DE69132531T2

DE69132531T2 - Verbindungen und ihre Verwendung in einer binären Synthesestrategie

Info

Publication number: DE69132531T2
Application number: DE69132531T
Authority: DE
Inventors: P. Fodor; W. Holmes; W. Solas; Lubert Stryer; L. Winkler
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1990-12-06
Filing date: 1991-11-20
Publication date: 2001-09-13
Anticipated expiration: 2011-11-21
Also published as: IL100193A; EP0562025B1; NZ240744A; AU9153491A; EP0562025A1; ATE199054T1; CA2097708A1; WO1992010092A1; MX9102400A; JP4112582B2; ES2155822T3; ATE244065T1; DE69133293T2; EP1046421A2; EP0562025A4; ZA919650B; GR3035773T3; DE69132531D1; JPH06504997A; DK0562025T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Polymersynthese. Insbesondere betrifft die Erfindung Verbindungen, die Schutzgruppen in einem geordneten Verfahren bereitstellen, und zwar zur Bildung einer Vielzahl von Polymersequenzen durch aufeinanderfolgende Zugabe von Reagenzien, welches den Schritt des aufeinanderfolgenden Schützens und Entschützens von Abschnitten der Vielzahl von Polymersequenzen umfasst. Die Erfindung betrifft auch die lichtgesteuerte Synthese von verschiedenen Polymersequenzen auf Trägern.
Die US-PS 4,296,933 (Du Pont) beschreibt eine photopolymerisierbare Beschichtungszusammensetzung, die eine nicht-gasförmige, ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Verbindung, eine spezifizierte nitroaromatische Verbindung und ein organisches, strahlungsempfindliches, freie Radikale erzeugendes System umfasst und zur Erzeugung eines positiven oder negativen polymeren Bildes auf einem Träger geeignet ist.
In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel Formel 1
bereit, worin n = 0 oder 1 ist, Y eine funktionelle Gruppe ist, R¹ und R² unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidogruppe sind und R³ eine Alkoxy-, Alkyl-, Aryl- oder Alkenylgruppe ist.
Y kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus einem Sauerstoffatom der Carboxylgruppe einer natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäure, einer Aminogruppe einer natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäure oder der C-5'-Sauerstoffgruppe einer natürlichen oder nicht natürlichen Desoxyribonuclein- oder Ribonucleinsäure.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel Formel 2
bereit, worin n = 0 oder 1 ist, Y eine C-5'-Sauerstoffgruppe einer natürlichen oder nichtnatürlichen Desoxyribonuclein- und Ribonucleinsäure ist, R¹ bis R&sup4; unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Methyl- (nur R³), Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino- Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidogruppen sind und R&sup5; eine Alkoxy-, Alkyl-, Aryl- oder Alkenylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass (i) R² und R³ nicht beide Methoxygruppen sind, wenn R' und R&sup4; Wasserstoffatome sind und R&sup5; eine 2-Nitrophenyl- oder 3,4-Dimethoxy-6-nitrophenylgruppe ist und (ii) R¹, R², R³ und R&sup4; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind.
In der Verbindung der allgemeinen Formel 2 sind R¹ und R&sup4; vorzugsweise unabhängig aus einer Methoxygruppe, einem Wasserstoffatom, einer Alkoxy- und Halogengruppe ausgewählt.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel Formel 3
bereit, worin n 0 oder 1 ist, Y eine funktionelle Gruppe ist, R¹ und R² unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidogruppe sind und R³ eine Alkoxy-, Alkyl-, Aryl- oder Alkenylgruppe ist.
In der Verbindung der allgemeinen Formel 1 oder 3 sind R¹ und R² vorzugsweise unabhängig aus einer Methoxygruppe, einem Wasserstoffatom, einer Alkoxy- und Halogengruppe ausgewählt.
Im Fall einer Verbindung der allgemeinen Formel 2 kann R&sup5; eine Methylgruppe sein, wohingegen im Fall einer beliebigen anderen Verbindung R³ eine Methylgruppe sein kann.
In den Verbindungen der allgemeinen Formeln 1, 2 oder 3 kann Y eine funktionelle Gruppe eines Moleküls sein, das aus natürlichen und nicht natürlichen Aminosäuren und Peptiden, Nucleosiden und Oligonucleotiden ausgewählt ist.
Vorteilhafterweise stellen die erfindungsgemäßen Verbindungen verbesserte, mit Licht entfernbare Schutzgruppen bereit.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel 1 oder 3 bereit, um Schutzgruppen in einem geordneten Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Polymersequenzen durch aufeinanderfolgendes Zugeben von Reagentien bereitzustellen, umfassend den Schritt des aufeinanderfolgenden Schützens und Entschützens von Abschnitten der Vielzahl von Polymersequenzen zur Addition anderer Abschnitte der Polymersequenzen unter Verwendung einer binären Synthesestrategie. Dieser Aspekt der Erfindung stellt verbesserte Maskierungstechniken für VSLIPS's bereit.

Die binäre Synthesestrategie ist vorzugsweise

(a) eine binäre Maskierungsstrategie, wobei die Maskierungsstrategie mindestens zwei aufeinanderfolgende Schritte bereitstellt, bei denen eine Maske eine vorhergehende Maske faktorisiert, und zwar durch Schützen eines Abschnitts eines vorher belichteten Abschnitts vor Licht und Belichten eines Abschnitts eines vorher geschützten Abschnitts, oder
(b) eine binäre Maskierungsstrategie, wobei die Masken in einer Graucode- Maskierungsstrategie angeordnet sind, wobei die Graucode-Maskierungsstrategie eine Kantenbelichtung auf jeder einer Vielzahl von Synthesestellen aufweist. Die Verwendung der Verbindungen kann ferner den Schritt des Herstellens eines Abschnitts der Polymere mittels einer nicht-binären Maskierungstrategie umfassen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einem Reaktorsystem zur Synthese verschiedener Polymersequenzen auf einem Träger verwendet werden. Ein solches Reaktorsystem ermöglicht das In-Kontakt-Bringen von Reaktionsfluiden mit einem Träger und das Zuführen ausgewählter Reaktionsfluide zu dem Reaktor. Es ist auch ein Verschiebungstisch zur Bewegung einer Maske oder eines Trägers von mindestens einer ersten relativen Position relativ zu einer zweiten relativen Position; Licht zur Belichtung des Trägers durch eine Maske an ausgewählten Zeitpunkten; und ein geeignet programmierter digitaler Computer zur selektiven Ausrichtung eines Fluidstroms von dem Reaktorsystem, zur selektiven Aktivierung des Verschiebungstisches und zur selektiven Belichtung des Trägers bereitgestellt, um so eine Vielzahl von verschiedenen Polymersequenzen an vorbestimmten Positionen auf dem Träger zu bilden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer Technik zur Auswahl von Linkermolekülen in der VLSLIPS verwendet werden, auch ein Verfahren zum Screenen einer Vielzahl von Linkerpolymeren zur Verwendung in Bindungsaffinitätsstudien. Bei der Bildung einer Vielzahl von Linkerpolymeren auf einem Träger in ausgewählten Bereichen, werden die Linkerpolymere durch die Schritte des rekursiven Belichtens eines Abschnitts der ausgewählten Bereiche auf einer Oberfläche eines Trägers, um eine Schutzgruppe zu entfernen und In-Kontakt-Bringen der Oberfläche mit einem Monomer; In-Kontakt-Bringen der Vielzahl von Linkerpolymeren mit einem Liganden; und In-Kontakt-Bringen des Liganden mit einem markierten Rezeptor gebildet.
Die Erfindung ermöglicht verbesserte Maskierungstechniken für VLSLIPS. In einem Aspekt der Maskierungstechnik ermöglicht die Erfindung ein geordnetes Verfahren zur Bildung einer Vielzahl von Polymersequenzen durch aufeinanderfolgende Zugabe von Reagenzien, umfassend den Schritt des aufeinanderfolgenden Schützens und Entschützens von Abschnitten der Vielzahl von Polymersequenzen zur Addition anderer Abschnitte der Polymersequenzen unter Verwendung einer binären Synthesestrategie.
Es können verbesserte Datensammelgeräte und -techniken eingesetzt werden. Beispielsweise können die Geräte ein System zur Bestimmung der Affinität eines Rezeptors für einen Liganden umfassen, wobei das System umfasst: eine Einrichtung zur Belichtung einer Trägeroberfläche, wobei der Träger eine Vielzahl von Liganden an vorbestimmten Positionen umfasst, wobei die Einrichtung zur Belichtung eine gleichzeitige Belichtung an einer Vielzahl der vorbestimmten Positionen ermöglicht; und eine Gruppierung von Detektoren zum Nachweis von Fluoreszenz an der Vielzahl von vorbestimmten Positionen. Die Erfindung ermöglicht auch verbesserte Datenanalysetechniken, einschließlich der Schritte des Zusammenbringens fluoreszierend markierter Rezeptoren mit einem Träger, wobei der Träger eine Vielzahl von Liganden in Bereichen an bekannten Positionen umfasst; des Bestimmens eines Fluoreszenzwertes aus Datensammelpunkten an einer Vielzahl von Datensammelpunkten innerhalb jedes Bereiches; Entfernen der Datensammelpunkte, die von einer vorbestimmten statistischen Verteilung abweichen; und Bestimmen einer relativen Bindungsaffinität des Rezeptors aus den verbleibenden Datensammelpunkten.
Es sind auch geschützte Aminosäure-N-carboxyanhydride zur Verwendung bei der Polymersynthese möglich. Beispielsweise kann eine Verbindung der allgemeinen Formel
verwendet werden, worin R eine Seitenkette einer natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäure und X eine mit Licht entfernbare Schutzgruppe ist.
Ein weitergehendes Verständnis der Natur und der Vorteile der vorliegenden Erfindung ergibt sich aus den nachstehenden Teilen der Beschreibung und den beigefügten Zeichungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht schematisch die lichtgesteuerte, räumlich adressierbare parallele chemische Synthese;
Fig. 2 veranschaulicht schematisch ein Beispiel einer lichtgesteuerten Peptidsynthese;
Fig. 3 veranschaulicht schematisch die Software für das automatisierte System zur Synthese verschiedender Polymersequenzen;
Fig. 4a und 4b veranschaulichen den Betrieb eines Programms zur Polymersynthese;
Fig. 5 ist eine schematische Veranschaulichung einer "reinen" binären Maskierungsstrategie;
Fig. 6 ist eine schematische Veranschaulichung einer binären Graucode-Maskierungsstrategie;
Fig. 7 ist eine schematische Veranschaulichung einer modifizierten binären Graucode- Maskierungsstrategie;
Fig. 8a veranschaulicht schematisch eine Maskierungsstrategie für eine vierstufige Synthese;
Fig. 8b veranschaulicht schematisch die Synthese aller 400 Peptiddimeren;
Fig. 9 ist eine Koordinatenkarte für die zehnstufige binäre Synthese;
Fig. 10 veranschaulicht schematisch ein Datensammelsystem;
Fig. 11 ist ein Blockdiagramm, das den Aufbau des Datensammelsystems zeigt;
Fig. 12 ist ein Flussdiagramm, das den Betrieb einer Software für das Datensammel- /Analysesystem veranschaulicht; und
Fig. 13 veranschaulicht schematisch ein Beispiel der lichtgesteuerten Oligonucleotidsynthese.

Inhalt

I. Definitionen
II. Allgemeines
A. Entschützen und Addition
1. Beispiel
2. Beispiel
B. Antikörper-Erkennung
1. Beispiel
III. Synthese
A. Reaktorsystem
B. Binäre Synthesestrategie
1. Beispiel
2. Beispiel
3. Beispiel
4. Beispiel
5. Beispiel
6. Beispiel
C. Linkerauswahl
D. Schutzgruppen
1. Verwendung von Schutzgruppen, die mit Licht entfernbar sind, während der Festphasensynthese von Peptiden
2. Verwendung von Schutzgruppen, die mit Licht entfernbar sind, während der Festphasensynthese von Oligonucleotiden
E. Aminosäure-N-carboxyanhydride, die mit einer mit Licht entfernbaren Gruppe geschützt sind
IV. Datensammlung
A. Datensammelsystem
B. Datenanalyse
V. Andere repräsentative Anwendungen
A. Oligonucleotidsynthese
1. Beispiel
VI. Schlußfolgerung

