CZ310613B6 - Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití - Google Patents

Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití

Info

Publication number
CZ310613B6
CZ310613B6 CZ2020-529A CZ2020529A CZ310613B6 CZ 310613 B6 CZ310613 B6 CZ 310613B6 CZ 2020529 A CZ2020529 A CZ 2020529A CZ 310613 B6 CZ310613 B6 CZ 310613B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
transfection
lipidoid
mrna
mmol
general formula
Prior art date
Application number
CZ2020-529A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2020529A3 (cs
Inventor
Petr CĂ­gler
Cígler Petr Mgr., Ph.D.
Klára GRANTZ ŠAŠKOVÁ
Grantz Šašková Klára Mgr., Ph.D.
Václav Vaněk
Vaněk Václav Mgr., Ph.D.
Zuzana Kružíková
Zuzana Mgr. Kružíková
František Sedlák
František MUDr. Sedlák
Original Assignee
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. filed Critical Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i.
Priority to CZ2020-529A priority Critical patent/CZ310613B6/cs
Priority to US18/015,254 priority patent/US12559450B2/en
Priority to KR1020227011339A priority patent/KR102827114B1/ko
Priority to IL291097A priority patent/IL291097B2/en
Priority to BR112022024346A priority patent/BR112022024346A2/pt
Priority to CN202180008677.8A priority patent/CN114945556B/zh
Priority to MX2022013522A priority patent/MX2022013522A/es
Priority to PCT/CZ2021/050079 priority patent/WO2022063350A1/en
Priority to EP21762590.4A priority patent/EP4031522B1/en
Priority to AU2021348717A priority patent/AU2021348717B2/en
Priority to JP2022530325A priority patent/JP7260717B2/ja
Priority to CA3154983A priority patent/CA3154983C/en
Publication of CZ2020529A3 publication Critical patent/CZ2020529A3/cs
Priority to ZA2022/03990A priority patent/ZA202203990B/en
Publication of CZ310613B6 publication Critical patent/CZ310613B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/57—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C233/62—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by amino groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/04—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C219/12—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having at least one of the hydroxy groups esterified by a carboxylic acid having the esterifying carboxyl group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/02—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C233/04—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C07C233/06—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having nitrogen atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/04—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C235/06—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the nitrogen atoms of the carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/24—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C07C237/26—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring of the carbon skeleton of a ring being part of a condensed ring system formed by at least four rings, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • C12N9/222—Clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]-associated [CAS] enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/56—Ring systems containing bridged rings
    • C07C2603/58—Ring systems containing bridged rings containing three rings
    • C07C2603/70—Ring systems containing bridged rings containing three rings containing only six-membered rings
    • C07C2603/74—Adamantanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Předmětem předkládaného řešení je lipidoid obecného vzorce I, kde X je zvoleno ze skupiny, sestávající z -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, ‑C(=O)NHNH-, -CH2‑, -O-, -S-, -NH-, -NHNH-, ‑NHC(=O)-, ‑NHNHC(=O)-, -C≡C-,-CH=CH-, -CH2C(=O)NH-, -CH2C(=O)O-, CH2C(=S)O-, CH2C(=S)S-, -CH2C(=O)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-; Y je nezávisle zvoleno ze skupiny alkylenových řetězců C2-C10; Z je atom vodíku; a R jsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé R je zvoleno ze skupiny alkyl C8-C20, alkenyl C8-C20, alkynyl C8-C20, přičemž v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více –CH2- skupin nahrazeno jednou nebo více skupinami vybranými z -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -SS-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, -O-, -S-; a jeho farmaceuticky přijatelné soli, adiční soli a solváty. Tento lipidoid je využitelný jako transfekční agens. Řešení dále popisuje transfekční činidla, transfekční částice obsahující tento lipidoid, a jejich použití.

Description

Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
Oblast techniky
Vynález se týká nových ionizovatelných lipidoidů a využití těchto látek pro transfekci a administraci nukleotidů a nukleových kyselin a jejich syntetických analogů do buněk a tkání.
Dosavadní stav techniky
Vývoj terapií založených na nukleových kyselinách (NK) zažívá v posledních letech nebývalou renesanci. Díky vysoké účinnosti a zároveň nízkému riziku nežádoucích vedlejších účinků oproti dříve testovaným terapeutickým deoxyribonukleovým kyselinám (DNA), se nyní prosazují terapie využívající ribonukleové kyseliny (RNA). Již několik takových léků dosáhlo klinického použití, například patisiran na hereditámí transthyretinovou amyloidózu, dále eteplirsen pro určité typy Duchennovy svalové dystrofie či nusinersen pro léčbu spinální svalové atrofie. Všechna tato onemocnění jsou život ohrožující a neexistuje pro ně alternativní léčba. Případné léky cílící na ribonukleovou kyselinu (RNA) či její využití lze rozdělit do tří kategorií podle toho, zda cílí na NK, nebo proteiny, či proteiny kódují. Do první kategorie patří jednořetězcové antisensní oligonukleotidy o 13 až 25 nukleotidech (nt), které blokují translaci mediátorové RNA (mRNA) nebo RNA sestřih (nusinersen, eteplirsen); a dále malé interferující RNA (siRNA, 2123nt), které mRNA degradují (patisiran). Terapeutické molekuly RNA cílící proteiny používají typ molekuly známý jako RNA aptamer. Ten je navržen tak, že moduluje funkci konkrétního proteinu. Příkladem takového léku je pegaptanib, používaný k léčbě neovaskulámí věkem podmíněné makulámí degenerace, který byl v roce 2004 prvním schváleným léčivem svého druhu. Terapie používající mRNA se používají zejména k přípravě tzv. personalizovaných vakcín proti rakovině, či vakcín proti infekčním chorobám (např. viru Zika). Právě u virových onemocnění se u kandidátů na profýlaktickou vakcínu na bázi mRNA proti vzteklině a pandemické chřipce prokázala bezpečná indukovaná tvorba protilátek u zdravých dobrovolníků. V preklinických fázích vývoje jsou také mRNA terapie nahrazující proteiny, například pro léčbu hemofilie.
Obrovský rozkvět nyní zažívají molekulární technologie umožňující přímou editaci genomu, zejména ty založené na systému CRISPR-Cas9. CRISPR technologie je nástroj, který umožňuje měnit sekvence DNA a modifikovat funkci genu. Potenciální aplikace zahrnují opravu genetických defektů, léčbu a prevenci šíření chorob či zlepšení zemědělských plodin. CRISPRCas9 systém je testován v celé řadě preklinických a klinických studií zahrnující léčbu HIV, léčbu hematologických malignit i genetických poruch včetně srpkovité anémie a β-thalassémie. Editaci RNA pak umožňuje systém ADARs (adenosin deaminasy cílící RNA), který se zatím z klinického hlediska zdá být bezpečnější. Molekulární technologie pro přímou editaci genomu mohou být doručeny na místo účinku v podobě mRNA, která kóduje příslušný enzym zodpovědný za editaci.
Klíčovým faktorem umožňujícím bezpečné použití všech výše zmíněných technologií (případně dalších, založených na NK) je jejich bezpečný a efektivní transport na místo účinku. Kritickým krokem je přitom průnik negativně nabitých NK přes fosfolipidovou membránu buňky; proces záměrného vnášení NK do eukaryotických buněk se nazývá transfekce. V posledních desetiletích dochází k intenzivnímu vývoji nosičů (tzv. vektorů), které by byly schopné NK přes buněčnou membránu efektivně transportovat, a zároveň zajistily ochranu NK před degradací in vivo (Stewart, Μ. P.: Chem. Rev. 2018,118, 7409-7531).
