com a administração de uma dosagem de uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz de um ou mais outros agentes úteis para a terapia do câncer. O relatório descritivo também diz respeito a um agonista de TLR3 para uso na prevenção, controle, tratamento ou melhora de câncer, em que o referido agonista de TLR3 é usado em combinação com um ou mais agentes úteis para a terapia do câncer. De preferência, o agonista de

TLR3 é administrado mais de uma vez. Opcionalmente, o agonista de TLR3 é administrado em um intervalo de menos de um mês, menos de três semanas, menos de duas semanas ou menos de uma semana. Opcionalmente, tal tratamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, ou a cada 1, 2, 3, 4 e 5 semanas ou a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses.

[0123] Cada composto das combinações ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção pode ser administrado separadamente, sequencialmente ou simultaneamente. Em uma forma de realização, o agonista de TLR3 da invenção é administrado antes ou após o outro agente quimioterápico.

[0124] Em uma forma de realização, um dsRNA é administrado a um indivíduo usando um regime de dosagem que mantém a concentração plasmática do agonista em um nível desejável. Em uma forma de realização específica, a concentração plasmática do dsRNA é mantida em cerca de 10 µg/ml, 15 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml, 30 µg/ml, 35 µg/ml, 40 µg/ml, 45 µg/ml ou 50 µg/ml. A concentração plasmática que é desejável em um indivíduo irá variar dependendo de vários fatores, incluindo, mas não se limitando a, a natureza do câncer, a gravidade do câncer e a meia-vida de circulação (estabilidade) e afinidade de ligação do agonista de TLR3.

[0125] As quantidades de dosagem e frequências de administração fornecidas neste documento são abrangidas pelos termos terapeuticamente eficaz e profilaticamente eficaz. A dosagem e a frequência irão ainda variar tipicamente de acordo com fatores específicos para cada paciente dependendo dos agentes terapêuticos ou profiláticos específicos administrados, da gravidade e tipo de câncer, da via de administração, bem como da idade, peso corporal.

[0126] Em particular, as doses de agonista de TLR3 de acordo com a invenção que podem ser administradas estão entre 0,1 mg/kg e 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg de peso corporal.

[0127] De preferência, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agonista de TLR3 (opcionalmente em combinação com outro agente terapêutico ou protocolo terapêutico) reduz o tamanho de um tumor ou a propagação de um tumor em um indivíduo em pelo menos 5%, de preferência pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% em relação a um controle, tal como PBS.

[0128] No escopo da presente invenção, deve ser entendido que “um agonista de TLR3 para uso” é equivalente a “o uso de um agonista de TLR3” e, em particular, que “um agonista de TLR3 para uso no tratamento de” é equivalente a “o uso de um agonista TLR3 para o tratamento de”. A invenção também abrange “o uso de um agonista de TLR3 para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de” de acordo com a presente divulgação.

TIPOS DE CÂNCER

[0129] Em várias formas de realização, o presente relatório descritivo fornece métodos para determinar regimes de tratamento para indivíduos com câncer. Os métodos podem ser usados para determinar os regimes de tratamento de qualquer câncer ou tumor, por exemplo, mas não se limitando a, malignidades e distúrbios relacionados incluem, mas não estão limitados ao seguinte, e expressando TLR3.

[0130] Consequentemente, os métodos são úteis no tratamento de uma variedade de cânceres ou outras doenças proliferativas anormais, incluindo (mas não se limitando a) o seguinte: carcinoma, incluindo o da bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, estômago, colo do útero, tireóide e pele; incluindo carcinoma de células escamosas; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo leucemias mielógenas agudas e crônicas e leucemia promielocítica; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma e rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma, teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso central e periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrosarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, ceratoacantoma, seminoma, câncer folicular da tireoide e teratocarcinoma. Em formas de realização específicas, malignidade ou alterações disproliferativas (tais como metaplasias e displasias) ou distúrbios hiperproliferativos são tratados no ovário, bexiga, mama, cólon, pulmão, pele, pâncreas ou útero. Em outras formas de realização específicas, sarcoma, melanoma ou leucemia são tratados.

[0131] Os métodos são usados para tumores sólidos positivos para TLR3. Exemplos de tumores incluem câncer de mama, cólon, ovário, pulmão, cérebro e próstata e melanoma. De preferência, os métodos são direcionados ao tratamento do câncer de mama.

SÍNTESE DE DSRNA

[0132] Métodos de síntese padrão podem ser usados para produzir composições de dsRNA de acordo com as especificações da invenção. Como exemplo, pode ser usada a tecnologia de síntese em fase sólida de fosforamidita padrão. Ver M. D. Matteucci et al., Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862 (1981). A química de síntese de RNA 2'-ACE pode ser usada e com base em um esquema de grupo de proteção, conforme revelado em SA Scaringe, Ph.D Thesis, University of Colorado, 1996. A tecnologia Dharmacon™ para RNAi, Expressão Gênica e Edição de Genes, e química de síntese RNA 2'-ACE da GE Healthcare pode ser usada. Métodos tais como eletroforese em gel, tal como o gel de acrilamida usado nos exemplos, podem ser usados para verificar a pureza.

FIGURAS

[0133] Figura 1: Perfil de dsRNA em um gel de acrilamida a 8% (TBE 1X) de dsRNAs de 50 pb e Poli(A:U) comercial. 5 µg de dsRNA (345, 397, 398, 415, 418, 405, 411, 412, 413) e Poli(A:U) comercial foram carregados em gel de acrilamida a 8% e corados com BET. Os dados são representativos de 9 de 17 dsRNA de 50 pb testados.

[0134] Figura 2: Secreção de TNF alfa por células RAW264.7 de macrófagos de camundongo em resposta a dsRNA de 50 pb sozinho. As células RAW264.7 foram tratadas durante 24 horas com 10 µg/ml de cada dsRNA e a secreção de mTNF alfa foi medida com ELISA. Os dados são representativos de dois ensaios independentes usando dois lotes diferentes do dsRNA 412 de 50 pb.

[0135] Figura 3: Secreção de IL6 por células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas NCI-H292 após tratamento com 9 dsRNA de 50 pb sozinho. As células NCI-H292 foram tratadas durante 24 horas com 10 µg/ml de cada dsRNA e a secreção de hIL6 foi medida com ELISA. Os dados são representativos de três ensaios independentes.

[0136] Figura 4: dsRNA 412 de 50 pb não desencadeia a morte em células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas NCI-H292. As células NCI-H292 foram tratadas durante 24 horas com 50 µg/ml de cada dsRNA.

As células positivas para anexina-V foram medidas por quimioluminescência (kit Annexin V-Glo, Promega). Os dados são representativos de três ensaios independentes usando dois lotes diferentes do dsRNA 412 de 50 pb.

[0137] Figura 5: Perfil de dsRNA em um gel de acrilamida a 6% nativo (TBE 1X) do dsRNA 412, 432, 452 e Poli(A:U) comercial. 1 µg de dsRNA 412 (Poli(A:U) 50 pb), 432 (Poli(A:U) 70 pb), 452 (Poli(A:U) 90 pb) e Poli(A:U) comercial foram carregados em gel de acrilamida a 6% e corados com BET.