I. Definitionen

Für bestimmte, hier verwendete Begriffe sollen die nachstehend angegebenen allgemeinen Definitionen gelten:
1. Komplementär: Bezieht sich auf die topologische Verträglichkeit oder auf das Zusammenpassen von wechselwirkenden Oberflächen eines Ligandmoleküls und dessen Rezeptor. Folglich können der Rezeptor und dessen Ligand als komplementär beschrieben werden. Ferner sind die Kontaktoberflächeneigenschaften komplementär zueinander,
2. Epitop: Der Abschnitt eines Antigenmoleküls, der durch den Bereich der Wechselwirkung mit der als Antikörper bekannten Rezeptor-Unterklasse dargestellt wird.
3. Ligand: Ein Ligand ist ein Molekül, das von einem besonderen Rezeptor erkannt wird. Beispiele für Liganden, die durch diese Erfindung untersucht werden können, umfassen u. a. Agonisten und Antagonisten für Zellmembranrezeptoren, Toxine und tierische Gifte, virale Epitope, Hormone (z. B. Opiate, Steroide usw.), Hormonrezeptoren, Peptide, Enzyme, Enzymsubstrate, Cofaktoren, Arzneistoffe, Lectine, Zucker, Oligonucleotide, Nucleinsäuren, Oligosaccharide, Proteine und monoklonale Antikörper.
4. Monomer: Ein Molekül des Satzes kleiner Moleküle, die unter Bildung eines Polymers aneinander gebunden werden können. Monomersätze umfassen u. a. beispielsweise den Satz gewöhnlicher L-Aminosäuren, den Satz von D-Aminosäuren, den Satz synthetischer Aminosäuren, den Satz von Nucleotiden und den Satz von Pentosen und Hexosen. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff Monomer auf ein beliebiges Molekül eines Basissatzes zur Synthese eines Polymers. Beispielsweise bilden Dimere der 20 natürlich vorkommenden L-Aminosäuren einen Basissatz von 400 Monomeren zur Synthese von Polypeptiden. Verschiedene Basissätze von Monomeren können an aufeinanderfolgenden Schritten bei der Synthese eines Polymers verwendet werden. Ferner kann jeder der Sätze geschützte Moleküle umfassen, die nach der Synthese modifiziert werden.
5. Peptid: Ein Polymer, dessen Monomere alpha-Aminosäuren sind, die über Amidbindungen miteinander verbunden sind und das alternativ als Polypeptid bezeichnet wird. Im Zusammenhang mit dieser Beschreibung sollte beachtet werden, dass die Aminosäuren das optische L- oder D-Isomer sein können. Peptide weisen häufig eine Länge von zwei oder mehr Aminosäuremonomeren und häufiger mehr als Aminosäuremonomeren auf. Für Aminosäuren werden Standardabkürzungen verwendet (z. B. P für Prolin). Diese Abkürzungen sind in Stryer, Biochemistry, 3. Auflage, 1988, beschrieben.
6. Strahlung: Energie, die selektiv angewandt werden kann, einschließlich Energie mit einer Wellenlänge zwischen 10&supmin;¹&sup4; und 10&sup4; m, einschließlich beispielsweise Elektronenstrahlung, Gammastrahlung, Röntgenstrahlung, Ultraviolettstrahlung, sichtbares Licht, Infrarotstrahlung, Mikrowellenstrahlung und Radiowellen. "Bestrahlung" bezieht sich auf die Anwendung einer Strahlung auf eine Oberfläche.
7. Rezeptor: Ein Molekül, das eine Affinität für einen gegebenen Liganden aufweist. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle sein. Sie können in unverändertem Zustand oder als Aggregate mit anderen Spezies verwendet werden. Rezeptoren können kovalent oder nicht-kovalent an ein Bindungselement gebunden werden, und zwar entweder direkt oder über eine spezifische Bindungssubstanz. Beispiele für Rezeptoren, die in dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen u. a. Antikörper, Zellmembranrezeptoren, monoklonale Antikörper und Antiseren, die mit spezifischen antigenen Determinanten (wie solchen auf Viren, Zellen oder anderen Materialien) reagieren können, Arzneistoffe, Polynucleotide, Nucleinsäuren, Peptide, Cofaktoren, Lectine, Zucker, Polysaccharide, Zellen, Zellmembranen und Organelle. Rezeptoren werden vom Fachmann manchmal als Anti-Liganden bezeichnet. So wie der Begriff Rezeptoren hier verwendet wird, ist kein Bedeutungsunterschied beabsichtigt. Ein "Ligand- Rezeptor-Paar" wird gebildet, wenn sich zwei Makromoleküle über molekulare Erkennung unter Bildung eines Komplexes verbunden haben.
Weitere Beispiele für Rezeptoren, die mit dieser Erfindung untersucht werden können, umfassen u. a.:
a) Mikroorganismus-Rezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, die an Rezeptoren binden, wie spezifischen Transportproteinen oder Enzymen, die für das Überleben von Mikroorganismen essentiell sind, ist für eine neue Klasse von Antibiotika geeignet. Von besonderem Wert würden Antibiotika gegen opportunistische Pilze, Protozoen und Bakterien sein, die gegen die derzeit verwendeten Antibiotika resistent sind.
b) Enzyme: Beispielsweise liefert die Bestimmung der Bindungsstelle von Enzymen wie der Enzyme, die für die Spaltung von Neurotransmittern verantwortlich sind, nützliche Informationen. Die Bestimmung von Liganden, die an bestimmte Rezeptoren binden, um die Wirkung von Enzymen zu modulieren, welche die verschiedenen Neurotransmitter spalten, ist bei der Entwicklung von Arzneistoffen nützlich, die zur Behandlung von Störungen der neuronalen Übertragung verwendet werden können.
c) Antikörper: Beispielsweise kann die Erfindung bei der Erforschung der Ligand-Bindungsstelle auf einem Antikörpermolekül nützlich sein, das mit dem Epitop eines interessierenden Antigens bindet; die Bestimmung einer Sequenz, die ein antigenes Epitop nachahmt, kann zur Entwicklung von Impfstoffen führen, deren Immunogen auf einer oder mehrerer dieser Sequenzen basiert, oder die Bestimmung kann zur Entwicklung verwandter Diagnostika oder Verbindungen führen, die bei der therapeutischen Behandlung von Autoimmunerkrankungen (z. B. durch Blockieren der Bindung der gegen den "eigenen Körper gerichteten" Antikörper) nützlich sind.
d) Nucleinsäuren: Nucleinsäuresequenzen können synthetisiert werden, um DNA- oder RNA-Bindungssequenzen zu erstellen.
e) Katalytische Polypeptide: Polymere, vorzugsweise Polypeptide, die eine chemische Reaktion beschleunigen können, welche die Umwandlung von einem oder mehreren Reaktanten in ein oder mehrere Produkte beschleunigen können. Solche Polypeptide umfassen im Allgemeinen eine Bindungsstelle, die für mindestens einen Reaktanten oder ein Zwischenprodukt der Reaktion spezifisch ist und eine aktive Funktionalität nahe der Bindungsstelle, wobei die Funktionalität den gebundenen Reaktanten chemisch modifizieren kann. Katalytische Polypeptide sind z. B. in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 404, 920 beschrieben.
f) Hormonrezeptoren: Beispielsweise die Rezeptoren für Insulin und Wachstumshormon. Die Bestimmung der Liganden, die mit hoher Affinität an einen Rezeptor binden, ist bei der Entwicklung von z. B. eines oralen Ersatzes der täglichen Injektionen geeignet, die sich Diabetiker verabreichen müssen, um die Diabetes-Symptome zu vermindern, oder eines Ersatzes für das schwer erhältliche menschliche Wachstumshormon, das nur aus Leichen oder durch rekombinante DNA-Technologie erhalten werden kann. Andere Beispiele sind die vasokonstriktorischen Hormonrezeptoren. Die Bestimmung derjenigen Liganden, die an einen Rezeptor binden, kann zur Entwicklung von Arzneistoffen zur Kontrolle des Blutdrucks führen.
g) Opiatrezeptoren: Die Bestimmung von Liganden, die an die Opiatrezeptoren im Gehirn binden, ist bei der Entwicklung von weniger süchtig machenden Ersatzstoffen für Morphin und verwandte Arzneistoffe nützlich.
8. Träger: Ein Material mit einer festen oder halbfesten Oberfläche. In vielen Ausführungsformen ist mindestens eine Oberfläche des Trägers im Wesentlichen flach, obwohl es in manchen Ausführungsformen erwünscht sein kann, die Synthesebereiche für verschiedene Polymere mit beispielsweise Vertiefungen, erhöhten Bereichen, geätzten Rinnen oder dergleichen physisch voneinander zu trennen. Gemäß anderer Ausführungsformen können auf der Oberfläche kleine Kügelchen bereitgestellt werden, die nach dem Abschluss der Synthese freigesetzt werden können.
9. Schutzgruppe: Ein Material, das chemisch an eine Monomereinheit gebunden ist und das durch selektive Einwirkung eines Aktivators wie elektromagnetischer Strahlung entfernt werden kann. Beispiele für hier geeignete Schutzgruppen umfassen diejenigen, die Nitropiperonyl, Pyrenylmethoxycarbonyl, Nitroveratryl, Nitrobenzyl, Dimethyldimethoxybenzyl, 5-Brom-7-nitroindolinyl, o-Hydroxy-α-methylcinnamoyl und 2-Oxymethylenanthrachinon umfassen.
10. Vorbestimmter Bereich: Ein vorbestimmter Bereich ist ein auf einer Oberfläche liegender Bereich, der zur Bildung eines Polymers aktiviert ist, war oder werden soll. Der vorbestimmte Bereich kann eine zweckmäßige Form aufweisen, z. B. eine kreisförmige, rechteckige, elliptische Form oder eine Keilform usw. Aus Gründen der Kürze werden "vorbestimmte Bereiche" in dieser Patentschrift manchmal einfach als "Bereiche" bezeichnet.
11. Im Wesentlichen rein: Ein Polymer wird innerhalb eines vorbestimmten Bereichs eines Trägers als "im Wesentlichen rein" betrachtet, wenn es Eigenschaften aufweist, die es von anderen vorbestimmten Bereichen unterscheiden. Typischerweise wird die Reinheit als biologische Wirkung oder Funktion als Ergebnis einer einheitlichen Sequenz gemessen. Solche Eigenschaften werden typischerweise durch Bindung mit einem ausgewählten Liganden oder Rezeptor gemessen.
12. Aktivator: Bezieht sich auf eine Energiequelle, die angepasst ist, um eine Gruppe zu aktivieren und die von einer Quelle auf eine vorbestimmte Stelle auf einen Träger gerichtet wird. Ein wichtiges Beispiel eines Aktivators ist Licht. Andere Beispiele für Aktivatoren umfassen Ionenstrahlen, elektrische Felder, magnetische Felder, Elektronenstrahlen, Röntgenstrahlen und dergleichen.
13. Binäre Synthesestrategie: Bezieht sich auf eine geordnete Strategie zur parallelen Synthese verschiedener Polymersequenzen durch aufeinanderfolgendes Zugeben von Reagenzien, die durch eine Reaktantmatrix und eine Schaltmatrix dargestellt werden kann, deren Produkt eine Produktmatrix ist. Eine Reaktantmatrix ist eine 1 · m-Matrix der zuzugebenden Synthesebausteine. Die Schaftmatrix umfasst alle binären Zahlen oder einen Untersatz der binären Zahlen, vorzugsweise geordnet, zwischen 1 und m, die in Spalten angeordnet sind. In bevorzugten Ausführungsformen ist die binäre Strategie eine Strategie, bei der in mindestens zwei aufeinanderfolgenden Schritten die Hälfte eines interessierenden Bereichs auf dem Träger belichtet wird. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen bezieht sich die binäre Synthese auf eine Synthesestrategie, die auch einen vorhergehenden Syntheseschritt faktorisiert. So z. B. bei einer Strategie, bei der eine Schaltmatrix für eine Maskierungsstrategie die Bereiche halbiert, die vorher belichtet wurden, wobei etwa die Hälfte des vorher belichteten Bereichs belichtet und die verbleibende Hälfte geschützt wird (während auch etwa die Hälfte der vorher geschützten Bereiche geschützt und etwa die Hälfte der vorher geschützten Bereiche belichtet werden). Es ist klar, dass die binären Durchgänge mit nicht-binären Durchgängen gemischt werden können und dass lediglich ein Abschnitt eines Trägers einem binären Schema unterworfen werden kann, wobei dies auch als definitionsgemäße binäre Maskierungsstrategie betrachtet wird. Eine binäre "Maskierungs"-Strategie ist eine binäre Synthese, bei der Licht verwendet wird, um Schutzgruppen von Materialien zu entfernen, so dass andere Materialien wie Aminosäuren addiert werden können. In bevorzugten Ausführungsformen sind ausgewählte Spalten der Schaltmatrix so angeordnet, dass die binären Zahlen in den Spalten der Schaltmatrix erhöht werden.
14. Linker: Bezieht sich auf ein Molekül oder eine Gruppe von Molekülen, das/die an einem Substrat gebunden ist/sind und für die Beabstandung eines synthetisierten Polymers von dem Träger zur Präsentation/Bindung für/an einen Rezeptor sorgt/sorgen.

II. Allgemeines

Nachstehend werden Synthesestrategien und Vorrichtungen für die Herstellung einer chemischen Mannigfaltigkeit in sehr großem Maßstab beschrieben.
Beispielsweise werden Festphasenchemie, lichtempfindliche Schutzgruppen und Photolithographie zusammengebracht, um eine lichtgesteuerte, räumlich adressierbare parallele chemische Synthese zu erreichen.
Die Herstellung von Peptiden und Nucleotiden wird beschrieben, jedoch können auch andere Polymere hergestellt werden.
Solche Polymere umfassen z. B. sowohl lineare als auch cyclische Polymere von Nucleinsäuren, Polysaccharide, Phospholipide und Peptide, die entweder α-, β- oder ω- Aminosäuren aufweisen, Heteropolymere, worin ein bekannter Arzneistoff kovalent an eine beliebige der vorstehend genannten Verbindungen gebunden ist, Polyurethane, Polyester, Polycarbonate, Polyharnstoffe, Polyamide, Polyethylenimine, Polyarylensulfide, Polysiloxane, Polyimide, Polyacetate oder andere Polymere, die beim Lesen dieser Beschreibung ersichtlich sind.
Es wird ferner angemerkt, dass sich die hier beschriebenen Beispiele primär auf eine Synthese vom C- zum N-Terminus beziehen. Es kann jedoch auch eine Synthese vom Nzum C-Terminus durchgeführt werden.

A. Entschützen und Addition

Eine maskierte Lichtquelle oder ein anderer Aktivator wird verwendet, um die gleichzeitige Synthese vieler verschiedener chemischer Verbindungen gerichtet auszuführen. Fig. 1 ist ein Flussdiagramm, welches das Verfahren zur Bildung von chemischen Verbindungen gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform zeigt. Die Synthese findet auf einem festen Träger 2 statt. Ein Belichtungsmuster durch eine Maske 4a unter Verwendung einer Lichtquelle 6 bestimmt, welche Bereiche des Trägers für eine chemische Kopplung aktiviert werden. Die Aktivierung kann unter Verwendung von Licht zur Entfernung lichtempfindlicher Schutzgruppen von ausgewählten Bereichen des Trägers erreicht werden.
Nach dem Entschützen wird ein erster Satz von Synthesebausteinen (in Fig. 1 mit "A" gekennzeichnet), die jeweils eine lichtempfindliche Schutzgruppe tragen (mit "X" bezeichnet), mit der Oberfläche des Trägers in Kontakt gebracht und reagiert mit Bereichen, die im vorhergehenden Schritt dem Licht ausgesetzt waren. Der Träger wird dann durch eine zweite Maske 4b belichtet, was einen anderen Bereich für die Reaktion mit einem zweiten geschützten Synthesebaustein "B" aktiviert. Die bei diesen Belichtungen verwendeten Maskenmuster und die Reaktantenabfolge definieren die Endprodukte und ihre Positionen, was an vorbestimmten Stellen zu verschiedenen Sequenzen führt, wie es für die Sequenzen ACEG und BDFH im unteren Abschnittt von Fig. 1 gezeigt ist. Durch die Nutzung der Vorteile der kombinatorischen Maskierungsstrategien kann eine große Anzahl von Verbindungen mit einer kleinen Anzahl von chemischen Schritten gebildet werden.
Es ist ein hoher Miniaturisierungsgrad möglich, und zwar dadurch, dass die Dichte der Verbindungen in großem Maß von der räumlichen Adressierbarkeit des Aktivators, in einem Fall der Beugung von Licht, bestimmt wird. Jede Verbindung ist physisch erreichbar und deren Position ist genau bekannt. Daher ist die Gruppierung räumlich adressierbar und deren Wechselwirkungen mit anderen Molekülen kann bewertet werden.
Der Träger kann Aminogruppen enthalten, die mit einer lichtempfindlichen Schutzgruppe blockiert sind, wie es in Fig. 1 gezeigt ist. Aminosäuresequenzen werden durch Entfernen der lichtempfindlichen Gruppen für eine Kopplung mit einem Rezeptor zur Verfügung gestellt.
Wenn eine zu synthetisierende Polymersequenz z. B. ein Polypeptid ist, werden Aminogruppen an den Enden von Linkem, die an einen Glasträger gebunden sind, mit Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), einer mit Licht entfernbaren Schutzgruppe, derivatisiert. Die Linkermoleküle können z. B. ein Arylacetylen, Ethylenglycololigomere, die 2-10 Monomere enthalten, Diamine, Disäuren, Aminosäuren oder Kombinationen davon sein. Das Entschützen mit Licht wird durch Belichtung des Trägers durch beispielsweise eine Maske bewirkt, deren Muster transparente Bereiche aufweist, die z. B. Abmessungen von weniger als 1 cm², 10&supmin;¹ cm², 10&supmin;² cm², 10&supmin;³ cm², 10&supmin;&sup4; cm², 10&supmin;&sup5; cm², 10&supmin;&sup6; cm², 10&supmin;&sup7; cm², 10&supmin;&sup8; cm² oder 10&supmin;¹&sup0; cm² aufweisen. Beispielsweise haben die Bereiche eine Größe zwischen etwa 10 · 10 um und 500 · 500 um. Die Masken können so angeordnet werden, dass eine Schachbrettgruppierung von Polymeren erzeugt wird, obwohl eine beliebige aus einer Vielzahl von geometrischen Konfigurationen verwendet werden kann.