Pro transfekci NK jsou využívány jak virové, tak nevirové (fýzikální, chemické) vektory. Přestože cca 70 % klinických testů v oblasti genové terapie bylo dosud prováděno za pomoci virových vektorů, tento přístup s sebou nese četná rizika (karcinogenicitu, vyvolání imunitní
- 1 CZ 310613 B6 reakce, tkáňovou nespecifičnost, omezenou kapacitu inkorporace NK i výrobní náročnost). Fyzikální metody (např. elektroporaci) lze jen obtížně systémově využít v humánní medicíně.
Oproti tomu syntetické chemické vektory většinou vykazují nižší imunogenicitu, jsou schopny dopravovat větší množství genetického materiálu a vzhledem ktomu, že jsou tvořeny přesně definovanými molekulami, lze podle potřeby ovlivňovat jejich strukturu, zvýšit tím jejich účinnost a potlačit toxicitu. Jako chemické vektory jsou využívány kationické polymery nebo kationické lipidy, které vytváří s negativně nabitou NK komplex. Tento komplex je schopný proniknout přes buněčnou membránu a zároveň chrání NK před degradací v extracelulámím prostředí.
Ze strukturního hlediska jsou v současné době nej perspektivnější a klinicky nej pokročilejší formou těchto komplexů tzv. lipidické nanočástice (LNP). V nich jsou kationické lipidy obvykle formulovány s PEGylovaným lipidem, který brání agregaci, ovlivňuje velikost částic a jejich transfekční účinnost, pomocným lipidem a cholesterolem, které jsou nezbytné pro stabilní enkapsulaci NK, jak bylo ukázáno např. na systému pro transfekci siRNA (Kulkami, J.: Nanoscale. 2019, //. 21733-21739). LNP mohou pojmout molekuly NK o velikosti od několika nukleotidových jednotek až po miliony.
Syntetické kationické lipidy a lipidoidy (syntetické molekuly podobné lipidům lišící se větším množstvím hydrofobních řetězců) jsou tvořeny kationickou a hydrofobní doménou. Do dnešní doby bylo vyvinuto velké množství těchto látek s vysokou strukturní variabilitou obou domén, a to jak pomocí cíleného designu, tak testováním kombinatoriálně generovaných knihoven.
K transfekci siRNA byly speciálně vyvinuty lipidy a lipidoidy jako D-Lin-MC3-DMA, C12-200, cKK-E12, SA2-SC8 a další (Dong, Y.: Adv. Drug Deliv. Rev. 2019, 144, 133-147). Formulace obsahující D-Lin-MC3-DMA byla nedávno (srpen 2018) uvedena pod názvem Onpattro (původně Patisiran) do klinické praxe, a stala se tak prvním schváleným siRNA léčivem vůbec (Zhang, X.: J. Clin. Pharmacol. 2020, 60 (1), 37-49). Formulace vyvinuté pro siRNA však nemusí být efektivní v případě mRNA, a cílená optimalizace je proto nezbytná (Cullis, P.: Mol. Ther. 2017, 25 (7), 1467-1475).
Pro transfekci mRNA se užívají ionizovatelné lipidy a lipidoidy jako D-Lin-MC3-DMA, C12200, CKK-E12, a TT3 (Zhong, Z.: Nano Today 2018, 23, 16-39; Kowalski, P.: Mol. Ther. 2019, 27 (4), 1-19; Li, B.: Nano Lett. 2015, 15, 8099-8107). Ionizovatelné lipidy jsou využívány i pro transfekci DNA. Opět je nutno zdůraznit, že transfekční systémy optimalizované pro transfekci malých molekul (siRNA) nejsou vždy vhodné pro transfekci DNA, a dokonce ani formulace vyvinuté pro mRNA nemusí být efektivní v případě DNA (Buck, J.: ACS Nano 2019, 13, 37543782).
Vzhledem ktomu, že dosud jen velmi málo syntetických vektorů založených na ionizovatelných lipidech bylo - navzdory enormnímu terapeutickému potenciálu - dovedeno až do fáze klinického využití, je nezbytné vyvíjet nové systémy s vyšší efektivitou, které zároveň budou vykazovat co nej nižší in vivo toxicitu.
Podstata vynálezu
Předmětný vynález řeší problém efektivity transfekce a cíleného dopravování nukleotidů a nukleových kyselin a jejich syntetických analogů za použití ionizovatelných (kationických) lipidů a problém toxicity těchto lipidů pro cílový organismus anebo buňku. Zjistili jsme překvapivě, že pokud se jako centrální jádro ionizovatelného lipidoidu využije adamantan, zvýší se významně transfekční účinnost takovýchto lipidoidů oproti dosud známým řešením, zvláště při transfekci mRNA, cyklických dinukleotidů, siRNA, i DNA. Zároveň tyto lipidoidy obsahující adamantan vykazují při relevantních dávkách extrémně nízkou cytotoxicitu. U myší nevyvolávají žádné
-2 CZ 310613 B6 známky toxicity po intravenozní ani intraperitoneální aplikaci. Specifickou vlastností adamantanového jádra, užitého jako centrální strukturní motiv nových ionizovatelných lipidoidů, je v porovnání s dosud vyvinutými ionizovatelnými lipidy a lipidoidy sterická náročnost v jeho blízkosti a vysoká rigidita. Je též známo, že výhodou bioaktivních látek strukturně odvozených od adamantanu je obecně dobrá biokompatibilita, a tedy vhodnost pro farmaceutické využití v humánní medicíně.
Předmětem vynálezu jsou ionizovatelné lipidoidy obecného vzorce I (I) kde X je zvoleno ze skupiny, zahrnující -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, -C(=0)NHNH-, -CH2-, -O-, -S-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=0)-, -NHNHC(=0)-, -OC-, -CH=CH-, -CH2C(=0)NH-, -CH2C(=O)O-, CH2C(=S)O-, CH2C(=S)S-, -CH2C(=0)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-;
Y je zvoleno ze skupiny, zahrnující alkylenový řetězec C2-Cio;
Z je atom vodíku;
a R jsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé R je zvoleno ze skupiny, zahrnující alkyl C\C20, alkenyl Cs-C2o, alkynyl Cs-C2o, přičemž v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více -CH2- skupin nahrazeno jednou nebo více skupinami vybranými z -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -S-S-, -C(=0)NH-, -NHC(=0)-, -O-, -S-;
a jejich farmaceuticky přijatelné soli, adiční soli a solváty.
Termín „alkyl“ znamená nasycený uhlovodíkový řetězec, který může být přímý, větvený nebo cyklický nebo cyklus-obsahující.
Termín „alkenyl“ znamená uhlovodíkový řetězec obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu mezi atomy uhlíku, který může být přímý, větvený nebo cyklický nebo cyklus-obsahující.
Termín „alkynyl“ znamená uhlovodíkový řetězec obsahující alespoň jednu trojnou vazbu mezi atomy uhlíku, a popřípadě navíc i jednu nebo více dvojných vazeb mezi atomy uhlíku, který může být přímý, větvený nebo cyklický nebo cyklus-obsahující.