Dados representativos de dois experimentos independentes.

[0138] Figura 6: Secreção de TNF alfa por células RAW264.7 de macrófagos de camundongo em resposta a Poli(A:U) de tamanho crescente sozinho. As células RAW264.7 foram tratadas durante 24 horas com 10 µg/ml de cada dsRNA e a secreção de mTNF alfa foi medida com ELISA. Os dados são representativos de três ensaios independentes.

[0139] Figura 7: Poli(A:U) de tamanho crescente sozinho ativa o gene repórter ISRE em RAW264.7 de macrófagos de camundongo. As células RAW264.7 foram tratadas durante 24 horas com 50 µg/ml com o dsRNA indicado. A bioluminescência induzida por ISRE foi medida (QUANTI-luc, Invivogen). Os dados são representativos de três ensaios independentes.

[0140] Figura 8: Poli(A:U) de tamanhos crescentes sozinho desencadeia a secreção dependente de TLR3 de IL6 por células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas NCI-H292. As células WT ou TLR3 KO NCI-H292 foram tratadas por 24 horas com 10 µg/ml de cada dsRNA e a secreção de hIL6 foi medida com ELISA. Os dados são representativos de três ensaios independentes.

[0141] Figura 9: Poli(A:U) de tamanhos crescentes sozinho desencadeia a morte dependente de TLR3 de células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas NCI-H292. As células NCI-H292 foram tratadas durante 24 horas com 50 µg/ml dos dsRNAs indicados. As células positivas para anexina-V foram medidas por quimioluminescência (kit Annexin V-Glo, Promega). Os dados são representativos de três ensaios independentes.

[0142] Figura 10: Perfil de dsRNA em um gel de acrilamida a 6% nativo (TBE 1X) do dsRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 e Poli(A:U) comercial. 1 µg de cada um destes dsRNA e Poli(A:U) comercial foram carregados em gel de acrilamida a 6% e corados com BET. Dados representativos de dois experimentos independentes.

[0143] Figura 11: Secreção de TNF alfa por células RAW264.7 de macrófagos de camundongo em resposta a Poli(A:U) comercial e dsRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535. Células RAW264.7 foram tratadas por 24 horas com 10 µg/ml de cada dsRNA e a secreção de mTNF alfa foi medida com ELISA.

Os dados são representativos de dois ensaios independentes.

[0144] Figura 12: Secreção dependente de TLR3 de IL6 por células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas NCI-H292, em resposta a Poli(A:U) comercial e dsRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535. As células WT ou TLR3 KO NCI-H292 foram tratadas durante 24 horas com 10 µg/ml de cada dsRNA e a secreção de hIL6 foi medida com ELISA. Os dados são representativos de pelo menos dois ensaios independentes.

[0145] Figura 13: Morte dependente de TLR3 de células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas NCI-H292, em resposta a Poli(A:U) comercial e dsRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535. Células NCI- H292 foram tratadas durante 24 horas com 50 µg/ml dos dsRNAs indicados. As células positivas para anexina-V foram medidas por quimioluminescência (kit Annexin V-Glo, Promega). Os dados são representativos de dois ensaios independentes.

[0146] Figura 14: Secreção de TNF alfa por células RAW264.7 de macrófagos de camundongo em resposta ao dsRNA 532 feito a partir de duas tecnologias de fabricação química diferentes. As células RAW264.7 foram tratadas durante 24 horas com uma dose-resposta de 1 a 100 µg/ml do dsRNA 532 indicado e a secreção de mTNF alfa foi medida com ELISA. Os dados são a média de pelo menos três ensaios independentes e são representativos de pelo menos seis ensaios independentes.

[0147] Figura 15: Secreção de TNF alfa por células RAW264.7 de macrófagos de camundongo em resposta ao dsRNA 532 feito de duas empresas fabricantes diferentes. As células RAW264.7 foram tratadas durante 24 horas com uma dose-resposta de 1 a 100 µg/ml do dsRNA 532 indicado e a secreção de mTNF alfa foi medida com ELISA. Os dados são a média de pelo menos cinco ensaios independentes.

[0148] Figura 16: dsRNA 532 feito a partir de duas tecnologias de síntese química diferentes ou de duas empresas fabricantes diferentes desencadeia o mesmo nível de morte de células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas NCI-H292. As células NCI-H292 foram tratadas durante 24 horas com uma dose-resposta de 1 a 100 µg/ml dos dsRNAs indicados. As células positivas para anexina-V foram medidas por quimioluminescência (kit Annexin V-Glo, Promega). Os dados são representativos de pelo menos quatro ensaios independentes.

[0149] Figura 17: dsRNA 532 feito a partir de duas tecnologias de síntese química diferentes desencadeia o mesmo nível de redução da viabilidade celular de células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas NCI- H292. As células NCI-H292 foram tratadas durante 24 horas com uma dose- resposta de 1 a 100 µg/ml dos dsRNAs indicados. Os ensaios de viabilidade celular foram medidos por MTS (kit de solução Cell Titer Aqueous, Promega). Os dados são representativos de pelo menos quatro ensaios independentes.

[0150] Figura 18: dsRNA 532 feito de duas empresas fabricantes diferentes desencadeia o mesmo nível de redução da viabilidade celular de células de câncer de pulmão de células não pequenas humanas NCI-H292. As células NCI-H292 foram tratadas durante 24 horas com uma dose-resposta de 1 a 100 µg/ml dos dsRNAs indicados. Os ensaios de viabilidade celular foram medidos por MTS (kit de solução Cell Titer Aqueous, Promega). Os dados são representativos de pelo menos cinco ensaios independentes.

[0151] Figura 19: Perfil de dsRNA em um gel de acrilamida a 6% nativo (TBE 1X) de Poli(A:U) e dsRNA 532 após digestão com RNAse I ou RNAse III. 1 µg de dsRNA e Poli(A:U) comercial foram carregados em gel de acrilamida a 6% e corados com BET. Os dados são representativos de pelo menos dois ensaios independentes.

[0152] Figura 20: Perfil de cálculo de dsRNA Tm do Poli(A:U) e do dsRNA 532. 1 µg de dsRNA foi misturado com uma mistura de Q-PCR SyBr verde e foi realizada a análise da curva de fusão. Os dados são representativos de pelo menos três ensaios independentes. Na abscissa, temperatura em graus Celsius. Na ordenada, -d(RFU)/dT. O pico de fusão é indicado.