1. Beispiel

Freie Aminogruppen wurden durch Behandlung der gesamten Trägeroberfläche mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) nach der Entschützung mit Licht fluoreszierend markiert. Glasobjektträger wurden gereinigt, durch Behandeln mit 0,1% Aminopropyltriethoxysilan in 95%igem Ethanol aminiert und 20 min bei 110ºC inkubiert. Die aminierte Oberfläche des Objektträgers wurde dann mit einer 30 mM-Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von NVOC-GABA (Nitroveratryloxycarbonyl-γ-aminobuttersäure) in DMF in Kontakt gebracht. Die NVOC-Schutzgruppe wurde durch Belichten des Trägers mit Licht einer Wellenlänge von 365 nm von einer Quecksilberbogenlampe durch eine 100 um Chrom-auf-Glas Schachbrettmaske für 20 min bei einer Leistungsdichte von 12 mW/cm² photolytisch entfernt. Die belichtete Oberfläche wurde dann mit 1 mM FITC in DMF behandelt. Die Trägeroberfläche wurde mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop (Zeiss-Axioskop 20) bei einer 488 nm Anregung durch einen Argonionenlaser (Spectra-Physics Modell 2025) gescannt. Die Fluoreszenzemission über 520 nm wurde mit einem gekühlten Photomultiplier (Hamamatsu 943-02), der im Photonenzählmodus betrieben wurde, nachgewiesen. Die Fluoreszenzintensität wurde in eine Farbanzeige umgewandelt, wobei die Bereiche höchster Intensität rot und die Bereiche niedrigster Intensität schwarz dargestellt wurden. Das Vorliegen eines fluoreszierenden Schachbrettmusters mit Elementen von 100 · 100 um und hohem Kontrast zeigte, dass in spezifischen Bereichen durch räumlich lokalisiertes Entschützen mit Licht freie Aminogruppen erzeugt worden sind.

2. Beispiel

Fig. 2 ist ein Fließschema, das dieses Beispiel veranschaulicht. Carboxy-aktiviertes NVOC- Leucin wurde mit einem aminierten Träger umgesetzt. Der Carboxy-aktivierte HOBT-Ester von Leucin und andere bei dieser Synthese verwendete Aminosäuren wurden durch Mischen von 0,25 mmol der NVOC-aminogeschützten Aminosäure mit 37 mg HOBT (1- Hydroxybenzotriazol), 111 mg BOP (Benzotriazolyl-n-oxy-tris(dimethylamino)- phosphoniumhexafluorophosphat) und 86 ul DIEA (Diisopropylethylamin) in 2,5 ml DMF gebildet. Die NVOC-Schutzgruppe wurde durch einheitliche Belichtung entfernt. Carboxyaktiviertes NVOC-Phenylalanin wurde mit den freigesetzten Aminogruppen 2 Stunden bei Raumtemperatur zur Kopplung umgesetzt und mit DMF und Methylenchlorid gewaschen. Zwei unmaskierte Zyklen des Entschützens mit Licht und des Koppelns mit Carboxyaktiviertem NVOC-Glycin wurden durchgeführt. Dis Oberfläche wurde dann durch eine 50 um Chrom-auf-Gias Schachbrettmustermaske belichtet. Anschließend wurde Carboxyaktiviertes Nα-tBOC-O-tButyl-L-Tyrosin zugegeben. Die gesamte Oberfläche wurde gleichförmig belichtet, um die restlichen NVOC-Gruppen zu photolysieren. Schließlich wurde Carboxy-aktiviertes NVOC-L-Prolin zugegeben, die NVOC-Gruppe wurde durch Belichten entfernt und die t-BOC- und t-Butylschutzgruppen wurden mit TFA entfernt. Nach der Entfernung der Schutzgruppen bestand die Oberfläche aus einer 50 um Schachbrettgruppierung von Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (YGGFL) und Pro-Gly-Gly-Phe-Leu (PGGFL), vgl. auch SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2.

B. Antikörpererkennung

Der Träger kann verwendet werden, um zu bestimmen, welche der Vielzahl von Aminosäuresequenzen von einem interessierenden Antikörper erkannt wird.

1. Beispiel

In einem Beispiel wurde die Gruppierung von Pentapeptiden in dem in Fig. 2 veranschaulichten Beispiel mit einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen β-Endorphin untersucht. Es ist bekannt, dass dieser Antikörper (genannt 3E7) YGGFL und YGGFM (vgl. auch SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 21) mit nanomolarer Affinität bindet, was von Meo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 80, 4084 diskutiert wird. Dieser Antikörper benötigt als Aminoterminus Tyrosin für ein Binden mit hoher Affinität. Die in Fig. 2 beschriebene gebildete Gruppierung von Peptiden wurde mit 2 ug/ml monoklonalem Maus-Antikörper (3E7) inkubiert, dessen YGGFL-Erkennung bekannt ist, vgl. auch SEQ ID NO: 1. 3E7 bindet nicht an PGGFL, vgl. auch SEQ ID NO: 2. Durch eine zweite Inkubation mit Fluoresceinmarkiertem Ziegen-Anti-Maus-Antikörper wurden die Bereiche markiert, die 3E7 gebunden hatten. Die Oberfläche wurde mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop gescannt. Die Ergebnisse zeigten abwechselnd helle und dunkle 50 um-Quadrate, was zeigte, dass YGGFL (SEQ ID NO: 1) und PGGFL (SEQ ID NO: 2) in einer durch die Maske bestimmten geometrischen Gruppierung synthetisiert worden sind. Ein Fluoreszenz-Schachbrettbild mit hohem Kontrast (> 12 : 1 Intensitätsverhältnis) zeigt, dass (a) YGGFL (SEQ ID NO: 1) und PGGFL (SEQ ID NO: 2) in abwechselnden 50 um-Quadraten synthetisiert worden sind, dass (b) an der Oberfläche gebundenes YGGFL (SEQ ID NO: 1) für eine Bindung an dem Antikörper 3E7 zugänglich ist und dass (c) der Antikörper 3E7 nicht an PGGFL (SEQ ID NO: 2) bindet.
Eine dreidimensionale Darstellung der Fluoreszenzintensitätsdaten in einem rechteckigen Abschnitt des Schachbretts von 2 mal 4 Quadraten wurde hergestellt. Sie zeigt, dass die Grenze zwischen den Synthesestellen scharf ist. Die Höhe jeder Spitze in dieser Anzeige ist linear proportional zu der integrierten Fluoreszenzintensität in einem 2,5 um-Pixel. Der Übergang zwischen PGGFL und YGGFL findet innerhalb von 2 Spitzen (5 um) statt. Die Fluoreszenzintensität verschiedener YGGFL-Quadrate schwankt nur wenig. Die mittlere Intensität von sechzehn YGGFL-Synthesestellen betrug 2,03 · 10&sup5; Zählungen und die Standardabweichung betrug 9,6 · 10³ Zählungen.

III. Synthese

A. Reaktorsystem

Fig. 3 veranschaulicht schematisch eine Vorrichtung, die zur Synthese verschiedener Polymersequenzen auf einem Träger verwendet worden ist. Die Vorrichtung umfasst einen automatisierten Peptidsynthesizer 401. Der automatisierte Peptidsynthesizer ist eine Vorrichtung, die unter der Steuerung eines Computers 404 ausgewählte Reagenzien durch eine Durchflusszelle 402 strömen lässt. Der Synthesizer kann ein ABI Peptidsynthesizer Modell Nr. 431A sein. Der Computer kann aus einer Vielzahl von Computern oder diskreten Logikbauelementen ausgewählt sein, einschließlich z. B. einem IBM PC-AT Computer oder einem ähnlichen Computer, der mit geeigneten internen Steuerungssystemen in dem Peptidsynthesizer verbunden ist. Der PC wird mit Signalen von dem Peptidsynthesizer gespeist, die z. B. das Ende eines Kopplungszyklus anzeigen.
Der Träger 406 wird auf der Durchflusszelle befestigt und bildet einen Hohlraum zwischen dem Träger und der Durchflusszelle. Ausgewählte Reagenzien fließen vom Peptidsynthesizer an ausgewählten Zeitpunkten durch diesen Hohlraum und Bilden eine Gruppierung von Peptiden auf der Fläche des Trägers in dem Hohlraum. Über dem Träger und vorzugsweise in Kontakt mit dem Träger ist eine Maske 408 befestigt. Die Maske 408 ist in ausgewählten Bereichen gegenüber einer ausgewählten Licht-Wellenlänge durchlässig und in anderen Bereichen gegenüber der ausgewählten Licht-Wellenlänge undurchlässig. Die Maske wird mit einer Lichtquelle 410 wie z. B. einer UV-Lichtquelle belichtet. In einem Beispiel ist die Lichtquelle 410 ein von Oriel hergestelltes Modell Nr. 82420. Die Maske wird von einem x-y-z-Verschiebungstisch 412, wie z. B. einem x-y-Verschiebungstisch von der Newport Corp., gehalten und verschoben. Der Computer koordiniert den Betrieb des Peptidsynthesizers, des x-y-Verschiebungstisches und der Lichtquelle. Natürlich kann der Träger anstelle der Maske verschoben werden.
Im Betrieb wird der Träger auf der Durchflusszelle befestigt. Der Träger, dessen Oberfläche mit einer geeigneten, mit Licht entfernbaren Schutzgruppe geschützt ist, wird an ausgewählten Stellen belichtet, und zwar durch Positionieren der Maske und Richten von Licht von einer Lichtquelle durch die Maske auf den Träger für einen gewünschten Zeitraum (wie z. B. 1 s bis 60 min im Fall der Peptidsynthese). Ein ausgewähltes Peptid oder ein anderes Monomer/Polymer wird vom Peptidsynthesizer zur Bindung an den ausgewählten Stellen auf dem Träger durch den Reaktorhohlraum gepumpt. Nach einer ausgewählten Reaktionszeit (wie z. B. etwa 1 s bis 300 min im Fall von Peptidreaktionen) wird das Monomer durch Waschen von dem System entfernt, die Maske wird in geeigneter Weise erneut angeordnet oder ersetzt und der Zyklus wird wiederholt.
Reaktionen können bei oder nahe bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Die Fig. 4a und 4b sind Fließschemata der beim Betrieb des Reaktorsystems verwendeten Software. Bei dem Schritt SO&sub2; wird die Peptidsynthese-Software gestartet. Bei dem Schritt SO&sub4; kalibriert das System Positioniereinrichtungen auf dem x-y- Verschiebungstisch und beginnt mit einer Hauptschleife. Bei dem Schritt 506 bestimmt das System gegebenenfalls, welche Funktionstasten des Computers gedrückt wurden. Wenn F1 gedrückt wurde, fordert das System den Anwender zur Eingabe eines gewünschten Syntheseverfahrens auf. Wenn der Anwender die Taste F2 drückt, lässt es das System zu, dass der Anwender bei dem Schritt 510 eine Datei für ein Syntheseverfahren editiert. Wenn der Anwender die Taste F3 drückt, lädt das System bei dem Schritt 512 ein Verfahren von einer Diskette. Wenn der Anwender die Taste F4 drückt, speichert das System bei dem Schritt 514 ein eingegebenes oder editiertes Verfahren auf einer Diskette. Wenn der Anwender die Taste F5 drückt, wird das gegenwärtige Verfahren bei dem Schritt 516 angezeigt, während das Drücken von F6 den Hauptteil des Programms startet, d. h., die tatsächliche Synthese gemäß des ausgewählten Verfahrens. Wenn der Anwender die Taste F7 drückt, zeigt das System die Position der synthetisierten Peptide, während das Drücken der Taste F10 den Anwender zum Betriebssystem zurückbringt.
Die Fig. 4b veranschaulicht den Syntheseschritt 518 genauer. Die Hauptschleife des Programms wird gestartet, wobei das System zunächst die Maske bei dem Schritt 526 zu einer nächsten Position bewegt. Während der Hauptschleife des Programms fließen die benötigten Chemikalien unter der Steuerung des im Peptidsynthesizer angeordneten Computers durch die Reaktionszelle. Bei dem Schritt 528 wartet das System dann auf einen Belichtungsbefehl und belichtet bei dem Empfang des Belichtungsbefehls den Träger bei dem Schritt 530 für eine gewünschte Zeit. Wenn bei dem Schritt 532 die Bestätigung einer vollständigen Belichtung erhalten worden ist, bestimmt das System bei dem Schritt 534, ob das Verfahren abgeschlossen ist, und wartet, falls dies der Fall ist, auf eine zusätzliche Tastatureingabe bei dem Schritt 536 und beendet danach die Ausführung des Syntheseverfahrens.
Ein zum Betrieb des vorstehend beschriebenen Systems verwendetes Computerprogramm ist in Turbo C geschrieben (Borland Int'I) und wurde auf einem IBM-kompatiblen System implementiert. Die Motorsteuersoftware wird von einer von der Newport Corporation hergestellten Software angepasst. Es ist klar, dass eine Vielzahl von Programmiersprachen verwendet werden könnten, ohne von dem Schutzbereich dieser Erfindung abzuweichen. Es wird dabei auf ein Graphikprogramm in "Programmer Guide to PC and PS2 Video Systems" (Wilton, Microsoft Press, 1987) verwiesen.
Eine Ausrichtung der Maske kann durch eines von zwei Verfahren erreicht werden. Erstens kann das System auf der relativen Ausrichtung der verschiedenen Komponenten beruhen, was gewöhnlich akzeptabel ist, da die x-y-z-Verschiebungstische für die hier benötigten Zwecke ausreichend genau sind. Alternativ werden Ausrichtungsmarkierungen für eine passende Ausrichtung auf dem Träger mit einer CCD-Vorrichtung gekoppelt.
Reine Reagenzien müssen nicht notwendigerweise bei jedem Schritt zugegeben werden, noch müssen die Schutzgruppen bei jedem Schritt vollständig photolysiert werden. Dabei werden an jeder Syntheseposition viele Produkte gebildet. Wenn beispielsweise die Monomere A und B während eines Syntheseschritts gemischt werden, werden A und B an entschützte Bereiche binden, und zwar etwa im Verhältnis zu ihrer Konzentration in Lösung. Daher wird sich ein Gemisch von Verbindungen in einem Synthesebereich bilden. Ein Träger, der mit Gemischen von Verbindungen in verschiedenen Synthesebereichen ausgebildet ist, kann beispielsweise zur Durchführung eines ersten Screenings einer großen Zahl von Verbindungen verwendet werden, worauf eine kleinere Anzahl von Verbindungen in Bereichen, die eine hohe Bindungsaffinität zeigen, weiter gescreent werden. Entsprechende Ergebnisse können durch lediglich teilweise Photolyse eines Bereiches, Zugeben eines ersten Monomers, erneutes Photolysieren des gleichen Bereichs und Zugeben eines zweiten Monomers zu dem Bereich erhalten werden.