Termín „alkylenový řetězec“ znamená nasycený uhlovodíkový řetězec, který může být přímý, větvený nebo cyklický nebo cyklus-obsahující, ale s výhodou je přímý. Tento řetězec má dvě valence, tedy váže se jako linker nebo můstek dvěma vazbami.
V případě, že molekula obecného vzorce I má kladný náboj, je součástí sloučeniny protiont, což může být farmaceuticky přijatelný anion organické nebo anorganické kyseliny, čímž vzniká farmaceuticky přijatelná sůl. Takový anion může být vybrán například ze skupiny zahrnující acetát, aspartát, benzesulfonát, benzoát, besylát, bikarbonát, bitartarát, bromid, kamsylát, karbonát, chlorid, citrát, dekanoát, edetát, esylát, fumarát, gluceptát, glukonát, glutamát, glykolát,
-3 CZ 310613 B6 hexanoát, jodid, laktát, malát, maleát, mandelát, mesylát, methansulfát, napsylát, nitrát, oktanoát, oleát, palmoát, pantothenát, fosfát, polygalakturonát, propionát, salicylát, stearát, sukcinát, sulfát, tartarát, tosylát.
Pokud sloučenina vzorce I obsahuje chirální centra, pak vzorec I zahrnuje čisté enantiomery i směsi enantiomerů včetně racemátu.
Vzorec I zahrnuje sloučeniny vzorce I ve volné formě, i ve formě solí, adičních solí (s kyselinami nebo bázemi) a/nebo solvátů, včetně hydrátů či alkoholových solvátů.
Spojka X ve vzorci I je vytvořena reakcí navázání aminových částí molekuly k centrálnímu adamantanovému jádru. Může se proto jednat o různé spojky, v závislosti na zvolené reakci, např. tvorbě esteru, amidu a jejich analogů, atd. X je tedy zvoleno ze skupiny, zahrnující -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-, -C(=S)S-, -C(=0)NHNH-, -CH2-, -O-, -S-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=0)-, -NHNHC(=0)-, -OC-, -CH=CH-, -CH2C(=0)NH-, -CH2C(=O)O-, CH2C(=S)O-, CH2C(=S)S-, -CH2C(=0)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-. S výhodou je X zvoleno z -C(=0)NH-, -C(=O)O-.
Spojka Y je alkylenový řetězec zajišťující alespoň minimální vzdálenost aminu od spojky X a adamantanového jádra. Y je alkylenový řetězec C2-C10, s výhodou C2-G.
Substituent Z může dále v malém rozsahu upravovat vlastnosti látky vzorce I. S výhodou je Z atom vodíku.
Řetězce R mohou být vzájemně stejné nebo různé, s výhodou jsou stejné, nebo jsou všechny atomy dusíku substituovány shodně (dvěma stejnými R nebo dvěma různými R), z důvodu syntetické jednoduchosti. Rjsou mastné řetězce, a jsou vybrány ze skupiny zahrnující alkyl GC20, alkenyl Cs-C2o, alkynyl Cs-C2o, přičemž v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více -CH2- skupin nahrazeno jednou nebo více skupinami vybranými z CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -SS-, -C(=0)NH-, -NHC(=0)-, -O-, -S-. S výhodou jsou R vybrány ze skupiny zahrnující alkyl Cs-C2o, alkenyl Cs-C2o, alkynyl Cs-C2o, přičemž v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více -CH2- skupin nahrazeno jednou nebo více skupinami vybranými z -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-.
Látky obecného vzorce I se připraví odpovídající reakcí adamantanového prekurzoru, substituovaného skupinou Z v poloze 7 a prekurzorovými skupinami spojky X v polohách 1, 3, 5 s aminem obecného vzorce X'-Y-NR2, kde X' je prekurzorová skupina spojky X. Amin lze připravit odborníkovi známými reakcemi a postupy, a některé vhodné aminy jsou i komerčně dostupné.
V konkrétnějším příkladu se látky obecného vzorce I se s výhodou připraví tak, že se nechá reagovat látka obecného vzorce II
Z.
AOOC
AQOC (Π), kde A je vodík, s diaminem obecného vzorce III
-4 CZ 310613 B6
Η·5Ν \· — (III) za přítomnosti kondenzačního činidla a báze, nebo se nechá reagovat látka obecného vzorce II, kde A je halogen, s diaminem obecného vzorce III za přítomnosti báze.
Předmětem předkládaného vynálezu je také transfekční činidlo obsahující alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I, a alespoň jeden pomocný lipid. Transfekční činidlo lze připravit smísením složek.
S výhodou transfekční činidlo obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I v množství 10 až 50 molámích procent, a alespoň jeden pomocný lipid v množství 50 až 90 molámích procent. S výhodou obsahuje transfekční činidlo alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I v množství 15 až 30 molámích procent, a alespoň jeden pomocný lipid v množství 70 až 85 molámích procent. V některých výhodných provedeních obsahuje transfekční činidlo alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I v množství 15 až 30 molámích procent, cholesterol v množství 30 až 55 molámích procent, a alespoň jeden další pomocný lipid v množství 20 až 50 molámích procent.
Ve zvláště výhodném provedení transfekční činidlo obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I v množství 15 až 30 molámích procent, cholesterol v množství 30 až 55 molámích procent, l,2-dioleoyl-5«-glycero-3-fosfoethanolamin v množství 20 až 45 molámích procent a l,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylenglykol-2000 v množství 0,5 až 5 molámích procent.
Předmětem předkládaného vynálezu je také transfekční částice obsahující alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I, alespoň jednu nukleovou kyselinu a/nebo její kratší úsek a/nebo její derivát, a s výhodou dále alespoň jeden pomocný lipid. Transfekční částice lze připravit například tak, že se roztok lipidoidu obecného vzorce I, obsahující případně pomocné lipidy, smísí s roztokem nukleové kyseliny a/nebo jejího kratšího úseku a/nebo jejího derivátu.
Hmotnostní poměr celkového množství nukleové kyseliny a/nebo jejího derivátu ku celkovému množství lipidoidu obecného vzorce I a pomocných lipidů v transfekční částici je s výhodou v rozmezí 1:2 až 1:500, výhodněji 1:5 až 1:100. Konkrétně a pro ilustraci: v částicích, jejichž příprava je popsána v příkladech, byl tento poměr pro mRNA kolem 1:9 a pro siRNA kolem 1:68.
Transfekční částice jsou obvykle nanočástice, čímž jsou obecně rozuměny částice mající rozměry v rozmezí 1 až 1000 nm. Typicky jsou rozměry transfekčních nanočástic v rozmezí 50 až 1000 nm, výhodněji 50 až 500 nm, ještě výhodněji 50 až 200 nm.
Struktura transfekčních částic byla pozorována metodou kryogenní transmisní elektronové mikroskopie, a pozorování ukázala, že se jedná o kompaktní vrstevnaté lipidické nanočástice obsahující uvnitř nukleovou kyselinu.
Pomocnými lipidy jsou v transfekčních činidlech a transfekčních částicích zejména kationické lipidy, steroidy či konjugáty lipidů s hydrofilními polymery [jako je poly(ethylenglykol), poly(2ethyl-2-oxazolin), poly(2-methyl-2-oxazolin), poly(glycerol), poly(/V-(2hydroxypropyl) methakrylamid), glykol chitosan]. Pomocné lipidy mohou být například vybrány z cholesterolu, l,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylenglykol-2000, l.2-diolcoyl-s77glycero-3-fosfoethanolaminu, l.2-diolcoyl-s77-glyccro-3-fosfocholinu. 1,2-distearoyl-s77-glyccro3-fosfocholinu, l.2-diolcoyl-s77-glyccro-3-fosfocthanolamin-A'-(C’yaninc 5).
