BR112020019052A2

BR112020019052A2 - Anticorpo que se liga especificamente a gipr humano, proteína de fusão de glp-1, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, composição farmacêutica e uso da composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112020019052A2
Application number: BR112020019052-7A
Authority: BR
Inventors: Xiaofeng Wang; Hua Zhang; Chenjiang YAO; Cheng Zhang; Shuqian Jing
Original assignee: Gmax Biopharm Llc
Priority date: 2018-03-20
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2021-01-05
Also published as: EP3808771A1; EP3808771A4; US11780916B2; RU2020130794A3; KR20200133365A; AU2019236822B2; JP2021518132A; WO2019179424A1; CA3094286A1; US20210061904A1; CN110305211A; CN117003874A; JP7313372B2; TW201940508A; CN117126279A; TWI832847B; RU2020130794A; AU2019236822A1

Abstract

trata-se de um anticorpo de receptor de polipeptídeo inibidor gástrico (gipr) e sua proteína de fusão com peptídeo semelhante a glucagon 1 (glp-1) e uma composição farmacêutica do mesmo. é também fornecido um método para usar o anticorpo de gipr e sua proteína de fusão com glp-1 para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de doença hepática gordurosa não alcoólica, esteato-hepatite não alcoólica, diabetes tipo 2 ou obesidade.

Description

“ANTICORPO QUE SE LIGA ESPECIFICAMENTE A GIPR HUMANO, PROTEÍNA DE FUSÃO DE GLP-1, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA”

CAMPO

[0001] Trata-se de um anticorpo de receptor de polipeptídeo inibidor gástrico (GIPR) e sua proteína de fusão com peptídeo semelhante a glucagon 1 (GLP-1) e uma composição farmacêutica do mesmo. Também é fornecido no presente documento um método para usar o anticorpo de GIPR e sua proteína de fusão com GLP-1 para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de doença hepática gordurosa não alcoólica, esteato-hepatite não alcoólica, diabetes tipo 2 ou obesidade.

ANTECEDENTES

[0002] O polipeptídeo inibidor gástrico (GIP) intestinal é um hormônio de polipeptídeo secretado por células K intestinais após a alimentação e inclui duas isoformas de peptídeos de 42 e 30 aminoácidos. GIP faz parte do processo fisiológico de secreção de insulina ativando-se o receptor de polipeptídeo inibidor gástrico (GIPR) na superfície de células β pancreáticas (Tseng et al., 1996, J. Clin. Invest. 98:2440-2445; Ravn et al., 2013, J. Biol. Chem. 288:19.760 a 19.772). Visto que a função biológica clássica de GIP é similar a GLP-1, esses hormônios de peptídeo são coletivamente chamados de incretinas. GIPR é amplamente distribuído em muitos tecidos, incluindo tecidos de pâncreas, osso, coração, estômago, intestino e adiposo (Peter et al., 2013, J. Biol. Chem. 288:19.760 a 19.772), e essa distribuição diversa sugere que a via de GIP/GIPR tenha mais funções biológicas do que a regulação de glicose sanguínea. A evidência experimental mostra que a via de sinalização de GIP/GIPR é pelo menos proximamente relacionada ao metabolismo lipídico nesses tecidos (Yip e Wolfe, 2000, Life Sci. 66:91 a 103). Os dados experimentais também mostram que há um aumento de concentração de GIP de circulação sanguínea em pacientes obesos ou diabéticos (Creutzfeldt et al., 1978, Diabetologia 14:15 a 24; Flatt et al., 1984, J. Endocrinol. 101:249 a 256; Salera et al., 1982, J. Clin. Endocrinol. Metab. 55:329 a 336; Vilsbøll et al., 2003, J. Clin. Endocrinol. Metab. 88:2.706 a 2.713). Após bloquear o sinal de GIPR com um inibidor de GIPR, uma perda de peso significativa, uma redução em resistência à insulina e até mesmo uma inversão de diabetes tipo 2 foram observadas em camundongos obesos induzidos por dieta de alto teor de gordura (Ravn et al., 2013, J. Biol. Chem. 288:19760-72).

[0003] Os análogos de peptídeo semelhante a glucagon 1 de longa atuação (análogo de GLP-1) são uma nova geração de fármacos de diabetes 2 (Tomlinson et al., 2015, Expert Opin. Investig. Drugs 25:1.744 a 7.658; Gallwitz, 2015, Eur. Endocr. 11:21 a 25). Os fármacos de GLP-1 de longa atuação também são estudados em testes clínicos para o tratamento de doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). Os estudos mostram que os fármacos de GLP-1 de longa atuação têm um efeito significativo na melhora de morfologia de tecido hepático, a redução da razão de alanina aminotransferase/glutationa aminotransferase e o teor de gordura hepática em pacientes com NAFLD (Samson et al., 2013, J. Diabetes Complications 27:401 a 406; Portillo-Sanchez e Cusi, 2016, Clin. Diabetes Endocrinol. 2:9).

[0004] Se os fármacos de GLP-1 e os inibidores de GIPR podem ser usados juntos, incluindo a combinação dos dois juntos, por exemplo, como uma proteína de fusão, essa combinação pode alcançar o efeito de melhorar simultaneamente a resistência à insulina e reduzir o acúmulo de gordura excessiva (obesidade), enquanto se reduz a glicose sanguínea, e também de interferir no metabolismo lipídico. Nesse aspecto, a parte de GLP-1 pode ser usada para melhorar a tolerância à glicose, reduzir o apetite, reduzir a glicose sanguínea e reduzir o peso corporal; enquanto a parte de anticorpo de GIPR pode ser usada para reduzir o acúmulo adicional de gordura e melhorar a função hepática. O efeito de redução de gordura do anticorpo de GIPR e o efeito de perda de peso do GLP-1 podem ser usados de modo sinérgico para tratar a doença hepática gordurosa não alcoólica/esteato- hepatite não alcoólica. Essa revelação fornece um fármaco de proteína de fusão que beneficiará os pacientes que têm uma ou mais doenças dentre doença hepática gordurosa não alcoólica/esteato-hepatite não alcoólica, diabetes tipo 2 e obesidade.

SUMÁRIO

[0005] É fornecido no presente documento um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, em que o anticorpo é um inibidor de GIPR.

[0006] Também é fornecido no presente documento um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, que compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, e

SEQ ID NO: 15; b. Sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 16; c. Sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, e SEQ ID NO: 17; d. Sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, e SEQ ID NO: 26; e. Sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 29; f. Sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 30; É fornecida no presente documento uma proteína de fusão de GLP- 1, que compreende um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito fragmentos de GLP-1; a proteína de fusão conecta o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 com o terminal amino de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de anticorpo de GIPR, ou conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 com o terminal carbóxi de uma cadeia leve do anticorpo de GIPR.

[0007] É fornecida no presente documento uma proteína de fusão de GLP-1, que compreende um anticorpo de GIPR e dois fragmentos de GLP-1; a proteína de fusão conecta o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 com o terminal amino de uma cadeia leve de um anticorpo de GIPR: N'-GLP-1-Ligante-R-C'; ou o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 que se conecta ao terminal amino de uma cadeia pesada de um anticorpo de GIPR: N'- GLP-1-Ligante-R-C'; em que: N' representa um terminal amino da cadeia de polipeptídeos de proteína de fusão, C' representa um terminal carbóxi de uma cadeia de polipeptídeos de proteína de fusão, GLP-1 representa um fragmento de GLP-1, R é a sequência de aminoácidos da cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo de GIPR e Ligante representa um ligante de peptídeo.

[0008] É fornecido no presente documento um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de GIPR descrito no presente documento.

[0009] É fornecido no presente documento um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento.

[0010] É fornecido no presente documento um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica um anticorpo de GIPR descrito no presente documento.

[0011] É fornecido no presente documento um vetor que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento.

[0012] É fornecida no presente documento uma célula hospedeira que compreende um vetor descrito no presente documento.

[0013] É fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de GIPR descrito no presente documento e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0014] É fornecida no presente documento uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento e um carreador farmaceuticamente aceitável. É adicionalmente fornecido no presente documento o uso de um anticorpo de GIPR descrito no presente documento na preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou melhora de doenças de esteato-hepatite não alcoólica.

[0015] É fornecido no presente documento o uso de uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento na preparação de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar doenças hepáticas gordurosas não alcoólicas.

[0016] É fornecido no presente documento o uso de um anticorpo de GIPR descrito no presente documento na preparação de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar diabetes tipo 2.

[0017] É fornecido no presente documento o uso de uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento na preparação de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar diabetes tipo 2.

[0018] É fornecido no presente documento o uso de um anticorpo de GIPR descrito no presente documento na preparação de um medicamento para perder peso ou tratar, prevenir ou melhorar a obesidade e doenças relacionadas à obesidade.

[0019] É fornecido no presente documento o uso de uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento na preparação de um medicamento para perder peso ou tratar, prevenir ou melhorar a obesidade e doenças relacionadas à obesidade.

[0020] É fornecido no presente documento o uso de um anticorpo de GIPR descrito no presente documento na preparação de um medicamento para tratar simultaneamente duas ou mais doenças de doença hepática gordurosa não alcoólica, obesidade ou diabetes tipo 2.

[0021] É fornecido no presente documento o uso de uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento na preparação de um medicamento para tratar simultaneamente duas ou mais doenças de doença hepática gordurosa não alcoólica, obesidade ou diabetes tipo 2.

[0022] É fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de esteato- hepatite não alcoólica, que compreende fornecer aos indivíduos uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo de GIPR descrito no presente documento.

[0023] É fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de esteato- hepatite não alcoólica, que compreende fornecer aos indivíduos uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento.

[0024] É fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de diabetes tipo 2, que compreende fornecer aos indivíduos uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo de GIPR descrito no presente documento.

[0025] É fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de diabetes tipo 2, que compreende fornecer aos indivíduos uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento.

[0026] É fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de obesidade, que compreende fornecer aos indivíduos uma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo de GIPR descrito no presente documento.

[0027] É fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar um ou mais sintomas de obesidade, que compreende fornecer aos indivíduos uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 descrita no presente documento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0028] A Figura 1 mostra os resultados de teste FACS da ligação específica de anticorpo L10H8 de hGIPR expresso de modo recombinante (que compreende a SEQ ID NO: 70 e a SEQ ID NO: 79) a hGIPR. O pico cinza e o pico de linha pontilhada são controles negativos, o pico cinza representa o pico de fundo da célula em branco CHO-DHFR-, o pico de linha pontilhada representa o pico de ligação negativo de L10H8 à célula em branco CHO-DHFR- , e o pico de linha contínua representa o pico de ligação específica de L10H8 a CHO-DHFR-hGIPR.

[0029] A Figura 2 mostra a curva de inibição de concentração de anticorpo L7H6 de hGIPR (que compreende a SEQ ID NO: 67 e a SEQ ID NO: 77) que antagoniza a ativação de GIP de via de sinalização de hGIPR, conforme determinado pelo ensaio de cAMP direto (IC50 = 7,6 nM, R2 = 0,99).

[0030] A Figura 3 mostra a curva de inibição de anticorpo de GIPR/proteína de fusão de GLP-1 GLP-1-Ligante-L7H6 (que compreende a SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 111) que antagoniza a ativação de GIP da via de sinal de hGIPR, conforme determinado pelo ensaio de cAMP direto (IC50 = 14,9 nM, R2 = 0,99).

[0031] A Figura 4 mostra a curva de ativação do experimento de gene repórter para testar o anticorpo de GIPR/proteína de fusão de GLP-1 GLP-1-Ligante-L7H6 para ativar a via de sinalização de hGLP-1R, conforme determinado pelo ensaio de gene repórter (EC50 = 0,04 nM, R2 = 0,99).

[0032] A Figura 5 mostra a curva de tempo de taxa de mudança de peso corporal em grupos diferentes de camundongos obesos C57BL/6 induzida por dieta de alto teor de gordura durante o período de teste de eficácia.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0033] A menos que definido de outro modo no presente documento, os termos científicos e técnicos devem ter os significados entendidos por indivíduos de habilidade comum na técnica. Em geral, a nomenclatura e as técnicas que se referem a farmacologia, biologia, bioquímica, cultura celular e de tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de ácido nucleico de proteína, assim como hibridização, são bem conhecidas e comumente usadas nesse campo.

[0034] Essa invenção usou abreviações de letra única ou três letras padrão para indicar sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos. Quando a sequência de polipeptídeos é escrita, o primeiro resíduo de aminoácido (N') com o grupo amino está na extrema esquerda e o último resíduo de aminoácido (C') com o grupo carboxila está na extrema direita, por exemplo, a sequência de fragmento de GLP-1 envolvida nessa invenção: SEQ ID NO:105,

SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:108 e SEQ ID NO:109. A sequência de polipeptídeos reversa se refere a uma sequência de polipeptídeos em que os aminoácidos dispostos em uma ordem reversa em relação à original, por exemplo, as sequências de fragmento de GLP-1 reversas convertidas das sequências de fragmento de GLP-1 acima: SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 123. As extremidades 5' das cadeias a montante de sequências de ácido nucleico de fita simples e de fita dupla estão na esquerda e suas extremidades 3' estão na direita. A porção específica de um polipeptídeo pode ser representada por um número de resíduo de aminoácido, como os aminoácidos 80 a 130, ou representada pelo resíduo atual do sítio, como Lys80 a Lys130. A sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo específica também pode ser descrita explicando- se sua diferença da sequência de referência.

[0035] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" se referem a uma molécula que contém dois ou mais aminoácidos que são interligados por uma ligação de peptídeo. Esses termos cobrem, por exemplo, proteínas naturais e artificiais e análogos de peptídeo de sequências de proteína (como proteínas mutantes, variantes e proteínas de fusão) e proteínas que são pós- transcricionais ou de outro modo modificadas de modo não covalente ou covalente. Um peptídeo, polipeptídeo ou proteína pode ser um monômero ou um polímero.

[0036] O termo "fragmento de polipeptídeo" se refere ao polipeptídeo que tem um terminal amino e/ou um terminal carboxila ausente da proteína de comprimento completo correspondente. Por exemplo, o comprimento de fragmento pode ser de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150,

ou 200 aminoácidos. O comprimento de fragmento pode ser, por exemplo, de até 1000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11, ou 10 aminoácidos. O fragmento pode conter adicionalmente um ou mais aminoácidos adicionais em uma extremidade ou ambas, como as sequências de aminoácidos de proteínas naturais diferentes (por exemplo, Fc ou domínios de zíper de leucina) ou sequências de aminoácidos artificiais (por exemplo, sequências de junta artificial).

[0037] Os peptídeos nessa invenção incluem peptídeos modificados por qualquer razão e por quaisquer meios, por exemplo, por (1) diminuição de sensibilidade à proteólise, (2) diminuição de sensibilidade à oxidação, (3) alteração da afinidade por complexos de proteína de formação, (4) alteração da afinidade de ligação, e (5) conferência ou modificação de outras propriedades físico-químicas ou funcionais. O análogo contém uma proteína mutante de um polipeptídeo. Por exemplo, o mesmo pode realizar substituição de aminoácido única ou múltipla (por exemplo, substituições de aminoácido conservativas) em sequências naturais (por exemplo, fora do domínio do polipeptídeo que forma contato intramolecular). A "substituição de aminoácido conservada" é uma que não muda significativamente as características estruturais da sequência parental (por exemplo, a substituição de aminoácidos não deve destruir as hélices presentes na sequência parental ou interferir em outros tipos estruturais secundários necessários para fornecer à sequência parental suas propriedades ou função).

[0038] Um "mutante" de um polipeptídeo é uma sequência de aminoácidos que contém a inserção, deleção, e/ou substituição de um ou mais resíduos em uma sequência de aminoácidos em relação a outra sequência de polipeptídeos. As variantes nesta invenção incluíram proteínas de fusão.

[0039] Um "derivado" de um polipeptídeo é um polipeptídeo quimicamente modificado, por exemplo, ligando-se a outros componentes químicos, como polietileno glicol, albumina (como albumina sérica humana), fosforilação e glicosilação.

[0040] A menos que declarado de outro modo, o termo "anticorpo" inclui os anticorpos com duas cadeias pesadas de comprimento completo e duas cadeias leves de comprimento completo, assim como seus derivados, variantes, fragmentos e proteínas que sofreram mutação, cujos casos são listados abaixo.

[0041] O termo "anticorpo" é uma proteína que contém a porção de ligação a antígeno e opcionalmente o arcabouço ou porção de framework que permite que a porção de ligação a antígeno adote uma conformação que promove a ligação do anticorpo ao antígeno. Os exemplos de anticorpos incluem anticorpos completos, fragmentos de anticorpo (como a porção de ligação a antígeno de um anticorpo), derivados de anticorpo e análogos de anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode conter arcabouços de proteína alternativos ou arcabouços artificiais com CDRs transplantadas ou derivados de CDRs. O arcabouço inclui, mas sem limitação, um arcabouço derivado de anticorpo que é introduzido, como um que estabiliza a estrutura tridimensional do anticorpo, e como um arcabouço completamente sintético para polímero biocomparável. Consultar, por exemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins 53:121 a 129; Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639 a 654. Além disso, o anticorpo pode ser um anticorpo de peptídeo simulado ("PAMs") ou um arcabouço que contém anticorpos simulados que usa no mesmo os ligantes de fibrina como arcabouços.

[0042] Os anticorpos podem ter estruturas, como imunoglobulina inata. “Imunoglobulina” é uma molécula tetramérica. Na imunoglobulina natural, cada tetrâmero consiste em dois pares de cadeia de polipeptídeo idênticos, em que cada par tem uma cadeia "leve" (aproximadamente 25 k Da) e uma cadeia "pesada" (aproximadamente 50 a 70 kDa). O terminal amino de cada cadeia inclui um domínio variável de cerca de 100 a 110 aminoácidos, que é principalmente relacionado ao reconhecimento de antígeno. O terminal carboxila de cada cadeia determina a região constante principalmente associada ao efeito dos efetores. A cadeia leve de anticorpo humano é dividida em cadeias leves κ e λ. As cadeias pesadas foram divididas em μ, δ, α ou ε, e determinaram o mesmo tipo de antígeno, como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Em cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são conectadas pela região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, e a cadeia pesada também inclui a região "D" de cerca de 10 mais aminoácidos. Consultar Fundamental Immunology capítulo 7 (editado por Paul, 2ª edição, Raven Press, 1989). As regiões variáveis de cada par de cadeias leves/pesadas formam sítios de ligação a anticorpo, dessa maneira, uma imunoglobulina completa tem dois sítios de ligação.

[0043] As cadeias de imunoglobulina inatas exibem a mesma estrutura básica de uma região esquelética (FR) relativamente conservante conectada por três regiões altamente variáveis, também conhecidas como regiões de decisão complementar ou CDRs. Da extremidade N à extremidade C, as cadeias leves e pesadas contêm os domínios estruturais FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A distribuição de aminoácidos em todos os domínios estruturais foi consistente com Kabat et al. em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, PHS, NIH, publicação NIH nº 91-3242, 1991.