B. Binäre Synthesestrategie

Bei einer lichtgesteuerten chemischen Synthese hängen die gebildeten Produkte von dem Muster und von der Reihenfolge der Masken und Reaktanten ab. Um einen Satz von Produkten herzustellen, existiert im Allgemeinen eine endliche Zahl möglicher Maskierungsstrategien. Es kann eine binäre Synthesestrategie eingesetzt werden. Die binäre Synthesestrategie wird hier in erster Linie bezüglich einer Maskierungsstrategie veranschaulicht, obwohl sie auf andere Polymersynthesestrategien wie der Stiftstrategie und der gleichen anwendbar sein wird.
Bei einer binären Synthesestrategie wird der Träger mit einer ersten Maske belichtet, mit einem ersten Synthesebaustein in Kontakt gebracht, mit einer zweiten Maske belichtet, mit einem zweiten Synthesebaustein in Kontakt gebracht, usw. Jede Kombination aus maskierter Belichtung und In-Kontakt-Bringen mit einem Synthesebaustein wird hier als "Zyklus" bezeichnet.
Bei einer bevorzugen binären Maskierungsstrategie lassen die Masken für jeden Zyklus eine Belichtung der Hälfte eines interessierenden Bereichs auf dem Träger und keine Belichtung der restlichen Hälfte des interessierenden Bereichs zu. Der Begriff "Hälfte" soll hier nicht genau die Hälfte des interessierenden Bereichs, sondern einen großen Anteil des interessierenden Bereichs wie z. B. etwa 30 bis 70% des interessierenden Bereichs bedeuten. Es ist klar, dass die gesamte Maskierungsstrategie keine binäre Form aufweisen muss, sondern es können auch nicht-binäre Zyklen zwischen binäre Zyklen eingeführt werden.
Bei der binären Maskierungsstrategie kann ein gegebener Zyklus lediglich die Hälfte des Bereichs belichten, der in einem vorhergehenden Zyklus belichtet worden ist, während die restliche Hälfte des belichteten Abschnitts von dem vorhergehenden Zyklus nicht belichtet wird.
Umgekehrt belichtet ein gegebener Zyklus die Hälfte des Bereichs, der in dem vorhergehenden Zyklus nicht belichtet wurde und belichtet die Hälfte des Bereichs nicht, der in einem vorhergehenden Zyklus nicht belichtet wurde.
In der Synthesestrategie beträgt die größte Länge (l) des synthetisierten Polymers l = n/a, wobei n die Zahl der Zyklen und a die Zahl der chemischen Synthesebausteine ist (beachte, dass ein gegebener Synthesebaustein wiederholt werden kann).
Die Synthesestrategie wird am einfachsten in Matrixschreibweise veranschaulicht und gehandhabt. An jeder Synthesestelle ist die Bestimmung, ob ein gegebenes Monomer zugesetzt werden soll, ein binärer Vorgang. Daher ist jedes Produktelement Pj durch das Skalarprodukt zweier Vektoren gegeben, einem chemischen Reaktantvektor, z. B. C = [A, B, C, D] und einem binären Vektor 6j. Die Untersuchung der Produkte in dem nachstehenden Beispiel für eine vierstufige Synthese zeigt, dass in einer vierstufigen Synthese σ&sub1; = [1, 0, 1, 0], σ&sub2; = [1, 0, 0, 1], σ&sub3; = [4, 1, 1, 0] und σ&sub4; = [0, 1, 0, 1] ist, wobei 1 eine Belichtung und 0 keine Belichtung bedeutet.
So wird es möglich, aus den Spaltenvektoren σj (j = 1, k, wobei k die Anzahl der Produkte ist) eine "Schaltmatrix" S zu bilden.
Das Resultat P einer Synthese ist einfach P = CS, das Produkt der chemischen Reaktantmatrix und der Schaltmatrix.
Die Schaltmatrix für eine Synthese mit n Zyklen, die zu k Produkten führt, weist n Zeilen und k Spalten auf. Ein wichtiges Merkmal von S ist, dass jede Zeile eine Maske spezifiziert. Eine zweidimensionale Maske mj für den j-ten chemischen Schritt einer Synthese wird direkt aus der j-ten Zeile von S erhalten, und zwar dadurch, dass die Elemente sj1, ... sjk beispielsweise in einem quadratischen Format angeordnet werden. Die nachstehend angegebene besondere Anordnung liefert ein quadratisches Format. Es können jedoch auch lineare oder andere Anordnungen eingesetzt werden.
Natürlich können Verbindungen, die in einer mit Licht aktivierten Synthese hergestellt worden sind, in einer beliebigen definierten geometrischen Gruppierung angeordnet werden. Eine quadratische oder rechteckige Matrix ist zweckmäßig, aber nicht erforderlich. Die Zeilen der Schaltmatrix können in eine beliebige zweckmäßige Gruppierung transformiert werden, solange für jede Zeile äquivalente Transformationen verwendet werden.
Beispielsweise werden die Masken in der nachstehend angegebenen vierstufigen Synthese durch
bezeichnet, wobei 1 eine Belichtung (Aktivierung) und 0 keine Belichtung bedeutet.
Die Matrixdarstellung kann verwendet werden, um einen gewünschten Satz von Produkten und Produktkartierungen zu erzeugen. Jede Verbindung ist durch das Produkt des chemischen Vektors und eines speziellen Schaltvektors definiert. Daher speichert man für jede Syntheseadresse einfach den Schaltvektor, ordnet alle Schaltvektoren in einer Schaltmatrix an und entnimmt jede der Zeilen, um die Masken zu bilden.
In manchen Fällen sind spezielle Produktverteilungen oder eine maximale Anzahl von Produkten gewünscht. Beispielsweise besteht für C = [A, B, C, D] jeder beliebige Schaltvektor (c) aus vier Bits. Es gibt sechzehn vier-Bit-Vektoren. Daher können durch die aufeinanderfolgende Zugabe der Reagenzien [A, B, C, D] maximal 16 verschiedene Produkte hergestellt werden. Die 16 Spaltenvektoren können auf 16 verschiedene Arten unter Bildung einer Schaltmatrix angeordnet werden. Die Reihenfolge der Spaltenvektoren definiert die Maskierungsmuster und daher die räumliche Anordnung der Produkte, jedoch nicht ihre Zusammensetzung. Eine Anordnung dieser Spalten ergibt die nachstehende Schaltmatrix (in der aus Gründen der Vollständigkeit "Null" ( ) -Additionen in Klammern angegeben sind, obwohl solche Null-Additionen an anderer Stelle in dieser Patentschrift nicht angegeben sind):
Gemäß dieses Beispiels sind die Spalten von S die binären Darstellungen der Zahlen 15 bis 0. Die 16 Produkte dieser binären Synthese sind ABCD, ABC, ABD, AB, ACD, AC, AD, A, BCD, BC, BD, B, CD, C, D und (null). Es sollte auch beachtet werden, dass jeder der Schaltvektoren aus den vorstehenden vierstufigen Synthesemasken (und damit die Syntheseprodukte) in der binären vier-Bit-Schaltmatrix vorliegen (vgl. Spalten 6, 7, 10 und 11).
Dieses Syntheseverfahren stellt einen einfachen Weg zur Kartierung der fertiggestellten Produkte bereit. Die Produkte an den verschiedenen Positionen auf dem Träger werden einfach durch die Spalten der Schaltmatrix definiert (wobei die erste Spalte beispielsweise angibt, dass das Produkt ABCD an der linken oberen Position des Trägers vorliegen wird). Ferner kann, wenn lediglich ausgewählte gewünschte Produkte hergestellt werden sollen, die Maskensequenz durch Entnehmen der Spalten mit den geeigneten Sequenzen abgeleitet werden. Um beispielsweise den Produktsatz ABCD, ABD, ACD, AD, BCD, BD, CD und D zu bilden, werden die Masken unter Verwendung einer Schaltmatrix gebildet, bei der lediglich die 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13. und 15 Spalte als Schaltmatrix angeordnet sind:
Um alle Polymere der Länge 4 zu bilden, wird die Reaktantmatrix [ABGDABCDABCDABCD] verwendet. Die Schaltmatrix wird aus einer Matrix der in Spalten angeordneten binären Zahlen 0 bis 2¹&sup6; gebildet. Die Spalten mit 4 Monomeren werden dann ausgewählt und in einer Schaltmatrix angeordnet. Daraus ist ersichtlich, dass die binäre Schaltmatrix im Allgemeinen eine Darstellung aller Produkte liefert, die bei einer n-stufigen Synthese hergestellt werden können, von der die gewünschten Produkte dann entnommen werden.
Die Zeilen der binären Schaltmatrix werden in bevorzugten Ausführungsformen die Eigenschaft aufweisen, das bei jedem Maskierungsschritt die Hälfte des Synthesebereichs belichtet wird. Jeder Maskierungsschritt faktorisiert auch den vorhergehenden Maskierungsschritt, d. h., die Hälfte des Bereichs, der in dem vorhergehenden Schritt belichtet worden ist, wird erneut belichtet, wohingegen die andere Hälfte nicht belichtet wird. Die Hälfte des Bereichs, der im vorhergehenden Schritt nicht belichtet wurde, wird auch belichtet, wohingegen die andere Hälfte nicht belichtet wird. Demgemäß ist der Maskierungsvorgang rekursiv. Die Masken werden wie vorstehend beschrieben dadurch aufgebaut, dass die Elemente jeder Zeile entnommen und quadratisch gruppiert werden. Beispielsweise sind die vier Masken in S für eine vierstufige Synthese:
Durch die rekursive Faktorisierung der Masken können die Produkte einer lichtgesteuerten Synthese als Polynom dargestellt werden. (Einige mit Licht aktivierte Synthesen können nur durch irreduzible, d. h. durch Primpolynome dargestellt werden.) Beispielsweise ist das der in Fig. 8a (nachstehend erläutert) oben abgebildeten Synthese entsprechende Polynom
P = (A + B)(C + D)
Ein Reaktionspolynom kann so zerlegt werden, als ob es ein algebraischer Ausdruck wäre, mit der Maßgabe, dass die Reihenfolge der Verbindung der Reaktanten X&sub1; und X&sub2; beibehalten wird (X&sub1;X&sub2; ≠ X&sub2;X&sub1;), d. h., die Produkte sind nicht kommutativ. Das Produkt ist also AC + AD + BC + BD. Das Polynom spezifiziert die Reaktanten für jeden Schritt explizit und die Masken für jeden Schritt implizit. Jedes Klammerpaar steht für einen Synthesedurchgang. Die chemischen Reaktanten eines Durchgangs (z. B A und B) reagieren an nichtüberlappenden Steilen und können damit nicht mit sich selbst reagieren. Der Synthesebereich ist gleichmäßig unter den Elementen eines Durchgangs aufgeteilt (z. B. A ist einer Hälfte des Bereichs und B der anderen Hälfte zugewiesen). Folglich sind die Masken für einen Durchgang (z. B. die Masken mA und mB) orthogonal und bilden einen orthonormalen Satz. Die Polynomschreibweise zeigt auch, dass jedes Element in einem Durchgang mit jedem Element des nächsten Durchgangs verbunden werden soll (z. B. A mit C, A mit D, B mit C und B mit D). Dies wird dadurch erreicht, dass mC gleichermaßen mA und mB überlappt und entsprechendes gilt für mD. Da C und D Elemente eines Durchgangs sind, sind mC und mD orthogonal zueinander und bilden einen orthonormalen Satz.
Die Polynomdarstellung der vorstehend beschriebenen binären Synthese, bei der 16 Produkte aus 4 Reaktanten hergestellt werden, ist:
P = (A + )(B + )(C + )(D + )
was zu ABCD, ABC, ABD, AB, ACD, AC, AD, A, BCD, BC, BD, B, CD, C, D und führt, falls zerlegt wird (mit der Regel, dass X = X und X = X ist und unter Berücksichtigung, dass das Verbinden geordnet stattfindet). In einer binären Synthese enthält jeder Durchgang einen Reaktanten und eine Null (mit dargestellt). Die Hälfte des Synthesebereichs nimmt den Reaktanten auf und die andere Hälfte bleibt leer. Jede Maske überlappt jede andere Maske in gleicher Weise.
Binäre Durchgänge und nicht-binäre Durchgänge können gegebenenfalls gemischt werden, wie z. B. in
P = (A + )(B)(C + D + )(E + F + G).
Die 18 gebildeten Verbindungen sind ABCE, ABCF, ABCG, ABDE, ABDF, ABDG, ABE, ABF, ABG, BCE, BCF, BCG, BDE, BDF, BDG, BE, BF und BG. Die Schaltmatrix S für diese 7-stufige Synthese ist
Der mit (B) bezeichnete Durchgang bringt B in alle Produkte ein, da der Reaktionsbereich einheitlich aktiviert worden ist (die Maske für B bestand vollständig aus der Zahl 1).
Die Anzahl von Verbindungen k, die in einer Synthese mit r Durchgängen gebildet werden, wobei der i-te Durchgang bi chemische Reaktanten und zi Nullen aufweist, ist
k = Σ(bi + zi)
und die Anzahl der chemischen Schritte n ist
n = Σbi
Die Anzahl der synthetisierten Verbindungen, wenn b = a (die Anzahl der chemischen Synthesebausteine) und z = 0 ist, beträgt an/a, verglichen mit 2n für eine binäre Synthese. Für n = 20 und a = 5 würden 625 Verbindungen (alles Tetramere) gebildet werden, verglichen mit 1,049 · 10&sup6; Verbindungen in einer binären Synthese mit der gleichen Anzahl chemischer Schritte.
Es sollte auch angemerkt werden, dass Durchgänge in einem Polynom ineinander verschachtelt werden können, wie z. B. in
(A + (B + )(C + ))(D + )
Die Produkte sind AD, BCD, BD, CD, D, A, BC, B, C und .
Binäre Synthesen sind aus zwei Gründen attraktiv. Erstens erzeugen sie die maximale Anzahl von Produkten (2n) für eine gegebene Anzahl von chemischen Schritten (n). Bei vier Reaktanten werden bei der binären Synthese 16 Verbindungen gebildet, während lediglich 4 gebildet werden, wenn jeder Durchgang 2 Reaktanten aufweist. Eine 10-stufige binäre Synthese führt zu 1024 Verbindungen und eine 20-stufige Synthese führt zu 1048576 Verbindungen. Zweitens sind Produkte, die in einer binären Synthese gebildet worden sind, ein vollständig ineinander verschachtelter Satz mit Längen im Bereich von 0 bis n. Alle Verbindungen, die durch Entfernen einer oder mehrerer Einheiten von dem längsten Produkt (dem n-mer) gebildet werden können, liegen vor. In dem binären Satz sind die kleineren Sätze enthalten, die aus denselben Reaktanten unter Verwendung beliebiger anderer Maskensätze (z. B. liegen AC, AD, BC und BD, die in der in Fig. 5 gezeigten Synthese gebildet werden, in dem Satz der 16 in der binären Synthese gebildeten Verbindungen vor) gebildet würden. In manchen Fällen kann jedoch die experimentell erreichbare räumliche Auflösung nicht ausreichen, um alle gebildeten Verbindungen aufzunehmen. Daher können es Beschränkungen in der Praxis erfordern, dass ein spezieller Untersatz der möglichen Schaltvektoren für eine gegebene Synthese ausgewählt wird.

1. Beispiel

Fig. 5 veranschaulicht eine Synthese mit einer binären Maskierungsstrategie. Die binäre Maskierungsstrategie stellt die größte Anzahl von Sequenzen für eine gegebene Anzahl von Zyklen bereit. Gemäß diesem Beispiel erlaubt eine Maske ml die Belichtung der Hälfte des Trägers. Der Träger wird dann mit dem Synthesebaustein A in Kontakt gebracht, der an den belichteten Bereichen bindet.
Danach erlaubt die Maske m&sub2; die Belichtung der Hälfte des vorher belichteten Bereichs, während sie keine Belichtung der Hälfte des vorher belichteten Bereichs zulässt. Dann wird der Synthesebaustein B zugegeben, der an den belichteten Bereichen von m&sub2; bindet.
Das Verfahren setzt sich mit den Masken m&sub3;, m&sub4; und m&sub5; fort, was zu der in dem unteren Abschnitt der Figur gezeigten Produktgruppierung führt. Das Verfahren erzeugt 32 (2 potenziert mit der Anzahl der Monomeren) Sequenzen mit 5 (der Anzahl der Monomeren) Zyklen.

2. Beispiel

Fig. 6 veranschaulicht eine weitere bevorzugte binäre Maskierungsstrategie, die hier als Graucode-Maskierungsstrategie bezeichnet wird. Gemäß diesem Beispiel werden die Masken ml bis m&sub5; so ausgewählt, dass eine Seite eines gegebenen Synthesebereichs durch die Kante von lediglich einer Maske definiert wird. Die rechte Kante der Stelle, an der beispielsweise die Sequenz BCDE gebildet wird, wird durch m&sub5; definiert und deren linke Seite wird von der Maske m&sub4; gebildet (und keine andere Maske ist an den Seiten dieser Stelle entlang angeordnet). Demgemäß werden Probleme, die durch eine schlechte Ausrichtung, Diffusion von Licht unter der Maske und dergleiche minimiert.

3. Beispiel

Fig. 7 veranschaulicht eine weitere binäre Maskierungsstrategie. Gemäß diesem Schema, das hier als modifizierte Graucode-Maskierungsstrategie bezeichnet wird, wird die Anzahl der erforderlichen Masken minimiert. Beispielsweise könnte die Maske m&sub2; mit der Maske ml identisch sein und einfach lateral verschoben werden. Entsprechend könnte die Maske m&sub4; mit der Maske m&sub3; identisch sein und einfach lateral verschoben werden.