-5 CZ 310613 B6
Vlákno nukleové kyseliny a její kratší úseky obsahují jeden nebo více nukleotidů a/nebo deoxynukleotidů. Nukleová kyselina a její kratší úseky mohou mít povahu terapeutického, diagnostického či profylaktického agens nebo mohou zajistit značení buněk či tkání, do nichž jsou transfekovány. Sloučeniny obecného vzorce I tedy mají zejména terapeutické nebo biotechnologické využití.
Nukleová kyselina a její kratší úseky jsou vybrány z oligonukleotidů (1 až 100 nukleotidů, např. aptamerů), cyklických dinukleotidů (např. 2’,3’-cGAMP), antisenzních oligonukleotidů, deoxyribonukleové kyseliny (jednořetězcové DNA, dvouřetězcové DNA, cDNA, plasmidové DNA kódující gen nebo geny), ribonukleové kyseliny, typicky mediátorové RNA (mRNA), transferové RNA (tRNA), malé interferující RNA (siRNA), dvouřetězcové RNA, mikro-RNA (miRNA), piwi-RNA (piRNA), antisensní RNA (asRNA), tzv. guide RNA (gRNA) systému CRISPR a jejich kombinací (typicky např. gRNA a mRNA kódující Cas9 nukleasu, Casl3a/C2c2 a Casl3b, či analogické nukleasy vhodné pro využití v systému CRISPR, CRISPRi a dalších variací a následné úpravě genomu hostitelské buňky či tkání či úpravě transkriptomu hostitelské buňky či tkání). Všechny zde uvedené nukleové kyseliny (NK) dále mohou být tvořené či upravené pomocí syntetických analogů bází, například za účelem zvýšení stability v biologických systémech. Syntetické analogy NK zahrnují zejména tyto substituce: 2’-O-methyl, 2’-Omethoxyethyl, 2’-fluoro, methylenový můstek mezi 2’-kyslíkem a 4’-uhlíkem pentosového kruhu (tzv. locked nucleic acid), fosforylaci na 5’ a/nebo 3’ konci vlákna, boranofosfonáty, fosforothioáty.
Předkládaný vynález dále zahrnuje použití lipidoidů obecného vzorce I pro transfekci buněk či tkání nukleovou kyselinou a/nebo jejím kratším úsekem a/nebo jejím derivátem in vitro. Kromě toho vynález zahrnuje lipidoidy obecného vzorce I nebo transfekční částice pro použití pro transfekci buněk či tkání nukleovou kyselinou a/nebo jejím kratším úsekem a/nebo jejím derivátem in vivo (kromě transfekce lidských embryí, a kromě modifikace lidské zárodečné linie).
Transfekční částice obsahující lipidoidy obecného vzorce I jsou využitelné pro řadu biologických aplikací v základním výzkumu, zejména pro transfekce buněčných kultur či zvířat s cílem doručení aktivní NK a následného umlčení či aktivace chromozomálního genu či genů, editaci genomu (vystřižení genu, vložení genu či zavedení mutace genu) nebo transkriptomu či umožnění exprese daného proteinu kódovaného NK vloženou pomocí transfekční částice, tzv. „in trans“.
Ve veterinární a humánní medicíně lze transfekční částice obsahující lipidoidy obecného vzorce I s výhodou využít pro terapeutické účely či profýlaktické účely. Částice obsahující terapeutickou NK lze do zvířete či člověka administrovat s cílem umlčení či aktivace chromozomálních genu/ů, umlčení nebo aktivace imunogenů, inhibice či aktivace signálních drah, editace genomu (vystřižení genu, vložení genu či zavedení mutace genu) nebo transkriptomu či umožnění exprese daného proteinu/ů kódovaného NK.
Předkládaný vynález rovněž zahrnuje lipidoidy obecného vzorce I nebo transfekční činidla nebo transfekční částice pro použití jako léčiva, zejména pro genovou terapii. Zejména jsou vhodné pro použití pro léčbu malignit a/nebo genetických poruch.
Lipidoidy obecného vzorce I nebo transfekční částice lze formulovat pro terapeutické, kosmetické či biotechnologické použití ve formě přípravků s farmaceuticky přijatelnými excipienty. Přípravky mohou být v kapalné formě či pevné formě, případně v dalších formách, jako je například aerosol. Kapalné formy zahrnují roztoky, suspense, disperze, upravené například pro injekční či perorální podání. Pevné formy zahrnují například kapsle, tablety, potahované tablety, prášky, čípky, a další formy.
-6 CZ 310613 B6
Farmaceuticky přijatelné excipienty zahrnují rozpouštědla, činidla regulující rozpustnost, činidla regulující pH, nosiče, plniva, pojivá, kluzné látky, disintegranty, konzervační činidla, sorbenty, činidla regulující viskozitu, činidla ovlivňující senzorické vlastnosti, jako je chuť, vůně či barva přípravku.
Lipidoidy obecného vzorce I nebo transfekční činidla nebo transfekční částice mohou být dále s výhodou využity pro účely kosmetického průmyslu za účelem doručení aktivní látky na místo účinku. Takto mohou být transfekční částice s aktivní látkou připraveny v podobě krému, pasty, balzámu, tekutiny a dalších a použity dále jako make-up, vlasová kosmetika, či produkt osobní hygieny.
Objasnění výkresů
Obrázek 1. Schéma syntézy lipidoidů 4a-g.
Obrázek 2. Schéma syntézy lipidoidů 9.
Obrázek 3. Schéma syntézy lipidoidů 13.
Obrázek 4. Schéma syntézy lipidoidů 21.
Obrázek 5. Ověření funkčního doručení mRNA-LNP (B27) do jater myší.
Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam zkratek:
ekv. Rf TLC RVO rt br s s d m dd ekvivalent retenční faktor chromatografie na tenké vrstvě rotační vakuová odparka laboratorní teplota široký signál singlet dublet multiplet dublet dubletů interakční konstanta
d HRMS ESI MALDI IR NMR CE5 CE20 CE50 Dl D2 D3 D4 TFA HCTU chemický posun hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením ionizace elektrosprejem ionizace laserem za přítomnosti matrice infračervená spektroskopie nukleární magnetická rezonance směs cyklohexan-ethylacetát 95:5 (v/v) směs cyklohexan-ethylacetát 80:20 (v/v) směs cyklohexan-ethylacetát 50:50 (v/v) směs dichlormethan-methanol-25% vodnýNHs 75:22:3 (v/v/v) směs dichlormethan-methanol-25% vodnýNHs 175:22:3 (v/v/v) směs dichlormethan-methanol-25% vodný NH3 275:22:3 (v/v/v) směs dichlormethan-methanol-25% vodnýNHs 375:22:3 (v/v/v) trifluoroctová kyselina O-( 1 //-6-chlorbcnzotriazol -1 -yl)-1,1,3,3 -tetramethyluronium
-7 CZ 310613 B6 hexafluorofosfát DIPEA DMF DCM
ACN TBDPSC1
DIC DMAP
LNP NK DNA RNA mRNA siRNA tRNA miRNA ssDNA/RNA dsDNA/RNA
DMG-PEG2000 DOPE DOPC DSPC DOPE-Cy5 Lip2000
AA'-diisopropylcthylamin
ΛΆ'-dimcthylformamid dichlormethan acetonitril terc-butyldifenylchlorsilan diisopropylkarbodiimid
4-dimethylaminopyridin lipidické nanočástice nukleová kyselina deoxyribonukleová kyselina ribonukleová kyselina mediátorová RNA malá interferující RNA transferová RNA mikro RNA jednořetězcová DNA/RNA dvouřetězcová DNA/RNA l,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylenglykol-2000
1,2-dioleoyl-5«-glycero-3 -phosphoethanolamin
1,2-dioleoyl-5«-glycero-3 -fosfocholin
1,2-di stearoyl-sw-glyccro-3-fosfochol in
l.2-diolcoyl-sw-glyccro-3-fosfocthanolamin-A-(Cyaninc 5)
Lipofectamine® 2000 (Invitrogen)
Příklad 1
AW-Didodccylcthan-l.ž-diamin 3a
Do 500ml baňky s kulatým dnem opatřené chlorkalciovým uzávěrem a magnetickým míchadlem byl vložen roztok aminu la (5,00 g, 31,2 mmol) v DCM (100 ml) a ochlazen na 0 °C v ledové lázni. Za intenzivního míchání byl přidán n-dodecylaldehyd (20,8 ml, 93,6 mmol, 3 ekv.), a následně triacetoxyborohydrid sodný (19,8 g, 93,6 mmol, 3 ekv.) ve třech dávkách v průběhu 10 minut. Chladicí lázeň byla odstraněna, a reakční směs byla míchána 2 h za laboratorní teploty. Průběh reakce byl sledován pomocí TLC za použití mobilní fáze hexan-ethylacetát 80:20 (v/v) na TLC-destičce předem saturované amoniakem (detekce ninhydrinem). Po skončení reakce byl přidán vodný roztok NaOH (1 M, 200 ml), reakční směs byla míchána 15 min, poté přelita do dělicí nálevky a naředěna vodou (300 ml). Produkt byl extrahován DCM (300 ml, 2x50 ml), spojená organická fáze promyta solankou (50 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Tmavý olej ovitý odparek byl přečištěn chromatografri na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu ethylacetátu v hexanu (10 až 30 %). Byl získán amin 2a (5,12 g, 33,0 %) ve formě nažloutlého oleje.
K roztoku látky 2a (5,12 g) v DCM (10 ml) ochlazenému za míchání v ledové lázni na 0 °C byla přidána trifluoroctová kyselina (10 ml), a reakční směs byla ponechána při 0 °C 3 h. Poté byl roztok přelit do 11 dělicí baňky, naředěn 20% vodným roztokem Na2CO2 (300 ml), a produkt byl extrahován DCM (250 ml, 2x50 ml). Spojená organická fáze promyta solankou (100 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surový produkt byl přečištěn chromatografri na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu Dl v DCM (0 až 70 %). Byl získán diamin 3a (2,55 g, 62,4 %; A/0,46 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCI3): δ = 2,895, 2,64, 2,48, 1,45, 1,28, 1,26, 1,24-1,28, 1,24, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCI3): δ = 54,31, 53,85, 38,33, 31,90, 29,65, 29,62, 29,61, 29,52, 29,34, 26,36, 23,88, 22,67, 14,10 ppm. IR (film): VnUcm1 = 3371 w a 3315 w (v NH2), 2801 m (vs N-CH2), 2953 s (Vas CH3), 2924 vs (vas CH2), 2853 s (vs CH2), 1467 m a 1457 m, sh (βδ CH2 a
-8CZ 310613 B6
5as CH3), 1378 w a 1367 w (5S CH3), 721 m (β;ι?, CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C26H57N2 [M + H]+ 397,45163; nalezeno 397,45093.
Al.A'A's-Tris(2-(didodccylamino)cthyl)adamantan-l.3.5-trikarboxamid 4a
K roztoku adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (40 mg, 0,149 mmol) v bezvodém DMF (1,5 ml) byl přidán O-(lH-6-chlorbenzotriazol- 1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfát (HCTU, 256 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.) a Λ'.Λ'-diisopropylcthylamin (DIPEA, 0,415 ml, 2,39 mmol, 16 ekv.), a roztok byl míchán 15 min za teploty místnosti. Poté byl přidán roztok /VýM-didodecylethan-l^-diaminu 3a (237 mg, 0,149 mmol, 4 ekv.) v DCM (1,0 ml), a reakční směs byla míchána 12 h. Roztok byl přelit do 250ml dělicí baňky, naředěn nasyceným vodným roztokem NaHCOs (50 ml), a produkt byl extrahován DCM (50 ml, 2x20 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (20 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surový produkt byl přečištěn chromatografň na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu Div DCM (20-50 %). Byl získán lipidoid 4a (71 mg, 33,9 %; Rf0,T3 v D2 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCI3): δ = 7,33, 3,56, 3,32, 3,125, 3,075, 2,34, 2,01, 1,91, 1,79, 1,67, 1,36, 1,285, 1,26-1,32, 1,25, 0,88 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCI3): δ = 180,48, 56,72, 53,78, 41,38, 39,04, 36,86, 36,29, 31,90, 29,64, 29,62, 29,50, 29,40, 29,35, 29,04, 27,79, 26,36, 23,88, 22,68, 14,10 ppm. IR (CCI4): Vmax/cm1 = 3440 w a 3322 w (v NH), 1653 w (amid I) a 1623 w (amid I vázaný), 1535 w (amid II), 2956 m (vas CH3), 2927 vs (vas CH2), 2855 m (vs CH2), 1467 w a 1457 w (βδ CH2 a óas CH3), 1378 w (ds CH3). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro C91H179N6O3 [M + H]+ 1404,4033; nalezeno 1404,4012.
Příklad 2 /V^/V'-Didodecylpropan-Ed-diamin 3b
Amin 2b byl připraven z aminu íb (6,0 g, 34,43 mmol), n-dodecylaldehydu (22,91 ml, 103,30 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (21,89 g, 103,30 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 2a v Příkladu 1. Amin 2b byl získán ve formě nažloutlého oleje (7,72 g, 43,9 %).
Odchránění aminu 2b bylo provedeno podle procedury popsané pro látku 2a v Příkladu 1; byl získán diamin 3b (4,26 g, 68,6 %; R/0,35 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCls): δ = 3,07, 2,70, 2,50, 1,81, 1,46, 1,28, 1,26, 1,25-1,29, 1,24, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCls): δ = 53,70, 53,30, 41,18, 31,90, 29,64, 29,62, 29,60, 29,58, 29,48, 29,33, 27,42, 25,71, 23,87, 22,67, 14,10 ppm. IR (film): Vm^/cnr1 = 3361 w a 3274 w (v NH2), 2803 m (vs N-CH2). 2954 s (vas CH3), 2924 vs (vas CH2), 2853 s (vs CH2), 1467 m a 1456 m, sh (βδ CH2 a óas CH3), 1378 w a 1364 w (6S CH3), 720 m (β;ι?, CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C27H59N2 [M + H]+ 411,46728; nalezeno 411,46652.