EXEMPLOS

[0153] Abreviações: TLR3: Receptor Toll-Like 3 (CD283) WT: Tipo Selvagem KO: Knock Out (inativação) TBE: Tris Borato EDTA APS: Persulfato de Amônio TEMED: Tetrametiletilenodiamina BET: Bromuro de Etidio DNA: Ácido Desoxirribonucléico RNA: Ácido Ribonucléico dsRNA: RNA de fita dupla ssRNA: RNA de fita dupla Poli(A:U): Ácido Poli-Adenílico-Poli-Uridílico PAU: Poli(A:U) comercial de alto peso molecular Poli(I:C): Ácido Poli-Inosínico-Poli-Citidílico PIC: Poli(I:C) pb: par de base mTNFa: fator de necrose tumoral alfa de camundongo hIL6: Interleucina-6 humana Å: Angstrom 5’ppp: 5’ tri-fosfato

ISRE: Elemento de Resposta Estimulada por Interferon TABELA 1

SE Nº de

Q identific Sequência 5’→3’ ID ação de

N dsRNA O: UACIUCAUAUAIIIACCUAUIUUAUCUICIUIUCCAACCU 1 Sense

UAIIAUUCAC 1 Antise IUIAAUCCUAAIIUUIIACACICAIAUAACAUAIIUCCCUAU 2 nse AUIACIUA UCIIUCIACICAAICIAUUACACUCCUIUCACAUCAUAAU 3 Sense

CIUUUICUAU 3 Antise AUAICAAACIAUUAUIAUIUIACAIIAIUIUAAUCICUUICIU 4 nse CIACCIA AAUIAAIUAUUIICAIACAUUIAIUICCIAACAAIACCUIAC 5 Sense

CUAACIIU 4 Antise ACCIUUAIIUCAIIUCUUIUUCIICACUCAAUIUCUICCAA 6 nse UACUUCAUU CICUIUUUUCIAAAUUACCCUUUAUICICIIIUAUUIAACC 7 Sense

ACICUUAUI 5 Antise CAUAAICIUIIUUCAAUACCCICICAUAAAIIIUAAUUUCIA 8 nse AAACAICI IIAAIUIUIICUAIAUCUUAICUUACIUCACUAIAIIIUCCACI 9 Sense 6 UUUAIU Antise ACUAAACIUIIACCCUCUAIUIACIUAAICUAAIAUCUAIC 10

SE Nº de

Q identific Sequência 5’→3’ ID ação de

N dsRNA O: nse CACACUUCC AAIAIAIUCUCAUAAUACIUCCIICCICAUICICAIIIUAUAU 11 Sense

UUIIACA 9 Antise UIUCCAAAUAUACCCUICICAUICIICCIIACIUAUUAUIAI 12 nse ACUCUCUU AUAIAAACUACAIIACUAACCUUCCUIICAACCIIIAIIUIIIA 13 Sense

AUCCIU 10 Antise ACIIAUUCCCACCUCCCIIUUICCAIIAAIIUUAIUCCUIUAI 14 nse UUUCUAU IAIIAIIAIUCIUCAIACCAIAUAICUUUIAUIUCCUIAUCIIAA 15 Sense

IIAUC 13 Antise IAUCCUUCCIAUCAIIACAUCAAAICUAUCUIIUCUIACIA 16 nse CUCCUCCUC IIAUACIAIAUCCIUAIAUUIAUAAIIIACACIIAAUAUCCCCI 17 Sense

IACICA 14 Antise UICIUCCIIIIAUAUUCCIUIUCCCUUAUCAAUCUACIIAU 18 nse CUCIUAUCC ACIUUCUAAIAIUUIIACIAAAUIUUUCICIACCUAIIAUIAII 19 Sense

UCICCC 16 Antise IIICIACCUCAUCCUAIIUCICIAAACAUUUCIUCCAACUC 20 nse UUAIAACIU

SE Nº de

Q identific Sequência 5’→3’ ID ação de

N dsRNA O: UACIUAICAAIIUIACACAAICACAIUAIAUCCUICCCICIU 21 Sense

UUCCUAUI 17 Antise CAUAIIAAACICIIICAIIAUCUACUIUICUUIUIUCACCUUI 22 nse CUACIUA CUAIUUIUIIAUUIIAUUICCAUUCUCCIAIUIUAUUACCIU 23 Sense

IACIICCI 18 Antise CIICCIUCACIIUAAUACACUCIIAIAAUIICAAUCCAAUCC 24 nse ACAACUAI CACIIIUCCCAUIUAAUICAIUCIUAICCUACCUIACUIUA 25 Sense

CUUIIAAIU 19 Antise ACUUCCAAIUACAIUCAIIUAIICUACIACUICAUUACAUII 26 nse IACCCIUI IACCIIACIAACCACAIAICICUIIAAIAAUCUCUAICUICUU 27 Sense

UACAAAI 20 Antise CUUUIUAAAICAICUAIAIAUUCUUCCAICICUCUIUIIUU 28 nse CIUCCIIUC UUUCCCACUICCUUAAICCIICUUICCCUUUCUICCUIU 29 Sense

AIAUCCAUUII 21 Antise CCAAUIIAUCUACAIICAIAAAIIICAAICCIICUUAAIICAIUI 30 nse IIAAA 22 Sense ICAACUUCIAIIACCUAAUIUIACCIACCUAIAUUCIICAUU 31

SE Nº de

Q identific Sequência 5’→3’ ID ação de

N dsRNA O:

IUIIICAI Antise CUICCCACAAUICCIAAUCUAIIUCIIUCACAUUAIIUCCU 32 nse CIAAIUUIC IAUCUAUIICIUIAIACCCIUUAUICUCCAUUACIIUCAIUIII 33 Sense

UCACAI 23 Antise CUIUIACCCACUIACCIUAAUIIAICAUAACIIIUCUCACIC 34 nse CAUAIAUC ACUICIACIUUCUAAACIUUIIUCCIUCAIAAICICCAUCC 35 Sense

AIIAUCACI 24 Antise CIUIAUCCUIIAUIICICUUCUIACIIACCAACIUUUAIAACI 36 nse UCICAIU ACUIIUICCAACICICAIICAUAIUUCIAIIAIAAUUAUCCIIIII 37 Sense

CAAU 25 Antise AUUICCCCCIIAUAAUUCUCCUCIAACUAUICCUICICIU 38 nse UIICACCAIU IACAACCAICAUCUCIIIUCUUICCCAACCCIUCUACACI 39 Sense

CUIUUAUAIC 26 Antise ICUAUAACAICIUIUAIACIIIUUIIICAAIACCCIAIAUICUIIU 40 nse UIUC CAUICUAICIUICIIIIUACACUUICUAACCAUUUIIIACACII 41 27 Sense

IACACU

SE Nº de

Q identific Sequência 5’→3’ ID ação de

N dsRNA O: Antise AIUIUCCCIUIUCCCAAAUIIUUAICAAIUIUACCCCICACI 42 nse CUAICAUI AUAIACIIACAICUUIIUAUCCUIAICACAIUCICICIUCCIA 43 Sense

AUCUAIC 28 Antise ICUAIAUUCIIACICICIACUIUICUCAIIAUACCAAICUIUC 44 nse CIUCUAU UACCCAUACUCCACCIUUIICAIIIIIAUCICAUIUCCCACI 45 Sense

UIAAACAU 29 Antise AUIUUUCACIUIIIACAUICIAUCCCCCUICCAACIIUIIAIU 46 nse AUIIIUA AIUACAAIACUAICCUUICUAICAACCICIIICUIIIAICCUA 47 Sense

AIIUAUC 30 Antise IAUACCUUAIICUCCCAICCCICIIUUICUAICAAIICUAIUC 48 nse UUIUACU UUCAICICICAIICUUIIIUCIAIAUAAAAUCUCCAIUICCCA 49 Sense