4. Beispiel

In Fig. 8a ist eine vierstufige Synthese gezeigt. Die Reaktanten sind der geordnete Satz {A, B, C, D}. Im ersten Zyklus aktiviert die Belichtung durch ml die obere Hälfte des Synthesebereichs. Der Synthesebaustein A wird dann zugesetzt, wobei die Verteilung 602 erhalten wird. Die Belichtung durch die Maske m&sub2; (welche die untere Hälfte aktiviert), gefolgt von der Zugabe von B ergibt die nächste Zwischenverteilung 604. Nach der Belichtung durch m&sub3; (welche die linke Hälfte aktiviert) wird C zugesetzt, wobei die Verteilung 604 5 erhalten wird. Nach der Belichtung durch m&sub4; (welche die rechte Hälfte aktiviert) wird D zugesetzt, wobei das Endproduktmuster 608 {AC, AD, BC, BD} erhalten wird.

5. Beispiel

Die vorstehende Maskierungsstrategie für die Synthese kann für alle 400 Dipeptide aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren erweitert werden, wie es in Fig. 8b gezeigt ist. Die Synthese besteht aus zwei Durchgängen mit 20 Photolyse- und chemischen Kopplungszyklen pro Durchgang. In dem ersten Zyklus von Durchgang 1 aktiviert Maske 1 1/20 des Trägers für die Kopplung mit der ersten der 20 Aminosäuren. Neunzehn nachfolgende Belichtungs-/Kopplungszyklen in dem Durchgang 1 ergeben einen Träger, der aus 20 rechteckigen Streifen besteht, die jeweils eine bestimmte Aminosäure der 20 Aminosäuren aufweist. Die Masken von Durchgang 2 sind orthogonal zu den Masken des Durchgangs 1. Daher führt ein einzelner Belichtungs-/Kopplungszyklus im Durchgang 2 zu 20 Dipeptiden. Die 20 Belichtungs-/Kopplungszyklen von Durchgang 2 vervollständigen die Synthese der 400 Dipeptide.

6. Beispiel

Die Leistungsfähigkeit der binären Maskierungsstrategie zeigt sich durch das Ergebnis einer 10-stufigen Synthese, die zu 1024 Peptiden führte. Der Polynomausdruck für diese 10- stufige binäre Synthese lautete:
(f + )(Y + ) (G + ) (A + ) (G + ) (T + ) (F + ) (L + ) (S + ) (F + )
Jedes Peptid belegte ein Quadrat mit den Abmessungen 400 · 400 um. Eine Gruppierung mit 32 · 32 Peptiden (1024 Peptide, einschließlich der Null-Peptide und 10 Peptiden mit l = 1 und einer begrenzten Anzahl von Duplikaten) zeigte sich deutlich in einem Fluoreszenz- Scan, der nach der Entschützung der Seitengruppen und der Behandlung mit dem Antikörper 3E7 und fluoresceiniertem Antikörper durchgeführt worden ist. Jede Synthesestelle war ein Quadrat mit den Abmessungen 400 · 400 um.
Der Scan zeigte einen Bereich von Fluoreszenzintensitäten bezüglich eines Hintergrundwertes von 3300 Zählungen zu 22400 Zählungen im hellsten Quadrat (x = 20, y = 9). Lediglich 15 Verbindungen zeigten eine Intensität, die größer war als 12300 Zählungen. Der Mittelwert der Gruppierung war 4800 Zählungen.
Die Identität jedes Peptids in der Gruppierung könnte aus ihren x- und y-Koordinaten (jeweils von 0 bis 31) und der Karte von Fig. 9 bestimmt werden. Die chemischen Einheiten an den Positionen 2, 5, 6, 9 und 10 werden durch die y-Koordinate und diejenigen an den Positionen 1, 3, 4, 7, 8 durch die x-Koordinate spezifiziert. Alle Peptide bis auf eines waren kürzer als 10 Reste. Beispielsweise ist das Peptid bei x = 12 und y = 3 YGAGF (SEQ ID NO: 3; Positionen 1, 6, 8, 9 und 10 sind Nullen). YGAFLS (SEQ ID NO: 4), das hellste Element der Gruppierung, liegt bei x = 20 und y = 9.
Es ist häufig erwünscht, eine Bindungsaffinität eines gegebenen Peptids aus der gemessenen Fluoreszenzintensität abzuleiten. Der einfachste Fall ist dabei ein Fall, bei dem ein einzelnes Peptid an ein univalentes Antikörpermolekül bindet. Der Fluoreszenz-Scan wird durchgeführt, nachdem der Objektträger für einen definierten Zeitraum mit Puffer gewaschen worden ist. Die Größenordnung der Fluoreszenzintensitäten wird dann in erster Linie aus den relativen Dissoziationsgeschwindigkeiten der Antikörper-Peptid-Komplexe bestimmt. Wenn die Geschwindigkeitskonstanten gleich sind (wenn sie z. B. diffusionskontrolliert sind), wird die Größenordnung der Fluoreszenzintensitäten typischerweise der Größenordnung der Bindungsaffinitäten entsprechen. Die Situation ist jedoch manchmal komplexer, da ein bivalenter primärer Antikörper und ein bivalenter sekundärer Antikörper verwendet werden. Die Peptiddichte in einem Synthesebereich entsprach einer mittleren Trennung von etwa 7 nm, was multivalente Antikörper-Peptid- Wechselwirkungen zuließe. Daher werden gemäß dem hier beschriebenen Verfahren erhaltene Fluoreszenzintensitäten häufig ein qualitativer Indikator für die Bindungsaffinität sein.
Eine weitere wichtige Erwägung ist die Genauigkeit der Synthese. Deletionen werden durch unvollständiges Entschützen mit Licht oder eine unvollständige Kopplung erzeugt. Die Kopplungsausbeute pro Zyklus liegt bei diesen Experimenten typischerweise zwischen 85 und 95%. Die Implementierung der Schaltmatrix durch Maskierung ist aufgrund von Lichtbeugung, interner Reflexion und Streuung nicht perfekt. Demzufolge ergeben sich bei unbeabsichtigter Belichtung von Bereichen, die Dunkel sein sollten, "blinde Passagiere" (chemische Einheiten, die nicht vorhanden sein sollten). Eine binäre Synthesegruppierung enthält viele Kontrollen, die benötigt werden, um die Genauigkeit einer Synthese zu bewerten. Beispielsweise könnte das Fluoreszenzsignal von einem Synthesebereich, der nominell ein Tetrapeptid ABCD enthält, von einer Tripeptid-Deletionsverunreinigung wie z. B. ACD herrühren. Ein derartiges Artefakt würde durch den Befund ausgeschlossen werden, dass die Fluoreszenzintensität der ACD-Stelle geringer ist als die der ABCD-Stelle.
Die 15 am stärksten fluoreszierenden Peptide in der durch die vorstehend beschriebene Synthese von 1024 Peptiden erhaltenen Gruppierung waren YGAFLS (SEQ ID NO: 4), YGAFS (SEQ ID NO: 5), YGAFL (SEQ ID NO: 6), YGGFLS (SEQ ID NO: 7), YGAF (SEQ ID NO: 8), YGALS (SEQ ID NO: 9), YGGFS (SEQ ID NO: 10), YGAL (SEQ ID NO: 11), YGAFLF (SEQ ID NO: 12), YGAF (SEQ ID NO: 8), YGAFF (SEQ ID NO: 13), YGGLS (SEQ ID NO: 14), YGGFL (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 15), YGAFSF (SEQ ID NO: 16) und YGAFLSF (SEQ ID NO: 17). Ein erstaunliches Merkmal ist, das alle fünfzehn mit YG beginnen, was mit vorhergehenden Arbeiten übereinstimmt, die zeigen, dass ein Tyrosin am Amino-Terminus eine Schlüsseldeterminante des Bindens an 3E7 ist. Der Rest 3 dieses Satzes ist entweder A oder G und der Rest 4 ist entweder F oder L. Der Ausschluss von S und T aus diesen Positionen ist scharf. Der Befund, dass die bevorzugte Sequenz YG (A/G) (F/L) ist, stimmt gut mit dem Ergebnis einer Studie überein, in der eine sehr große Bibliothek von Peptiden auf Phagen, die durch rekombinante DNA-Verfahren erzeugt worden ist, bezüglich der Bindung an den Antikörper 3E7 gescreent worden ist (vgl. Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87, 6378).
Zusätzliche binäre Synthesen auf der Basis von Leadverbindungen aus Peptid-auf-Phage- Experimenten zeigten, dass YGAFMQ (SEQ ID NO: 18), YGAFM (SEQ ID NO: 19) und YGAFQ (SEQ ID NO: 20) stärkere Fluoreszenzsignale als YGGFM (SEQ ID NO: 21), das Immunogen, das zur Herstellung des Antikörpers 3E7 verwendet wurde, ergeben.
Variationen der vorstehenden Maskierungsstrategie werden unter bestimmten Umständen wertvoll sein. Wenn eine interessierende "Kern"-Sequenz beispielsweise aus PQR besteht, das von XYZ getrennt ist, ist das Ziel, Peptide zu synthetisieren, in welchen diese Einheiten durch eine variable Anzahl verschiedener Reste getrennt sind. Der Kern kann in jedes Peptid unter Verwendung einer Maske plaziert werden, die an jeder Stelle 1 aufweist. Die Polynomdarstellung einer geeigneten Synthese ist:
(P) (Q) (R) (A + ) (B + ) (C + ) (D + ) (X) (Y) (Z)
Es werden 16 Peptide gebildet, die eine Länge im Bereich des 6-mers PQRXYZ und des 10- mers PQRABCDXYZ aufweisen.
Unter bestimmten Umständen werden auch verschiedene andere Maskierungsstrategien von Wert sein. Durch mehrmalige Verwendung einer bestimmten Maske werden zwei oder mehr Reaktanten im gleichen Produktsatz erscheinen. Wenn beispielsweise angenommen wird, dass die Maske für eine 8-stufige Synthese
A 11110000
B 00001111
C 11001100
D 00110011
E 10101010
F 01010201
G 11110000
H 00001111
lautet, dann sind die Produkte ACEG, ACFG, ADEG, ADFG, BCEH, BCFH, BDEH und BDFH. A und G erscheinen immer im selben Produkt, obwohl nicht notwendigerweise benachbart, da ihre Additionen von der selben Maske kontrolliert worden sind, wobei entsprechendes für B und H gilt.

C. Linker-Auswahl

Die als Zwischenstück zwischen den synthetisierten Polymeren und dem Träger verwendeten Linker-Moleküle werden vorzugsweise bezüglich der optimalen Länge und/oder des optimalen Typs für eine verbesserte Bindungswechselwirkung mit einem Rezeptor ausgewählt. Diverse Linker verschiedener Länge und/oder verschiedenen Typs werden für eine nachfolgende Anbindung eines Liganden synthetisiert. Durch Variationen der Länge des Linkers und des Linker-Typs wird es möglich, die Bindungswechselwirkung zwischen einem immobilisierten Liganden und dessen Rezeptor zu optimieren.
Wenn einer der Partner auf einem Träger immobilisiert ist, wird der Grad der Bindung zwischen einem Liganden (Peptid, Hemmstoff, Hapten, Arzneistoff, usw.) und dessen Rezeptor (Enzym, Antikörper, usw.) in manchen Fällen von der Zugänglichkeit des Rezeptors in Lösung zu dem immobilisierten Liganden abhängen. Die Zugänglichkeit wiederum wird von der Länge und/oder dem Typ des Linker-Moleküls abhängen, das zur Immobilisierung eines der Partner verwendet worden ist. Die VLSIPS-Technologie wird daher vorzugsweise eingesetzt, um eine Gruppierung von vorzugsweise inaktiven oder inerten Linkem mit verschiedener Länge und/oder verschiedenen Typs unter Verwendung von photochemischen Schutzgruppen zu erzeugen, um selektiv verschiedene Bereiche des Trägers zu belichten und darauf chemisch aktive Gruppen zu bilden.
In der einfachsten Ausführungsform dieses Konzeptes wird dieselbe Einheit in verschiedener Anzahl oder verschiedenen Längen an bekannten Stellen mittels VLSIPS-Techniken auf dem Träger gebunden, um eine Gruppierung von Polymeren verschiedener Länge zu erzeugen. Ein einzelner Ligand (Peptid, Arzneistoff, Hapten, usw.) wird an jedes davon gebunden und es wird ein Assay mit der Bindungsstelle durchgeführt, um den Bindungsgrad mit einem Rezeptor zu bewerten, von dem bekannt ist, dass er an den Liganden bindet. In Fällen, bei denen die Länge des Linkers die Fähigkeit des Rezeptors beeinflusst, an den Liganden zu binden, werden verschiedene Bindungsstärken beobachtet werden. Im Allgemeinen wird derjenige Linker, der am stärksten bindet, dann verwendet werden, um andere Liganden zu testen, die gemäß den hier beschriebenen Techniken synthetisiert worden sind.
Das Binden zwischen einem einzelnen Ligand-/Rezeptor-Paar kann für Linker mit verschiedenen Monomersequenzen bewertet werden. Linker werden gemäß den hier beschriebenen Techniken in einer Gruppierung synthetisiert und weisen verschiedene Monomersequenzen (und gegebenenfalls verschiedene Längen) auf. Danach werden alle Linker-Moleküle mit einem Liganden versehen, von dem bekannt ist, dass er zumindest eine gewisse Bindungsaffinität für einen gegebenen Rezeptor aufweist. Der gegebene Rezeptor wird dann mit dem Liganden in Kontakt gebracht und die Bindungsaffinität wird bestimmt. Linker-Moleküle, die eine angemessene Bindung zwischen dem Liganden und dem Rezeptor liefern, werden dann in Screening-Studien verwendet.