[0044] A menos que especificado de outro modo, "anticorpo" significa a imunoglobulina intacta ou a porção de ligação a antígeno que pode competir especificamente se ligando ao anticorpo intacto. A porção de ligação a antígeno pode ser produzida por técnicas de DNA recombinantes, clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. A porção de ligação a antígeno inclui, em particular, Fab, Fab', F(ab)2, Fv, anticorpos de domínio estrutural (dAbs), área de decisão complementar contida (CDRs), anticorpo de cadeia única (scFv), anticorpo quimérico, anticorpo de cadeias duplas (diacorpos), anticorpos de três cadeias (triacorpos), anticorpos de quatro cadeias (tetracorpos) e um polipeptídeo que contém pelo menos uma porção da imunoglobulina que se liga a um antígeno específico de polipeptídeo.

[0045] O fragmento Fab é um fragmento univalente com domínios VL, VH, CL, e CH1; O fragmento F(ab ')2 é um fragmento bivalente que tem dois fragmentos Fab conectados por uma ligação dissulfeto na região de articulação; os fragmentos Fv têm domínios VH e VL; os fragmentos dAb têm domínio VH, domínio VL ou fragmentos de ligação a antígeno de domínio VH ou VL (patentes nº U.S. 6.846.634 e U.S. 6.696.245; pedidos de patente públicos nº U.S. 2005/0202512, U.S. 2004/0202995, U.S. 2004/0038291, US 2004/0009507 e U.S. 2003/0039958; Ward et al., 1989, Nature 341:544 a 546).

[0046] O anticorpo de cadeia única (scFv) é uma proteína de fusão em que as regiões VL e VH são unidas por um conector (por exemplo, uma sequência sintética de resíduos de aminoácidos) para formar um anticorpo de proteína contínua, no qual o conector é longo o suficiente para permitir que a cadeia de proteína se dobre novamente em si e forme um sítio de ligação a antígeno univalente (Consultar, por exemplo, Bird et al., 1988, Science 242:423 a 426; e Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5.879 a 5.883).

[0047] Um anticorpo de cadeia dupla é um anticorpo bivalente que contém duas cadeias de polipeptídeos, em que cada uma contém as regiões VH e VL conectadas por uma junta que é tão curta que não permite o pareamento dos dois domínios na mesma cadeia. Portanto, permite-se que cada domínio se pareie com um domínio complementar em outra cadeia de polipeptídeos (consultar, por exemplo, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6.444 a 6.448; Poljak et al., 1994, Structure 2:11 21 a 23). Se as duas cadeias de polipeptídeo do anticorpo de fita dupla são idênticas, o anticorpo de fita dupla resultante de seu pareamento terá o mesmo sítio de ligação a antígeno. As cadeias de polipeptídeos com sequências diferentes podem ser usadas para preparar anticorpos de fita dupla com sítios de ligação a antígeno diferentes. De modo similar, anticorpos de três cadeias e quatro cadeias são os anticorpos que contêm três e quatro cadeias de polipeptídeos e formam três e quatro sítios de ligação a antígeno, que podem ser iguais ou diferentes.

[0048] Esse artigo usou o método da descrição de Kabat et al. em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª edição, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados Unidos, PHS, NIH, Publicação NIH nº 91-3242, 1991 para identificar a região de decisão complementar (CDRs) e região framework (FR) de um dado anticorpo. Uma ou mais CDRs podem ser incorporadas a uma molécula covalente ou não covalentemente para mudar as mesmas para um anticorpo. O anticorpo pode incorporar uma cadeia de polipeptídeos maior em CDR (ou CDRs). A CDR (ou CDRs) pode ser covalentemente fixada a outra cadeia de polipeptídeo, ou pode ser não covalentemente incorporada em CDR (ou CDRs). CDRs permitem que os anticorpos se liguem especificamente a antígenos associados específicos.

[0049] Os anticorpos podem ter um ou mais sítios de ligação. Se há mais do que um sítio de ligação, o sítio de ligação pode ser igual ou diferente de outro. Por exemplo, a imunoglobulina humana natural tem usualmente dois sítios de ligação idênticos, enquanto os anticorpos "biespecíficos" ou "bifuncionais" têm dois sítios de ligação diferentes.

[0050] O termo "anticorpo murino" inclui anticorpos que têm uma ou mais regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de camundongo.

[0051] O termo "anticorpo humanizado" é um anticorpo produzido transplantando-se a sequência de regiões de decisão complementar de moléculas de anticorpo de camundongo no framework de regiões variáveis de anticorpo humano.

[0052] Os termos "domínio de ligação a antígeno," "região de ligação a antígeno" ou "sítio de ligação a antígeno" são as partes de um anticorpo que contêm resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e contribuem para a sua especificidade e afinidade pelo antígeno. Para anticorpos que se ligam especificamente a seus antígenos, isso incluirá pelo menos parte de pelo menos um de seus domínios de CDR.

[0053] O termo “epítopo” é a parte de uma molécula que se liga (por exemplo, por um anticorpo) ao anticorpo. Um epítopo pode conter uma parte descontínua de uma molécula (por exemplo, em um polipeptídeo, os resíduos de aminoácidos que são descontínuos na primeira ordem do polipeptídeo são próximos o suficiente um do outro nas estruturas terciárias e quaternárias do polipeptídeo a serem unidas por um anticorpo).

[0054] A "mesma porcentagem" de dois polinucleotídeos ou duas sequências de polipeptídeos é determinada com o uso da sequência de comparação de parâmetros padrão do programa de computador GAP (Pacote GCG Wisconsin; uma parte da versão 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)).

[0055] Os termos "polinucleotídeo", "oligonucleotídeo" e "ácido nucleico" podem ser usados alternativamente ao longo de todo o texto e incluem moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (por exemplo, mRNA), análogos de DNA ou RNA e seus híbridos produzidos com o uso de análogos de nucleotídeo (por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo e análogos de nucleotídeo não naturais). As moléculas de ácido nucleico podem ser de fita simples ou dupla. Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico contidas nessa invenção codificam o anticorpo ou seus fragmentos, derivados, proteínas mutantes, ou quadro de leitura aberta contínua de variantes.

[0056] Se suas sequências podem ser invertidas e paralelas, dois nucleotídeos de fita simples são "complementares” um ao outro, de modo que cada nucleotídeo em um polinucleotídeo seja oposto ao nucleotídeo complementar no outro, nenhuma lacuna seja introduzida e nenhum nucleotídeo não pareado seja encontrado nas extremidades 5' ou 3' de cada sequência. Se dois polinucleotídeos podem se cruzar sob condições moderadamente estritas, um polinucleotídeo é "complementar" ao outro. Desse modo, um polinucleotídeo pode ser complementar a outro polinucleotídeo, mas não sua sequência complementar.

[0057] O termo "carreador" é um ácido nucleico que pode ser usado para introduzir outro ácido nucleico conectado ao mesmo em uma célula. Um tipo de carreador é um "plasmídeo" que se refere a uma molécula de DNA de fita dupla linear ou circular que pode ser fixada a um segmento de ácido nucleico adicional. Outro tipo de carreador é um vetor viral (por exemplo, retrovírus defeituoso em replicação, adenovírus e vírus complementar adenoviral) em que segmentos de DNA adicionais podem ser introduzidos no genoma viral. Alguns carreadores podem se replicar de modo autônomo nas células hospedeiras nas quais são introduzidos (por exemplo, os carreadores bacterianos que contêm a origem de replicação bacteriana e os carreadores de mamíferos do tipo livre). Outros carreadores (por exemplo, carreadores de mamíferos do tipo não livre) são integrados ao genoma de célula hospedeira quando introduzidos na célula hospedeira e se replicam, desse modo, com o genoma hospedeiro. "Carreador de expressão" é o tipo de carreador que pode orientar a expressão de polinucleotídeos selecionados.

[0058] Se a sequência reguladora afeta a expressão de uma sequência de nucleotídeos (por exemplo, nível, tempo ou sítio de expressão), então, a sequência de nucleotídeos é "operacionalmente ligada" à sequência reguladora. A "sequência reguladora" é o ácido nucleico que afeta a expressão (por exemplo,

nível, tempo ou sítio de expressão) do ácido nucleico com o qual é operacionalmente ligado. Genes reguladores, por exemplo, atuam diretamente em ácidos nucleicos regulados ou através de uma ou mais outras moléculas (por exemplo, polinucleotídeos que se ligam a sequências reguladoras e/ou ácidos nucleicos). Os exemplos de sequências reguladoras incluem promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Os exemplos adicionais de sequências reguladoras podem ser descritos como Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Volume 185, Academic Press, San Diego, CA; And Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605 a 3606.

[0059] O termo "célula hospedeira" se refere a uma célula usada para expressar um ácido nucleico, como aquele fornecido nesse artigo. A célula hospedeira pode ser de procariotas, como E. coli, ou pode ser de eucariotas, como eucariotas unicelulares (levedura ou outros fungos, por exemplo), células vegetais (como células vegetais de tabaco ou tomate), células animais (por exemplo, células de macaco, células de hamster, células de insetos ou células de ratos e camundongos) ou hibridoma. Usualmente, a célula hospedeira é uma célula de cultura que pode ser transformada ou transfectada com um peptídeo que codifica o ácido nucleico, o qual pode ser, então, expresso na célula hospedeira. A expressão "célula hospedeira recombinante" pode ser usada para descrever uma célula hospedeira transformada ou transfectada com uma expressão esperada de ácido nucleico. A célula hospedeira também pode ser uma célula que contém o ácido nucleico, mas não expressa o mesmo no nível desejável, a menos que sequências reguladoras sejam introduzidas na célula hospedeira de modo que seja operacionalmente ligada ao ácido nucleico. Deve ser entendido que o termo “célula hospedeira” se refere não apenas à célula de indivíduo específico, como também à progênie ou possível progênie dessa célula. Devido a certas modificações que ocorrem em gerações subsequentes, como mutações ou influências ambientais, a progênie pode, de fato, ser diferente da célula parental, mas ainda estará no escopo da terminologia usada nessa invenção.

Receptor de peptídeo inibidor gástrico intestinal

[0060] O receptor de peptídeo inibidor gástrico intestinal pertence ao tipo B da família de receptor acoplado de sete proteínas G transmembranares. O receptor é acoplado a uma ou mais vias de sinalização intracelular por uma proteína de ligação de nucleotídeo guanina heterotrimérica (proteína G) (Drucker et al., 2006, Cell Metab. 3:153 a 165). Até agora, os estudos mostram que GIPR é principalmente expresso na superfície de célula β pancreática e células adiposas (Ravn et al., 2013, J. Biol. Chem. 288:19.760 a 19.772), que está envolvido tanto na glicose quanto no metabolismo lipídico em seres humanos, e é, portanto, aproximadamente relacionado a diabetes, obesidade e doenças relacionadas (Skaw et al., 2016, Diabetes Obes. Metab. 18:847 a 854). Tanto "GIPR humano" quanto "hGIPR" usados neste documento se referem ao receptor de peptídeo inibidor intestinal humano, os quais podem ser usados de modo intercambiável. Tanto o "GIPR de camundongo" quanto o "mGIPR" usados neste documento se referem ao receptor de peptídeo inibidor gástrico de camundongo, os quais também podem ser usados de modo intercambiável.

[0061] Em uma modalidade, o anticorpo apresentado aqui é um anticorpo que se liga especificamente ao GIPR humano. Em outra modalidade, o anticorpo apresentado aqui é um anticorpo que se liga especificamente a GIPR na membrana celular, e o anticorpo pode inibir ou bloquear a transdução de sinais de GIP nessas células. Em outra modalidade, o anticorpo apresentado aqui é um anticorpo que se liga especificamente ao GIPR humano e pode se ligar a GIPR de outras espécies (por exemplo, macacos ou camundongos) e bloquear a sinalização de GIP nessas espécies. Em uma modalidade adicional, o anticorpo apresentado aqui é um anticorpo murino que se liga ao GIPR humano e pode se ligar a GIPR de outras espécies (por exemplo, macaco).

[0062] Em uma modalidade, as sequências de aminoácidos e polinucleotídeos de GIPR são listadas abaixo, com dados de sequência do banco de dados Gene-Bank do centro nacional dos E.U.A. para informações de biotecnologia e do banco de dados Uniprot do instituto europeu para informações de biotecnologia: Polinucleotídeo (SEQ ID NO:114) humano (Homo sapiens); número de acesso: S79852; Aminoácido (SEQ ID NO:113) humano (Homo sapiens); número de acesso: AAB35419.2; Polinucleotídeo (SEQ ID NO:116) de macaco (Rhesus macaque); número de acesso: XM_015124289.1; Aminoácido (SEQ ID NO:115) de macaco (Rhesus macaque); número de acesso: XP_014979775; Polinucleotídeo (SEQ ID NO:118) de camundongo (Mus musculus); número de acesso: CCDS39795; e aminoácido (SEQ ID NO:117) de camundongo (Mus musculus); número de acesso: Q0P543.

Anticorpo de receptor de peptídeo inibidor gástrico (GIPR) intestinal

[0063] Em uma modalidade, é fornecido no presente documento o anticorpo de GIPR. Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é o anticorpo de GIPR completo. Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é o fragmento de anticorpo de GIPR. Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é um derivado de anticorpo de GIPR. Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é a proteína mutante de anticorpo de GIPR. Em uma modalidade adicional, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é a variante do anticorpo de GIPR.

[0064] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis sequências de aminoácidos, em que cada uma é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 15; b. Sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 16; c. Sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, e SEQ ID NO: 17; d. Sequência de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, e SEQ ID NO: 26;

e. Sequência de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 29; e f. Sequência de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 30.

[0065] A Tabela 1 lista as sequências de aminoácidos das CDRs de cadeia leve do anticorpo de GIPR fornecido no presente documento, assim como as sequências de codificação de polinucleotídeos correspondentes. A Tabela 2 lista as sequências de aminoácidos das CDRs de cadeia pesada do anticorpo de GIPR fornecido no presente documento, assim como as sequências de codificação de polinucleotídeos correspondentes.

Tabela 1: sequências de aminoácidos de CDR de cadeia leve e sequências de codificação de polinucleotídeos CDR1 CDR2 CDR3 A-1 aaggccagtcaggatg tgggcatacatccggc cagcaatatagcagct Nucleotí- tgggtactgctgtagc acact atccgtggacg deo c (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 31) A-1 KASQDVGTAVA WAYIRHT QQYSSYPWT Aminoácido (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 3) A-2 agacccagtgaaagtg cttgcatccaacctag cagcaaaataatgagg Nucleotí- ttgatagttatggcaa aatct atcctcggacg deo tagttttatgcac (SEQ ID NO: 35) (SEQ ID NO: 36) (SEQ ID NO: 34) A-2 RPSESVDSYGNSFMH LASNLES QQNNEDPRT Aminoácido (SEQ ID NO: 4) (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6) A-3 aaggcaagtgaggaca gatgcaaccagtttgg caacagtattggagta Nucleotí- tatataatcggttcgc aaact ttccgtggacg deo c (SEQ ID NO: 38) (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 37) A-3 KASEDIYNRFA DATSLET QQYWSIPWT Aminoácido (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8) (SEQ ID NO: 9)

CDR1 CDR2 CDR3 A-4 agggccagccaaagtg tatgcatccaacctag caacacagttgggatt Nucleotí- tcaatacatctgtcta aatct ttccttacacg deo tagttatatacac (SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 42) (SEQ ID NO: 40) A-4 RASQSVNTSVYSYIH YASNLES QHSWDFPYT Aminoácido (SEQ ID NO: 10) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12) A-5 agagccagccagtccg tatgcatccaacctag cagcacagcttcgatt Nucleotí- tgaacacagccgtgta aatct tcccctacacc deo ctcttatatccac (SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 43) A-5 RASQSVNTAVYSYIH YASNLES QHSFDFPYT Aminoácido (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 14) A-6 aaggcgagtcaggaca gcaaacagattggtag ctacagtatgatgagt Nucleotí- ttaatagctatttaag at ttccattcacg deo c (SEQ ID NO: 47) (SEQ ID NO: 45) (SEQ ID NO: 46) A-6 KASQDINSYLS ANRLVD LQYDEFPFT Aminoácido (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17)

Tabela 2: sequências de aminoácidos de CDR de cadeia pesada e sequências de codificação de polinucleotídeos CDR1 CDR2 CDR3 A-1 ggattcactttcagta tccattagtagtggtg ggcgagggcggtagta Nucleotí- gctatgccatgtct gtgccacctactatcc gctacccggcctggtt deo (SEQ ID NO: 48) agacagtgtgaag tgctttc (SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 50) A-1 GFTFSSYAMS SISSGGATYYPDSVKG GEGGSSYPAWFAF Aminoácido (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 20) A-2 ggattcactttcagta gaaattagtagtggtg gataaggcgactcgaa Nucleotí- gctatgccatgtct gtagttacacctacta ctggcatgggattttt deo tccagacactgtgacg ttaccatactatggac (SEQ ID NO: 48) ggc tac (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 52) A-2 GFTFSSYAMS EISSGGSYTYYPDTVT DKATRTGMGFFYHTMD Aminoácido G Y (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22) A-3 ggctacacattcagta gagattttacctggaa acggtagtagctacaa Nucleotí- ggtactggatagag gtgatagtcctaacta ggtttgcttac deo caatgagaagttcaag

CDR1 CDR2 CDR3 (SEQ ID NO: 53) ggc (SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO: 54) A-3 GYTFSRYWIE EILPGSDSPNYNEKFK TVVATRFAY Aminoácido (SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 24) (SEQ ID NO: 25) A-4 ggctactcaatcacca tacataagctacagag ggggaatacggccccg Nucleotí- gtgattatgcctggaa gcatcgctacctataa gcaactttgacttc deo c accatctctcaaaagt (SEQ ID NO: 58) (SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 57) A-4 GYSITSDYAWN YISYRGIATYKPSLKS GEYGPGNFDF Aminoácido (SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 28) A-5 ggctactcaatcacca tacataagctacagag ggggaatacggccccg Nucleotí- gtgattatgcctggaa gcatcgctacctataa gcaactttgacttc deo c accatctctcaaaagt (SEQ ID NO: 58) (SEQ ID NO: 56) (SEQ ID NO: 57) A-5 GYSITSDYAWN YISYRGIATYKPSLKS GEYGPGNFDF Aminoácido (SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 28) A-6 ggctactcaatcacca tacatgagctaccgtg tatgattacgacgttc Nucleotí- gtgattatgcctggaa gtaccgcaacgtacaa cccggtttccttac deo c tccatttctcaaaagt (SEQ ID NO: 59) (SEQ ID NO: 60) (SEQ ID NO: 56) A-6 GYSITSDYAWN YMSYRGTATYNPFLKS YDYDVPRFPY Aminoácido (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 26) (SEQ ID NO: 30)

[0066] Em uma modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento compreende uma sequência diferente de uma das sequências de aminoácidos de CDR listadas nas Tabelas 1 e 2 por cinco, quatro, três, duas ou uma adição, substituição e/ou deleção de aminoácido único. Em outra modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento contém uma sequência diferente de uma das sequências de aminoácidos de CDR listadas nas Tabelas 1 e 2 por quatro, três, duas ou uma adição, substituição e/ou deleção de aminoácido único.