AIACCAC 31 Antise IUIIUCUUIIICACUIIAIAUUUUAUCUCIACCCAAICCUICI 50 nse CICUIAA ICAACIIAACIUCCUUAICUCCIICAIICAAUUAAIIIIAACIC 51 Sense 32 AAICAU Antise AUICUUICIUUCCCCUUAAUUICCUICCIIAICUAAIIACIU 52

SE Nº de

Q identific Sequência 5’→3’ ID ação de

N dsRNA O: nse UCCIUUIC IUAUCAUUIUICACCUICCIIUIACCACUCAACIAUIUIIIIA 53 Sense

CICCIUU 33 Antise AACIICIUCCCCACAUCIUUIAIUIIUCACCIICAIIUICACA 54 nse AUIAUAC IUUACCCAUAUIIUCCACAIIACACUCIUCICUUCCIIICU 55 Sense

UICCCUCUA 34 Antise UAIAIIICAAICCCIIAAICIACIAIUIUCCUIUIIACCAUAUIII 56 nse UAAC ACICUIUCUCUIICACIUIIIUIICCUAIAIIAAUCACAUCCA 57 Sense

AICCUII 36 Antise CCAIICUUIIAUIUIAUUCCUCUAIICCACCCACIUICCAIAI 58 nse ACAICIU IUCIUIICAAUIUUCIUCUIIIUIUIIUCUACACAAUICIIICIIUI 59 Sense

CIU 37 Antise ACICACCICCCICAUUIUIUAIACCACACCCAIACIAACA 60 nse UUICCACIAC UIICAIACACACCIUIACCCCICCUCUCCAUUIAUICCACI 61 Sense

ICIAAUIUC 38 Antise IACAUUCICCIUIICAUCAAUIIAIAIICIIIIUCACIIUIUIUCUI 62 nse CCA

SE Nº de

Q identific Sequência 5’→3’ ID ação de

N dsRNA O: AICCCUUCUCCCCUICIICCACICCCIUAIAIAUCACICCU 63 Sense

UUIACCCUC 40 Antise IAIIIUCAAAIICIUIAUCUCUACIIICIUIICCICAIIIIAIAAIIIC 64 nse U ACICUICAIIACUUICAACCIIICAIACUCIICIICAIIUCCUAI 65 Sense

UICAI 41 Antise CUICACUAIIACCUICCICCIAIUCUICCCIIUUICAAIUCC 66 nse UICAICIU IICIAAIICCCUAACIIIAIAUACICICCCACAACUCIICICIAA 67 Sense

UACII 42 Antise CCIUAUUCICICCIAIUUIUIIICICIUAUCUCCCIUUAIIICC 68 nse UUCICC ICACCAIAUCUIUAAIIUCCICCACICAIACIAIICCIIICIIAIA 69 Sense

CCAC 44 Antise IUIIUCUCCICCCIICCUCIUCUICIUIICIIACCUUACAIAU 70 nse CUIIUIC UCCUIIAIIAIIIICIIAUAICCUCUUACCCIUICCCCACCIUU 71 Sense

IICIIU 45 Antise ACCICCAACIIUIIIICACIIIUAAIAIICUAUCCICCCCUCCU 72 nse CCAIIA 47 Sense UICICCIIUCCCCAICCICICUCAUICUCIICACCICCAUAA 73

SE Nº de

Q identific Sequência 5’→3’ ID ação de

N dsRNA O:

CCAIACCI Antise CIIUCUIIUUAUIICIIUICCIAICAUIAICICIICUIIIIACCIICIC 74 nse A UAICCICCCCUIIICCICIIUCCICUACCUUICAIIAAUCIAII 75 Sense

CCIUCC 48 Antise IIACIICCUCIAUUCCUICAAIIUAICIIACCICIICCCAIIIICII 76 nse CUA ICUICUUCIICICCCCIIICICACCCCUICCICIIIIICIIIAUCIC 77 Sense

CCI 345 Antise CIIICIAUCCCICCCCCICIICAIIIIUICICCCIIIICICCIAAICA 78 nse IC IUCIICICCCIICCCCCCIICCCCICAICIIICUCCCCICCCIII 79 Sense

CCICC 397 Antise 80

IICIICCCIIICIIIIAICCCICUICIIIICCIIIIIICCIIICICCIAC nse IIIIIICCCACICIICIICICCICCIICICCCCCIIIICICCCCICIUC 81 Sense

I 398 Antise CIACICIIIICICCCCIIIIICICCIICIICICCICCICIUIIICCCCC 82 nse C Sense CIIICCIICIIIIIICIIICIIIIICCCCUIICCCICCCIICICCCCICI 83 415 Antise CICIIIICICCIIICIIICCAIIIICCCCCICCCICCCCCCICCIICC 84

SE Nº de

Q identific Sequência 5’→3’ ID ação de

N dsRNA O: nse CI Sense IIICCIIIICIICCCCIIICIICIICCICCIICCCCIICIICIIIICICC 85 418 Antise IICICCCCICCICCIIIICCIICIICCICCICCCIIIICCICCCCIIC 86 nse CC Sense IIAUAIIIICIICCCCIIICIICIICCICCIICCCCIICIICIIIICIUU 87 405 Antise AACICCCCICCICCIIIICCIICIICCICCICCCIIIICCICCCCU 88 nse AUCC AUUUAAAAAAUAAAUAUAAUAAAAUAUAAUUUAAUU 89 Sense

AAUUAUUUAUUAAU 413 Antise AUUAAUAAAUAAUUAAUUAAAUUAUAUUUUAUUAUA 90 nse UUUAUUUUUUAAAU Sense IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII 91 411 Antise CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC 92 nse CCCCCCCCCCCCCCC AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 93 Sense

AAAAAAAAAAAAA 412 Antise UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU 94 nse UUUUUUUUUUUUUUU

[0154] Tabela 1: Sequências de 47 dsRNA de 50 pb testados quanto à sua capacidade de ativar a resposta inflamatória nas células RAW264.7 de macrófagos de camundongo.

TABELA 2 Nº de identificação de dsRNA 60 bases A Sense 422 60 bases U Antisense 70 bases A Sense 432 70 bases U Antisense 80 bases A Sense 442 80 bases U Antisense 90 bases A Sense 452 90 bases U Antisense 70 bases: 10 I - 50 A – 10 I Sense 532 70 bases: 10 C – 50 U – 10 C Antisense 70 bases: 35 A – 35 I Sense 533 70 bases: 35 U – 35 C Antisense 70 bases: 10 A – 50 I – 10 A Sense 534 70 bases: 10 U – 50 C – 10 U Antisense 70 bases I Sense 535 70 bases C Antisense

[0155] Tabela 2: Sequências do dsRNA Poli(A:U) variando de 60 a 90 pb (sequências 422, 432, 442, 452) e sequências da família dsRNA de 70 pb com quantidade crescente de Poli(ácido inosínico: ácido citidílico) (dsRNAs 532, 533, 534, 535) em relação à sequência de dsRNA 432 e testados quanto à sua capacidade de ativar a resposta inflamatória nas células RAW264.7 de macrófagos de camundongo e apoptose com resposta inflamatória na célula de câncer de pulmão humana NCI-H292.