/Vý/VýM-trisO-ididodecylaminolpropylladamantan-l^S-trikarboxamid 4b
Lipidoid 4b byl připraven z adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (20 mg, 0,075 mmol), HCTU (128 mg, 0,298 mmol, 4 ekv.), DIPEA (0,208 ml, 1,19 mmol, 16 ekv.) a diaminu 3b (123 mg, 0,298 mmol, 4 ekv.) podle procedury popsané pro látku 4a v Příkladu 1; byl získán lipidoid 4b (64 mg, 59,3 %; Rf 0,51 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě žlutého viskózního oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCI3): δ = 7,59, 3,36, 2,99, 2,88, 2,31, 2,13, 2,00, 1,96, 1,81, 1,67, 1,31, 1,28, 1,25-1,30, 1,24, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCI3): δ = 177,39, 55,22, 50,70, 41,78, 40,38, 37,20, 35,67, 31,89, 29,60, 29,51, 29,48, 29,32, 29,19, 28,39, 26,94, 24,10, 23,68, 22,67, 14,10 ppm. IR (CC14): Vn^/cm1 = 3466 w a 3287 w (v NH), 1656 m (amid I) a 1511 m (amid II), 2814 w (vs CH2NR2). 2954 s (vas
-9CZ 310613 B6
CH3), 2927 vs (Vas CH2), 2871 m (vs CH3), 2855 s (vs CH2), 1468 m a 1456 m (βδ CH2 a 5as CH3), 1378 w (5S CH3), 721 w (β1?, CH2). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro C94Hi85O3N6 [M + H]+ 1446,45027; nalezeno 1446,44896.
Příklad 3
A.A-Didodccylbutan-l.á-diamin 3c
Amin 2c byl připraven z aminu 1c (5,0 g, 26,56 mmol), n-dodecylaldehydu (17,67 ml, 79,67 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (16,89 g, 79,67 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 2a v Příkladu 1. Amin 2c byl získán ve formě nažloutlého oleje (4,15 g, 29,8%).
Odchránění aminu 2c bylo provedeno podle procedury popsané pro látku 2a v příkladu 1; byl získán diamin 3c (2,36 g, 70,3 %; 7?/0,29 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. 1H NMR (600 MHz, CDC13): δ = 2,85, 2,81, 2,59, 1,725, 1,68, 1,51, 1,28, 1,265, 1,25-1,30, 1,24, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 53,33, 52,74, 40,44, 31,90, 29,64, 29,60, 29,60, 29,40, 29,33, 28,65, 27,46, 24,83, 24,40, 22,67, 14,10 ppm. IR (film): Vn^/cm1 = 3370 w a 3274 w (v NH2), 2798 m (vs NCH2). 2957 s (vas CH3), 2924 vs (vas CH2), 2853 s (vs CH2), 1467 m a 1456 m, sh (βδ CH2 a 6as CH3), 1378 w a 1367 w (5S CH3), 720 m (β;ι?, CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C28H6iN2 [M + H]+ 425,48293; nalezeno 425,48227.
/V1,/V3ýV5-tris(4-(didodecylamino)butyl)adamantan-l,3,5-trikarboxamid 4c
Lipidoid 4c byl připraven z adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (40 mg, 0,149 mmol), HCTU (256 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.), DIPEA (0,416 ml, 2,39 mmol, 16 ekv.) a diaminu 3c (253 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.) podle procedury popsané pro látku 4a v Příkladu 1; byl získán lipidoid 4c (64 mg, 28,8 %; Rf 0,48 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. Ή NMR (600 MHz, CDC13): δ = 7,27, 3,335, 3,03, 2,98, 2,28, 2,12, 2,06, 1,875, 1,81, 1,74, 1,64, 1,33, 1,28, 1,251,29, 1,24, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 177,27, 52,78, 52,27, 41,83, 40,26, 37,36, 37,20, 31,88, 29,58, 29,49, 29,43, 29,31, 29,10, 28,37, 26,82, 26,56, 22,94, 22,66, 20,79, 14,10 ppm. IR (CCL): Vmax/cm’1 = 3441 w a 3329 w (v NH), 1641 m (amid I), 1534 w (amid II), 2956 m (vas CH3), 2927 vs (vas CH2), 2855 m (vs CH2), 1466 m a 1458 m (βδ CH2 a das CH3), 1378 w (ds CH3). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro CgyHigiNeCL [M + H]+ 1488,4972; nalezeno 1488,4956.
Příklad 4 /V1 ,/V1 -Didodecylpentan-1,5 -diamin 3 d
Amin 2d byl připraven z aminu Id (5,0 g, 24,72 mmol), n-dodecylaldehydu (16,45 ml, 74,15 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (15,71 g, 74,15 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 2a v Příkladu 1. Amin 2d byl získán ve formě nažloutlého oleje (6,01 g, 45,1 %).
Odchránění aminu 2d bylo provedeno podle procedury popsané pro látku 2a v Příkladu 1; byl získán diamin 3d (4,32 g, 88,3 %; 7?/0,28 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDC13): δ = 2,75, 2,68, 2,55, 1,565, 1,53, 1,50, 1,35, 1,28, 1,27, 1,24-1,28, 1,24, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 53,61, 53,55, 41,48, 32,10, 31,89, 29,63, 29,61, 29,58, 29,45, 29,32, 27,41, 25,74, 24,90, 24,55, 22,66, 14,09 ppm. IR (film): VnUcm1 = 3367 w a 3284 w (v NH2), 2797 m (vs N-CH2). 2956 s (vas CH3), 2924 vs (vas CH2), 2853 s (vs CH2), 1467 m a 1456 m, sh (βδ CH2 a 6as CH3), 1378 w a 1367 w (δ., CH3), 720 m (β;ι?, CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro
- 10CZ 310613 B6
C29H63N2 [Μ + H]+ 439,49858; nalezeno 439,49783.
AÚAAA'ůTris(5-(didodccylamino)pcntyl)adamantan-l.3.5-trikarboxamid 4d
Lipidoid 4d byl připraven z adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (40 mg, 0,149 mmol), HCTU (256 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.), DIPEA (0,416 ml, 2,39 mmol, 16 ekv.) a diaminu 3d (262 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.) podle procedury popsané pro látku 4a v příkladu 1; byl získán lipidoid 4d (74 mg, 32,4 %; Rf 0,49 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCI3): δ = 6,91, 3,27, 2,99, 2,29, 2,09, 1,97, 1,82, 1,81, 1,76, 1,59, 1,45, 1,34, 1,28, 1,25-1,30, 1,24, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCI3): δ = 177,01, 52,77, 52,30, 41,82, 40,10, 38,33, 37,59, 31,88, 29,58, 29,48, 29,43, 29,30, 29,09, 28,53, 28,39, 26,84, 23,83, 23,09, 23,02, 22,66, 14,10 ppm. IR (CCU): Vmax/cm1 = 3322 w (v NH), 1640 m (amid I), 1535 w (amid II), 2956 m (vas CH3), 2927 vs (Vas CH2), 2855 m (vs CH2), 1467 m a 1457 m (βδ CH2 a óas CH3), 1378 w (ds CH3), 722 m (Pas CH2). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro CiooHmNeCE [M + H]+ 1530,5442; nalezeno 1530,5478.
Příklad 5 /V^/V'-Didodecylhexan-lA-diamin 3e
Amin 2e byl připraven z aminu le (5,0 g, 23,11 mmol), n-dodecylaldehydu (15,38 ml, 69,34 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (14,70 g, 69,34 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 2a v příkladu 1. Amin 2e byl získán ve formě nažloutlého oleje (3,67 g, 28,7 %).