[0067] Em outra modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento contém uma sequência diferente de uma das sequências de aminoácidos de CDR listadas nas Tabelas 1 e 2 por três, duas ou uma adição, substituição e/ou deleção de aminoácido único.

[0068] Em outra modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento contém uma sequência diferente de uma das sequências de aminoácidos de CDR listadas nas Tabelas 1 e 2 por duas ou uma adição, substituição e/ou deleção de aminoácido único.

[0069] Em modalidades adicionais, o anticorpo fornecido no presente documento contém uma sequência que difere de uma das sequências de aminoácidos de CDR listadas nas Tabelas 1 e 2 por uma adição, substituição e/ou deleção de aminoácido único.

[0070] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 15; e b. Sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, e SEQ ID NO: 26.

[0071] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 16; e b. Sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 29.

[0072] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma, duas, três ou quatro sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, e SEQ ID NO: 17; e b. Sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 30.

[0073] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma, duas, três ou quatro sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 15; b. Sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, e SEQ ID NO: 26; c. Sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 16; e d. Sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 29.

[0074] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma, duas, três ou quatro sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, e SEQ ID NO: 15; b. Sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, e SEQ ID NO: 26; c. Sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, e SEQ ID NO: 17; e d. Sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 30.

[0075] Em modalidades adicionais, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma, duas, três ou quatro sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, e SEQ ID NO: 16;

b. Sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 29; c. Sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, e SEQ ID NO: 17; e d. Sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 30.

[0076] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma, duas ou três sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, e SEQ ID NO: 17.

[0077] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma, duas ou três sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, e SEQ ID NO: 30.

[0078] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionadas dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 26, e SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 26.

[0079] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionadas dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 29.

[0080] Em modalidades adicionais, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionadas dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 30.

[0081] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende: a. Uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 26, e SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 26; e b. Uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 29.

[0082] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende: a. Uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 26,e SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 26; e b. Uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 28,e SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 30.

[0083] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento contém: a. Uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 29; e b. Uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 6 e SEQ

ID NO: 22, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 30.

[0084] Em uma modalidade adicional, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende: a. Uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 26, e SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 26; b. Uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 29; e c. Uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 30.

[0085] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende: a. Combinação de sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, e SEQ ID NO: 20;

b. Combinação de sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, e SEQ ID NO: 22; c. Combinação de sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, e SEQ ID NO: 25; d. Combinação de sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 28; e. Combinação de sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada: SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 28; ou f. Combinação de sequências de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada: SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 29, e SEQ ID NO:

30.

[0086] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 70, e SEQ ID NO: 71; e uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%,

ou pelo menos 95% idêntica a qualquer sequência acima; e b. Sequências de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada: SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, e SEQ ID NO: 80; e uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica a qualquer sequência acima.

[0087] Em outra modalidade, a sequência de codificação de polinucleotídeos para o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma ou duas sequências de codificação de polinucleotídeos, em que cada sequência de codificação de polinucleotídeos é independentemente selecionada dentre as sequências de polinucleotídeos listadas abaixo: a. Sequências de codificação de polinucleotídeos de domínio variável de cadeia leve: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, e SEQ ID NO: 91; e uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% idêntica a qualquer sequência acima; e b. Sequências de codificação de polinucleotídeos de domínio variável de cadeia pesada: SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, e SEQ ID NO: 100; e uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica a qualquer sequência acima.

[0088] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma sequência de aminoácidos independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 70, e SEQ ID NO: 71.

[0089] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma sequência de aminoácidos independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, e SEQ ID NO: 80.

[0090] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma combinação de sequências de aminoácidos independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada listadas abaixo: SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 79, e SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 80.

[0091] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma sequência de aminoácidos independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, e SEQ ID NO: 77.

[0092] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma combinação de sequências de aminoácidos independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada listadas abaixo: SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 72 (L1H1), SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 73 (L2H2), SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 74 (L3H3), SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 74 (L4H3), SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 75 (L5H4), SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 76 (L6H5), SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 77 (L7H6), SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 77 (L8H6), SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 78 (L9H7), SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 79 (L10H8), e SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 80 (L11H9).

[0093] O símbolo "LxHy" também pode ser usado no presente documento para se referir ao anticorpo de GIPR fornecido no presente documento, em que "x" corresponde ao código de sequência de região variável de cadeia leve e "y" corresponde ao código de sequência de região variável de cadeia pesada. Por exemplo, L2H2 é um anticorpo completo com uma região variável de cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 62 (L2) e a região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 73 (H2).

[0094] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos constante de cadeia leve: SEQ ID NO: 101 e a SEQ ID NO: 102; e b. Sequências de aminoácidos constante de cadeia pesada: SEQ ID NO: 103 e a SEQ ID NO: 104 e SEQ ID NO: 124.

[0095] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre uma combinação de sequências de aminoácidos constantes de cadeia leve e cadeia pesada listadas abaixo: SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 103, e SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 104. Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre uma combinação de sequências de aminoácidos constantes de cadeia leve e cadeia pesada listadas abaixo: SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 124, e SEQ ID NO: 102 e SEQ ID NO: 124.

[0096] Em uma modalidade, os anticorpos de GIPR fornecidos no presente documento compreendem as CDRs de cadeia leve e pesada listadas no presente documento, e as sequências de aminoácidos dos FRs (framework). As sequências de aminoácidos de FRs estão contidas no domínio variável da cadeia leve ou da cadeia pesada e não são separadamente exibidas. Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de CDR1 de cadeia leve listada no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de CDR2 de cadeia leve listada no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de CDR3 de cadeia leve listada no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de CDR1 de cadeia pesada listada no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de CDR2 de cadeia pesada listada no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de CDR3 de cadeia pesada listada no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de FR1 de cadeia leve no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de FR2 de cadeia leve no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de FR3 de cadeia leve no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de FR4 de cadeia leve no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de FR1 de cadeia pesada no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de FR2 de cadeia pesada no presente documento. Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma sequência de FR3 de cadeia pesada no presente documento. Em uma modalidade adicional, o anticorpo compreende uma sequência de FR4 de cadeia pesada no presente documento.

[0097] Em uma modalidade, uma sequência de CDR3 de cadeia leve do anticorpo difere da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14 das sequências de CDR3 de cadeia leve ilustradas acima por não mais do que seis, cinco, quatro, três, duas ou uma adição (ou adições), substituição (ou substituições), e/ou deleção (ou deleções) de aminoácido. Em outra modalidade, uma sequência de CDR3 de cadeia pesada do anticorpo difere da SEQ ID NO: 22 e a SEQ ID NO: 28 das sequências de CDR3 de cadeia pesada ilustradas acima por não mais do que seis, cinco, quatro, três, duas ou uma adição (ou adições), substituição (ou substituições), e/ou deleção (ou deleções) de aminoácido. Em uma modalidade adicional, uma sequência de CDR3 de cadeia leve do anticorpo difere da SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14 das sequências de CDR3 de cadeia leve ilustradas acima por não mais do que seis, cinco, quatro, três, duas ou uma adição (ou adições), substituição (ou substituições), e/ou deleção (ou deleções) de aminoácido, e uma sequência de CDR3 de cadeia pesada do anticorpo difere da SEQ ID NO: 22 e a SEQ ID NO: 28 das sequências de CDR3 de cadeia pesada ilustradas acima por não mais do que seis, cinco, quatro, três, duas ou uma adição (ou adições), substituição (ou substituições), e/ou deleção (ou deleções) de aminoácido. Em outra modalidade, o anticorpo compreende adicionalmente uma combinação de uma, duas, três, quatro, cinco ou seis de sequências de CDR de cadeia leve e cadeia pesada ilustradas acima.

[0098] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve selecionada das sequências de domínio variável de cadeia leve L2 (SEQ ID NO:62), L3 (SEQ ID NO:63), L4 (SEQ ID NO:64), L6 (SEQ ID NO:66), L7 (SEQ ID NO:67), e L8 (SEQ ID NO:68) listadas no presente documento. Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve do anticorpo de GIPR difere da sequência de aminoácidos de um domínio variável de cadeia leve de L2 (SEQ ID NO:62), L3 (SEQ ID NO:63), L4 (SEQ ID NO:64), L6 (SEQ ID NO:66), L7 (SEQ ID NO:67), e L8 (SEQ ID NO:68) por quinze, catorze, treze, doze, onze, dez, nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, duas ou uma diferença de aminoácido, em que a diferença em cada sequência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um resíduo de aminoácido. Em outra modalidade, o domínio variável de cadeia leve do anticorpo de GIPR compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de um domínio variável de cadeia leve de L2 (SEQ ID NO:62), L3 (SEQ ID NO:63), L4 (SEQ ID NO:64), L6 (SEQ ID NO:66),

L7 (SEQ ID NO:67), e L8 (SEQ ID NO:68). Em outra modalidade, a sequência de codificação de polinucleotídeos do domínio variável de cadeia leve do anticorpo de GIPR compreende uma sequência de codificação de nucleotídeos pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de codificação de polinucleotídeos de L2 (SEQ ID NO:62), L3 (SEQ ID NO:63), L4 (SEQ ID NO:64), L6 (SEQ ID NO:66), L7 (SEQ ID NO:67), e L8 (SEQ ID NO:68). Em outra modalidade, a sequência de codificação de polinucleotídeos do domínio variável de cadeia leve do anticorpo de GIPR compreende sequências de polinucleotídeos hibridizadas sob condições moderadas com uma dentre as sequências de codificação de polinucleotídeos complementares de L2 (SEQ ID NO:62), L3 (SEQ ID NO:63), L4 (SEQ ID NO:64), L6 (SEQ ID NO:66), L7 (SEQ ID NO:67), e L8 (SEQ ID NO:68). Em uma modalidade adicional, a sequência de codificação de polinucleotídeos do domínio variável de cadeia leve do anticorpo de GIPR compreende uma sequência de polinucleotídeos hibridizada sob condições estringentes com uma sequência de codificação de polinucleotídeos complementar de um domínio variável de cadeia leve de L2 (SEQ ID NO:62), L3 (SEQ ID NO:63), L4 (SEQ ID NO:64), L6 (SEQ ID NO:66), L7 (SEQ ID NO:67), e L8 (SEQ ID NO:68).

[0099] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento compreende uma sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada selecionada das sequências de domínio variável de cadeia pesada H2 (SEQ ID NO:73), H3 (SEQ ID NO:74), H5 (SEQ ID NO:76), e H6 (SEQ ID NO:77) listadas no presente documento. Em outra modalidade, a sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada do anticorpo de GIPR difere de uma sequência de domínio variável de cadeia pesada de H2 (SEQ ID NO:73), H3 (SEQ ID NO:74), H5 (SEQ ID NO:76), e H6 (SEQ ID NO:77) por quinze, catorze, treze, doze, onze, dez, nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, dois ou um aminoácido, em que a diferença em cada sequência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de um resíduo de aminoácido.

Em outra modalidade, o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo de GIPR compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de domínio variável de cadeia pesada de H2 (SEQ ID NO:73), H3 (SEQ ID NO:74), H5 (SEQ ID NO:76), e H6 (SEQ ID NO:77). Em outra modalidade, o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo de GIPR compreende uma sequência de codificação de polinucleotídeos pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de codificação de polinucleotídeos de domínio variável de cadeia pesada de H2 (SEQ ID NO:73), H3 (SEQ ID NO:74), H5 (SEQ ID NO:76), e H6 (SEQ ID NO:77). Em outra modalidade, a sequência de codificação de polinucleotídeos do domínio variável de cadeia pesada de anticorpo de GIPR compreende uma sequência de polinucleotídeos hibridizada a uma sequência de codificação de polinucleotídeos complementar de um dentre os domínios variáveis de cadeia pesada de H2 (SEQ ID NO:73), H3 (SEQ ID NO:74), H5 (SEQ ID NO:76), e H6 (SEQ ID NO:77) sob condições moderadamente estritas.

Em uma modalidade, a sequência de codificação de polinucleotídeos do domínio variável de cadeia pesada de anticorpo de GIPR compreende uma sequência de polinucleotídeos hibridizada sob condições estringentes com uma sequência de codificação de polinucleotídeos complementar dentre os domínios variáveis de cadeia pesada de H2 (SEQ ID NO:73), H3 (SEQ ID NO:74), H5 (SEQ ID NO:76), e H6 (SEQ ID NO:77).

[0100] Em uma modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento é um anticorpo que compreende uma combinação de L1H1 (SEQ ID NO:61 e SEQ ID NO:72), L2H2 (SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO:73), L3H3 (SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:74), L4H3 (SEQ ID NO:64 e SEQ ID NO:74), L5H4 (SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:75), L6H5 (SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:76), L7H6 (SEQ ID NO:67 e SEQ ID NO:77), L8H6 (SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:77), L9H7 (SEQ ID NO:69 e SEQ ID NO:78), L10H8 (SEQ ID NO:70 e SEQ ID NO:79), ou L11H9 (SEQ ID NO:71 e SEQ ID NO:80), ou de um fenótipo desejável (por exemplo, IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgE ou IgD), ou um fragmento Fab ou F(ab')2 do mesmo.

[0101] Em uma modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento é um anticorpo que compreende uma combinação de L2H2 (SEQ ID NO:62 e SEQ ID NO:73), L3H3 (SEQ ID NO:63 e SEQ ID NO:74), L4H3 (SEQ ID NO:64 e SEQ ID NO:74), L6H5 (SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:76), L7H6 (SEQ ID NO:67 e SEQ ID NO:77), ou L8H6 (SEQ ID NO:68 e SEQ ID NO:77), ou de um fenótipo desejável (por exemplo, IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgE ou IgD), ou um fragmento Fab ou F(ab')2 do mesmo.

[0102] Os anticorpos fornecidos no presente documento podem compreender qualquer uma das regiões constantes conhecidas no campo. A região constante de cadeia leve pode ser, por exemplo, região constante de cadeia leve κ ou λ, como uma região constante de cadeia leve κ ou λ de camundongo. A região constante de cadeia pesada pode ser, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada α, δ, ε, γ ou μ, como a região constante de cadeia pesada α, δ, ε, γ ou μ de camundongo. Em uma modalidade, a região constante de cadeia leve ou pesada é um fragmento, derivado, variante ou mutante da região constante natural.

[0103] Em uma modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento compreende adicionalmente um domínio constante κ ou λ de cadeia leve humana ou fragmento do mesmo. A sequência de aminoácidos da região constante de cadeia leve é conforme o seguinte: Sequência de aminoácidos de domínio constante de κ de cadeia leve humana: (SEQ ID NO: 101); e Sequência de aminoácidos de domínio constante de λ de cadeia leve humana: (SEQ ID NO: 102).

[0104] Em uma modalidade, os anticorpos fornecidos no presente documento compreendem adicionalmente um domínio constante de cadeia pesada humana ou fragmento do mesmo.

[0105] A sequência de aminoácidos da região constante de cadeia pesada é conforme o seguinte: Sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada humana（hIgG2）: (SEQ ID NO: 103); Sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada humana（hIgG4）: (SEQ ID NO: 104); e Sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada humana（hIgG4）: (SEQ ID NO: 124).

[0106] Em uma modalidade, os anticorpos de GIPR fornecidos no presente documento são selecionados dentre anticorpos derivados de camundongos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos recombinantes, fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno, anticorpos de cadeia única, anticorpos de cadeia dupla, anticorpos de cadeia tripla, anticorpos de cadeia quádrupla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')x, anticorpos de domínio estrutural, anticorpos IgD, anticorpos IgE, anticorpos IgM, anticorpos IgGl, anticorpos IgG2, anticorpos IgG3 ou anticorpos IgG4.

[0107] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é um anticorpo monoclonal de GIPR.

[0108] Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é um anticorpo monoclonal que compreende uma combinação de sequências de aminoácidos selecionadas dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 79, e SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 80.

[0109] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é um anticorpo de GIPR de camundongo. Em outra modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é um anticorpo humanizado de GIPR.

[0110] Em uma modalidade, o anticorpo de GIPR fornecido no presente documento reduz a transdução de sinal de GIP humano com um valor de IC50 de cerca de 1 nM a 200 nM ou cerca de 1 nM a

100 nM.

Anticorpos e Fragmentos de Anticorpo

[0111] Em uma modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento é um anticorpo de comprimento completo (incluindo anticorpo policlonal, monoclonal, quimérico, humanizado ou humano com cadeias pesada e/ou leve de comprimento completo). Em outra modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento é um fragmento de anticorpo, por exemplo, fragmento F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc ou Fd, e pode ser incorporado em anticorpos de domínio único, anticorpos de cadeia única, maxicorpos, minicorpos, intracorpos, anticorpos de cadeia dupla, anticorpos de cadeia tripla, anticorpos de quatro cadeias, v-NAR e bis-scFv (consultar, por exemplo, Hollinger e Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23:1.126 a 1.136). Em outra modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento também inclui polipeptídeos de anticorpo, como aqueles revelados na Patente nº U.S. 6703199, incluindo monocorpos de polipeptídeo de fibronectina. Em outra modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento também inclui outros polipeptídeos de anticorpo revelados na Publicação de Patente nº U.S. 2005/0238646, que são polipeptídeos de cadeia única.

[0112] Em uma modalidade, as regiões variáveis do gene IgG que expressam um anticorpo monoclonal de interesse em um hibridoma são amplificadas com o uso dos iniciadores de nucleotídeo. Esses iniciadores podem ser sintetizados por um indivíduo de habilidade comum na técnica, ou podem ser adquiridos a partir de fornecedores comercialmente disponíveis, os quais sintetizam iniciadores para regiões variáveis humanas e de camundongos, entre outros, iniciadores para regiões VHa, VHb, VHc,

VHd, CH1, VL e CL. Esses iniciadores podem ser usados para amplificar regiões variáveis de cadeia pesada ou leve, as quais podem ser, então, inseridas em vetores, como IMMUNOZAPTMH ou IMMUNOZAPTML (Stratagene), respectivamente. Esses vetores podem ser, então, introduzidos em E. coli, levedura ou sistemas com base em mamíferos para expressão. Quantidades grandes de proteína de cadeia única que contêm uma fusão das regiões VH e VL podem ser produzidas com o uso desses métodos (consultar Bird et al., 1988, Science 242:423 a 426).

[0113] Deve ser entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica que certas proteínas, como anticorpos, podem ser submetidas a uma variedade de modificações pós-tradução. Os tipos e extensões dessas modificações dependem frequentemente das linhagens de célula hospedeira usadas para expressar a proteína, assim como as condições de cultura. Tais modificações podem incluir variações em glicosilação, oxidação de metionina, formação de dicetopiperizina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um resíduo básico de terminal carboxila (como lisina ou arginina) devido à ação de carboxipeptidases (conforme descrito em Harris, 1995, Journal of Chromatography 705:129 a 134).