[0156] As seguintes outras fitas e suas fitas complementares podem ser sintetizadas da mesma maneira e, em seguida, hibridizadas: 5’ (I)10 – (U)50 - (I)10 3’ 5’ (A)60 – (I)10 3’ 5’ (A)50 – (I)20 3’ 5’ (A)20 – (I)50 3’ 5’ (A)10 – (I)60 3’ 5’ (I)5 – (A)60 - (I)5 3’ 5’ (I)15 – (A)40 - (I)15 3’

5’ (I)20 – (A)30 - (I)20 3’ 5’ (I)25 – (A)20 - (I)25 3’ 5’ (I)30 – (A)10 - (I)30 3’ 5’ (I)5 – (A)50 - (I)15 3’ 5’ (I)13 – (A)64 - (I)13 3’ 5’ (I)10 – (A)70 - (I)10 3’ EXEMPLO 1 E FIGURA 1: ANÁLISE DE DSRNAS DE 50 PB E POLI(A:U) COMERCIAL EM GEL DE ACRILAMIDA A 8% NATIVO (TBE 1X).

[0157] Os dsRNAs liofilizados obtidos da DHARMACON™ (Colorado, EUA) foram ressuspensos em água fisiológica estéril livre de RNAse (INVIVOGEN, França) de acordo com o protocolo do fabricante. Após a adição de tampão de carregamento de ácido nucleico (Invitrogen, número de catálogo AM8556), 5 µg de dsRNAs foram carregados em um gel de acrilamida a 8% preparado da seguinte forma: 9,3 ml de água estéril livre de RNAse (Sigma- Aldrich onde, número de catálogo W4502), 1,5 ml de TBE 10x (Sigma-Aldrich), 4 ml de acrilamida-bis 30% (Merck Chemicals, Alemanha, número de catálogo

1.00639.1000), 0,2 ml de APS (Sigma-Aldrich), 20 µl de TEMED (Sigma-Aldrich).

A escala de RNA foi obtida da Invitrogen (número de catálogo SM1833). A migração das amostras foi estabelecida em 100 V por 1 h antes da coloração BET (Sigma-Aldrich) em 1 µg/ml. O gel foi então visualizado usando o analisador GelDoc XR+ (BIORAD, Califórnia, EUA). Os dados são representativos de 9 de 17 dsRNA de 50 pb.

EXEMPLO 2 E FIGURA 2: SECREÇÃO DE TNF-ALFA POR CÉLULAS RAW264.7 DE MACRÓFAGOS DE CAMUNDONGO EM RESPOSTA A DSRNA DE 50 PB SOZINHO.

[0158] Os dsRNAs liofilizados foram obtidos da IDT ou DHARMACON. 5.104 células RAW264.7 foram semeadas em um volume final de 200 µl em placas de 96 poços (CORNING, EUA, número de catálogo 353072).

24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNA sem reagente de transfecção em uma concentração final de 10 µg/ml por 24 horas e os sobrenadantes foram coletados para medir a secreção de TNF-alfa de camundongo por ELISA (BioLegend, EUA, número de catálogo 430903). PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de dois ensaios independentes usando dois lotes diferentes de dsRNA 412 de 50 pb.

EXEMPLO 3 E FIGURA 3: SECREÇÃO DE IL6 POR CÉLULAS DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS NCI-H292 APÓS TRATAMENTO COM PAU OU COM DSRNAS DE 50 PB SOZINHO.

[0159] 3.103 células NCI-H292 WT ou TLR3 KO foram semeadas em um volume final de 300 µl/poço de placas de p48 poços (CORNING, EUA, número de catálogo 353078). 24 horas depois, o meio de cultura foi substituído por um fresco e as células foram tratadas com dsRNAs sem reagente de transfecção a uma concentração final de 10 µg/ml. 24 horas depois, os sobrenadantes foram coletados para medir a secreção de IL-6 humana por ELISA (BioLegend, EUA, número de catálogo 430501). PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de três ensaios independentes.

EXEMPLO 4 E FIGURA 4: O DSRNA 412 DE 50 PB NÃO DESENCADEIA A MORTE EM CÉLULAS DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS NCI- H292.

[0160] 1.104 células NCI-H292 WT ou TLR3 KO foram semeadas em um volume final de 100 µl/poço de placas de p96 poços (GREINER, EUA, número de catálogo 655098). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNAs sem reagente de transfecção a uma concentração final de 50 µg/ml por 24 horas depois, antes que a apoptose fosse medida com leitura de luminescência de anexina V+ usando o kit Real-Time Glo AnnexinV da Promega (França, número de catálogo JA1000) PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de três ensaios independentes usando dois lotes diferentes do dsRNA 412 de 50 pb.

EXEMPLO 5 E FIGURA 5: ANÁLISE DE DSRNA 412, 432, 452 E POLI(A:U) EM UM GEL DE ACRILAMIDA A 6% NATIVO (TBE 1X).

[0161] Os dsRNAs liofilizados obtidos da DHARMACON foram ressuspensos em água fisiológica estéril livre de RNAse (INVIVOGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. Após a adição de tampão de carregamento de RNA (Invitrogen), 1 µg de dsRNA foi carregado em um gel de acrilamida a 6% preparado da seguinte forma: 10,3 ml de água estéril livre de RNAse (Sigma- Aldrich), 1,5 ml de TBE 10x (Sigma-Aldrich), 3 ml de acrilamida-bis 30% (Merck Chemicals), 0,2 ml de APS (Sigma-Aldrich), 20 µl de TEMED (Sigma-Aldrich). A escala de RNA foi adquirida da Invitrogen. A migração das amostras foi estabelecida em 100 V por 1 hora antes da coloração com BET (Sigma-Aldrich) em 1 µg/ml. O gel foi então visualizado usando o analisador Gel Doc (BIORAD).

EXEMPLO 6 E FIGURA 6: SECREÇÃO DE TNF-ALFA POR CÉLULAS RAW264.7 DE MACRÓFAGOS DE CAMUNDONGO EM RESPOSTA A POLI(A:U) DE TAMANHO CRESCENTE SOZINHO.

[0162] 5.104 células RAW264.7 foram semeadas em um volume final de 200 µl em placa de 96 poços (CORNING, EUA, número de catálogo 353072). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNA sem reagente de transfecção em uma concentração final de 10 µg/ml por 24 horas e os sobrenadantes foram coletados para medir a secreção de TNF-alfa de camundongo por ELISA (BioLegend). PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de três ensaios independentes.

EXEMPLO 7 E FIGURA 7: POLI(A:U) DE TAMANHOS CRESCENTES SOZINHO ATIVA O GENE REPÓRTER ISRE EM MACRÓFAGOS DE CAMUNDONGO RAW264.7.

[0163] 5.104 células RAW264.7 (Invivogen, França, número de catálogo rawl-isg) foram semeadas em um volume final de 100 µl por poço em placas de 96 poços (CORNING, EUA, 353072). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNA sem reagente de transfecção a uma concentração final de 50 µg/ml por 24 horas antes do ensaio de bioluminescência induzida por ISRE usando o kit QUANTI-Luc (Invivogen, número de catálogo rep-qlc1), de acordo com o protocolo do fabricante. PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de três ensaios independentes.