Odchránění aminu 2e bylo provedeno podle procedury popsané pro látku 2a v příkladu 1; byl získán diamin 3e (2,17 g, 72,2 %; Rf 0,31 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCls): δ = 2,73, 2,65, 2,57, 1,56, 1,52, 1,51, 1,36, 1,31, 1,28, 1,25-1,29, 1,24, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCls): δ = 53,51, 53,20, 41,62, 32,40, 31,89, 29,63, 29,61, 29,57, 29,44, 29,32, 27,39, 27,09, 26,53, 25,65, 25,02, 22,66, 14,10 ppm. IR (film): VnUcm1 = 3374 w a 3294 w (v NH2), 2797 m (vs N-CH2). 2956 s (vas CH3), 2924 vs (vas CH2), 2853 s (vs CH2), 1467 m a 1455 m, sh (βδ CH2 a óas CH3), 1378 w a 1367 w (δ?, CH3), 721 m (β3 CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C30H65N2 [M + H]+ 453,51423; nalezeno 453,51340.
A1 ,N3 JM5-Tris(6-(didodecylamino)hexyl)adamantan-1,3,5 -trikarboxamid 4e
Lipidoid 4e byl připraven z adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (40 mg, 0,149 mmol), HCTU (256 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.), DIPEA (0,416 ml, 2,39 mmol, 16 ekv.) a diaminu 3e (270 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.) podle procedury popsané pro látku 4a v příkladu 1; byl získán lipidoid 4e (91 mg, 38,8 %; Rf 0,52 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCI3): δ = 7,80, 3,33, 3,03, 2,99, 2,37, 2,27, 2,02, 1,92, 1,81, 1,76, 1,62, 1,43, 1,41, 1,34, 1,285, 1,26-1,30, 1,24, 0,88 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCls): δ = 177,87, 52,87, 52,26, 41,74, 39,31, 36,86, 31,90, 29,60, 29,50, 29,44, 29,32, 29,10, 28,26, 26,82, 25,77, 25,52, 23,44, 23,14, 22,68, 14,12 ppm. IR (CC14): VnUcm1 = 3463 w a 3327 w (v NH), 1641 m (amid I), 1535 m (amid II), 2958 s (vas CH3), 2871 s (vs CH3), 1467 m a 1457 m (βδ CH2 a óas CH3), 2927 s (vas CH2), 2855 s (vs CH2), 1378 w (6S CH3), 721 w (β1?, CH2), 2799 w (vs CH2NR2). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro Cio3H2o3Ne03 [M + H]+ 1572,5911; nalezeno 1572,5881.
Příklad 6
A1.Λ'1 -Didodecylheptan-1,7-diamin 3 f
- 11 CZ 310613 B6
Amin 2f byl připraven z aminu If (1,0 g, 4,34 mmol), w-dodecylaldehydu (3,14 ml, 13,02 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (2,76 g, 13,02 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 2a v Příkladu 1. Amin 2f byl získán ve formě nažloutlého oleje (1,74 g, 70,6 %).
Odchránění aminu 2f bylo provedeno ve směsi TFA (4 ml) a DCM (4 ml) podle procedury popsané pro látku 2a v příkladu 1; byl získán diamin 3f (0,842 g, 59,1 %; A/0,38 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDC13): δ = 2,73, 2,69, 2,64, 1,56, 1,50, 1,30, 1,28, 1,25-1,31, 1,25, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCI3): δ = 53,37, 53,20, 41,62, 32,22, 31,89, 27,10-29,60, 26,57, 25,14, 22,66, 14,10 ppm. IR (CC14): Vn^/cm1 = 3391 vw (vas NH2); 2960 s, sh (vas CH3); 2927 vs (vas CH2); 2872 s, sh (vs CH3); 2855 vs (vs CH2); 2798 m (vs N-CH2); 1467 s a 1458 m (βδ CH2 a óas CH3); 1378 w (5S CH3); 1302 w (ys CH2); 721 w (β1?, a yas CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C3iH6?N2 [M + H]+ 467,52988; nalezeno 467,52974.
Al.A'A's-Tris(7-(didodccylamino)hcptyl)adamantan-l.3.5-trikarboxamid 4f
Lipidoid 4f byl připraven z adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (40 mg, 0,149 mmol), HCTU (256 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.), DIPEA (0,416 ml, 2,39 mmol, 16 ekv.) a diaminu 3f (278 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.) podle procedury popsané pro látku 4a v Příkladu 1; byl získán lipidoid 4f (199 mg, 82,6 %; Rf 0,55 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. 1H NMR (600 MHz, CDCI3): δ = 7,97, 3,22, 3,09, 2,34, 1,92, 1,83, 1,82, 1,70, 1,58, 1,52, 1,36, 1,30, 1,285, 1,28, 1,25-1,32, 1,25, 0,88 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCI3): δ = 177,27, 54,00, 53,14, 41,59, 39,48, 39,30, 36,92, 31,89, 29,60, 29,48, 29,39, 29,32, 29,06, 28,22, 26,50, 25,58, 23,63, 23,38, 22,67, 14,10 ppm. IR (CCL): vmax/cm_1 = 3438 w (volná) a 3339, 3196 w (vázaná) (v NH); 1627 m (amid I); 1535 m (amid II); 2956 s, sh (vas CH3); 2873 m, sh (vs CH3); 1468 m a 1457 m, sh (β?, CH2 a óas CH3); 2927 vs (vas CH2); 2856 s (vs CH2); 1378 w (ds CH3); 722 w (β;ι?, CH2); 2805 w (vs CH?NR2). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro CioeH^gNeCL [M + H]+ 1614,6381; nalezeno 1614,6414.
Příklad 7
A'.A'-Didodccyloktan-IA-diamin 3g
Amin 2g byl připraven z aminu íg (1,0 g, 4,09 mmol), n-dodecylaldehydu (2,96 ml, 12,28 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (2,60 g, 12,28 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 2a v Příkladu 1. Amin 2g byl získán ve formě nažloutlého oleje (1,98 g, 83,1 %).
Odchránění aminu 2g bylo provedeno ve směsi TFA (4 ml) a DCM (4 ml) podle procedury popsané pro látku 2a v příkladu 1; byl získán diamin 3g (0,848 g, 52,0 %; A/0,35 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCI3): δ = 2,70, 2,63, 2,53, 1,51, 1,47, 1,32, 1,28, 1,25-1,32, 1,25, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCI3): δ = 53,61, 53,20, 41,92, 33,00, 31,90, 27,30-29,60, 26,70, 25,83, 22,67, 14,10 ppm. IR (CC14): Vmax/cnr1 = 3391 vw (vas NH2); 2960 s, sh (vas CH3); 2927 vs (vas CH2); 2872 s, sh (vs CH3); 2855 vs (vs CH2); 2799 m (vs N-CH2): 1467 s a 1458 m (βδ CH2 a óas CH3); 1378 w (6S CH3); 1302 w (ys CH2); 721 w (β1?, a yas CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C32HegN2 [M + H]+ 481,54553; nalezeno 481,54507.