[0114] Um método comum para a produção de um anticorpo monoclonal murino é por células de hibridoma. Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados por uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Tais técnicas de isolamento incluem cromatografia por afinidade com Proteína A Sepharose, cromatografia por exclusão de tamanho e cromatografia de troca iônica (consultar, por exemplo, Coligan nas páginas 2.7.1 a

2.7.12 e páginas 2.9.1 a 2.9.3; Baines et al., "Purification of

Immunoglobulin G (IgG)" em Methods in Molecular Biology, volume 10, páginas 79 a 104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Um anticorpo monoclonal pode ser purificado por cromatografia por afinidade com o uso de um ligante apropriado selecionado com base nas propriedades particulares do anticorpo (por exemplo, isotipo de cadeia pesada ou leve, especificidade de ligação, etc.). Os exemplos de ligantes adequados imobilizados em um suporte sólido incluem Proteína A, Proteína G, um anticorpo (de cadeia leve ou cadeia pesada) de região anticonstante, um anticorpo anti- idiotipo e uma proteína de ligação a TGF-β, ou um fragmento ou variante dos mesmos.

[0115] A evolução molecular das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) no centro do sítio de ligação de anticorpo também foi usada para isolar anticorpos com afinidades aumentadas, por exemplo, anticorpos que têm afinidades aumentadas para c-erbB-2, conforme descrito por Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551 a 567. Consequentemente, tais técnicas são úteis no preparo de anticorpos contra GIPR.

[0116] Os anticorpos contra GIPR humano podem ser usados, por exemplo, em ensaios para detectar a presença de GIPR, in vitro ou in vivo.

[0117] Anticorpos também podem ser preparados por qualquer uma das técnicas convencionais. Por exemplo, os mesmos podem ser purificados de células que expressam naturalmente os mesmos (por exemplo, um anticorpo pode ser purificado de um hibridoma que produz o mesmo) ou produzido em sistemas de expressão recombinantes com o uso de qualquer técnica conhecida na arte. Por exemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, Nova

Iorque (1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, (1988). Isso é discutido na seção de ácido nucleico abaixo.

[0118] Os anticorpos podem ser preparados e triados por propriedades desejáveis por quaisquer técnicas conhecidas. Algumas técnicas se referem ao isolamento de ácidos nucleicos que codificam as cadeias de polipeptídeos (ou porções das mesmas) de anticorpos relacionados (por exemplo, anticorpos anti-GIPR) e manipulação de ácido nucleico. Os ácidos nucleicos podem ser fundidos com outro ácido nucleico relevante ou modificados por técnicas de DNA recombinante (por exemplo, mutações induzidas ou outras técnicas convencionais) para adicionar, deletar ou substituir um ou mais resíduos de aminoácidos.

[0119] Quando se deseja melhorar a afinidade de anticorpos, de acordo com a invenção, que contêm uma ou mais das CDRs mencionadas acima, tais anticorpos podem ser obtidos por vários protocolos de maturação de afinidade, incluindo a manutenção das CDRs (Yang et al., 1995, J. Mol. Biol., 254:392 a 403), embaralhamento de cadeia (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779 a 783), uso de cepas de mutação de E. coli. (Low et al., 1996, J. Mol. Biol., 250:350- a 68), embaralhamento de DNA (Patten et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8:724 a 733), exibição de fago (Thompson et al., 1996, J. Mol. Biol., 256:7 a 88) e técnicas de PCR adicionais (Crameri et al., 1998, Nature, 391:288 a 291). Todos esses métodos ou maturação de afinidade são discutidos em Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology, 16:535 a 539).

[0120] Em uma modalidade, os fragmentos do anticorpo de GIPR são fornecidos no presente documento. Tais fragmentos podem compreender sequências inteiramente derivadas de anticorpo ou sequências adicionais. Os exemplos de fragmentos de ligação a antígeno incluem Fab, F(ab')2, anticorpos de cadeia única, diacorpos, tricorpos, tetracorpos e anticorpos de domínio. Outros exemplos são fornecidos em Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500 a 506.

[0121] Os anticorpos de cadeia única podem ser formados ligando-se fragmentos de domínio variável de cadeia pesada e leve (Fv região) por meio de uma ponte de aminoácidos (ligante de peptídeo curto) que resulta em uma cadeia de polipeptídeos única. Tais Fvs de cadeia única (scFvs) têm sido preparados por DNA de fusão que codifica um ligante de peptídeo entre DNAs que codificam os dois polipeptídeos de domínio variável (VL e VH). Os polipeptídeos resultantes podem se dobrar novamente em si para formar monômeros de ligação a antígeno, ou os mesmos podem formar multímeros (por exemplo, dímeros, trímeros ou tetrâmeros), dependendo do comprimento de um ligante flexível entre os dois domínios variáveis (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95 a 108). Combinando-se polipeptídeos que compreendem VL e VH diferentes, scFvs multiméricos que se ligam a epítopos diferentes podem ser formados (Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31 a 40). As técnicas desenvolvidas para a produção de anticorpos de cadeia única incluem aquelas descritas na Patente nº U.S. 4946778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544; de Graaf et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:379 a 387. Os anticorpos de cadeia única derivados de anticorpos fornecidos no presente documento incluindo, mas sem limitação, scFvs que compreendem a combinação de domínio variável L1H1, são abrangidos pela presente invenção.

[0122] Anticorpos derivados de um anticorpo também podem ser obtidos, por exemplo, por hidrólise proteolítica do anticorpo, por exemplo, digestão de pepsina ou papaína de um anticorpo inteiro de acordo com métodos convencionais. A título de exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer um fragmento SS denominado F(ab’)2. Esse fragmento pode ser adicionalmente clivado com o uso de um agente de redução de tiol para produzir fragmentos monovalentes 3.5S Fab’. Opcionalmente, a reação de clivagem pode ser realizada com o uso de um grupo de bloqueio para os grupos sulfidrila que resultam da clivagem de ligações de dissulfeto. Como alternativa, uma clivagem enzimática com o uso de papaína produz dois fragmentos monovalentes Fab e um fragmento Fc diretamente. Esses métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, Patente nº U.S. 4331647, Nisonoffet et al., 1960, Arch. Biochem. Biophys. 89:230; Porter, 1959, Biochem. J. 73:119; Edelman et al., Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); e por Andrews, S. M. e Titus, J. A. in Current Protocols in Immunology (Coligan J. E. , et al., eds), John Wiley & Sons, Nova Iorque (2003), páginas 2.8.1 a 2.8.10 e 2.10A.1 a

2.10A.5. Outros métodos para clivar anticorpos, como separação de cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia pesada leve monovalentes (Fd), clivagem adicional dos fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas também podem ser usados, enquanto os fragmentos se ligam ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

[0123] Uma outra forma de fragmento de anticorpo é um peptídeo que compreende uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo. CDRs podem ser obtidas construindo-se polinucleotídeos que codificam as CDRs. Tais polinucleotídeos são preparados, por exemplo, usando-se a reação em cadeia da polimerase para sintetizar a região variável com o uso de mRNA ou células produtoras de anticorpo como um modelo (consultar, por exemplo, Larrick et al., 1991, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106; Courtenay-Luck, "(Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," em Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); e Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression or Antibodies," em Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995). O fragmento de anticorpo pode compreender adicionalmente pelo menos um domínio de região variável de um anticorpo descrito no presente documento. Desse modo, por exemplo, o domínio de região V pode ser monomérico e ser um domínio VH ou VL, que pode se ligar ao GIPR com uma afinidade de 1 x 10-7 M ou menos conforme descrito abaixo.

[0124] O domínio de região variável pode ser qualquer domínio variável de ocorrência natural ou uma versão manipulada do mesmo. Por versão manipulada entende-se um domínio de região variável que foi criado com o uso de técnicas de engenharia de DNA recombinante. Tais versões manipuladas incluem aquelas criadas, por exemplo, de uma região variável de anticorpo específica por inserções, deleções ou mudanças em ou nas sequências de aminoácidos do anticorpo específico. Os exemplos particulares incluem domínios de região variável manipulados que contêm pelo menos uma CDR e opcionalmente um ou mais aminoácidos de framework de um primeiro anticorpo e o restante do domínio de região variável de um segundo anticorpo.

[0125] O domínio de região variável pode ser covalentemente fixado a um aminoácido C-terminal a pelo menos um outro domínio de anticorpo ou um fragmento do mesmo. Desse modo, por exemplo, um domínio VH que está presente no domínio de região variável pode ser ligado a um domínio CH1 de imunoglobulina ou um fragmento do mesmo. De modo similar, um domínio VL pode ser ligado a um domínio CK ou um fragmento do mesmo. Dessa maneira, por exemplo, o anticorpo pode ser um fragmento Fab, em que o domínio de ligação a antígeno contém domínios VH e VL associados covalentemente ligados em seus terminais C a um domínio CH1 e Cκ, respectivamente. O domínio CH1 pode ser estendido com aminoácidos adicionais, por exemplo, para fornecer uma região de articulação ou uma porção de um domínio de região de articulação, conforme constatado em um fragmento Fab’, ou para fornecer domínios adicionais, como domínios CH2 e CH3 de anticorpo.

Derivados e Variantes de Anticorpos

[0126] As sequências de nucleotídeos de L1 e H1 podem ser alteradas, por exemplo, por mutagênese aleatória ou por mutagênese sítio-dirigida (por exemplo, mutagênese sítio- específica direcionada por oligonucleotídeo) para criar um polinucleotídeo alterado que compreende uma ou mais substituições, deleções ou inserções particulares de nucleotídeo em comparação com o polinucleotídeo que não sofreu mutação. Os exemplos de técnicas para realizar tais alterações são descritos em Walder et al., 1986, Gene 42:133; Bauer et al., 1985, Gene

37:73; Craik, 1985, BioTechniques, 3:12-19; Smith et al., 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press; e Patente nº U.S. 4518584 e 4737462. Estes e outros métodos podem ser usados para produzir, por exemplo, derivados de anticorpos de GIPR que têm propriedade desejável, por exemplo, um aumento em afinidade, avidez ou especificidade para GIPR ou estabilidade in vivo ou in vitro, ou efeitos colaterais in vivo reduzidos em comparação com o anticorpo não derivatizado.

[0127] Outros derivados de anticorpos de GIPR no escopo ou essa invenção incluem conjugados covalentes ou agregados ou anticorpos anti-GIPR, ou fragmentos dos mesmos, com outras proteínas ou polipeptídeos, como por expressão ou proteínas de fusão recombinantes que compreendem polipeptídeos heterólogos fundidos ao terminal N ou terminal C ou um polipeptídeo de anticorpo anti-GIPR. Por exemplo, o peptídeo conjugado pode ser um polipeptídeo de sinal heterólogo (ou líder), por exemplo, o líder de fator alfa de levedura ou um peptídeo, como uma etiqueta de epítopo. Um anticorpo que contém proteínas de fusão pode compreender peptídeos adicionados para facilitar a purificação ou identificação de proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, poli-His). Um anticorpo também pode ser ligado ao peptídeo FLAG, conforme descrito em Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1.204, e Patente nº U.S. 5011912. O peptídeo FLAG é altamente antigênico e fornece um epítopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal específico (mAb), o que possibilita o ensaio rápido e a purificação fácil de uma proteína recombinante expressa. Os reagentes úteis para preparar proteínas de fusão nas quais o peptídeo FLAG é fundido a um dado polipeptídeo estão comercialmente disponíveis (Sigma, St. Louis, Mo.). Em outra modalidade, os oligômeros que contêm um ou mais anticorpos podem ser empregados como antagonistas de GIPR. Os oligômeros podem estar na forma de dímeros, trímeros ou oligômeros superiores covalentemente ligados ou não covalentemente ligados. Os oligômeros que compreendem dois ou mais anticorpos são contemplados para uso, em que um exemplo é um homodímero. Outros oligômeros incluem heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrâmeros, heterotetrâmeros, etc.

[0128] Uma modalidade é direcionada aos oligômeros que compreendem múltiplos anticorpos unidos por meio de interações covalentes ou não covalentes entre porções químicas de peptídeo fundidas aos anticorpos. Tais peptídeos podem ser ligantes de peptídeo (espaçadores), ou peptídeos que têm a propriedade de promover a oligomerização. Os zíperes de leucina e certos polipeptídeos derivados de anticorpos estão entre os peptídeos que podem promover a oligomerização de anticorpos fixados aos mesmos, conforme descrito em mais detalhes abaixo.

[0129] Em modalidades particulares, os oligômeros compreendem de dois a quatro anticorpos. Os anticorpos do oligômero podem estar em qualquer forma, como qualquer uma das formas descritas acima, por exemplo, variantes ou fragmentos. Preferencialmente, os oligômeros compreendem anticorpos que mostram a atividade de ligação a GIPR.

[0130] Em uma modalidade, um oligômero é preparado com o uso de polipeptídeos derivados de imunoglobulinas. A preparação de proteínas de fusão que compreendem certos polipeptídeos heterólogos fundidos a várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) foi descrita, por exemplo, por Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10.535; Byrn et al.,

1990, Nature 344:677; e Hollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", em Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1 a 10.19.11. Uma modalidade fornecida no presente documento é direcionada a um dímero que compreende duas proteínas de fusão criadas fundindo-se um fragmento de ligação a GIPR de um anticorpo anti-GIPR à região Fc de um anticorpo. O dímero pode ser feito, por exemplo, inserindo-se a fusão de gene que codifica a proteína de fusão em um vetor de expressão apropriado, que expressa a fusão de gene em células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante, e que permite que a proteína de fusão expressa se monte como moléculas de anticorpo, em que as ligações de dissulfeto entre cadeias se formam entre as porções químicas Fc para render o dímero.

[0131] O termo "polipeptídeo Fc" conforme usado no presente documento inclui formas nativas e de muteína de polipeptídeos derivados da região Fc de um anticorpo. As formas truncadas de tais polipeptídeos que contêm a região de articulação que promove a dimerização também são incluídas. As proteínas de fusão que compreendem porções químicas Fc (e oligômeros formados das mesmas) oferecem a vantagem de purificação fácil por cromatografia de afinidade por colunas de Proteína A ou Proteína G.

[0132] Um polipeptídeo Fc adequado, descrito no pedido PCT nº WO 93/10151 (incorporado ao presente documento a título de referência), é um polipeptídeo de cadeia única que se estende da região de articulação N-terminal para o terminal C nativo da região Fc de um anticorpo de IgG1 humana. Outro polipeptídeo Fc útil é a muteína Fc descrita na Patente nº U.S. 5457035 e em

Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3.992 a 4.001. A sequência de aminoácidos dessa muteína é idêntica àquela da sequência Fc nativa apresentada no documento nº WO 93/10151, exceto por o aminoácido 19 ter sido mudado de Leu para Ala, o aminoácido 20 ter sido mudado de Leu para Glu e o aminoácido 22 ter sido mudado de Gly para Ala. A muteína exibe afinidade reduzida por receptores Fc. Em outras modalidades, a porção variável das cadeias pesada e/ou leve de um anticorpo anti-GIPR pode ser substituída para a porção variável de uma cadeia pesada e/ou leve de anticorpo.

[0133] Alternativamente, o oligômero é uma proteína de fusão que compreende múltiplos anticorpos, com ou sem ligantes de peptídeo (peptídeos espaçadores). Dentre os ligantes de peptídeos adequados estão aqueles descritos nas Patentes nº U.S. 4751180 e 4935233.

[0134] Outro método para preparar anticorpos oligoméricos envolve o uso de um zíper de leucina. Os domínios de zíper de leucina são peptídeos que promovem a oligomerização das proteínas nas quais são encontrados. Os zíperes de leucina foram originalmente identificados em diversas proteínas de ligação a DNA (Landschulz et al., 1988, Science 240:1.759) e têm sido encontrados em uma variedade de proteínas diferentes. Entre os zíperes de leucina conhecidos estão os peptídeos de ocorrência natural e derivados dos mesmos que se dimerizam ou trimerizam. Os exemplos de domínios de zíper de leucina adequados para produzir proteínas oligoméricas solúveis são descritos no pedido PCT nº WO 94/10308, e o zíper de leucina derivado de proteína de tensoativo de pulmão D (SPD) é descrito em Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191, ambos incorporados ao presente documento a título de referência. O uso de um zíper de leucina modificado que permite a trimerização estável de uma proteína heteróloga fundida ao mesmo é descrito em Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267 a 278. Em um método, as proteínas de fusão recombinantes que compreendem um fragmento de anticorpo anti- GIPR ou derivado fundido a um peptídeo de zíper de leucina são expressas em células hospedeiras adequadas, e os fragmentos de anticorpo anti-GIPR oligoméricos adequados ou derivados que se formam são recuperados do sobrenadante da cultura.

[0135] Em outra modalidade, os derivados de anticorpo podem compreender pelo menos uma das CDRs reveladas no presente documento. Por exemplo, uma ou mais CDRs podem ser incorporadas em regiões de framework de anticorpo conhecidas (IgG1, IgG2, etc.), ou conjugadas a um veículo adequado para intensificar a meia-vida do mesmo. Os veículos adequados incluem, mas sem limitação, Fc, albumina, transferrina e semelhantes. Estes e outros veículos adequados são conhecidos na técnica. Tais peptídeos de CDR conjugados podem estar em forma monomérica, dimérica, tetramérica ou outra forma. Em uma modalidade, um ou mais polímeros solúveis em água são ligados em uma ou mais posições específicas, por exemplo, no terminal amino, de um agente de ligação. Em um exemplo, um anticorpo derivado compreende uma ou mais ligações de polímeros solúveis em água, incluindo, mas sem limitação, polietileno glicol, polioxietileno glicol ou polipropileno glicol. Consultar, por exemplo, as Patentes nº U.S. 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 e

4179337. Em certas modalidades, um derivado compreende um ou mais dentre monometoxi-polietileno glicol, dextrano, celulose ou outros polímeros à base de carboidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico, assim como misturas de tais polímeros. Em certas modalidades, um ou mais polímeros solúveis em água são aleatoriamente fixados a uma ou mais cadeias laterais. Em certas modalidades, PEG pode atuar para melhorar a capacidade terapêutica para um agente de ligação, como um anticorpo. Tais métodos são discutidos, por exemplo, na Patente nº U.S. 6133426, que é incorporada ao presente documento a título de referência, para qualquer propósito.

[0136] Será observado que um anticorpo fornecido no presente documento pode ter pelo menos uma substituição de aminoácido, visto que o anticorpo retém especificidade de ligação. Portanto, as modificações às estruturas de anticorpo são abrangidas pelo escopo da invenção. As mesmas podem incluir substituições de aminoácidos, as quais podem ser conservativas ou não conservativas, que não destroem a capacidade de ligação a GIPR humano de um anticorpo. As substituições de aminoácidos conservativas podem abranger resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, os quais são tipicamente incorporados por síntese química de peptídeo em vez de síntese em sistemas biológicos. Isso inclui peptidomiméticos e outras formas revertidas ou invertidas de porções químicas de aminoácidos. Uma substituição de aminoácido conservativa também pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo com um resíduo normativo de modo que haja pouco ou nenhum efeito na polaridade ou carga do resíduo de aminoácido nessa posição. As substituições não conservativas podem envolver a troca de um membro de uma classe de aminoácidos ou miméticos de aminoácido para um membro de outra classe com propriedades físicas diferentes (por exemplo, tamanho, polaridade, hidrofobicidade, carga).