EXEMPLO 8 E FIGURA 8: POLI(A:U) DE TAMANHOS CRESCENTES SOZINHO DESENCADEIA A SECREÇÃO DEPENDENTE DE TLR3 DE IL6 POR CÉLULAS DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS NCI-H292.

[0164] 3.104 células NCI-H292 WT ou TLR3 KO foram semeadas em um volume final de 300 µl por poço em placas de 48 poços (CORNING, EUA, número de catálogo 353078). Após 24 horas, o meio de cultura foi substituído por um fresco e as células foram tratadas com dsRNAs sem reagente de transfecção a uma concentração final de 10 µg/ml. 24 horas depois, os sobrenadantes foram coletados para medir a secreção de IL-6 humana por ELISA (BioLegend). PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de três ensaios independentes.

EXEMPLO 9 E FIGURA 9: POLI(A:U) DE TAMANHOS CRESCENTES SOZINHO DESENCADEIA A MORTE DEPENDENTE DE TLR3 DE CÉLULAS DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS NCI-H292.

[0165] 1.104 células NCI-H292 WT ou TLR3 KO foram semeadas em um volume final de 100 µl/poço de placa de p96 poços (CORNING, EUA, número de catálogo 655098). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNAs sem reagente de transfecção a uma concentração final de 50 µg/ml por 24 horas antes que a apoptose fosse medida com leitura de luminescência de anexina V+ usando o kit Real-Time Glo AnnexinV da Promega (França, número de catálogo JA1000). PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de três ensaios independentes.

EXEMPLO 10 E FIGURA 10: ANÁLISE DE DSRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 E POLI(A:U) EM UM GEL DE ACRILAMIDA A 6% NATIVO (TBE 1X).

[0166] Os dsRNAs liofilizados, obtidos da DHARMACON, foram ressuspensos em água fisiológica estéril livre de RNAse (INVIVOGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. Após a adição de tampão de carregamento de RNA (Invitrogen), 1 µg de dsRNA foi carregado em um gel de acrilamida a 6% preparado da seguinte forma: 10,3 ml de água estéril livre de RNAse (Sigma- Aldrich), 1,5 ml de TBE 10x (Sigma-Aldrich), 3 ml de acrilamida-bis 30% (Merck Chemicals), 0,2 ml de APS (Sigma-Aldrich), 20 µl de TEMED (Sigma-Aldrich). A escala de RNA foi adquirida da Invitrogen. A migração das amostras foi estabelecida em 100 V por 1 hora antes da coloração com BET (Sigma-Aldrich) em 1 µg/ml. O gel foi então visualizado usando o analisador Gel Doc (BIORAD).

O gel é representativo de dois ensaios independentes.

EXEMPLO 11 E FIGURA 11: SECREÇÃO DE TNF-ALFA POR CÉLULAS RAW264.7 DE MACRÓFAGOS DE CAMUNDONGO EM RESPOSTA A POLI(A:U) E DSRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535.

[0167] 5.104 células RAW264.7 foram semeadas em um volume final de 200 µl por poço usando placa de p96 poços (CORNING, EUA, número de catálogo 353072). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNA sem reagente de transfecção em uma concentração final de 10 µg/ml por 24 horas e os sobrenadantes foram coletados para medir a secreção de TNF-alfa de camundongo por ELISA (BioLegend). PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de dois ensaios independentes.

EXEMPLO 12 E FIGURA 12: POLI(A:U) DE TAMANHOS CRESCENTES E DSRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 SOZINHO DESENCADEIA A SECREÇÃO DEPENDENTE DE TLR3 DE IL6 POR CÉLULAS DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS NCI-H292.

[0168] 3.104 células NCI-H292 WT ou TLR3 KO foram semeadas em um volume final de 300 µl por poço usando placa de p48 poços (CORNING, EUA, número de catálogo 353078). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNAs sem reagente de transfecção a uma concentração final de 10 µg/ml durante 24 horas e os sobrenadantes foram coletados para medir a secreção de IL-6 humana por ELISA (BioLegend). PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de pelo menos dois ensaios independentes.

EXEMPLO 13 E FIGURA 13: POLI(A:U) DE TAMANHOS CRESCENTES E DSRNA 422, 432, 442, 532, 533, 534, 535 SOZINHO DESENCADEIA A APOPTOSE DEPENDENTE DE TLR3 DE CÉLULAS DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS NCI-H292.

[0169] 1.104 células NCI-H292 WT ou TLR3 KO foram semeadas em um volume final de 100 µl por poço usando placa de p96 poços (GREINER, EUA, número de catálogo 655098). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNAs sem reagente de transfecção a uma concentração final de 50 µg/ml por 24 horas antes que a apoptose fosse medida com leitura de luminescência de anexina V+ usando o kit Real-Time Glo AnnexinV da Promega (França, número de catálogo JA1000). PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular.

Os dados são representativos de pelo menos dois ensaios independentes.

EXEMPLO 14 E FIGURA 14: SECREÇÃO DE TNF-ALFA POR CÉLULAS RAW264.7 DE MACRÓFAGOS DE CAMUNDONGO EM RESPOSTA A 532 FEITO COM DUAS TECNOLOGIAS DE FABRICAÇÃO QUÍMICA DIFERENTES.

[0170] Os dsRNAs liofilizados foram obtidos da DHARMACON usando duas tecnologias de fabricação química diferentes: TBDMS ou 2’ACE.

5.104 células RAW264.7 foram semeadas em um volume final de 200 µl por poço de placas de p96 poços (CORNING, EUA, número de catálogo 353072). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNA sem reagente de transfecção em uma concentração final variando de 1 a 100 µg/ml por 24 horas e os sobrenadantes foram coletados para medir a secreção de mTNF-alfa por ELISA (BioLegend, EUA, número de catálogo 430903). Os dados são a média de pelo menos três ensaios diferentes e são representativos de pelo menos seis ensaios independentes. A análise estatística é realizada usando o teste t-student bicaudal não pareado; NS = Não significativo com p > 0,05.

EXEMPLO 15 E FIGURA 15: SECREÇÃO DE TNF-ALFA POR CÉLULAS RAW264.7 DE MACRÓFAGOS DE CAMUNDONGO EM RESPOSTA A 532 FEITO A PARTIR DE DUAS EMPRESAS FABRICANTES DIFERENTES.

[0171] Os dsRNAs liofilizados foram obtidos da DHARMACON ou da BIOSPRING. 5.104 células RAW264.7 foram semeadas em um volume final de 200 µl por poço de placas de p96 poços (CORNING, EUA, número de catálogo 353072). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNA sem reagente de transfecção em uma concentração final variando de 1 a 100 µg/ml por 24 horas e os sobrenadantes foram coletados para medir a secreção de mTNF-alfa por ELISA (BioLegend, EUA, número de catálogo 430903). Os dados são a média de pelo menos cinco experimentos diferentes. A análise estatística é realizada usando o teste t-student bicaudal não pareado; NS = Não significativo com p > 0,05.

EXEMPLO 16 E FIGURA 16: 532 DE SÍNTESES DE FABRICAÇÃO QUÍMICA DIFERENTES

E DE EMPRESAS FABRICANTES DIFERENTES DESENCADEIAM O MESMO NÍVEL DE

APOPTOSE DE CÉLULAS DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS NCI-H292.