D. Schutzclruppen

Wie es vorstehend diskutiert worden ist, erlauben selektiv entfernbare Schutzgruppen die Erzeugung genau definierter Bereiche auf einer Trägeroberfläche mit verschiedenen Reaktivitäten. Vorzugsweise werden die Schutzgruppen von der Oberfläche dadurch selektiv entfernt, dass ein spezieller Aktivator verwendet wird, wie z. B. eine elektromagnetische Strahlung einer spezifischen Wellenlänge und Intensität. Insbesondere belichtet der spezifische Aktivator ausgewählte Bereiche der Oberfläche, um die Schutzgruppen in den belichteten Bereichen zu entfernen.
Schutzgruppen werden in Verbindung mit Festphasen-Oligomersynthesen verwendet, wie z. B. Peptidsynthesen unter Verwendung natürlicher oder nicht-natürlicher Aminosäuren, Nucleotidsynthesen unter Verwendung von Desoxyribonuclein- und Ribonucleinsäuren, Oligosaccharidsynthesen und dergleichen. Zusätzlich zu dem Schutz der Trägeroberfläche vor unerwünschten Reaktionen blockieren die Schutzgruppen ein reaktives Ende des Monomers, um eine Autopolymerisation zu verhindern. Beispielsweise bewahrt das Binden einer Schutzgruppe an die endständige Aminogruppe einer aktivierten Aminosäure wie z. B. einen N-Hydroxysuccinimid-aktivierten Ester der Aminosäure, die endständige Aminogruppe eines Monomers davor, während der Peptidsynthese mit dem aktivierten Esterabschnitt eines anderen Monomers zu reagieren.
Alternativ kann die Schutzgruppe an die Carboxylgruppe einer Aminosäure gebunden werden, um eine Reaktion an dieser Stelle zu verhindern. Die meisten Schutzgruppen können entweder an die Amino- oder an die Carboxylgruppe einer Aminosäure gebunden werden und die Natur der chemischen Synthese wird bestimmen, welche reaktive Gruppe eine Schutzgruppe erfordert. Analog dazu bewahrt die Bindung einer Schutzgruppe an die 5'-Hydroxylgruppe eines Nucleosids während der Synthese unter Verwendung von beispielsweise einer Phosphattriester-Kopplungschemie die 5'-Hydroxylgruppe eines Nucleosids davor, mit dem 3'-aktivierten Phosphattriester eines anderen Nucleosids zu reagieren.
Ungeachtet der spezifischen Anwendung werden Schutzgruppen verwendet, um einen Rest eines Moleküls vor der Reaktion mit einem anderen Reagenz zu bewahren. Schutzgruppen haben die folgenden Eigenschaften: Sie verhindern, dass ausgewählte Reagenzien die Gruppe, an die sie gebunden sind, verändern; sie sind gegenüber den Synthesebedingungen stabil (d. h., sie bleiben am Molekül gebunden); sie sind unter Bedingungen entfernbar, welche die verbleibende Struktur nicht nachteilig beeinflussen; und sie reagieren nicht nennenswert mit der Oberfläche oder dem an die Oberfläche gebundenen Oligomer, sobald sie entfernt worden sind. Die Auswahl einer geeigneten Schutzgruppe wird natürlich von der chemischen Natur der Monomereinheit und dem Oligomer abhängen sowie von den speziellen Reagenzien, gegen die sie schützen sollen.
Vorzugsweise sind die Schutzgruppen mit Licht aktivierbar. Die Eigenschaften und die Verwendungen photoreaktiver Schutzverbindungen wurden in einem Übersichtsartikel zusammengestellt, vgl. McCray et al., Ann. Rev. of Biophys. and Biophys. Chem. (1989), 18, 239-270).
Vorzugsweise können die lichtempfindlichen Schutzgruppen durch Strahlung im ultravioletten (UV) oder sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums entfernt werden. Mehr bevorzugt können die Schutzgruppen durch Strahlung im nahen UV-Bereich oder im sichtbaren Bereich des Spektrums entfernt werden. Die Aktivierung kann jedoch auch durch andere Verfahren wie einem örtlich begrenzten Erhitzen, Efektronenstrahllithographie, Laserpumpen, Oxidation oder Reduktion mit Mikroelektroden und dergleichen durchgeführt werden. Sulfonylverbindungen sind geeignete reaktive Gruppen für die Elektronenstrahllithographie. Die oxidative oder reduktive Entfernung wird dadurch erreicht, dass die Schutzgruppe vorzugsweise unter Verwendung von Mikroelektroden, die auf die vorbestimmten Bereiche der zu aktivierenden Oberfläche gerichtet sind, einer elektrischen Stromquelle ausgesetzt wird. Es können auch andere Verfahren eingesetzt werden.
Viele, wenn auch nicht alle mit Licht entfernbaren Schutzgruppen werden aromatische Verbindungen sein, die im nahen UV-Bereich und im Bereich sichtbarer Strahlung absorbieren. Geeignete mit Licht entfernbare Schutzgruppen sind beispielsweise in McCray et al., Patchornik, J. Amer. Chem. Soc. (1970), 92, 6333 und Amit et al., J. Org. Chem. (1974), 39, 192 beschrieben.
Eine bevorzugte Klasse von mit Licht entfernbaren Schutzgruppen hat die allgemeine Formel
worin R¹, R², R³ und R&sup4; unabhängig ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe, eine Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido- oder Phosphidogruppe sind, oder benachbarte Substituenten (d. h., R¹-R², R²-R³, R³-R&sup4;) sind substituierte Sauerstoffgruppen, die zusammen ein cyclisches Acetal oder Ketal bilden; R&sup5; ist eine Alkoxyl-, Alkyl-, Halogen-, Aryl- oder Alkenylgruppe und n hat den Wert 0 oder 1.
Eine bevorzugte Schutzgruppe, 6-Nitroveratryl (NV), die zum Schutz der endständigen Carboxylgruppe einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nucleotids verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R² und R³ jeweils eine Methoxygruppe, R¹, R&sup4; und R&sup5; jeweils Wasserstoffatome sind und n den Wert 0 hat:
Eine bevorzugte Schutzgruppe, 6-Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), die zum Schutz der endständigen Aminogruppe einer Aminosäure verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R² und R³ jeweils eine Methoxygruppe, R¹, R&sup4; und R&sup5; jeweils Wasserstoffatome sind und n den Wert 1 hat:
Eine weitere bevorzugte Schutzgruppe, 6-Nitropiperonyl (NP), die zum Schutz der endständigen Carboxylgruppe einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nucleotids verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R² und R³ zusammen ein Methylenacetal bilden, R&sup4;, R&sup4; und R&sup5; jeweils Wasserstoffatome sind und n den Wert 0 hat:
Eine weitere bevorzugte Schutzgruppe, 6-Nitropiperonyloxycarbonyl (NPOC), die zum Schutz der endständigen Aminogruppe einer Aminosäure verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R² und R³ zusammen ein Methylenacetal bilden, R¹, R&sup4; und R&sup5; jeweils Wasserstoffatome sind und n den Wert 1 hat:
Eine am meisten bevorzugte Schutzgruppe, Methyl-6-nitroveratryl (MeNV), die zum Schutz der endständigen Carboxylgruppe einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nucleotids verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R² und R³ jeweils eine Methoxygruppe sind, R¹ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom ist, R&sup5; eine Methylgruppe ist und n den Wert 0 hat:
Eine weitere am meisten bevorzugte Schutzgruppe, Methyl-6-nitroveratryloxycarbonyl (MeNVOC), die zum Schutz der endständigen Aminogruppe einer Aminosäure verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R² und R³ jeweils eine Methoxygruppe sind, R¹ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom ist, R&sup5; eine Methylgruppe ist und n den Wert 1 hat:
Eine weitere am meisten bevorzugte Schutzgruppe, Methyl-6-nitropiperonyl (MeNP), die zum Schutz der endständigen Carboxylgruppe einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nucleotids verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R² und R³ zusammen ein Methylenacetal bilden, R¹ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom ist, R&sup5; eine Methylgruppe ist und n den Wert 0 hat:
Eine weitere am meisten bevorzugte Schutzgruppe, Methyl-6-nitropiperonyloxycarbonyl (MeNPOC), die zum Schutz der endständigen Aminogruppe einer Aminosäure oder der 5- Hydroxylgruppe von Nucleosiden verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R² und R³ zusammen ein Methylenacetal bilden, R¹ und R&sup4; jeweils ein Wasserstoffatom ist, R&sup5; eine Methylgruppe ist und n den Wert 1 hat:
Eine geschützte Aminosäure mit einer photoaktivierbaren Oxycarbonylschutzgruppe wie NVOC oder NPOC oder deren entsprechende Methylderivate MeNVOC bzw. MeNPOC an der endständigen Aminogruppe wird durch Acylieren des Amins der Aminosäure mit einem aktivierten Oxycarbonylester der Schutzgruppe gebildet. Beispiele für aktivierte Oxycarbonylester von NVOC und MeNVOC haben dies allgemeine Formel:
worin X ein Halogenatom, ein gemischtes Anhydrid, eine Phenoxy-, p-Nitrophenoxy-, N- Hydroxysuccinimidgruppe und dergleichen ist.
Eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Nucleotid mit einer photoaktivierbaren Schutzgruppe wie z. B. NV oder NP oder deren entsprechende Methylderivate MeNV bzw. MeNP an der endständigen Carboxylgruppe der Aminosäure oder an der endständigen 5'- Hydroxylgruppe des Nucleotids wird durch Acylieren der endständigen Carboxylgruppe oder der 5'-OH-Gruppe mit einem aktivierten Benzylderivat der Schutzgruppe gebildet. Beispiele für aktivierte Benzylderivate von MeNV und MeNP haben die allgemeinen Formeln:
worin X ein Halogenatom, eine Hydroxyl-, Tosyl-, Mesyl-, Trifluormethyl-, Diazo-, Azidogruppe und dergleichen ist.
Ein weiteres Verfahren zur Erzeugung geschützter Monomere ist die Umsetzung des Benzylalkoholderivates der Schutzgruppe mit einem aktivierten Ester des Monomers. Um beispielsweise die endständige Carboxylgruppe einer Aminosäure zu schützen, wird ein aktivierter Ester der Aminosäure mit dem Alkoholderivat der Schutzgruppe, wie z. B. 6- Nitroveratrol (NVOH) umgesetzt. Beispiele für aktivierte Ester, die für eine solche Verwendung geeignet sind, umfassen Halogenformiat, ein gemischtes Anhydrid, Imidazoylformiat, Acylhalogenid und umfassen auch die Bildung des aktivierten Esters in situ unter Verwendung gewöhnlicher Reagenzien wie z. B. DCC und dergleichen, vgl. Atherton et al. für weitere Beispiele aktivierter Ester.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung geschützter Monomere ist die Umsetzung des Benzylalkoholderivats der Schutzgruppe mit einem aktivierten Kohlenstoffatom des Monomers. Um beispielsweise die 5'-Hydroxylgruppe einer Nucleinsäure zu schützen, wird ein Derivat mit einem 5'-aktivierten Kohlenstoffatom mit dem Alkoholderivat der Schutzgruppe umgesetzt, wie z. B. Methyl-6-nitropiperonol (MePyROH). Beispiele für Nucleotide mit aktivierenden Gruppen, die an die 5'-Hydroxylgruppe gebunden sind, haben die allgemeine Formel:
worin Y ein Halogenatom, eine Tosyl-, Mesyl-, Trifluormethyl-, Azido- oder Diazogruppe und dergleichen ist.
Eine weitere Klasse bevorzugter photochemischer Schutzgruppen hat die Formel:
worin R¹, R² und R³ unabhängig ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe, eine Aryl-, Benzyl, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfanat-, Sulfido- oder Phosphidogruppe sind, R&sup4; und R&sup5; unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkoxy-, Alkyl-, Halogen-, Aryl- oder Alkenylgruppe sind und n den Wert 0 oder 1 hat.
Eine bevorzugte Schutzgruppe, 1-Pyrenylmethyloxycarbonyl (PyROC), die zum Schutz der endständigen Aminogruppe einer Aminosäure verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R¹ bis R&sup5; jeweils Wasserstoffatome sind und n den Wert 1 hat:
Eine weitere bevorzugte Schutzgruppe, 1-Pyrenylmethyl (PyR), die zum Schutz der endständigen Carboxylgruppe einer Aminosäure oder der Hydroxylgruppe eines Nucleotids verwendet wird, wird beispielsweise gebildet, wenn R¹ bis R&sup5; jeweils Wasserstoffatome sind und n den Wert 0 hat:
Eine Aminosäure mit einer Pyrenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe an ihrer endständigen Aminogruppe wird durch Acylierung des freien Amins der Aminosäure mit einem aktivierten Oxycarbonylester der Pyrenylschutzgruppe gebildet. Beispiele für aktivierte Oxycarbonylester von PyROC haben die allgemeine Formel:
worin X ein Halogenatom, ein gemischtes Anhydrid, eine p-Nitrophenoxy- oder N- Hydroxysuccinimidgruppe und dergleichen ist.
Eine geschützte Aminosäure oder ein geschütztes Nucleotid mit einer photoaktivierbaren Schutzgruppe wie z. B. PyR an der endständigen Carboxylgruppe der Aminosäure bzw. der endständigen 5'-Hydroxylgruppe der Nucleinsäure wird durch Acylierung der endständigen Carboxylgruppe oder der 5'-OH-Gruppe mit einem aktivierten Pyrenylmethylderivat der Schutzgruppe gebildet. Beispiele für aktivierte Pyrenylmethylderivate von PyROC haben die allgemeine Formel:
worin X ein Halogenatom, eine Hydroxyl-, Diazo- oder Azidogruppe und dergleichen ist.
Ein weiteres Verfahren zur Erzeugung geschützter Monomere ist die Umsetzung des Pyrenylmethylalkoholrests der Schutzgruppe mit einem aktivierten Ester des Monomers. Beispielsweise kann ein aktivierter Ester der Aminosäure mit dem Alkoholderivat der Schutzgruppe, wie z. B. Pyrenylmethylalkohol (PyROH) zur Bildung des geschützten Derivats der endständigen Carboxylgruppe der Aminosäure umgesetzt werden. Beispiele für aktivierte Ester umfassen Halogenformiat, ein gemischtes Anhydrid, Imidazoylformiat, Acylhalogenid und umfassen auch die Bildung des aktivierten Esters in situ unter Verwendung gewöhnlicher Reagenzien wie z. B. DCC und dergleichen.
Es ist klar, dass viele lichtempfindliche Schutzgruppen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind.
Vorzugsweise wird der Träger bestrahlt, um die mit Licht entfernbaren Schutzgruppen zu entfernen und Bereiche zu erzeugen, die freie reaktive Reste und Nebenprodukte aufweisen, die von der Schutzgruppe stammen. Die Entfernungsgeschwindigkeit der Schutzgruppen hängt von der Wellenlänge und der Intensität der einfallenden Strahlung sowie von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Schutzgruppe selbst ab. Bevorzugte Schutzgruppen werden mit einer höheren Geschwindigkeit und bei niedrigerer Strahlungsintensität entfernt. Beispielsweise werden bei einem gegebenen Satz von Bedingungen MeNVOC und MeNPOC schneller photolytisch von dem N-Terminus einer Peptidkette entfernt als ihre unsubstituierten Stammverbindungen NVOC bzw. NPOC.
Die Entfernung der Schutzgruppe wird durch Bestrahlung erreicht, um die reaktive Gruppe und die Abbauprodukte zu trennen, die von der Schutzgruppe stammen. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die Bestrahlung von NVOC- und MeNVOC-geschützten Oligomeren über das folgende Reaktionsschema abläuft:
NVOC-AA → 3,4-Dimethoxy-6-nitrosobenzaidehyd + CO&sub2; + AA
MeNVOC-AA → 3,4-Dimethoxy-6-nitrosoacetophenon + CO&sub2; + AA
wobei AA den N-Terminus des Aminosäure-Oligomers darstellt.
Zusammen mit der ungeschützten Aminosäure werden andere Produkte in die Lösung freigesetzt: Kohlendioxid und eine 2,3-Dimethoxy-6-nitrosophenylcarbonylverbindung, die mit nucleophilen Teilen des Oligomers unter unerwünschten Sekundärreaktionen reagieren kann. Im Fall einer NVOC-geschützten Aminosäure ist das Abbauprodukt ein Nitrosobenzaldehyd, während das Abbauprodukt der anderen Verbindung ein Nitrosophenylketon ist. Beispielsweise wird angenommen, dass der resultierende Aldehyd aus dem Abbau von NVOC mit freien Aminen unter Bildung einer Schiff-Base (Imin) reagiert, welche die übrige Polymersynthese beeinflusst. Bevorzugte mit Licht entfernbare Schutzgruppen reagieren langsam oder reversibel mit dem Oligomer auf dem Träger.
Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird vermutet, dass das aus der Bestrahlung eines MeNVOC-geschützten Oligomers resultierende Keton mit einer niedrigeren Geschwindigkeit mit Nucleophilen an dem Oligomer reagiert als die aus der Bestrahlung desselben NVOC-geschützten Oligomers resultierenden Aldehyde. Obwohl es nicht eindeutig feststeht, wird angenommen, dass diese Differenz der Reaktionsgeschwindigkeit auf den Unterschied der allgemeinen Reaktivität zwischen Aldehyden und Ketonen gegenüber Nucleophilen aufgrund sterischer und elektronischer Effekte zurückzuführen ist.
Die mit Licht entfernbaren Schutzgruppen können leicht entfernt werden. Beispielsweise wurde die Photolyse von N-geschütztem L-Phenylaianin in Lösung mit verschiedenen, mit Licht entfernbaren Schutzgruppen analysiert. Die Ergebnisse zeigt die nachstehende Tabelle: Tabelle Photolyse von geschütztem L-Phe-OH
Die Halbwertszeit t1/2 ist die Zeit in Sekunden, die erforderlich ist, um 50% der Ausgangsmenge der Schutzgruppe zu entfernen. NBOC ist die 6- Nitrobenzyloxycarbonylgruppe, NVOC ist die 6-Nitroveratryloxycarbonylgruppe, MeNVOC ist die Methyl-6-nitroveratryloxycarbonylgruppe und MeNPOC ist die Methyl-6- nitropiperonyloxycarbonylgruppe. Die Photolyse wurde in dem angegebenen Lösungsmittel mit einer Bestrahlung bei einer Wellenlänge von 362/364 nm und einer Intensität von 10 mW/cm² durchgeführt und die Konzentration jedes geschützten Phenylalanins war 0,10 mM.
Die Tabelle zeigt, dass die Entschützung von NVOC-, MeNVOC- und MeNPOC-geschütztem Phenylalanin schneller stattfand als die Entschützung von NBOC. Ferner zeigt die Tabelle, dass die Entschützung der beiden Derivate, die an dem Benzylkohlenstoffatom substituiert sind, MeNVOC und MeNPOC, sowohl in Dioxan als auch in angesäuertem Dioxan mit den höchsten Photolysegeschwindigkeiten ablief.