[0137] Além disso, um indivíduo versado na técnica pode gerar variantes a serem testadas, as quais contêm uma substituição de aminoácido única em cada resíduo de aminoácido desejável. As variantes podem, então, ser triadas com o uso de ensaios de atividade conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais variantes podem ser usadas para reunir informações sobre variantes adequadas. Por exemplo, se um indivíduo constatou que uma mudança a um resíduo de aminoácido particular resultou em atividade destruída, indesejavelmente reduzida ou não adequada, as variantes com tal mudança podem ser evitadas. Em outras palavras, com base nas informações reunidas de tais experimentos de rotina, um indivíduo versado na técnica pode determinar prontamente os aminoácidos nos quais substituições adicionais devem ser evitadas sozinhas ou em combinação com outras mutações.

[0138] Um indivíduo versado na técnica poderá determinar variantes adequadas do polipeptídeo conforme apresentado no presente documento com o uso de técnicas bem conhecidas. Em certas modalidades, um indivíduo versado na técnica pode identificar áreas adequadas da molécula que podem ser mudadas sem destruir a atividade alvejando-se regiões não importantes para a atividade. Em certas modalidades, um indivíduo pode identificar resíduos e porções das moléculas que são conservadas entre polipeptídeos similares. Em certas modalidades, áreas iguais que podem ser importantes para atividade biológica ou para estrutura podem ser submetidas a substituições de aminoácidos conservativas sem destruir a atividade biológica ou sem afetar de modo adverso a estrutura de polipeptídeo. Adicionalmente, um indivíduo versado na técnica pode revisar os estudos de função de estrutura que identificam resíduos em polipeptídeos similares que são importantes para atividade ou estrutura. Em vista de tal comparação, um indivíduo pode prever a importância de resíduos de aminoácidos em uma proteína que corresponde a resíduos de aminoácidos que são importantes para a atividade ou estrutura em proteínas similares. Um indivíduo versado na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente similares para tais resíduos de aminoácidos importantes previstos.

[0139] Um indivíduo versado na técnica também pode analisar uma estrutura tridimensional e sequência de aminoácidos em relação a essa em polipeptídeos similares. Em vista de tais informações, um indivíduo versado na técnica pode prever o alinhamento de resíduos de aminoácidos de um anticorpo em relação à sua estrutura tridimensional. Em certas modalidades, um indivíduo versado na técnica pode escolher não realizar mudanças radicais nos resíduos de aminoácidos previstos como na superfície da proteína, visto que tais resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Várias publicações científicas foram destinadas à previsão de estrutura secundária. Consultar Moult, 1996, Curr. Op. Biotech. 7:422 a 427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13:222 a 245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211 a 222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45 a 148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251 a 276 e Chou et al., Biophys. J. 26:367 a 384. Ademais, os programas de computador estão atualmente disponíveis para auxiliar na provisão de estrutura secundária.

Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas que têm uma identidade de sequência maior do que 30%, ou similaridade maior do que 40% têm frequentemente topologias estruturais similares. O crescimento recente do banco de dados estrutural de proteína (PDB) forneceu previsibilidade intensificada de estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobras na estrutura de um polipeptídeo ou proteína. Consultar Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244 a 247. Foi sugerido (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369 a 376) que há um número limitado de dobras em um dado polipeptídeo ou proteína e que, uma vez que um número crítico de estruturas foi resolvido, a previsão estrutural se tornará drasticamente mais precisa.

[0140] Os métodos adicionais para prever estrutura secundária incluem “threading” (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4:15 a 19), “análise de perfil” (Bowie et al., 1991, Science 253:164 a 170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146 a 159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:4.355 a 4.358), e “ligação evolucionária” (consultar Holm, supra (1999), e Brenner, supra (1997)). Em certas modalidades, as variantes de anticorpos incluem variantes de glicosilação, em que o número e/ou tipo de sítios de glicosilação foram alterados em comparação com as sequências de aminoácidos de um polipeptídeo parental. Em certas modalidades, variantes compreendem um número maior ou menor de sítios de glicosilação N-ligados em relação à proteína nativa. Alternativamente, a eliminação de tal sequência por substituições remove uma cadeia de carboidrato N-ligada existente. Também é fornecida uma redisposição cadeias de carboidratos N-ligados, em que um ou mais sítios de glicosilação

N-ligados (tipicamente aqueles que são de ocorrência natural) são eliminados e um ou mais novos sítios N-ligados são criados. As variantes de anticorpo preferenciais adicionais incluem variantes de cisteína, em que um ou mais resíduos de cisteína são deletados de, ou substituídos por, outro aminoácido (por exemplo, serina) em comparação com a sequência parental de aminoácidos. As variantes de cisteína podem ser úteis quando os anticorpos devem ser redobrados em uma conformação biologicamente ativa, como após o isolamento de corpos de inclusão insolúveis. As variantes de cisteína têm geralmente menos resíduos de cisteína do que a proteína nativa, e têm tipicamente um número par para minimizar as interações resultantes de cisteínas não pareadas.

[0141] As substituições de aminoácidos desejáveis (conservativas ou não conservativas) podem ser determinadas por aqueles versados na técnica no momento em que tais substituições são desejáveis. Em certas modalidades, as substituições de aminoácidos podem ser usadas para identificar resíduos importantes de anticorpos para GIPR humano, ou para aumentar ou diminuir a afinidade dos anticorpos a GIPR humano descrita no presente documento.

[0142] De acordo com certas modalidades, as substituições de aminoácidos preferenciais são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexos de proteína, (4) alteram afinidades de ligação, e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais em tais polipeptídeos. De acordo com certas modalidades, substituições de aminoácidos únicas ou múltiplas

(em certas modalidades, substituições de aminoácidos conservativas) podem ser feitas na sequência de ocorrência natural (em certas modalidades, na porção do polipeptídeo fora do domínio (ou domínios) que forma contatos intermoleculares). Em certas modalidades, uma substituição de aminoácido conservativa tipicamente não pode mudar substancialmente as características estruturais da sequência parental (por exemplo, um aminoácido de substituição não deve romper uma hélice que ocorre na sequência parental, ou romper outros tipos de estruturas secundárias que caracterizam a sequência parental). Os exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reconhecidos pela técnica são descritos em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman e Company, Nova Iorque (1984)); Introduction to Protein Structure (Branden e Tooze, Eds., Garland Publishing, Nova Iorque, N.Y. (1991)); e Thornton et al., 1991, Nature 354:105, em que cada um é incorporado ao presente documento a título de referência.

[0143] Em certas modalidades, os anticorpos da invenção podem ser quimicamente ligados a polímeros, lipídios ou outras porções químicas.

[0144] Os agentes de ligação a antígeno podem compreender pelo menos uma das CDRs descritas no presente documento incorporadas a uma estrutura de framework biocompatível. Em uma modalidade, a estrutura de framework biocompatível compreende um polipeptídeo ou uma porção do mesmo que é suficiente para formar um suporte estrutural estável de modo conformacional, ou framework, ou arcabouço, que pode apresentar uma ou mais sequências de aminoácidos que se ligam a um antígeno (por exemplo,

CDRs, uma região variável, etc.) em uma região de superfície localizada. Tais estruturas podem ser um polipeptídeo de ocorrência natural ou “dobra” de polipeptídeo (um motivo estrutural), ou podem ter uma ou mais modificações, como adições, deleções ou substituições de aminoácidos, em relação a um polipeptídeo de ocorrência natural ou dobra. Esses arcabouços podem ser derivados de um polipeptídeo de qualquer espécie (ou de mais do que uma espécie), como um ser humano, outro mamífero, outro vertebrado, invertebrado, planta, bactéria ou vírus.

[0145] Tipicamente, as estruturas de framework biocompatíveis têm base nos arcabouços de proteína ou esqueletos diferentes de domínios de imunoglobulina. Por exemplo, aqueles com base em fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostatina, citocromo b, dedo de zinco de CP1, PST1, hélice superenrolada, LACI-D1, domínio Z e domínios tendamistat podem ser usados (consultar, por exemplo, Nygren e Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology 7:463 a 469).

[0146] Adicionalmente, um indivíduo versado na técnica reconhecerá que agentes de ligação adequados incluem porções desses anticorpos, como um ou mais dentre cadeia pesada CDR1, CDR2, CDR3, cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3, conforme especificamente revelado no presente documento. Pelo menos uma das regiões de cadeia pesada CDR1, CDR2, CDR3, cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 pode ter pelo menos uma substituição de aminoácido, visto que o anticorpo retém a especificidade de ligação da CDR não substituída. A porção não CDR do anticorpo pode ser uma molécula não proteína, em que o agente de ligação bloqueia de modo cruzado a ligação de um anticorpo revelado no presente documento a GIPR humano e/ou inibe a atividade de sinalização de

GIP através do receptor. A porção não CDR do anticorpo pode ser uma molécula não proteína em que o anticorpo exibe um padrão de ligação similar a peptídeos de GIPR humano em um ensaio de ligação de competição, como aquele exibido por pelo menos um dentre os anticorpos L2H2/L6H5, e/ou neutraliza a atividade de GIP. A porção não CDR do anticorpo pode ser composta de aminoácidos, em que o anticorpo é uma proteína de ligação recombinante ou um peptídeo sintético, e a proteína de ligação recombinante bloqueia de modo cruzado a ligação de um anticorpo revelado no presente documento a GIPR humano e/ou neutraliza a atividade do GIP in vitro ou in vivo. A porção não CDR do anticorpo pode ser composta de aminoácidos, em que o anticorpo é um anticorpo recombinante, e o anticorpo recombinante exibe um padrão de ligação similar aos peptídeos de GIPR humano em um ensaio de ligação competitivo, conforme exibido por pelo menos um dos anticorpos L2H2/L6H5, e/ou neutraliza a atividade do GIP.

Proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 ou GLP-1 reverso

[0147] Em uma modalidade, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1, que compreende um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito fragmentos de GLP-1 ou fragmentos de GLP-1 reverso, em que a proteína de fusão conecta o terminal carbóxi de fragmento de GLP-1 ao terminal amino da cadeia leve ou pesada de anticorpo de GIPR através de uma sequência de ligantes de peptídeo (Ligante), ou conecta o terminal amino de fragmento de GLP-1 reverso ao terminal carbóxi da cadeia leve ou pesada de anticorpo de GIPR.

[0148] Em outra modalidade, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1, que compreende um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, e um, dois, três, quatro, cinco, seis , sete ou oito fragmentos de GLP-1; a proteína de fusão conecta a extremidade carboxila de um fragmento de GLP-1 com a extremidade amino de uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo de GIPR através de uma sequência de ligantes de peptídeo (Ligante), ou conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 reverso ao terminal carbóxi de uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo de GIPR.

[0149] Em outra modalidade, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1, que compreende um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito fragmentos de GLP-1 reverso; a proteína de fusão conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 reverso ao terminal carbóxi de um anticorpo de GIPR de cadeia leve ou cadeia pesada.

[0150] Em outra modalidade, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1, que compreende um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, e um, dois, três ou quatro fragmentos de GLP-1; a proteína de fusão conecta a extremidade carboxila de um fragmento de GLP-1 com a extremidade amino de uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo de GIPR através de uma sequência de ligantes de peptídeo (Ligante).

[0151] Em outra modalidade, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1, que compreende um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, e um, dois, três ou quatro fragmentos de GLP-1 reverso; a proteína de fusão conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 reverso ao terminal carbóxi de um anticorpo de GIPR de cadeia leve ou cadeia pesada.

[0152] Em outra modalidade, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1, que compreende um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, e dois fragmentos de GLP-1; a proteína de fusão conecta a extremidade carboxila de um fragmento de GLP-1 com a extremidade amino de uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo de GIPR através de uma sequência de ligantes de peptídeo (Ligante).

[0153] Em outra modalidade, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1, que compreende um anticorpo que se liga especificamente a GIPR, e dois fragmentos de GLP-1 reversos; a proteína de fusão conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 reverso ao terminal carbóxi de uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo de GIPR.

[0154] Em outra modalidade, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de GLP-1 que compreende um anticorpo de GIPR e dois fragmentos de GLP-1; a proteína de fusão conecta a extremidade carboxila de um fragmento de GLP-1 com a extremidade amino de uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo de GIPR através de uma sequência de ligantes de peptídeo (Ligante): N'- GLP-1-Ligante-R-C'; ou conecta o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 ao terminal amino de uma cadeia pesada de anticorpo de GIPR: N'-GLP-1-Ligante-R-C'; em que: N' representa o terminal amino da cadeia de polipeptídeos de proteína de fusão, C' representa o terminal carbóxi da cadeia de polipeptídeos de proteína de fusão, GLP-1 representa o fragmento de GLP-1, R representa a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo de GIPR, e o Ligante representa uma sequência de ligantes de peptídeo.

[0155] Em outra modalidade, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de GLP-1 que compreende o anticorpo de GIPR e dois fragmentos de GLP-1 reversos; a proteína de fusão conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 reverso ao terminal carbóxi de uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo de GIPR: N'-R-Ligante-GLP-1 reverso-C'; ou conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 reverso através de uma sequência de ligantes de peptídeo (Ligante) ao terminal carbóxi de uma cadeia pesada de anticorpo de GIPR: N'-R-Ligante-GLP-1 reverso- C'; em que: N' representa o terminal amino da cadeia de polipeptídeos de proteína de fusão, C'representa o terminal carbóxi da cadeia de polipeptídeos de proteína de fusão, e o GLP-1 reverso representa um fragmento de GLP-1 reverso, R representa a sequência de aminoácidos da cadeia leve ou cadeia pesada de um anticorpo de GIPR, e Ligante representa uma sequência de ligantes de peptídeo.

[0156] Em uma modalidade adicional, é fornecida no presente documento uma proteína de fusão de GLP-1 que compreende um anticorpo de GIPR e dois fragmentos de GLP-1; a proteína de fusão conecta o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 através de uma sequência de ligantes de peptídeo (Ligante) ao terminal amino de um anticorpo de GIPR de cadeia leve: N'-GLP-1-Ligante-R-C'; em que: N' representa o terminal amino da cadeia de polipeptídeos de proteína de fusão, C'representa o terminal carbóxi da cadeia de polipeptídeos de proteína de fusão, GLP-1 representa um fragmento de GLP-1, R representa a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve de anticorpo de GIPR, e Ligante representa uma sequência de ligantes de peptídeo.

[0157] Em uma modalidade, na proteína de fusão de GLP-1 fornecida no presente documento, o fragmento de GLP-1 é independentemente selecionado dentre uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, e SEQ ID NO: 109. Em uma modalidade, na proteína de fusão de GLP-1 fornecida no presente documento, o fragmento de GLP-1 reverso é independentemente selecionado dentre uma das seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 , SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, e SEQ ID NO: 123.

[0158] Em uma modalidade, na proteína de fusão de GLP-1 fornecida no presente documento, a sequência de ligantes de peptídeo (Ligante) compreende independentemente de 1 a 200 resíduos de aminoácidos, de 2 a 100 resíduos de aminoácidos, de 5 a 50 resíduos de aminoácidos, de 6 a 25 resíduos de aminoácidos, ou de 10 a 20 resíduos de aminoácidos.

[0159] Em outra modalidade, na proteína de fusão de GLP-1 fornecida no presente documento, a sequência de ligantes de peptídeo (Ligante) é independentemente selecionada dentre as seguintes sequências de aminoácidos: SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 112.

Ácidos Nucleicos

[0160] Em um aspecto, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam os anticorpos fornecidos no presente documento. Os ácidos nucleicos compreendem, por exemplo, polinucleotídeos que codificam todo ou parte de um anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1, por exemplo, uma ou ambas as cadeias de um anticorpo da invenção, ou um fragmento, derivado, muteína ou variante dos mesmos;

polinucleotídeos suficientes para uso como sondas de hibridização; iniciadores de PCR ou iniciadores de sequenciamento para identificar, analisar, realizar mutação ou amplificar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo; ácidos nucleicos antissenso para inibir a expressão de um polinucleotídeo, e sequências complementares do supracitado. Os ácidos nucleicos podem ter qualquer comprimento. Os mesmos podem ter, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000 ou mais nucleotídeos em comprimento, e/ou podem compreender uma ou mais sequências adicionais, por exemplo, sequências reguladoras, e/ou ser parte de um ácido nucleico maior, por exemplo, um vetor. Os ácidos nucleicos podem ter fita simples ou fita dupla e podem compreender nucleotídeos de RNA e/ou DNA, e variantes artificiais dos mesmos (por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeos).

[0161] Os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de anticorpo (por exemplo, de cadeia pesada ou leve, apenas de domínio variável ou de comprimento completo) podem ser isolados de células B de camundongos que foram imunizadas com antígeno de GIPR. O ácido nucleico do anticorpo ou proteína de fusão de GLP- 1 pode ser isolado por procedimentos convencionais, como reação em cadeia da polimerase (PCR).

[0162] As sequências de ácido nucleico que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve são mostradas acima. O indivíduo versado observará que, devido à degeneração do código genético, cada uma dentre as sequências de polipeptídeos reveladas no presente documento é codificada por um grande número de outras sequências de ácido nucleico. A presente invenção fornece cada sequência de nucleotídeos degenerada que codifica cada anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1 fornecida no presente documento.

[0163] A invenção fornece adicionalmente ácidos nucleicos que hibridizam com outros ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos que compreendem uma sequência de nucleotídeos de qualquer um dentre L2H2/L6H5) sob condições de hibridização particulares. Os métodos para hibridizar ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989),

6.3.1 a 6.3.6. Conforme definido no presente documento, por exemplo, uma condição de hibridização moderadamente estringente usa uma solução de pré-lavagem que contém 5× cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), SDS 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampão de hibridização de cerca de 50% de formamida, 6×SSC, e uma temperatura de hibridização de 55 °C (ou outras soluções de hibridização similares, como uma que contém cerca de 50% de formamida, com uma temperatura de hibridização de 42 °C), e condições de lavagem de 60 °C, em 0,5×SSC, SDS 0,1%. Uma condição de hibridização estringente hibridiza em 6×SSC a 45 °C, após uma ou mais lavagens em 0,1×SSC, SDS 0,2% a 68 °C. Adicionalmente, um indivíduo versado na técnica pode manipular as condições de hibridização e/ou lavagem para aumentar ou diminuir a estringência de hibridização de modo que os ácidos nucleicos que compreendem sequências de nucleotídeos que são pelo menos 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ou 99% idênticas uma à outra permaneçam tipicamente hibridizados entre si. Os parâmetros básicos que afetam a escolha de condições de hibridização e diretrizes para planejar condições adequadas são estabelecidos por, por exemplo,

Sambrook, Fritsch, e Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 e 11; e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., Eds., John Wiley & Sons, Inc., seções 2.10 e 6.3 a 6.4), e podem ser prontamente determinados por aqueles de habilidade comum na técnica com base em, por exemplo, o comprimento e/ou a composição de base do DNA. As mudanças podem ser introduzidas por mutação em um ácido nucleico, assim levando a mudanças na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo) que este codifica. As mutações podem ser introduzidas com o uso de qualquer técnica conhecida na arte. Em uma modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidos particulares são mudados com o uso de, por exemplo, um protocolo de mutagênese sítio-dirigida. Em outra modalidade, um ou mais resíduos aleatoriamente selecionados são mudados com o uso de, por exemplo, um protocolo de mutagênese aleatória. Independentemente de como é produzido, um polipeptídeo mutante pode ser expresso e triado por uma propriedade desejável.