[0172] Os dsRNAs liofilizados foram obtidos da DHARMACON usando duas tecnologias de fabricação química diferentes: TBDMS ou 2’ACE; além disso, os dsRNAs liofilizados foram obtidos de BIOSPRING. 1.10 4 células NCI-H292 WT foram semeadas em um volume final de 100 µl por poço usando placa de p96 poços (GREINER, EUA, número de catálogo 655098). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNAs sem reagente de transfecção em uma concentração final variando de 1 a 100 µg/ml por 24 horas antes que a apoptose fosse medida com leitura de luminescência de anexina V+ usando o kit Real-Time Glo AnnexinV da Promega (França, número de catálogo JA1000). Os dados são representativos de pelo menos quatro ensaios independentes.

EXEMPLO 17 E FIGURA 17: 532 DE SÍNTESES DE FABRICAÇÃO QUÍMICA DIFERENTES

DESENCADEIAM O MESMO NÍVEL DE REDUÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE CÉLULAS DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS NCI-H292.

[0173] Os dsRNAs liofilizados foram obtidos da DHARMACON usando duas tecnologias de fabricação química diferentes: TBDMS ou 2’ACE. 1.104 células NCI-H292 WT foram semeadas em um volume final de 100 µl por poço usando placa de p96 poços (GREINER, EUA, número de catálogo 655098). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNAs sem reagente de transfecção em uma concentração final variando de 1 a 100 µg/ml por 24 horas antes da viabilidade celular ser medida com solução Cell Titer Aqueous da Promega (França, número de catálogo G3580). Os dados são representativos de pelo menos quatro ensaios independentes.

A análise estatística é realizada usando o teste t-student bicaudal não pareado; NS = Não significativo com p > 0,05.

EXEMPLO 18 E FIGURA 18: 532 DE EMPRESAS FABRICANTES DIFERENTES

DESENCADEIAM O MESMO NÍVEL DE REDUÇÃO DA VIABILIDADE CELULAR DE CÉLULAS DE CÂNCER DE PULMÃO DE CÉLULAS NÃO PEQUENAS HUMANAS NCI-H292.

[0174] Os dsRNAs liofilizados foram obtidos da DHARMACON ou da BIOSPRING. 1.104 células NCI-H292 WT foram semeadas em um volume final de 100 µl por poço usando placa de p96 poços (GREINER, EUA, número de catálogo 655098). 24 horas depois, as células foram tratadas com dsRNAs sem reagente de transfecção em uma concentração final variando de 1 a 100 µg/ml por 24 horas antes da viabilidade celular ser medida com solução Cell Titer Aqueous da Promega (França, número de catálogo G3580). Os dados são representativos de pelo menos cinco ensaios independentes.

EXEMPLO 19 E FIGURA 19: ANÁLISE DA SENSIBILIDADE DE POLI(A:U) E DO DSRNA 532 À RNASE I E À RNASE III E ANÁLISE EM UM GEL DE ACRILAMIDA A 6% NATIVO (TBE 1X).

[0175] A RNAse I é uma RNAse que apresenta alta preferência para RNA de fita simples em relação ao RNA de fita dupla, independentemente da sequência, enquanto a RNAse III é uma RNAse que cliva o RNA de fita dupla em dsRNA de 12-30 bases curtas. Os dsRNAs liofilizados obtidos da DHARMACON foram ressuspensos em água fisiológica estéril livre de RNAse (INVIVOGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. 1 µg de dsRNA foi primeiro incubado com 1 unidade de RNAse I (ThermoFischer AMBION, número de catálogo AM2294) ou 1 unidade de RNAse III (ThermoFischer AMBION, número de catálogo AM2290) por 10 ou 30 minutos a 37 °C, antes da adição de tampão de carregamento de RNA (Invitrogen) e carregamento em um gel de acrilamida a 6% preparado da seguinte forma: 10,3 ml de água estéril livre de RNAse (Sigma-Aldrich), 1,5 ml de TBE 10x (Sigma-Aldrich), 3 ml de acrilamida-bis 30% (Merck Chemicals), 0,2 ml de APS (Sigma-Aldrich), 20 µl de TEMED (Sigma-Aldrich). A escala de RNA foi adquirida da Invitrogen. A migração das amostras foi estabelecida em 100 V por 45 minutos antes da coloração com BET (Sigma-Aldrich) em 1 µg/ml. O gel foi então visualizado usando o analisador Gel Doc (BIORAD). PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de pelo menos dois ensaios independentes.

EXEMPLO 20 E FIGURA 20: ANÁLISE DO PERFIL DA CURVA DE FUSÃO DE RNA USANDO ANÁLISE DE MÁQUINA Q-PCR.

[0176] Os dsRNAs liofilizados obtidos da DHARMACON foram ressuspensos em água fisiológica estéril livre de RNAse (INVIVOGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. 1 µg de dsRNA foi misturado com mistura de PCR SyBr verde (Biorad, número de catálogo 1725270), antes da análise da curva de fusão usando máquina de Q-PCR da Biorad (Biorad, CFX Connect). A linha em negrito corresponde ao dsRNA nomeado acima do respectivo gráfico. PAU = Poli(A:U) comercial de alto peso molecular. Os dados são representativos de pelo menos três ensaios independentes.

TABELA 3: EFEITOS DOS COMPRIMENTOS E COMPOSIÇÃO DE BASE DE DSRNAS NA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS RAW264.7 E NCI-H292.

[0177] Legenda: - = Efeito Negativo, + a ++ = Ativação Positiva Inflamação em NCI-H292 de câncer de pulmão de células RAW264.7 de células não pequenas epiteliais Moléculas humanas macrófago mielóide murino Inflamação Apoptose Poli(A:U) comercial - PAU ++ ++ ++ 50 pb de Poli(I:C) #411 - - - 70 pb de Poli(I:C) #535 - ++ ++ 50 pb de Poli(A:U) #412 ++ - - 70 pb de Poli(A:U) #432 ++ + + 70 pb de Poli(I10A50I10: ++ ++ ++ C10U50C10) #532 70 pb de Poli(A35I35: C35U35) ++ ++ ++ #533 70 pb de Poli(A10I50A10: - ++ ++ U10C50U10) #534 TABELA 4: EFEITOS DOS COMPRIMENTOS E COMPOSIÇÃO DE BASE DE DSTNAS NA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS RAW264.7 E NCI-H292.