1. Verwendung von mit Licht entfernbaren Gruppen während der Festphasensynthese von Peptiden

Die Bildung von Peptiden auf einem Festphasenträger erfordert die schrittweise Bindung einer Aminosäure an eine trägergebundene wachsende Kette. Um eine nicht erwünschte Polymerisation der monomeren Aminosäure unter den Reaktionsbedingungen zu verhindern, ist ein Schutz der endständigen Aminogruppe der Aminosäure erforderlich. Nachdem das Monomer an das Ende des Peptids gekoppelt worden ist, wird die N-terminale Schutzgruppe entfernt und eine weitere Aminosäure wird an die Kette gekoppelt. Dieser Zyklus des Koppelns und Entschützens wird für jede Aminosäure in der Peptidsepuenz fortgesetzt, vgl. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2149 und Atherton et al., "Solid Phase Peptide Synthesis", 1989, IRL Press, London. Wie es vorstehend beschrieben worden ist, erlaubt die Verwendung einer mit Licht entfernbaren Schutzgruppe die Entfernung von Schutzgruppen in ausgewählten Abschnitten der Trägeroberfläche mittels Musterbelichtung während des Entschützungszyklus der Festphasensynthese. Dies erlaubt selektiv die räumliche Steuerung der Synthese, da die nächste Aminosäure lediglich an die bestrahlten Bereiche gekoppelt wird.
Die mit Licht entfernbaren Schutzgruppen können an aktivierte Ester einer Aminosäure an der endständigen Aminogruppe gebunden werden:
worin R die Seitenkette einer natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäure, X eine mit Licht entfernbare Schutzgruppe und Y ein aktiviertes Carbonsäurederivat ist. Die mit Licht entfernbare Schutzgruppe X ist vorzugsweise NVOC, NPOC, PyROC, MeNVOC, MeNPOC und dergleichen, wie es vorstehend diskutiert worden ist. Der aktivierte Ester Y ist vorzugsweise ein reaktives Derivat mit einer hohen Kopplungseffizienz wie z. B. ein Acylhalogenid, ein gemischtes Anhydrid, ein N-Hydroxysuccinimidester, Perfluorphenylester oder eine Urethan-geschützte Säure und dergleichen. Weitere aktivierte Ester und Reaktionsbedingungen sind bekannt (vgl. Atherton et al).

2. Verwendung von mit Licht entfernbaren Gruppen während der Festphasensynthese von Oligonucleotiden

Die Bildung von Oligonucleotiden auf einem Festphasenträger erfordert die schrittweise Bindung eines Nucleotids an ein trägergebundenes wachsendes Oligomer. Um eine nicht erwünschte Polymerisation des monomeren Nucleotids unter den Reaktionsbedingungen zu verhindern, ist ein Schutz der 5'-Hydroxylgruppe des Nucleotids erforderlich. Nachdem das Monomer an das Ende des Oligomers gekoppelt worden ist, wird die 5'- Hydroxylschutzgruppe entfernt und ein weiteres Nucleotid an die Kette gekoppelt. Dieser Zyklus des Koppelns und Entschützens wird für jedes Nucleotid in der Oligomersequenz fortgesetzt, vgl. Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach", 1984, IRL Press, London.
Wie es vorstehend beschrieben worden ist, erlaubt die Verwendung einer mit Licht entfernbaren Schutzgruppe die Entfernung von Schutzgruppen in ausgewählten Abschnitten der Trägeroberfläche mittels Musterbelichtung während des Entschützungszyklus der Festphasensynthese. Dies erlaubt selektiv die räumliche Steuerung der Synthese, da das nächste Nucleotid lediglich an die bestrahlten Bereiche gekoppelt wird.
Die Oligonucleotidsynthese umfasst im Allgemeinen das Koppeln eines aktivierten Phosphorderivats an die 3'-Hydroxylgruppe eines Nucleotids, wobei die 5'-Hydroxylgruppe eines Oligomers an einen festen Träger gebunden ist. Es gibt zwei chemische Hauptverfahren zur Durchführung dieser Kopplung: Das Phosphattriester- und das Phosphoramiditverfahren (vgl. Gait). Die beschriebenen Schutzgruppen sind für jedes dieser Verfahren geeignet.
Eine mit Licht entfernbare Schutzgruppen kann an ein aktiviertes Nucieotid an der 5'- Hydroxylgruppe gebunden werden:
worin B die an den Zuckerring gebundene Base ist; R ein Wasserstoffatom ist, wenn der Zucker Desxoxyribose ist oder R eine Hydroxylgruppe ist, wenn der Zucker Ribose ist; P eine aktivierte Phosphorgruppe ist und X eine mit Licht entfernbare Schutzgruppe ist. Die mit Licht entfernbare Schutzgruppe X ist vorzugsweise NV, NP, PyR, MeNV, MeNP, NVOC, NPOC, PyROC, MeNVOC, MeNPOC und dergleichen, wie es vorstehend beschrieben worden ist. Die aktivierte Phosphorgruppe P ist vorzugsweise ein reaktives Derivat mit einer hohen Kopplungseffizienz wie z. B. ein Phosphattriester, Phosphoramidit oder dergleichen. Weitere aktivierte Phosphorderivate und Reaktionsbedingungen sind bekannt (vgl. Galt).

E. Aminosäure-N-carboxyanhydride, die mit einer mit Licht entfernbaren Gruppe geschützt sind

Bei der Merrifield-Peptidsynthese wird ein aktivierter Ester einer Aminosäure mit der freien endständigen Aminogruppe eines trägergebundenen Oligomers gekoppelt. Aktivierte Ester von Aminosäuren, die für die Festphasensynthese geeignet sind, umfassen Halogenformiat, ein gemischtes Anhydrid, Imidazoylformiat, Acylhalogenid und umfassen auch die Bildung des aktivierten Esters in situ unter Verwendung gewöhnlicher Reagenzien wie z. B. DCC und dergleichen (vgl. Atherton et al). Eine bevorzugte geschützte und aktivierte Aminosäure hat die allgemeine Formel:
worin R die Seitenkette der Aminosäure und X eine mit Licht entfernbare Schutzgruppe ist. Diese Verbindung ist eine Urethan-geschützte Aminosäure mit einer mit Licht entfernbaren Schutzgruppe, die an dem Amin gebunden ist. Eine mehr bevorzugte aktivierte Aminosäure wird gebildet, wenn die mit Licht entfernbare Schutzgruppe die allgemeine Formel
hat, worin R¹, R², R³ und R&sup4; unabhängig ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe, eine Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido- oder Phosphidogruppe sind, oder benachbarte Substituenten (d. h., R¹-R², R²-R³, R³-R&sup4;) sind substituierte Sauerstoffgruppen, die zusammen ein cyclisches Acetal oder Ketal bilden; und R&sup5; ist ein Wasserstoffatom, eine Alkoxyl-, Alkyl-, Halogen-, Aryl- oder Alkenylgruppe.
Eine bevorzugte aktivierte Aminosäure wird gebildet, wenn die mit Licht entfernbare Schutzgruppe 6-Nitroveratryloxycarbonyl ist. D. h., R¹ und R&sup4; sind jeweils Wasserstoffatome, R² und R³ sind jeweils Methoxygruppen und R&sup5; ist ein Wasserstoffatom. Eine weitere bevorzugte aktivierte Aminosäure wird gebildet, wenn die mit Licht entfernbare Gruppe 6- Nitropiperonyl ist: R¹ und R&sup4; sind jeweils Wasserstoffatome, R² und R³ bilden zusammen ein Methylenacetal und R&sup5; ist ein Wasserstoffatom. Andere Schutzgruppen sind möglich. Ein weiterer bevorzugter aktivierter Ester wird gebildet, wenn die mit Licht entfernbare Gruppe Methyl-6-nitroveratryl oder Methyl-6-nitropiperonyl ist.
Eine weitere bevorzugte aktivierte Aminosäure wird gebildet, wenn die mit Licht entfernbare Schutzgruppe die allgemeine Formel
hat, worin R¹, R² und R³ unabhängig ein Wasserstoffatom, eine niedere Alkylgruppe, eine Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfanat-, Sulfido- oder Phosphidogruppe sind sowie R&sup4; und R&sup5; unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkoxy-, Alkyl-, Halogen-, Aryl- oder Alkenylgruppe sind. Die resultierende Verbindung ist eine Urethan-geschützte Aminosäure mit einer an das Amin gebundenen Pyrenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe. Eine mehr bevorzugte Ausführungsform wird gebildet, wenn R¹ bis R&sup5; jeweils Wasserstoffatome sind.
Die mit einer mit Licht entfernbaren Schutzgruppe versehenen Urethan-geschützten Aminosäuren werden durch Kondensation einer N-geschützten Aminosäure mit einem Acylierungsmittel wie z. B. einem Acylhalogenid, Anhydrid, Chlorformiat und dergleichen hergestellt (vgl. Fuller et al., US-PS 4,946,942 und Fuller et al., J. Amer. Chem. Soc. (1990), 112, 7414-7416).
Urethan-geschützte Aminosäuren, die mit Licht entfernbare Schutzgruppen aufweisen, sind im Allgemeinen als Reagenzien während der Festphasen-Peptidsynthese geeignet. Aufgrund der durch die mit Licht entfernbaren Schutzgruppen möglichen räumlichen Selektivität sind sie besonders für die räumlich adressierende Peptidsynthese geeignet. Diese Aminosäuren sind difunktionell: Die Urethangruppe dient zunächst zur Aktivierung der endständigen Carboxylgruppe für die Umsetzung mit dem an den Träger gebundenen Amin und, sobald sich die Peptidbindung gebildet hat, schützt die mit Licht entfernbare Schutzgruppe die neu gebildete endständige Aminofunktion vor einer weiteren Reaktion. Diese Aminosäuren sind auch gegenüber Nucleophilen hoch reaktiv, wie z. B. entschützten Aminen auf der Oberfläche des festen Trägers. Aufgrund dieser hohen Reaktivität werden die Festphasen-Peptidkopplungszeiten signifikant verringert und die Ausbeuten sind typischerweise höher.

IV. Datensammlung

A. Datensammelsystem

Gemäß der vorstehenden Beschreibung hergestellte Träger können verwendet werden, um zu bestimmen, welche der Vielzahl von Sequenzen darauf an einen interessierenden Rezeptor bindet/binden. Fig. 10 veranschaulicht eine Ausführungsform einer Vorrichtung, die zum Nachweis von Bereichen eines Trägers dient, welche Fluoreszenzmarker enthalten. Diese Vorrichtung würde beispielsweise verwendet werden, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines fluoreszierend markierten Rezeptors wie eines Antikörpers nachzuweisen, der an ein synthetisiertes Polymer auf einem Träger gebunden hat.
Licht wird von einer Lichtquelle 1002 auf den Träger gerichtet. Diese Lichtquelle ist beispielsweise eine Laserlichtquelle eines bekannten Typs, wie z. B. dem Modell 2025 von Spectra Physics. Licht von der Quelle wird auf eine Linse 1004 gerichtet, die vorzugsweise eine zylindrische Linse eines dem Fachmann bekannten Typs ist. Das sich ergebende Ausgangssignal der Linse 1004 ist ein linearer Strahl und kein Lichtpunkt. Folglich können Daten im Wesentlichen gleichzeitig entlang einer linearen Gruppierung von Pixeln und nicht auf einer Pixel-für-Pixel-Basis aufgenommen werden. Obwohl hier zur Veranschaulichung einer Technik zur Erzeugung eines linearen Lichtstrahls auf einer Oberfläche eine zylindrische Linse verwendet wird, ist es klar, dass auch andere Techniken eingesetzt werden könnten.
Der Strahl von der zylindrischen Linse wird durch einen dichroitischen Spiegel oder ein dichroitisches Prisma geschickt und auf die Oberfläche des geeignet hergestellten Trägers 1008 gerichtet. Der Träger 1008 ist auf einem x-y-Verschiebungstisch 1009 angeordnet, wie z. B. auf einem Modell Nr. PM500-8 von Newport. Bestimmte Stellen auf dem Träger werden fluoreszieren und die Fluoreszenz wird entlang des durch die gestrichelten Linien angegebenen Weges zurück durch den dichroitischen Spiegel geleitet und mit einer geeigneten Linse 1010 wie z. B. einer f/1,4-Kameralinse über eine variable f-Stop- Fokussierlinse 1014 auf einem Lineardetektor 1012 fokussiert. Durch die Verwendung eines linearen Lichtstrahls wird es möglich, Daten über eine Zeile von Pixeln entlang des Trägers zu erzeugen (wie z. B. etwa 1 cm) und nicht von einzelnen Punkten auf dem Träger. Alternativ wird Licht auf einen 2-dimensionalen Bereich des Trägers gerichtet und die Fluoreszenz wird durch eine 2-dimensionale CCD-Gruppierung nachgewiesen. Der lineare Nachweis ist bevorzugt, da wesentlich höhere Leistungsdichten erhalten werden.
Der Detektor 1012 weist das Ausmaß der von dem Träger emittierten Fluoreszenz als Funktion der Position nach. Der Detektor kann eine dem Fachmann gewöhnlich bekannte lineare CCD-Gruppierung sein. Der x-y-Verschiebungstisch, die Lichtquelle und der Detektor 1012 sind alle mit einem Computer 1016 verbunden, wie z. B. einem IBM PC-AT oder einem entsprechenden Computer, um die Vorrichtung und das Datensammeln von der CCD- Gruppierung zu steuern.
Im Betrieb wird der Träger durch den Verschiebungstisch geeignet positioniert. Die Lichtquelle wird dann eingeschaltet und Fluoreszenzintensitätsdaten werden mit dem Computer über den Detektor gesammelt.
Alternativ werden der Träger und der x/y-Verschiebungstisch unter einem Mikroskop angeordnet, das ein oder mehrere Objektiv(e) umfasst. Licht (etwa 488 nm) von einem Laser, welcher in einigen Ausführungsformen ein Argonionenlaser Modell Nr. 2020-05 von Spectra Physics ist, wird mittels eines dichroitischen Spiegels, der Licht mit einer Wellenlänge von größer als etwa 520 nm hindurchlässt, aber Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm reflektiert, auf den Träger gerichtet. Der dichroitische Spiegel kann beispielsweise ein Modell Nr. FT510 von Carl Zeiss sein. Licht, das von dem Spiegel reflektiert worden ist, tritt in das Mikroskop ein, das beispielsweise ein Modell Axioskop 20 von Carl Zeiss sein kann. Fluorescein-markierte Materialien auf dem Träger werden bei einer Wellenlänge von > 488 nm fluoreszieren und das Fluoreszenzlicht wird von dem Mikroskop gesammelt und durch den Spiegel geschickt. Das Fluoreszenzlicht von dem Träger wird dann durch ein Wellenlängenfilter und danach durch eine Blendenplatte geschickt. Der Wellenlängenfilter kann beispielsweise ein Modell Nr. OG530 von Melles Griot und die Blendenplatte beispielsweise ein Modell Nr. 477352/477380 von Carl Zeiss sein.
Das Fluoreszenzlicht tritt dann in eine Photomultiplierröhre ein, die in einigen Ausführungsformen ein Modell Nr. R943-02 von Hamamatsu ist. Das Signal wird in einem Vorverstärker verstärkt und die Photonen werden mit einem Photonenzähler gezählt. Die Anzahl der Photonen wird als Funktion der Position vom Computer aufgezeichnet. Der Vorverstärker kann beispielsweise ein Modell Nr. SR440 von Stanford Research Systems und der Photonenzähler ein Modell Nr. SR400 von Stanford Research Systems sein. Der Träger wird dann an die nächste Stelle bewegt und der Vorgang wird wiederholt. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Daten alle 1 bis 100 um aufgenommen, wobei ein Datensammeldurchmesser von etwa 0,8 bis 10 um bevorzugt ist. In Ausführungsformen mit ausreichend hoher Fluoreszenz wird ein CCD-Detektor mit Breitfeldbelichtung verwendet.
Fig. 11 veranschaulicht den Aufbau des Datensammelsystems genauer. Der Betrieb des Systems findet unter der Kontrolle des Photonenzählprogramms 1102 statt. Der Anwender gibt die Scan-Abmessungen, dis Anzahl der Pixel oder Datenpunkte in einem Bereich und die Scangeschwindigkeit in das Zählprogramm ein. Über einen GPIB-Bus 1104 ist das Programm (beispielsweise in einem IBM-PC-kompatiblen Computer) mit einer Mehrkanal- Skalierungseinrichtung 1106 wie z. B. einem Stanford Research SR430 und einer x-y-Tisch- Steuereinrichtung 1108 wie z. B. einer Newport PM500 verbunden. Das Signal von dem Licht des fluoreszierenden Trägers tritt in einen Photomultiplier 1110 ein, der ein Ausgangssignal an die Skalierungseinrichtung 1106 liefert. Die von der Skalierungseinrichtung ausgegebenen Daten stehen für die Anzahl von Zählungen in einem gegebenen Bereich.
Nach dem Scannen eines ausgewählten Bereichs wird die Tisch-Steuereinrichtung mit Befehlen bezüglich der Beschleunigung und der Geschwindigkeit aktiviert, was wiederum den Scan-Tisch 1112, wie z. B. einen Newport PM500-A zu einem anderen Bereich bewegt.
Daten werden in einer Bilddaten-Datei 1114 gesammelt und in einem Skalierungsprogramm 1116 verarbeitet. Ein skaliertes Bild wird zur Anzeige z. B. auf einem VGA-Anzeige 1118 ausgegeben. Das Bild wird auf der Basis einer Eingabe des Prozentsatzes der abzuschneidenden Pixel und dem minimalen und maximalen Pixelniveau skaliert, das sichtbar sein soll. Das System gibt die minimalen und maximalen Pixelniveaus in den Rohdaten aus, die verwendet werden können.