[0164] As mutações podem ser introduzidas em um ácido nucleico sem alterar significativamente a atividade biológica de um polipeptídeo que este codifica. Por exemplo, um indivíduo por fazer substituições de nucleotídeos que levam a substituições de aminoácidos em resíduos de aminoácidos não essenciais. Em uma modalidade, as sequências de nucleotídeos fornecidas no presente documento para L1 a L11 e H1 a H9, ou proteína de fusão de GLP- 1, ou fragmentos, variantes, ou derivados dos mesmos, sofrem mutação de modo que codifiquem sequências de aminoácidos fornecidas no presente documento para L1 a L11 e H1 a H9, que compreendem uma ou mais deleções ou substituições de resíduos de aminoácidos para resultar em sequências que portam dois ou mais resíduos de aminoácidos diferentes. Em outra modalidade, a mutagênese insere um aminoácido adjacente a um ou mais resíduos de aminoácidos mostrados no presente documento para L1 a L11 e H1 a H9 ou proteína de fusão de GLP-1 para resultar em sequências com dois ou mais resíduos de aminoácidos diferentes. Alternativamente, uma ou mais mutações podem ser introduzidas em um ácido nucleico que muda seletivamente a atividade biológica (por exemplo, ligação a GIPR) de um polipeptídeo que este codifica. Por exemplo, a mutação pode mudar quantitativamente ou qualitativamente a atividade biológica. Os exemplos de mudanças quantitativas incluem aumentar, reduzir ou eliminar a atividade. Os exemplos de mudanças qualitativas incluem mudar a especificidade de antígeno do anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1.

[0165] Em outro aspecto, a presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico que são adequadas para uso como iniciadores ou sondas de hibridização para a detecção de sequências de ácidos nucleicos da invenção. Uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender apenas uma porção de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de comprimento completo da invenção, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento que codifica uma porção ativa (por exemplo, uma porção de ligação a GIPR) de um polipeptídeo da invenção.

[0166] As sondas com base na sequência de um ácido nucleico da invenção podem ser usadas para detectar o ácido nucleico ou ácidos nucleicos similares, por exemplo, transcrições que codificam um polipeptídeo da invenção. A sonda pode compreender um grupo de marcador, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima. Tais sondas podem ser usadas para identificar uma célula que expressa o polipeptídeo.

[0167] Em outro aspecto, os vetores fornecidos no presente documento compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção ou uma porção do mesmo. Os exemplos de vetores incluem, mas sem limitações, plasmídeos, vetores virais, vetores de mamíferos não epissomais e vetores de expressão, por exemplo, vetores de expressão recombinantes.

[0168] Os vetores de expressão recombinantes fornecidos no presente documento podem compreender um ácido nucleico da invenção de forma adequada para a expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira. Os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para a expressão, que são operacionalmente ligadas à sequência de ácido nucleico a ser expressa. As sequências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras (por exemplo, intensificador de gene inicial SV40, promotor do vírus de sarcoma de Rous e promotor de citomegalovírus), aqueles que direcionam a expressão da sequência de nucleotídeos apenas em certas células hospedeiras (por exemplo, sequências reguladoras específicas de tecido, consultar Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al., 1987, Science 236:1237, cujas revelações de cada um são incorporadas a título de referência ao presente documento, em sua totalidade), e aqueles que direcionam expressão induzível direta de uma sequência de nucleotídeos em resposta a tratamento ou afecção particular (por exemplo, o promotor de metalotionina em células de mamíferos e o promotor responsivo tet-responsivo e/ou de estreptomicina tanto em sistemas procarióticos quanto eucarióticos (consultar Id.). Será observado por aqueles versados na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores, como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejável, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para assim produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas de fusão ou peptídeos, codificados por ácidos nucleicos, conforme descrito no presente documento.

[0169] Em outro aspecto, a presente invenção fornece células hospedeiras nas quais um vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou célula eucariótica. As células hospedeiras procarióticas incluem organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, E. coli ou bacilli. As células eucarióticas superiores incluem células de insetos, células de levedura e linhagens celulares estabelecidas de origem de mamífero. Os exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamíferos adequados incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) ou seus derivados, como Veggie CHO e linhagens celulares relacionadas que crescem em meios livres de soro (consultar Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) ou cepa de CHO DXB-11, que é deficiente em DHFR (consultar Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4.216 a 4.220). As linhagens celulares de CHO adicionais incluem CHO-K1 (nº ATCC CCL-61), EM9 (nº ATCC CRL-1861), e W20 (nº ATCC CRL-1862). As células hospedeiras incluem a linhagem COS-7 de células renais de macaco (nº ATCC CRL-1651) (consultar Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL-163), células AM- 1/D (descritas na Patente nº U.S. 6210924), células HeLa, linhagens celulares BHK (ATCC CRL-10), a linhagem celular CV1/EBNA derivada da linhagem celular renal de macaco verde africano CV1 (ATCC CCL-70) (consultar McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), células renais embrionárias humanas, como 293, 293 EBNA ou MSR 293, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, outras linhagens celulares primatas transformadas, células diploides normais, cepas celulares derivadas de cultura in vitro de tecido primário, explantes primários, células HL-60, U937, HaK ou Jurkat. Os vetores de clonagem e expressão apropriados para uso com hospedeiros celulares bacterianos, fúngicos, de levedura e de mamíferos são descritos por Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985).

[0170] O DNA de vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas por meio de transformação convencional ou técnicas de transfecção. Para transfecção estável de células de mamíferos, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e técnica de transfecção usados, apenas uma pequena fração de células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. A fim de identificar e selecionar esses integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, para resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de interesse. Os marcadores selecionáveis preferenciais incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, como G418, higromicina e metotrexato. As células transfectadas de modo estável com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas por seleção de fármaco (por exemplo, células que incorporaram o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras células morrem), entre outros métodos.

[0171] As células transformadas podem ser cultivadas sob condições que promovem a expressão de um polipeptídeo, e o polipeptídeo recuperado por procedimentos de purificação de proteína convencionais. Um tal procedimento de purificação é descrito nos Exemplos abaixo. Os polipeptídeos contemplados para uso no presente documento incluem anticorpo de GIPR de mamífero recombinante substancialmente homogêneo ou polipeptídeos de proteína de fusão de GLP-1 substancialmente livres de materiais endógenos contaminantes.

Atividade de Anticorpo de GIPR

[0172] A atividade do anticorpo de GIPR se refere ao efeito do anticorpo fornecido no presente documento na ligação especificamente a GIPR, inibição ou bloqueio de sinalização de GIP, que demonstra, após isso, um efeito biológico terapêutico, por exemplo, no tratamento de obesidade, T2DM e/ou Esteato- hepatite Não Alcoólica (NASH). O termo “que diminui a atividade biológica de sinalização de GIP” ou “que inibe ou bloqueia uma atividade biológica de sinalização de GIP” se refere a um efeito de anticorpo de GIPR ou sua proteína de fusão de GLP-1 do mesmo na inibição ou bloqueio das respostas celulares a jusante a GIP por ligação ao GIPR in vivo. Essas respostas incluem, mas sem limitação, efeito insulinotrópico, promoção de acúmulo de gordura e inibição de lipólise. Em uma modalidade, um anticorpo de camundongo ou anticorpo humanizado fornecido no presente documento se liga especificamente a um GIPR humano. Tais anticorpos compreendem anticorpos antagonistas ou neutralizantes que reduzem ou neutralizam a sinalização de GIP.

[0173] Em uma modalidade, a Kd do anticorpo fornecida no presente documento que se liga a GIPR humano está na faixa de aproximadamente 0,01 nM a 1,000 nM, de 0,1 nM a 500 nM, de 0,5 nM a 200 nM, de 1 nM a 200 nM, ou de 10 nM a 100 nM. Em outra modalidade, a Kd do anticorpo fornecida no presente documento que se liga a GIPR é aproximadamente de 1 nM a 200 nM. Em ainda outra modalidade, a Kd do anticorpo fornecido no presente documento que se liga a GIPR é aproximadamente de 10 nM a 100 nM. Em ainda outra modalidade, a Kd do anticorpo fornecido no presente documento que se liga a GIPR é aproximadamente 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, ou 100 nM.

[0174] Em uma modalidade, a IC50 do anticorpo fornecido no presente documento na sinalização de GIP antagonizante é aproximadamente de 0,01 nM a 500 nM, de 0,1 nM a 200 nM, de 0,5 nM a 200 nM, de 1 nM a 200 nM, ou de 10 nM a 100 nM. Em outra modalidade, a IC50 do anticorpo fornecido no presente documento em sinalização de GIP antagonizante é aproximadamente de 1 nM a 200 nM. Em ainda outra modalidade, a IC50 do anticorpo fornecido no presente documento em sinalização de GIP antagonizante é aproximadamente de 10 nM a 100 nM. Em ainda outra modalidade, a IC50 do anticorpo fornecido no presente documento em sinalização de GIP antagonizante é aproximadamente 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, ou 100 nM.

[0175] Em uma modalidade, o anticorpo fornecido no presente documento se liga especificamente a GIPR com uma ou mais propriedades a seguir: a. fornecer a Kd substancialmente similar como um anticorpo de referência na ligação a GIPR; b. fornecer a IC50 substancialmente similar como um anticorpo de referência no GIPR antagonizante ativado por GIP; e c. ligação de competição cruzada com um anticorpo de referência ao GIPR humano.

[0176] Em uma modalidade, o anticorpo de referência compreende uma combinação da sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia leve SEQ ID NO: 66 e da sequência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 76. Em outra modalidade, o anticorpo de referência é o anticorpo monoclonal L2H2, L6H5 ou L10H8.

[0177] Conforme usado no presente documento, o termo “substancialmente similar” significa comparável a, ou aproximadamente 200%, 180%, 160%, 150%, 140%, 120%, 110%, 100%, 99%, 98%, 97%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, ou 50% da IC50 ou Kd de um anticorpo de referência. Em uma modalidade, o anticorpo de referência é, por exemplo, um anticorpo que compreende uma combinação da SEQ ID NO:76 de cadeia pesada e SEQ ID NO:66 de cadeia leve. Em outra modalidade, o anticorpo de referência inclui L2H2, L6H5 ou L10H8.

Atividade biológica da proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1

[0178] A atividade biológica da proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 compreende a atividade biológica de

GLP-1 e a atividade de anticorpo de GIPR.

A atividade de anticorpos de GIPR é conforme descrito acima.

A "atividade biológica de GLP-1" se refere à atividade biológica da proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 que se liga in vivo e ativa o receptor de GLP-1, causando uma resposta de sinalização celular, e mostrando efeitos terapêuticos, como para obesidade, diabetes do tipo 2 ou esteato-hepatite não alcoólica.

A resposta de sinalização compreende, mas sem limitação, uma secreção de insulina aumentada, supressão de secreção de glucagon, supressão de apetite, perda de peso, indução de saciedade, inibição de apoptose, indução de proliferação de células β pancreáticas e diferenciação de células β pancreáticas.

Combinando as atividades biológicas de GLP-1 e anticorpos de GIPR, a proteína de fusão de GLP-1 fornecida no presente documento pode ser usada para tratar várias doenças e distúrbios associados a GLP-1R e GIPR.

A proteína de fusão exerce seu efeito biológico por meio de sua atuação em GLP-1R e/ou GIPR, de modo que o tratamento de proteína de fusão de GLP-1 fornecido no presente documento possa ser usado para tratar indivíduos cuja doença ou sintoma se beneficiará de "aumentar a sinalização de GLP-1R" ou "diminuir a sinalização de GIPR". Esses indivíduos são denominados indivíduos que "necessitam de terapia de estímulo de GLP-1R" ou "necessitam reduzir o estímulo de GIPR", incluindo diabetes não dependente de insulina, diabetes dependente de insulina, acidente vascular cerebral (GLP-1R, consultar o documento nº WO 00/16797), infarto do miocárdio (GLP-1R, consultar o documento nº WO 98/08531), obesidade (GLP-1R, consultar o documento nº WO 98/19698; GIPR, consultar Furija et al., 2008, PLoS ONE 3:e3163; documento nº U.S. 2017/0275370 A1), mudanças catabólicas após cirurgia (GLP-1R, consultar o documento nº U.S. 6.006.753), dispepsia funcional e síndrome do intestino irritável (GLP-1R, consultar o documento nº WO99/64060), esteatose hepática (GIPR, consultar o documento nº U.S. 2017/0275370A1), doença hepática gordurosa não alcoólica (GLP-1R, consultar Debra et al., 2016, Hepatobiliary Surg Nutr 5: 515 a 518; GIPR, consultar o documento nº U.S. 2017/0275370 A1), esteato-hepatite não alcoólica (GLP- 1, consultar Armstrong et al., 2013, BMJ Open 3:e003995; GIPR consultar o documento nº US 2017/0275370 A1), também incluindo indivíduos com risco de desenvolver diabetes não dependente de insulina (consultar o documento nº WO 00/07617), indivíduos com tolerância à glicose prejudicada ou glicose em jejum prejudicada, indivíduos cujo peso corporal é cerca de 25% superior à altura e peso normais e indivíduos com pancreatectomia parcial.

[0179] Em uma modalidade, as mudanças de atividade biológica do anticorpo de GIPR ou sua proteína de fusão com GLP-1 são detectadas com o uso de um ensaio de cAMP direto, quantificando a função de anticorpo de GIPR ou proteína de fusão de GLP-1 na inibição de GIPR in vitro.

Composições farmacêuticas

[0180] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica fornecida no presente documento compreende um anticorpo de GIPR fornecido no presente documento e um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

[0181] Em outra modalidade, uma composição farmacêutica fornecida no presente documento compreende uma proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 fornecida no presente documento, e um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis.

[0182] O termo "carreador" conforme usado no presente documento compreende um carreador, um excipiente farmacêutico ou um estabilizador que é nocivo quando células ou mamíferos são expostos a este na dosagem e concentração usada.

Método de tratamento

[0183] Em uma modalidade, é fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar a diabetes tipo 2, em que o mesmo compreende administrar a um indivíduo uma dosagem terapeuticamente eficaz do anticorpo de GIPR fornecido no presente documento ou uma composição farmacêutica do mesmo.

[0184] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar a doença hepática gordurosa não alcoólica, em que o mesmo compreende a administração a um indivíduo de uma dosagem terapeuticamente eficaz do anticorpo de GIPR fornecido no presente documento, ou uma composição farmacêutica do mesmo.

[0185] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar a doença hepática gordurosa não alcoólica, em que o mesmo compreende a administração a um indivíduo de uma dosagem terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão do anticorpo de GIPR fornecida no presente documento e GLP-1, ou uma composição farmacêutica do mesmo.

[0186] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar a esteato-hepatite não alcoólica, em que o mesmo compreende a administração a um indivíduo de uma dosagem terapeuticamente eficaz do anticorpo de GIPR fornecido no presente documento, ou uma composição farmacêutica do mesmo.

[0187] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar a esteato-hepatite não alcoólica, em que o mesmo compreende a administração a um indivíduo de uma dosagem terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão do anticorpo de GIPR fornecida no presente documento e GLP-1, ou uma composição farmacêutica do mesmo.

[0188] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar a diabetes tipo 2, em que o mesmo compreende administrar a um indivíduo uma dosagem terapeuticamente eficaz do anticorpo de GIPR fornecido no presente documento ou uma composição farmacêutica do mesmo.

[0189] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar a diabetes tipo 2, em que o mesmo compreende administrar a um indivíduo uma dosagem terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão do anticorpo de GIPR e GLP-1 fornecidos no presente documento ou uma combinação farmacêutica dos mesmos.

[0190] Em outra modalidade, é fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar a obesidade, em que o mesmo compreende administrar a um indivíduo uma dosagem terapeuticamente eficaz do anticorpo de GIPR fornecido no presente documento ou uma composição farmacêutica do mesmo.

[0191] Em uma modalidade adicional, é fornecido no presente documento um método para tratar, prevenir ou melhorar a obesidade, em que o mesmo compreende a administração a um indivíduo de uma dosagem terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão do anticorpo de GIPR fornecida no presente documento e GLP-1, ou uma composição farmacêutica do mesmo.

[0192] Em qualquer um dos usos fornecidos no presente documento, a composição farmacêutica fornecida no presente documento é destinada à injeção intravenosa ou subcutânea.

[0193] Conforme usado no presente documento, o termo “indivíduo” se refere a um mamífero, incluindo seres humanos, e é usado de modo intercambiável com o termo “paciente”.

[0194] O termo “tratamento” compreende alívio ou prevenção de pelo menos um sintoma ou outro aspecto de um distúrbio ou redução de severidade de doença. Um anticorpo de GIPR ou proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 fornecido no presente documento não precisa fornecer uma cura completa, ou erradicar todo sintoma ou manifestação de uma doença, para ser um agente terapêutico eficaz. Conforme reconhecido no campo pertinente, os agentes terapêuticos podem reduzir a severidade de um dado estado de doença, mas não precisam abolir toda manifestação da doença para serem eficazes. De modo similar, um agente profilático não precisa prevenir o início de uma afecção completamente a fim de ser eficaz. Simplesmente reduzir o impacto de uma doença (por exemplo, reduzindo-se o número ou severidade de seus sintomas, ou aumentando-se a eficácia de outro tratamento, ou produzindo- se outro efeito benéfico), ou reduzir a probabilidade de que a doença ocorrerá ou piorará em um indivíduo, é suficiente. Uma modalidade da invenção é direcionada a um método que compreende administrar a um paciente um anticorpo em uma quantidade e por um tempo suficiente para induzir uma melhora sustentada sobre uma linha de base de um indicador que reflete a severidade de um distúrbio particular.

[0195] Uma composição farmacêutica de um anticorpo de GIPR ou proteína de fusão de anticorpo de GIPR e GLP-1 pode ser administrada por qualquer técnica adequada, incluindo, mas sem limitação, por via parentérica, tópica ou por inalação. Se injetada, a composição farmacêutica pode ser administrada, por exemplo, por meio de uma via intra-articular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal ou subcutânea, por injeção de bolo ou infusão contínua. É considerada, por exemplo, a administração localizada na doença ou local de lesão, como a administração transdérmica e a liberação sustentada de um implante. A administração por inalação inclui, por exemplo, inalação nasal ou oral, uso de um nebulizador, inalação de um anticorpo em forma de aerossol, e semelhantes. Outras alternativas incluem preparações orais, incluindo pílulas, xaropes ou losangos.

[0196] De modo vantajoso, o anticorpo de GIPR ou a proteína de fusão de anticorpo de GIPR fornecido no presente documento é administrado em uma composição que compreende um ou mais componentes adicionais, como um carreador, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável. A composição compreende adicionalmente um ou mais agentes fisiologicamente ativos, conforme descrito abaixo. Em muitas modalidades particulares, a composição compreende um, dois, três, quatro, cinco, ou seis agentes fisiologicamente ativos além de um ou mais anticorpos (por exemplo, anticorpos murinos ou anticorpos humanizados) ou proteína de fusão de GLP-1 fornecidos no presente documento.