[0178] Legenda: - = Efeito Negativo, + a +++ = Ativação Positiva Inflamação em NCI-H292 de câncer de Composição de células RAW264.7 pulmão de células não Moléculas pequenas epiteliais humanas bases de macrófago mielóide murino Inflamação Apoptose Poli(A:U) comercial - +++ +++ +++

PAU 50 pb de Poli(AU:AU) - - - #413 50 pb de Poli(A:U) +++ - - #412 60 pb de Poli(A:U) +++ + + #422 (A:U)>50% 70 pb de Poli(A:U) +++ ++ ++ #432 80 pb de Poli(A:U) +++ ++ +++ #442 90 pb de Poli(A:U) +++ ++ ++ #452 70 pb de Poli(I10A50I10: +++ +++ +++ C10U50C10) #532

Inflamação em NCI-H292 de câncer de Composição de células RAW264.7 pulmão de células não Moléculas pequenas epiteliais humanas bases de macrófago mielóide murino Inflamação Apoptose (A:U)=(I:C)=50% 70 pb de Poli(A35I35: +++ +++ +++ C35U35) #533 50 pb de Poli(I:C) - - - #411 70 pb de Poli(I:C) - +++ +++ (I:C)>50% #535 70 pb de Poli(A10I50A10: - +++ +++ U10C50U10) #534 TABELA 2: EFEITOS DOS COMPRIMENTOS E COMPOSIÇÃO DE BASE DE DSRNAS NA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS RAW264.7 E NCI-H292.

[0179] Legenda: - = Efeito negativo, +/- = Linha de limite, + a +++ = Aumenta a ativação positiva.

Inflamação em NCI-H292 de câncer de células pulmão de células não Composição de pequenas epiteliais Moléculas RAW264.7 de bases humanas macrófago mielóide murino Inflamação Apoptose Poli(A:U) comercial - PAU +++ +++ +++ 50 pb de Poli(AU:AU) #413 - - - 50 pb de Poli(A:U) #412 +++ - - 60 pb de Poli(A:U) #422 +++ +/- +/- (A:U)>50% 70 pb de Poli(A:U) #432 +++ + + 80 pb de Poli(A:U) #442 +++ + ++ 90 pb de Poli(A:U) #452 +++ ++ ++ 70 pb de Poli(I10A50I10: +++ +++ +++ C10U50C10) #532 (A:U)=(I:C)=50% 70 pb de Poli(A35I35: +++ +++ +++ C35U35) #533 50 pb de Poli(I:C) #411 - - - 70 pb de Poli(I:C) #535 - +++ +++ (I:C)>50% 70 pb de Poli(A10I50A10: - +++ +++ U10C50U10) #534

Claims (14)

REIVINDICAÇÕES

1. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender RNAs de fita dupla (dsRNA) consistindo essencialmente em dsRNA possuindo duas fitas complementares, compreendendo pelo menos um bloco ou homopolímero de poli A e o bloco complementar ou homopolímero de poli U, cada bloco compreendendo pelo menos 15, 20, 25 ou 30 A, ou U, e cada fita possuindo um comprimento determinado entre 50 e 200 bases, de preferência entre 55 e 200 bases, e um veículo, carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

2. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo dsRNA possuir pelo menos um bloco de A de acordo com a seguinte fórmula (I), em que o dsRNA compreende pelo menos 20%, de preferência pelo menos 25%, mais preferencialmente pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente pelo menos 70%, de A e U: (II) [P]a [Q]b [R]c - Q representa um homopolímero de A ou U, b é um número inteiro de pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou mais; - a e c podem ser, independentemente, 0 ou um número inteiro tal que a + b + c = 50 a 200, preferencialmente entre 60 e 120, mais preferencialmente entre 70 e 100; a, b e c podem ser iguais ou diferentes; - se a = 1, no caso Q = A, P é feito de uma base entre U, G, I e C; no caso Q = U, P é feito de uma base entre A, G, I e C; - se a > 1, P é feito de pelo menos uma ou duas bases entre A, U, G, I e C, sob uma destas configurações: combinação aleatória de pelo menos duas dessas bases, um bloco de uma base entre A, U, G, I e C, pelo menos dois blocos de bases diferentes entre A, U, G, I e C, ou uma mistura de pelo menos um bloco de base entre A, U, G, I e C e pelo menos uma outra base entre A, U, G, I e C; - se c = 1, no caso R = A, R é feito de uma base entre U, G, I e C; no caso R = U, P é feito de uma base entre A, G, I e C; - se c > 1, R é feito de pelo menos uma ou duas bases entre A, U, G, I e C, sob uma destas configurações: combinação aleatória de pelo menos duas dessas bases, um bloco de uma base entre A, U, G, I e C, pelo menos dois blocos de bases diferentes entre A, U, G, I e C, ou uma mistura de pelo menos um bloco de base entre A, U, G, I e C e pelo menos uma outra base entre A, U, G, I e C; - P e R podem ser idênticos ou diferentes em termos de bases e/ou comprimento de sequência.

3. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo dsRNA ser de fórmula (II): [A]b [U]b b = 50 a 200, melhor cerca de 55 a cerca de 100, 150 ou 200, de preferência cerca de 60 a cerca de 120, de preferência entre cerca de 70 e cerca de 100, por exemplo, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90.

4. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo dsRNA ser de fórmula (III): [P]a [A]b [R]c [Y]a [U]b [Z]c P e R são escolhidos entre G, I e/ou C, e Y e Z são as bases complementares; em particular, b = é um número inteiro entre 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80;

a e c independentemente = cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40.

5. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo dsRNA ser de fórmula (IV): [A]b [R]c [U]b [Z]c R é escolhido entre G, I e/ou C, Z é a base complementar; em particular, b = é um número inteiro entre 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; c = cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40, de preferência cerca de 30 a cerca de 40, por exemplo, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45.

6. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo dsRNA ser de fórmula (V): [P]a [A]b [Y]a [U]b P é escolhido entre G, I e/ou C, Y é a base complementar; em particular, b = é um número inteiro entre 20, 25 ou 30 e 100, em particular cerca de 35 a cerca de 100, em particular cerca de 40 a cerca de 100, melhor cerca de 50 a cerca de 100, por exemplo, cerca de 50 a cerca de 90, de preferência cerca de 50 a cerca de 80, por exemplo, cerca de 40, cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80; a = cerca de 10 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 40, de preferência cerca de 30 a cerca de 40, por exemplo, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45.

7. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelo dsRNA ser de fórmula (VI): [P]a [A]b [R]c [Y]a [U]b [Z]c P e R são escolhidos, independentemente, entre I e C, e Y e Z são as bases complementares; b = é um número inteiro entre cerca de 20, 25 ou 30 e cerca de 100, um dentre a ou c pode ser 0, e a e c não sendo iguais a 0 ao mesmo tempo, são cerca de 10 a cerca de 50.

8. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo(s) bloco(s) de A conter(em) menos de 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1% de outra base entre U, G, I e C.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por compreender 0,01 a 100 mg do referido dsRNA por ml de composição.

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por ser como um medicamento.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por ser para uso em um método de tratamento de um câncer que expressa um receptor TLR3.

12. COMPOSIÇÃO para o uso, conforme definido na reivindicação 11, caracterizada pela composição ativar células mielóides e desencadear a morte de células cancerosas epiteliais.

13. COMPOSIÇÃO para o uso, conforme definido na reivindicação 11, caracterizada pela composição ativar TLR3 expresso por células mielóides, induzir a secreção de citocinas e quimiocinas inflamatórias e desencadear a ativação dependente de TLR3 de inflamação e morte em células cancerosas humanas ou de mamíferos.

14. COMPOSIÇÃO para o uso, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizada pela composição e uma droga quimioterápica serem para uma administração simultânea, separada ou sequencial a um mamífero ou humano.