B. Datenanalyse

Die Ausgabe des Datensammelsystems ist eine Gruppierung von Daten, welche die Fluoreszenzintensität gegen die Position auf dem Träger angibt. Die Daten werden typischerweise von Bereichen genommen, die wesentlich kleiner sind als der Bereich, in dem die Synthese eines gegebenen Polymers stattgefunden hat. Wenn beispielsweise Polymere in Quadraten mit den Abmessungen 500 · 500 um auf dem Träger synthetisiert worden sind, können die Daten von Bereichen genommen werden, die eine Abmessung von 5 · 5 um haben. Vorzugsweise haben die Bereiche auf dem Träger, von denen Fluoreszenzdaten genommen werden eine Größe von weniger als 1/2 der Fläche der Bereiche, in denen einzelne Polymere synthetisiert werden, vorzugsweise weniger als 1/10 der Fläche, auf der ein einzelnes Polymer synthetisiert wird und insbesondere weniger als 1/100 der Fläche, auf der ein einzelnes Polymer synthetisiert wird. Folglich werden innerhalb einer beliebigen Fläche, auf der ein gegebenes Polymer synthetisiert worden ist, eine große Anzahl von Fluoreszenzdatenpunkten gesammelt.
Eine Auftragung der Pixelanzahl gegen die Fluoreszenzintensität für einen Scan einer Zelle, wenn diese beispielsweise mit einem markierten Antikörper in Kontakt gebracht worden ist, wird typischerweise die Form einer Glockenkurve aufweisen. Es werden jedoch insbesondere bei höheren Intensitäten fehlerhafte Daten beobachtet. Da es erwünscht ist, bezüglich eines gegebenen Synthesebereichs einen Mittelwert der Fluoreszenzintensität zur Bestimmung der relativen Bindungsaffinität zu verwenden, werden diese fehlerhaften Daten zu einer Verfälschung der Daten führen.
Entsprechend können die Daten korrigiert werden, um diese fehlerhaften Datenpunkte zu entfernen. Danach wird ein Mittelwert der Datenpunkte verwendet, um die relative Bindungseffizienz zu bestimmen.
Fig. 12 veranschaulicht ein Beispiel eines Systems zur Entfernung fehlerhafter Daten von einem Satz von Fluoreszenzdaten wie z. B. Daten, die für Affinitäts-Screeningstudien verwendet werden. Ein Anwender oder das System gibt bei dem Schritt 1302 Daten ein, welche die Position des Chips und der Zellecken betreffen. Aus dieser Information und der Bilddatei erzeugt das System bei dem Schritt 1304 eine Computerdarstellung eines Histogramms, wobei das Histogramm (mindestens in Form einer Computerdatei) die Anzahl der Datenpixel gegen die Intensität aufträgt.
Für jede Zelle wird dann eine Hauptdatenanalyseschleife durchgeführt. Für jede Zelle berechnet das System bei dem Schritt 1306 die Gesamtfluoreszenzintensität oder die Pixelanzahl für die Bandenbreite, die um variierende Intensitätsniveaus zentriert ist. Wie es beispielsweise in der Auftragung rechts von dem Schritt 1306 gezeigt ist, berechnet das System die Pixelanzahl innerhalb der Bande der Breite w. Das System "bewegt" dann diese Bandenbreite auf eine höhere Mittelintensität und berechnet erneut die Pixelanzahl in der Bandenbreite. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis der gesamte Intensitätsbereich gescannt worden ist. Bei dem Schritt 1308 bestimmt das System, welche Bande die höchste Pixelgesamtzahl aufweist. Die Daten innerhalb dieser Bandenbreite werden für die weitere Analyse verwendet. Unter der Annahme, dass die Bandenbreite in vernünftiger Weise klein gewählt wird, wird dieses Verfahren die Wirkung haben, dass fehlerhafte Daten, die bei den höheren Intensitätsniveaus angesiedelt sind, eliminiert werden. Das System wiederholt sich dann bei dem Schritt 1310, wenn alle Zellen bewertet worden sind oder es wiederholt sich für die nächste Zelle.
Bei dem Schritt 1312 integriert das System dann die Daten innerhalb der Bandenbreite für jede der ausgewählten Zellen, sortiert bei dem Schritt 1314 die Daten unter Verwendung der Datei für das Syntheseverfahren und zeigt die Daten für einen Anwender beispielsweise auf einem Bildschirm an oder gibt sie auf einem Drucker aus.

V. Repräsentative Anwendungen

A. Oligonucleotidsynthese

Die allgemeine Anwendbarkeit der lichtgesteuerten, räumlich adressierbaren parallelen chemischen Synthese wird durch die Anwendung auf eine Nucleinsäuresynthese gezeigt.

1. Beispiel

Die mit Licht aktivierte Bildung eines Thymidin-Cytidin-Dimers wurde durchgeführt. Es wurde eine dreidimensionale Darstellung eines Fluoreszenz-Scans, der ein Schachbrettmuster mit 7 · 4 Quadraten zeigt, durch die lichtgesteuerte Synthese eines Dinucleotids erzeugt.
5'-Nitroveratrylthymidin wurde über die 3'-Hydroxylgruppe an einen Syntheseträger gebunden. Die Nitroveratryl-Schutzgruppen wurden dann durch Belichtung durch eine 500 um Schachbrettmaske entfernt. Der Träger wurde dann mit 2'-Desoxycytidin behandelt, das mit Phosphoramidit aktiviert war. Um die Reaktion fluorimetrisch zu verfolgen, wurde 5 das Desoxycytidin mit einem an das exocylclische Amin gebundenen FMOC-geschützten Aminohexyl-Linker modifiziert (5'-O-Dimethoxytrityl-4-N-(6-N-fluorenylmethylcarbamoylhexylcarboxy)-2'-desoxycytidin). Nach der Entfernung der FMOC-Schutzgruppe mit Base wurden die Bereiche, die das Dinucleotid enthielten, durch Behandlung des Trägers mit 1 mM FITC in DMF für eine Stunde fluoreszierend markiert.
Die dreidimensionale Darstellung der Fluoreszenzintensitätsdaten, welche abwechselnde Quadrate hell hervorgehobener Pixel zeigt, reproduziert das Schachbrett-Belichtungsmuster, das während der Photolyse des Trägers verwendet worden ist. Dieses Ergebnis zeigt, dass Oligonucleotide sowie Peptide mit dem lichtgesteuerten Verfahren synthetisiert werden können.
In einem weiteren Beispiel wurde die mit Licht aktivierte Bildung von Thymidin-Cytidin-Cytidin durchgeführt, wie es in Fig. 13 gezeigt ist. Hier wurde wie im vorstehenden Beispiel 5'- Nitroveratrylthymidin an den Träger gebunden, und zwar mittels Phosphoramidit-Chemie auf einer Oberfläche, die [Bis(2-hydroxyethyl)-3-aminopropylsiloxan] enthielt. Der Objekträger wurde dann 10 min in Gegenwart von Dioxan gleichförmig belichtet (362 nm bei etwa 14 mW/cm²). Nach dem Trocknen wurde die Oberfläche dann mit N-4-Dimethoxytrityl-5'- nitroveratryl-2'-desoxycytidin-3'-O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit in Gegenwart von Tetrazol behandelt (Standard-Phosphoramidit-Kopplungschemie). Nach der Oxidation und dem Trocknen wurde die Platte erneut wie zuvor belichtet, jedoch wurde eine 500 um Schachbrettmaske zwischen der Lichtquelle und dem Objektträger eingebracht. Die Oberfläche wurde dann mit 5'-O-(4,4'-Dimethoxy)-N-4-(6-((biotinoyl)amino)hexanoyl)amino)- hexanoyl-aminohexyl)-5-methyl-2'-desoxycytidin-3'-O-(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit zusammen mit Tetrazol in Kontakt gebracht. Nach der Oxidation und dem Trocknen wurden die das Trinucleotid enthaltenden Bereiche durch Behandlung mit FITCmarkiertem Streptavidin fluoreszierend markiert. Die sich ergebende Darstellung der Fluoreszenzintensitätsdaten zeigte abwechselnde helle und dunkle Quadrate, die dem während der Photolyse verwendeten 500 um-Schachbrett-Belichtungsmuster entsprachen.

VI. Schlußfolgerung

Die hier beschriebene Erfindung bietet einen neuen Ansatz für die gleichzeitige Synthese einer großen Zahl von Verbindungen. Das Verfahren kann immer dann eingesetzt werden, 5 wenn chemische Synthesebausteine zur Verfügung stehen, die in einem Festphasenformat gekoppelt werden können und wenn Licht verwendet werden kann, um eine reaktive Gruppe zu erzeugen.
Die vorstehende Beschreibung dient der Veranschaulichung und ist nicht beschränkend aufzufassen. Dem Fachmann werden beim Studium dieser Beschreibung viele Variationen der Erfindung offensichtlich werden. Während die Erfindung in erster Linie bezüglich der Peptid- und Nucleotidsynthese beispielhaft veranschaulicht wird, ist die Erfindung jedoch nicht dahingehend beschränkt. Der Bereich der Erfindung sollte daher nicht bezüglich der vorstehenden Beschreibung, sondern bezüglich der beigefügten Ansprüche bestimmt werden.

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:

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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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D (ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

Claims

1. Eine Verbindung der allgemeinen Formel

worin n = 0 oder 1 ist, Y eine funktionelle Gruppe ist, R¹ und R² unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino-, Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidogruppe sind und R³ eine Alkoxy-, Alkyl-, Aryl- oder Alkenylgruppe ist.

2. Eine Verbindung der allgemeinen Formel

worin n = 0 oder 1 ist, Y eine C-5'-Sauerstoffgruppe einer natürlichen oder nicht natürlichen Desoxyribonuclein- und Ribonucleinsäure ist, R¹ bis R&sup4; unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Methyl- (nur R³), Aryl-, Benzyl-, Halogen-, Hydroxyl-, Alkoxyl-, Thiol-, Thioether-, Amino- Nitro-, Carboxyl-, Formiat-, Formamido-, Sulfido- oder Phosphidogruppen sind und R&sup5; eine Alkoxy-, Alkyl-, Aryl- oder Alkenylgruppe ist, mit der Maßgabe, dass (i) R² und R³ nicht beide Methoxygruppen sind, wenn R¹ und R&sup4; Wasserstoffatome sind und R&sup5; eine 2-Nitrophenyl- oder 3,4-Dimethoxy-6-nitrophenylgruppe ist und (ii) R¹, R², R³ und R&sup4; nicht gleichzeitig Wasserstoffatome sind.

3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹ und R&sup4; unabhängig aus einer Methoxygruppe, einem Wasserstoffatom, einer Alkoxy- und Halogengruppe ausgewählt sind.

4. Eine Verbindung der allgemeinen Formel

5. Verbindung nach Anspruch 1 oder 4, wobei R¹ und R² unabhängig aus einer Methoxygruppe, einem Wasserstoffatom, einer Alkoxy- und Halogengruppe ausgewählt sind.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei im Fall einer Verbindung nach Anspruch 2 oder 3 R&sup5; eine Methylgruppe und für eine beliebige andere Verbindung R³ eine Methylgruppe ist.

7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Y eine funktionelle Gruppe eines Moleküls ist, das aus natürlichen und nicht natürlichen Aminosäuren und Peptiden, Nucleosiden und Oligonucleotiden ausgewählt ist.

8. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1, 4 oder 5 oder nach Anspruch 6 oder 7, wenn diese direkt oder indirekt von einem der Ansprüche 1, 4 oder 5 abhängen, um Schutzgruppen in einem geordneten Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Polymersequenzen durch aufeinanderfolgendes Zugeben von Reagentien bereitzustellen, umfassend den Schritt des aufeinanderfolgenden Schützens und Entschützens von Abschnitten der Vielzahl von Polymersequenzen zur Addition anderer Abschnitte der Polymersequenzen unter Verwendung einer binären Synthesestrategie.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei entweder

(a) die binäre Synthesestrategie eine binäre Maskierungsstrategie ist und wobei die Maskierungsstrategie mindestens zwei aufeinanderfolgende Schritte bereitstellt, bei denen eine Maske eine vorhergehende Maske faktorisiert, und zwar durch Schützen eines Abschnitts eines vorher belichteten Abschnitts vor Licht und Belichten eines Abschnitts eines vorher geschützten Abschnitts, oder

(b) die binäre Synthesestrategie eine binäre Maskierungsstrategie ist und wobei die Masken in einer Graucode-Maskierungsstrategie angeordnet sind, wobei die Graucode- Maskierungsstrategie eine Kantenbelichtung auf jeder einer Vielzahl von Synthesestellen aufweist.

10. Verwendung nach Anspruch 9, weiter umfassend den Schritt des Herstellens eines Abschnitts der Polymere mittels einer nicht-binären Maskierungstrategie.