[0197] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende um anticorpo murino ou anticorpo humanizado ou proteína de fusão de GLP-1 fornecidos no presente documento junto com uma ou mais substâncias selecionadas dentre o grupo que consiste em um tampão adequado para o anticorpo em um pH adequado, um antioxidante, como ácido ascórbico, um polipeptídeo de baixo peso molecular (como aqueles que têm menos do que 10 aminoácidos), uma proteína, um aminoácido, um carboidrato, como dextrina, um agente quelante, como EDTA, glutationa, um estabilizador e um excipiente. De acordo com padrões industriais apropriados, os conservantes também podem ser adicionados. A composição pode ser formulada como um liofilizado com o uso de soluções de excipientes adequadas como diluentes. Os componentes adequados são não tóxicos em recipientes nas dosagens e concentrações empregadas. Os exemplos adicionais de componentes que podem ser empregados em formulações farmacêuticas são apresentados em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edição (1980) e 20ª edição (2000). Os kits de Mack Publishing Company para uso por médicos são fornecidos, incluindo um ou mais anticorpos ou proteína de fusão de GLP-1 da invenção e um marcador ou outras instruções para uso no tratamento de quaisquer condições discutidas no presente documento. Em uma modalidade, o kit inclui uma preparação estéril de um ou mais anticorpos humanos ou proteínas de fusão de GLP-1, os quais podem estar na forma de uma composição conforme revelado acima, e podem estar em um ou mais recipientes.

[0198] As dosagens e a frequência de administração podem variar de acordo com tais fatores, como a via de administração, o anticorpo particular ou proteína de fusão de GLP-1 empregada, a natureza e a severidade da doença a ser tratada, caso a afecção seja aguda ou crônica, e o tamanho e condição geral do indivíduo. As dosagens apropriadas podem ser determinadas por procedimentos conhecidos na técnica pertinente, por exemplo, em testes clínicos que podem envolver estudos de escalação de dose.

[0199] O anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1 fornecidos no presente documento podem ser administrados, por exemplo, uma vez ou mais do que uma vez, por exemplo, em intervalos regulares por um período de tempo. Em modalidades particulares, o anticorpo murino ou anticorpo humanizado ou proteína de fusão de GLP-1 é administrado uma vez por um período de pelo menos um mês ou mais, por exemplo, por um, dois ou três meses ou até mesmo indefinidamente. Para tratar afecções crônicas, o tratamento a longo prazo é, em geral, o mais eficaz. Entretanto, para tratar afecções agudas, a administração por períodos mais curtos, por exemplo, de uma a seis semanas, pode ser suficiente. Em geral, o anticorpo humanizado é administrado até o paciente manifestar um grau relevante de modo médico de melhora sobre a linha de base para o indicador ou indicadores escolhidos.

[0200] Um exemplo do regime de tratamento fornecido no presente documento inclui injeção subcutânea do anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1 em uma dose apropriada uma vez por semana ou mais para tratar sintomas causados por diabetes tipo 2, obesidade ou esteato-hepatite não alcoólica. O anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1 pode ser administrado semanalmente ou mensalmente até o resultado desejável ser alcançado, por exemplo, os sintomas do paciente diminuírem. O tratamento pode ser renovado conforme necessário, ou, alternativamente, uma dose de manutenção pode ser dada.

[0201] A concentração de glicose sanguínea do paciente e o peso corporal podem ser monitorados antes, durante e/ou após o tratamento com o anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1, como o anticorpo humano ou proteína de fusão de GLP-1, para detectar quaisquer mudanças em sua pressão. Para certas condições, as mudanças em glicose sanguínea podem variar com fatores, como progressão de doença. A concentração de glicose sanguínea pode ser determinada com o uso de técnicas conhecidas.

[0202] As modalidades específicas dos métodos e composições no presente documento envolvem o uso de, por exemplo, o anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1 e um ou mais antagonistas de GIP, dois ou mais anticorpos ou proteínas de fusão de GLP-1 fornecidas no presente documento, ou o anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1 fornecida no presente documento e um ou mais outros antagonistas de GIP. Em uma modalidade adicional, o anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1 é administrado sozinho ou em combinação com outros agentes usados para tratar sintomas que são dolorosos para o paciente. Os exemplos desses agentes incluem fármacos de proteína e sem proteína. Quando múltiplos fármacos são administrados em combinação, a dosagem deve ser consequentemente ajustada, conforme se sabe na técnica. A terapia de combinação de “administração combinada" não é limitada à administração simultânea, mas também inclui regimes de tratamento em que o antígeno e a proteína são administrados pelo menos uma vez durante o curso de administração que envolve a administração de pelo menos um outro agente terapêutico ao paciente.

[0203] Por outro lado, é fornecido no presente documento um método para preparar um medicamento para tratar diabetes tipo 2, obesidade e esteato-hepatite não alcoólica e distúrbios relacionados, o qual compreende uma mistura do anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1 fornecido no presente documento e um excipiente farmaceuticamente aceitável para o tratamento das doenças relacionadas das doenças acima. O método de preparação farmacêutica é conforme descrito acima.

[0204] São fornecidas no presente documento as composições, kits e métodos relacionados a anticorpos ou proteínas de fusão de GLP-1 que podem se ligar especificamente ao GIPR humano. As moléculas de ácido nucleico, bem como os derivados e fragmentos do mesmo, também são fornecidos, em que os mesmos compreendem polinucleotídeos que codificam todo ou parte de um polipeptídeo que se liga a GIPR, por exemplo, ácido nucleico que codifica todo ou parte de um anticorpo de GIPR, fragmento de anticorpo, anticorpo derivado ou proteína de fusão de GLP-1. São fornecidos adicionalmente, no presente documento, os vetores e plasmídeos que contêm tais ácidos nucleicos e células e linhagens celulares que contêm tais ácidos nucleicos e/ou vetores e plasmídeos. Os métodos fornecidos no presente documento compreendem, por exemplo, métodos para preparar, identificar ou isolar anticorpos ou proteínas de fusão de GLP-1 que se ligam ao GIPR humano, um método para determinar a possibilidade de o anticorpo ou a proteína de fusão de GLP-1 se ligar a GIPR, e um método para administrar o anticorpo ou proteína de fusão de GLP-1 que se liga ao GIPR em um modelo animal.

[0205] As soluções técnicas descritas no presente documento serão adicionalmente entendidas pelos seguintes exemplos.

[0206] Se não especificado, os materiais iniciais e equipamentos descritos no presente documento são comercialmente disponíveis ou comumente usados na técnica. Os métodos nos exemplos a seguir, a menos que especificado de outro modo, são todos métodos convencionais na técnica.

1: Preparação de antígeno para imunização

[0207] As células CHO-DHFR- foram semeadas em uma placa de 6 poços. Após 24 horas (h), as células foram transfectadas com um plasmídeo pTM15 que contém gene hGIPR (consultar a SEQ ID NO: 114 para a sequência de nucleotídeos e a SEQ ID NO: 113 para a sequência de aminoácidos). A transfecção foi executada com o uso de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) após o protocolo recomendado do fabricante. 48 h após a transfecção, o meio foi substituído por um meio completo que contém higromicina 300 μg/ml, e o meio foi mudado a cada 3 dias (d). Por cerca de duas semanas de cultivo, os clones estáveis foram visíveis. As colônias de células dispersas foram removidas da placa e continuamente subcultivadas até alcançarem 100% de confluência. As linhagens celulares estáveis construídas foram analisadas por FACS, com o uso de um anticorpo monoclonal (Life Technologies) contra etiqueta V5 para verificar clones positivos após a seleção de pressão. Uma grande quantidade de expressão de hGIPR de superfície celular foi detectada nas células CHO-DHFR-hGIPR selecionadas. Finalmente, três linhagens celulares estáveis de expressão de hGIPR foram identificadas por subclonagem e verificação adicional. Essas linhagens celulares foram usadas para produzir imunógenos para a preparação de anticorpos (consultar Exemplo 2). Além disso, em algumas modalidades, a proteína de fusão do domínio extracelular de hGIPR e hIgG Fc também pode ser usada como um imunógeno para preparação de anticorpo. O método de preparação é o seguinte: subclonar o gene de proteína de fusão de domínio extracelular de hGIPR, hIgG Fc e o ligante de peptídeo (Ligante) no plasmídeo pTM5. O sobrenadante celular foi gerado por expressão transiente de massa com o uso de células HEK293 suspensas e, então, a proteína de fusão de domínio extracelular hGIPR foi obtida por purificação de cromatografia por afinidade.

2: Preparação de anticorpos

[0208] Os anticorpos contra hGIPR podem ser produzidos com o uso de um imunógeno incluindo qualquer um dentre os seguintes. Por exemplo, em certas modalidades, as células totais que expressam hGIPR são usadas como imunógenos para produzir anticorpos contra hGIPR. Adicionalmente, em certas modalidades, as proteínas de fusão que compreendem domínio extracelular N- terminal de hGIPR e hFc são usadas como imunógenos para gerar anticorpos contra hGIPR. O imunógeno e o adjuvante de hidróxido de alumínio foram misturados, e camundongos BALB/c (6 a 8 semanas) foram injetados de modo subcutâneo e estimulados uma vez por semana. Após 6 rodadas de imunização no total, as amostras sanguíneas foram coletadas das veias caudais e o soro foi separado por centrifugação, então, o título de soro foi analisado por FACS. Após os títulos mais altos serem alcançados, os camundongos foram sacrificados e suas células de baço foram colhidas sob condições assépticas. As células SP2/0 na fase de crescimento logarítmico foram coletadas, centrifugadas, e os péletes de células foram ressuspensos com meio de cultura livre de soro, então, centrifugados, ressuspensos por uma segunda vez e contados. As células de baço e células SP2/0 foram misturadas na razão de células SP2/0:células de baço≥1:1, após 3 rodadas de lavagem-centrifugação. Após os péletes da última centrifugação terem sido levemente agitados, 1 ml de PEG-1500 pré-aquecido foi adicionado por gotejamento, misturado por pipeta por 1 min e 30 ml do meio livre de soro pré-aquecido foram adicionados lentamente para terminar a fusão de PEG. Os péletes de células foram ressuspensos no meio de cultura de fusão. As células de baço e as células de camada de alimentador em 100 μl foram transferidas para placa em cada poço de placas de 96 poços. As células de hibridoma fundidas e as células de camada de alimentador foram cocultivadas em placas de 96 poços com seleção de HAT (sarcina, ametopterina e tmidina) para remover células não fundidas. Após 10 dias, os sobrenadantes das células de hibridoma nas placas de cultura foram coletados para análise ELISA.

3: Triagem de ELISA de anticorpos

[0209] As células CHO-DHFR-hGIPR que superexpressam células em branco hGIPR e CHO-DHFR- foram separadamente transferidas em uma placa de 96 poços e se permitiu que alcançassem 90% de confluência. O sobrenadante do meio de cultura foi removido e as células fixadas foram lavadas duas vezes com PBS, e metanol 100% foi adicionado para fixar as células a 4 °C. Então, 100 μl de H2O2-PBS 0,6% recém-produzidos foram adicionados, e após a incubação à temperatura ambiente por 20 minutos (min), as células foram lavadas duas vezes com PBS. Após o bloqueio com solução de BSA 1% (dissolvido em PBS), o sobrenadante de hibridoma foi adicionado e incubado por 90 min a 4 °C. Após diversas lavagens, 100 μl do anticorpo secundário Fc-HRP anticamundongo de cabra diluído (Sigma-Aldrich) foram adicionados em cada poço e incubados a 37 °C por 30 min. Após lavar cinco vezes, 100 μl de substrato cromogênico de TMB foram adicionados e incubados a 37 °C por 15 min e, então, 50 μl de H2SO4 2M foram adicionados para terminar a reação antes da leitura a 450 nm. Adicionalmente, em certas modalidades, uma proteína de fusão do domínio extracelular N-terminal de hGIPR e hFc é usada como o antígeno de revestimento. Após o bloqueio com BSA 1% (dissolvido em PBS), o sobrenadante de células de hibridoma foi adicionado e incubado a 4 °C por 90 min. As etapas subsequentes são as mesmas que o método ELISA acima para triar os anticorpos monoclonais anti- hGIPR. O controle positivo é o soro de camundongos imunizados; o controle negativo é o meio de cultura celular. Após a triagem preliminar por ELISA, diversas linhagens celulares de hibridoma positivas que secretam anticorpos hGIPR foram obtidas. Essas linhagens celulares de hibridoma que secretam os anticorpos hGIPR foram selecionadas e subclonadas limitando-se a diluição. Finalmente, o sobrenadante de células de hibridoma positivas foi verificado por análise de FACS (com referência ao Exemplo 10).

4: Clonagem e subclonagem de genes de anticorpo

[0210] As células de hibridoma que secretam anticorpos foram coletadas. O mRNA de hibridoma foi extraído de acordo com o protocolo do fabricante de kit de extração de mRNA QIAGEN. Então, o mRNA extraído foi transcrito de modo reverso em cDNA. Os iniciadores de transcrição reversa foram iniciadores específicos de regiões constantes de cadeias leve e pesada murinas, especificamente, o iniciador de transcrição reversa de cadeia pesada foi (5’-TTTGGRGGGAAGATGAAGAC-3’), os iniciadores de transcrição reversa de cadeia leve foram (5’- TTAACACTCTCCCCTGTTGAA-3’) e (5’-TTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’). As condições de reação de RT-PCR foram listadas conforme o seguinte: 25 °C por 5 min, 50 °C por 60 min, e 70 °C por 15 min. O cDNA transcrito de modo reverso foi diluído com TE 0,1 mM para 500 μl, adicionado ao tubo de centrífuga de ultrafiltração (Amicon Ultra-0.5) e centrifugado em 2,000 g por 10 min. O filtrado foi removido, 500 μl de TE 0,1 mM foram adicionados e centrifugados em 2,000 g por 10 min. O filtrado foi removido e o tubo de preparação foi colocado em inversão para o novo tubo centrífugo, e centrifugado em 2,000 g por 10 min para obter o cDNA purificado. O cDNA purificado (10 μl) foi assumido como um modelo, seguido pela adição de 4 μl de tampão de cauda 5 (Promega), 4 μl de dATP (1 mM) e transferase terminal 10 U (Promega), mistura uniforme e incubação a 37 °C por 5 min e, então, a 65 °C por 5 min. O cDNA de cauda PolyA foi usado como um modelo e PCR foi realizada para amplificar genes de região variável de cadeias leve e pesada de anticorpos. Os iniciadores a montante foram todos oligodT, com iniciadores a jusante de cadeia pesada sendo (5’-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3’) e (5’-TGGACAGGGCTCCATAGTTCC-3’), e iniciador a jusante de cadeia leve sendo (5’- ACTCGTCCTTGGTCAACGTG-3’). As condições de reação de PCR foram: 95 °C por 5 min; 95 °C por 30 segundos (s), 56 °C por 30 s, 72 °C por 1 min, 40 ciclos; e 72 °C por 7 min. Os produtos de PCR foram conectados ao vetor PMD 18-T (Takara Bio) para sequenciamento. Os iniciadores de PCR foram projetados com base nas sequências de DNA dos anticorpos, desse modo, os peptídeos de sinal de cadeia leve e cadeia pesada e domínios variáveis e região constante de IgG1 de camundongo foram ligados no vetor de expressão pTM5.

5: Humanização e otimização do anticorpo

[0211] Primeiramente, as sequências de regiões variáveis cadeia leve e pesada dos anticorpos de camundongo foram usadas como entrada em uma busca com ferramenta de alinhamento de sequência de regiões variáveis de anticorpo online de NCBI (Ig Blast) para encontrar as sequências de genes de linhagem germinativa de um anticorpo humano (sequência de genes de linha germinativa de Ig) homólogo à sequência de regiões variáveis de anticorpos de camundongo para humanização, e a sequência de genes humanos com homologia mais alta que exclui as sequências de CDR foi usada como um modelo para enxertar CDR para obter as sequências de regiões variáveis de anticorpo humanizado. Os genes de regiões variáveis de cadeias leve e pesada de anticorpo humanizado foram sintetizados e combinados com a sequência de regiões constantes de IgG2 ou IgG4 humana para obter sequências de anticorpos humanizados de comprimento completo. Os anticorpos recombinantes foram expressos de acordo com o Exemplo 8, e suas afinidades a GIPR foram analisadas por FACS conforme descrito no Exemplo 10 para selecionar o anticorpo com a melhor afinidade. As sequências de regiões variáveis do anticorpo humanizado foram manipuladas por mutagênese sítio-específica para melhorar adicionalmente sua afinidade por GIPR.

6: Subclonagem de genes de anticorpos de hGIPR humanizados

[0212] As sequências de genes de regiões variáveis de cadeias pesada e leve de anticorpos humanizados otimizados foram sintetizadas por externalização. Durante o processo, dois sítios de restrição, NheI na extremidade 5’ e SalI na extremidade 3’, foram introduzidos na sequência de regiões variáveis de cadeia pesada. A região variável de cadeia pesada completa foi ligada com uma região constante de cadeia pesada em um vetor de expressão de pTM5. De modo similar, introduzindo-se NheI na extremidade 5’ e BsiwI na extremidade 3’, a região variável de cadeia leve foi ligada com uma região constante de cadeia leve no vetor de expressão de pTM5.

7: Construto da proteína de fusão de anticorpo de hGIPR humanizado e GLP-1

[0213] O anticorpo humanizado otimizado foi fundido com GLP- 1 ou suas sequências derivadas, por meio do terminal N ou terminal C da cadeia leve para formar uma proteína de fusão de GLP-1, e as sequências dos dois são conectadas pela sequência de ligantes de peptídeo (Ligante) como uma ponte. A sequência de nucleotídeos do peptídeo de sinal-GLP-1-ligante é sintetizada por Genscript Biotechnology Co., Ltd. Com o uso do gene sintético como o modelo, a sequência da parte “peptídeo de sinal-GLP1- Ligante” foi amplificada com o uso de PCR. Além disso, com o uso da sequência de nucleotídeos do anticorpo humanizado como modelo, a sequência do anticorpo da sequência de proteínas de fusão é amplificada. Então, através da sobreposição de PCR, a parte “peptídeo de sinal-GLP-1-ligante de peptídeo” da sequência de ácidos nucleicos da proteína de fusão é conectada com a parte de anticorpo, introduzindo dois sítios de enzima de restrição Nhe1 e Not1 em ambas as extremidades dos iniciadores, e desse modo, a sequência de proteínas de fusão completa e o vetor de expressão pTM5 são ligados juntos.

8: Expressão Transiente de Anticorpo hGIPR e Proteína de Fusão GLP-1

[0214] As células de suspensão HEK293 ou CHO (5x105/ml) foram inoculadas em um frasco agitador. Após centrifugação a 37 °C por 24 h, a densidade das células alcançou 1x106/ml e as mesmas foram usadas para transfecção. Polietilenimina (PEI) é usada como um reagente de transfecção e a mesma é misturada com DNA. A mistura de PEI/DNA foi adicionada à cultura de células após 15 minutos de incubação. Após receber a mistura de PEI/DNA, as células foram continuamente cultivadas a 37 °C, CO2 5% por 24 h. Então, triptona foi adicionada à cultura celular como um suplemento para expressão. Finalmente, após a expressão de proteína ter sido completada (mais do que 96 h), o sobrenadante celular foi coletado para purificação de anticorpo.

9: Purificação e separação de anticorpo de hGIPR e proteína de fusão de GLP-1

[0215] Células e detritos celulares foram removidos da cultura após a centrifugação (8,000 rpm), e o sobrenadante foi filtrado através de um filtro de 0,22 μm. O sobrenadante clarificado é usado para purificação. O processo de purificação foi completado através de cromatógrafo. O sobrenadante primeiramente flui através da coluna de afinidade de proteína A/G, durante a qual o anticorpo na mesma é delimitado às proteínas A/G e permanece na coluna. Os anticorpos foram, então, eluídos da coluna de cromatografia com o uso de um tampão de eluição com um baixo pH (menos do que ou igual a 3,0). O eluente de baixo pH foi neutralizado imediatamente com Tris-HCl 1M. O anticorpo purificado foi, então, submetido à diálise contra PBS ou outros sistemas tampão.

10: FACS para verificar a atividade de ligação de anticorpos de hGIPR funcionais

[0216] PBS que contém EDTA 10 mM foi usado para remover as células CHO-DHFR-hGIPR e 105 células/tubo foram distribuídas em tubos EP de 1,5 ml, e o sobrenadante foi removido após a centrifugação. A amostra de controle negativo foi ressuspensa com um tampão de carregamento (PBS, FBS 2%). Para o controle positivo, 200 μl de solução de anticorpo de GIPR de concentração específica foram adicionados às células e incubados à temperatura ambiente; após a incubação, as células foram, então, centrifugadas em 1,500 rpm para remover o sobrenadante, lavadas com um tampão de carregamento FACS e centrifugadas novamente. As células foram ressuspensas com a adição (200 μl/poço) de um anticorpo fluorescente anticamundongo de cabra marcado por FITC ou anticorpo fluorescente anti-humano de cabra marcado por PE em diluição 1:50 e incubado à temperatura ambiente por 30 min no escuro. O sobrenadante foi removido após a centrifugação e as células foram lavadas com tampão de carregamento FACS, centrifugadas novamente e ressuspensas com o tampão de carregamento para análise FACS. O anticorpo funcional anti-hGIPR recombinante se liga especificamente às células CHO-DHFR-GIPR que expressam GIPR. Nos resultados experimentais mostrados na Figura 1, o pico cinza e o pico de linha pontilhada foram controles negativos; o pico de linha contínua, correspondente a 1 μM de anticorpo L10H8, mostra um deslocamento para a direita significativo para provar a ligação específica de L10H8 e CHO- DHFR-GIPR.

11: Teste de ensaio cAMP de anticorpo hGIPR ou anticorpo hGIPR/proteína de fusão de GLP-1 para sua atividade antagonista in vitro de GIPR

[0217] As células CHO-DHFR que expressam de modo estável o GIPR humano foram semeadas com 30,000 células por poço nas placas de cultura celular de 96 poços, colocadas em uma incubadora de CO2 5% a 37 °C de um dia para o outro. No dia seguinte, o sobrenadante foi removido e o sobrenadante de hibridoma ou anticorpo diluído em série de 45 µl/poço foi adicionado. As células foram deixadas à temperatura ambiente por 30 min, então, o peptídeo de GIP foi adicionado (Phoenix Pharmaceuticals, 50 pM) a 45 µl/poço. Então, a placa de 96 poços foi colocada em uma incubadora de CO2 5% a 37 °C por 30 minutos, 10 µl/poço de Triton X-100 10% foram adicionados para lisar as células em temperatura ambiente e o lisado foi misturado igualmente com a pipeta. O kit cAMP (CisBio) foi usado para detectar o cAMP produzido no experimento. 10 µl/poço do lisado de célula acima foram transferidos para uma placa de 384 poços branca, 5 µl/poço de cAMP-d2 diluído 1:20 foram adicionados, e finalmente 5 µl/poço de Anti-cAMP-Eu3±criptato diluído 1:20 foram adicionados, e a placa foi incubada à temperatura ambiente por 1 h. A razão de sinal 665 nm/620 nm de fluorescência resolvida em tempo foi lida no leitor de microplaca Envision 2103 e, então, Prism5.0 foi usado para calcular o valor de IC50. A Figura 2 mostra que L7H6 antagoniza GIPR com IC50 = 7,6 nM. A Figura 3 mostra que GLP-1- Ligante-L7H6 antagoniza GIPR com IC50 = 14,9 nM.

12: Teste de ensaio de gene repórter de anticorpo de hGIPR/proteína de fusão de GLP-1 para sua ativação in vitro de GLP-1R

[0218] As células CHO-DHFR- que coexpressam hGLP1R e CRE- Luciferase foram semeadas em uma placa de cultura de células de 96 poços com 20,000 células por poço, e cultivadas a 37 °C de um dia para o outro. No dia seguinte, a cultura sobrenadante foi removida. As células foram lavadas duas vezes com meio livre de soro e o líquido residual também foi removido. Então, foram adicionados 100 μl de meio livre de soro que contém anticorpos diluídos em série ou GLP-1 e estes foram incubados a 37 °C por 4 h. Após o estímulo, 100 μl de substrato de quimioluminescência Bright Glo (Promega) foram adicionados. Finalmente, os lisados de célula foram transferidos para uma placa de 96 poços branca,

e a intensidade luminosa relativa foi registrada no leitor de microplaca SpectraMax L (Molecular Devices). A Figura 4 mostra que GLP-1-Ligante-L7H6 ativa hGLP-1R com EC50 = 0,04 nM.

13: Estudo de eficácia in vivo de anticorpo hGIPR em camundongos obesos C57BL/6 induzidos por dieta de alto teor de gordura

[0219] Os modelos de obesidade de camundongos C57BL/6 induzidos por dieta de alto teor de gordura a 60% (camundongos DIO) foram estabelecidos. Após os camundongos serem adquiridos e alimentados em uma dieta normal por uma semana, selecionar aleatoriamente um certo número de camundongos como o grupo de controle normal para fornecer a dieta comum aos camundongos, e os animais restantes foram alimentados com dieta de alto teor de gordura. Todos os animais foram continuamente alimentados por 8 semanas, e o peso corporal e a ingestão de alimentos foram avaliados uma vez na semana. Subsequentemente, os camundongos alimentados com a dieta de alto teor de gordura foram aleatoriamente divididos no grupo L10H8 (10 mg/kg) e no grupo de modelo de acordo com seu peso corporal. Os fármacos foram injetados por via subcutânea a cada dois dias por 6 semanas. O grupo de controle normal não é administrado, e o grupo de modelo recebe a mesma quantidade de formulação em branco. Os dados de peso corporal, ingestão de alimentos e observação comportamental foram coletados durante o período de experimentos. No último dia do experimento, após 12 h de jejum (acesso livre à água), o sangue orbital do animal foi coletado em soro separado e, então, o mesmo foi submetido à eutanásia, o fígado foi dessecado e pesado e a morfologia hepática foi observada. ALT, AST, GLU, TC e TG em soros e TG no fígado foram testados (consultar resultados na Tabela 3).

Tabela 3: Resultados de Teste Bioquímico de Cada Grupo após Administração de Fármaco Grupo de Analitos Grupo normal Grupo L10H8 modelo 92,08 158,37 ± ALT（IU/L） 37,88 ± 5,08** ± 30,05** 40,50 184,82± AST（IU/L） 136,20 ± 24,21** 157,20± 27,09 35,49 GLU (mmol/L) 8,38± 1,15** 11,67± 2,04 10,91 ± 1,87 TC (mmol/L) 3,29 ± 0,25** 6,30± 0,31 6,62 ± 1,00 TG (mmol/L) 0,99 ± 0,07** 1,41± 0,13* 1,21 ± 0,11 TG hepático 159,08 ± 26,83± 16,96** 88,23 ± 9,61* (mmol/L) 67,87 Índice 3,65± 0,23 3,76 ± 0,44* 4,56 ± 1,28 hepático (g/100g) Nota: Média ± SEM, em comparação com o grupo de modelo，*P<0,05, **P<0,01; Índice hepático = peso de fígado/peso corporal *100.

[0220] Após 6 semanas de administração do L10H8, o ganho de peso do grupo L10H8 foi apenas levemente inferior em relação ao grupo de modelo, mas o peso do fígado foi significativamente inferior em relação ao grupo de modelo, e próximo em relação ao grupo de controle normal. O TG hepático do grupo L10H8 foi significativamente inferior em relação ao grupo de modelo e o TG sérico foi significativamente superior em relação ao grupo de modelo. Esses resultados mostram que L10H8 atrasa significativamente a absorção e o acúmulo de gordura hepática. A Figura 5 mostra a porcentagem da mudança de peso corporal de cada grupo. A Tabela 3 resume os dados analíticos hepáticos em cada grupo após o recebimento de anticorpo L10H8 por 6 semanas.

14: Estudo farmacocinético de anticorpo de GIPR/proteína de fusão de GLP-1 em macacos cynomolgus

[0221] Um total de 6 macacos cynomolgus (3 machos e 3 fêmeas)

recebeu uma injeção subcutânea de proteína de fusão de anticorpo de GLP-1/hGIPR em dose de 2 mg/kg, e 0,6 ml de amostra sanguínea total foram coletados, cada uma na pré-administração (0 min), pós-administração 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 2 d, 4 d, 6 d, 8 d, 10 d, 12 d, 18 d, 28 d por meio da veia de membro traseiro no lado do corpo igual ao sítio de administração e colocado em um tubo de centrífuga em gelo. Após a coagulação natural, as amostras sanguíneas foram, então, centrifugadas para separar os soros e armazenadas em baixa temperatura (-80 °C) até o uso. A parte de GLP-1 e a parte de anticorpo de hGIPR de proteína de fusão de anticorpo de GLP-1/hGIPR nas amostras de soro foram quantificadas separadamente por ELISA, e as meias-vidas de ambas no macaco cynomolgus foram determinadas através de análise de software.

15: Estudo de eficácia in vivo de anticorpo de hGIPR/proteína de fusão de GLP-1 em macacos cynomolgus induzidos por dieta de alto teor de gordura

[0222] Macacos cynomolgus foram induzidos por dieta de alto teor de gordura de 60% para estabelecer modelos de macaco cynomolgus obesos (macaco cynomolgus DIO) e, então, usados para avaliar a eficácia in vivo de GLP-1-Ligante-L7H6 por meio de administração subcutânea. Os macacos induzidos por dieta de alto teor de gordura foram aleatoriamente divididos no grupo GLP-1- Ligante-L7H6 (10 mg/kg) e no grupo de modelo de acordo com seu peso corporal. O fármaco foi injetado de modo subcutâneo a cada dois dias por um total de 8 semanas, e o grupo de modelo recebeu igual volume de formulação em branco. Os dados de peso corporal, ingestão de alimentos e observação comportamental foram coletados durante o período de experimentos. Após o experimento ter sido completado, os animais foram submetidos à eutanásia, o fígado foi dessecado e pesado, e a morfologia hepática foi observada. ALT, AST, GLU, TC e TG em soros e TG no fígado foram testados.

[0223] As modalidades acima são destinadas a revelar completamente e explicar como produzir e usar as modalidades reivindicadas para um indivíduo de habilidade comum na técnica, e as mesmas não são destinadas a limitar o escopo dessa revelação. As modificações óbvias para aqueles versados na técnica estão dentro do escopo das reivindicações no presente documento. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados no relatório descritivo foram incorporados ao presente documento como referências, assim como cada um dos mesmos foi especificamente e independentemente incorporado ao presente documento a título de referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo que se liga especificamente a GIPR humano caracterizado pelo fato de que compreende um, dois, três, quatro, cinco ou seis sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15; b. Sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 16; c. Sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 17; d. sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 26; e. sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29; e f. sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO:

30.

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo:

a. Sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 15; e b. sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 26.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 16; e b. sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO:

29.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ou compreende adicionalmente, uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 17; e b. sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia pesada: SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO:

30.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ou compreende adicionalmente, uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17.

6. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ou compreende adicionalmente, uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30.

7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ou compreende adicionalmente, uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR1 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionadas a partir da lista abaixo: SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 26.

8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende ou compreende adicionalmente, uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR2 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionadas a partir da lista abaixo: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 29.

9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende ou compreende adicionalmente, uma combinação de sequências de aminoácidos de CDR3 de cadeia leve e cadeia pesada independentemente selecionadas a partir da lista abaixo: SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 30.

10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. Sequências de domínio variável de cadeia leve: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 71; e uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica a qualquer sequência acima; e b. Sequências de domínio variável de cadeia pesada: SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80; e uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica a qualquer sequência acima.

11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que as sequências de codificação de polinucleotídeos compreendem uma ou duas sequências de polinucleotídeos, em que cada sequência de polinucleotídeos é independentemente selecionada dentre as sequências de polinucleotídeos listadas abaixo: a. Sequências de codificação de polinucleotídeos de domínio variável de cadeia leve: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 e SEQ ID NO: 91; e uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica a qualquer sequência acima; e b. Sequências de codificação de polinucleotídeos de domínio variável de cadeia pesada: SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 e SEQ ID NO: 100; e uma sequência de polinucleotídeos que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95% idêntica a qualquer sequência acima.

12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ou compreende adicionalmente, uma sequência de aminoácidos independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 71.

13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ou compreende adicionalmente, uma sequência de aminoácidos independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 80.

14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de sequências de aminoácidos independentemente selecionadas dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 80.

15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende ou compreende adicionalmente, uma sequência de aminoácidos independentemente selecionada dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76 e SEQ ID NO: 77.

16. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende uma combinação de sequências de aminoácidos independentemente selecionadas dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 77 e SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 77.

17. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou duas sequências de aminoácidos, em que cada sequência de aminoácidos é independentemente selecionada dentre as sequências de aminoácidos listadas abaixo: a. sequências de aminoácidos constante de cadeia leve: SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 102; e b. sequências de aminoácidos constante de cadeia pesada: SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 e SEQ ID NO: 124.

18. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo de GIPR murino ou um anticorpo de GIPR humanizado.

19. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal de GIPR.

20. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal que compreende uma combinação de sequências de aminoácidos independentemente selecionadas dentre a lista abaixo: SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 65 e SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 66 e SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 67 e SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 69 e SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 79 e SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 80.

21. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre anticorpo murinos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos recombinantes, fragmentos de anticorpo de ligação a antígeno, anticorpos de cadeia única, anticorpos de cadeia dupla, anticorpos de cadeia tripla, anticorpos de tetracadeia, fragmentos Fab, fragmentos F(ab’)x, anticorpos de domínio, anticorpos IgD, anticorpos IgE, anticorpos IgM, anticorpos IgG1, anticorpos IgG2, anticorpos IgG3 ou anticorpos IgG4.

22. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que tem um IC50 de aproximadamente 1 nM a 200 nM ou 1 nM a 100 nM para reduzir a transdução de sinal de GIP humano.

23. Proteína de fusão de GLP-1 caracterizada pelo fato de que suas características estruturais são: a proteína de fusão compreende um anticorpo de GIPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, e um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito fragmentos de GLP-1 ou fragmentos de GLP-1 reverso; a proteína de fusão conecta o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 com o terminal amino de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de anticorpo de GIPR por meio de um ligante de peptídeo, ou conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 reverso com o terminal carbóxi de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada do anticorpo de GIPR.

24. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo de GIPR e um, dois, três ou quatro fragmentos de GLP-1; a proteína de fusão conecta o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 com o terminal amino de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de anticorpo de GIPR por meio de um ligante de peptídeo.

25. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo de GIPR e um, dois, três ou quatro fragmentos de GLP-1 reverso; a proteína de fusão conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 reverso com o terminal carbóxi de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de anticorpo de GIPR por meio de um ligante de peptídeo.

26. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo de GIPR e dois fragmentos de GLP-1; a proteína de fusão conecta o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 com o terminal amino de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de anticorpo de GIPR por meio de um ligante de peptídeo.

27. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo de GIPR e dois fragmentos de GLP-1 reversos; a proteína de fusão conecta o terminal amino de um fragmento de GLP-1 reverso com o terminal carbóxi de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de anticorpo de GIPR por meio de um ligante de peptídeo.

28. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o anticorpo de GIPR, o fragmento de GLP-1 e um ligante de peptídeo são fundidos para formar a proteína de fusão em uma das seguintes formas: por meio de um ligante de peptídeo, o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 é fundido ao terminal amino de uma cadeia leve de anticorpo de GIPR: N'-GLP-1-Ligante-R-C';

por meio de um ligante de peptídeo, o terminal carbóxi de um fragmento de GLP-1 é fundido ao terminal amino de uma cadeia pesada de anticorpo de GIPR: N'-GLP-1-Ligante-R-C'; em que: N' representa um terminal amino da cadeia de polipeptídeos da proteína de fusão, C' representa um terminal carbóxi da cadeia de polipeptídeos da proteína de fusão, GLP-1 representa fragmento de GLP-1, e R representa a sequência de aminoácidos da cadeia leve ou da cadeia pesada de um anticorpo de GIPR, de acordo com as reivindicações 1 a 22, e Ligante representa um ligante de polipeptídeo.

29. Proteína de fusão de GLP-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, caracterizada pelo fato de que o ligante de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos de comprimento completo, parcial ou repetida independentemente selecionada dentre SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO:

112.

30. Proteína de fusão de GLP-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, caracterizada pelo fato de que o fragmento de GLP-1 compreende uma sequência de aminoácidos independentemente selecionada dentre SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 e SEQ ID NO: 109; ou em que o fragmento de GLP-1 reverso compreende uma sequência de aminoácidos independentemente selecionada dentre SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 e SEQ ID NO: 123.

31. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo de GIPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou a proteína de fusão de GLP-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30.

32. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 31.

33. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, de acordo com a reivindicação 32.

34. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo de GIPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou a proteína de fusão de GLP-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30, misturados com transportador farmaceuticamente aceitável.

35. Uso da composição farmacêutica caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo de GIPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou a proteína de fusão de GLP-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar doença hepática gordurosa não alcoólica.

36. Uso da composição farmacêutica caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo de GIPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou a proteína de fusão de GLP-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar diabetes tipo 2.

37. Uso da composição farmacêutica caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo de GIPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou a proteína de fusão de GLP-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar obesidade e doenças relacionadas à obesidade.

38. Uso da composição farmacêutica caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo de GIPR, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, ou a proteína de fusão de GLP-1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, na preparação de um medicamento para prevenir ou tratar simultaneamente duas ou mais doenças dentre doença hepática gordurosa não alcoólica, obesidade ou diabetes tipo 2.

39. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica deve ser administrada por via intravenosa ou por via subcutânea.