A'.A'TC-TrislS-Ididodccylaminojoktyljadamantan-U.S-trikarboxamid 4g
Lipidoid 4g byl připraven z adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (40 mg, 0,149 mmol), HCTU (256 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.), DIPEA (0,416 ml, 2,39 mmol, 16 ekv.) a diaminu 3g (286 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.) podle procedury popsané pro látku 4a v příkladu 1; byl získán lipidoid 4g (211 mg, 85,4 %; A/0,60 v mobilní fázi D2 na TLC-destičce předem saturované amoniakem, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCI3): δ =
- 12CZ 310613 B6
8,03, 3,21, 3,09, 3,07, 2,35, 1,985, 1,82, 1,815, 1,71, 1,51, 1,335, 1,33, 1,29, 1,28, 1,25-1,33, 1,25, 0,88 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 177,22, 54,04, 53,07, 41,56, 40,01, 39,08, 36,95, 31,89, 29,60, 29,49, 29,40, 29,32, 29,06, 28,45, 28,42, 28,30, 26,53, 26,13, 26,01, 23,88, 23,45, 22,67, 14,10 ppm. IR (CCU): Vmax/cm1 = 3439 w (volná) a 3341, 3196 w (vázaná) (v NH); 1635, 1627 w (amid I); 1533 w (amid II); 2954 m, sh (vas CH3); 2873 m, sh (vs CH3); 1467 m a 1457 w, sh (βδ CH2 a 5as CH3); 2927 vs (vas CH2); 2856 s (vs CH2); 1378 w (5S CH3); 2810 vw, sh (vs CH2NR2). HRMS: m/z vypočítáno pro CiogH^sNeOs [M + H]+ 1656,6856; nalezeno 1656,6882.
Příklad 8
1,2-Epoxydodekan 6
K roztoku n-dodecylaldehydu (6,0 ml, 27,13 mmol) v acetonitrilu (70 ml) ochlazenému na 0 °C ledovou lázní byl přidán JV-chlorsukcinimid (NCS, 3,44 g, 25,77 mmol, 0,95 ekv.) a /.-prolili (0,937 g, 8,14 mmol, 0,30 ekv.), a směs byla míchána 2 h při teplotě 0 °C. Poté byl roztok naředěn ethanolem (40 ml), byl přidán NaBH4 (2,57 g, 67,82 mmol, 2,5 ekv.), a reakční směs byla míchána 3,5 h při 0 °C. Roztok byl přelit do 1000ml dělicí baňky, naředěn vodou (100 ml) a solankou (100 ml), a produkt byl extrahován ethylacetátem (300 ml, 50 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (100 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surový produkt byl přečištěn chromatografň na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu ethylacetátu v cyklohexanu (0 až 20 %). Byl získán chloralkohol 5 (2,79 g, 46,6 %; R/0,42 v mobilní fázi CE20, detekce KM11O4) ve formě bezbarvého oleje.
K roztoku chloralkoholu 5 (2,79 g, 12,64 mmol) v dioxanu (38 ml) byl přidán roztok NaOH (11,37 g, 0,284 mmol, 22,5 ekv.) ve vodě (49 ml), a směs byla míchána 30 h při teplotě 35 °C. Poté byl roztok přelit do 500ml dělicí baňky, naředěn vodou (100 ml), a produkt byl extrahován DCM (100 ml, 50 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (50 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surový produkt byl přečištěn chromatografň na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu ethylacetátu v cyklohexanu (0 až 5 %). Byl získán epoxid 6 (1,797 g, 77,2 %; ///0.38 v mobilní fázi CE5, detekce fosfomolybdenovou kyselinou/Ce4+) ve formě bezbarvého oleje. Ή NMR (400 MHz, CDCI3): δ = 0,92 (t, J = 6 Hz, 3H), 1,29-1,60 (m, 18H), 2,47-2,49 (m, 1H), 2,76-2,78 (m, 1H), 2,90-2,95 (m, 1H) ppm. 13C NMR (101 MHz, CDCI3) δ = 14,11, 22,68, 25,97, 29,33, 29,45, 29,56, 29,59, 31,90, 32,50, 47,14, 52,42 ppm. IR (CC14): Vmax/cnr1 = epoxid: 2997 w, sh (vas CH2); 1482 w, 1410 w, 1130 w (δ?, O-CH2); 1259 w (vs skeletu, dýchací); 917 w (das kruhu); 896 vw (das COC); alif. řetězec: 2957 s (vas CH3); 2928 vs (vas CH2); 2872 m (vs CH3); 2856 s (vs CH2); 1467 m a 1458 m (βδ CH2 a das CH3); 1379 w (ds CH3). HRMS (El): m/z vypočítáno pro Ci2H24O [M]+ 184,1827; nalezeno 184,1832.
V .Λ'1 -Bis(2-hydroxydodecyl)hexan-1,6-diamin 8
Amin le (0,86 g, 3,98 mmol) a epoxid 6 (1,76 g, 9,54 mmol, 2,4 ekv.) byly smíseny ve skleněné 4ml vialce, a směs byla zahřívána bez přítomnosti rozpouštědla na 80 °C pod atmosférou argonu po dobu 24 h. Vzniklá nažloutlá kapalina byla přečištěna chromatografň na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu Dl v DCM (0 až 30 %). Byl získán amin 7 (1,98 g, 85,1 %; Rf 0,51 v mobilní fázi D3, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje.
Odchránění aminu 7 bylo provedeno ve směsi TFA (4 ml) a DCM (6 ml) podle procedury popsané pro látku 2a v příkladu 1; byl získán diamin 8 (1,271 g, 77,4 %; R/0,20 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. 1H NMR (600 MHz, CDCI3): δ = 3,65, 3,63, 2,84, 2,82, 2,565, 2,55, 2,41, 2,325, 1,60, 1,59, 1,41, 1,38, 1,35, 1,30-1,48, 1,28, 1,25-1,29, 1,25, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 69,39, 67,71, 62,72, 61,05, 55,78, 54,77, 40,86, 40,56, 35,22, 35,08, 31,90, 30,45, 29,6-29,9, 29,33, 25,65-26,77, 22,67,
- 13 CZ 310613 B6
14,10 ppm. IR (CCU): Vmax/cm1 = 3412 w, vbr (v OH); 1077 w, vbr (v C-OH); 1621 vw, vbr (β?, NH2); 1090 w (v C-NH2); 2956 m, sh (vas CH3); 2928 vs (vas CH2); 2871 m (vs CH3); 2855 s (vs CH2); 2810 w, sh (vs N-CH2); 1467 w a 1457 w (βδ CH2 a 5as CH3); 1378 vw (5S CH3); 722 vw (β;ι?, a yas CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C3oHe5N202 [M + H]+ 485,50406; nalezeno 485,50461.
7V1,/V3ýV5-Tris(6-(bis(2-hydroxydodecyl)amino)hexyl)adamantan-l,3,5-trikarboxamid 9
Lipidoid 9 byl připraven z adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (40 mg, 0,149 mmol), HCTU (256 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.), DIPEA (0,416 ml, 2,39 mmol, 16 ekv.) a diaminu 8 (289 mg, 0,596 mmol, 4 ekv.) podle procedury popsané pro látku 4a v příkladu 1; byl získán lipidoid 9 (188 mg, 75,5 %; Rf 0,43 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. Ή NMR (600 MHz, CDC13): δ = 6,97, 4,10, 4,075, 4,04, 4,00, 3,38, 3,31, 3,28, 3,24, 3,21, 3,19, 3,16, 3,11, 2,34, 2,14, 1,93, 1,87, 1,28, 1,25-1,31, 1,25, 0,88 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 177,50, 66,38, 65,92, 65,10, 64,73, 61,43, 61,23, 60,55, 59,64, 57,63, 54,48, 53,38, 41,70, 39,42, 39,23, 37,16, 31,90, 29,63, 29,56, 29,52, 29,34, 28,39, 22,68, 14,11 ppm. IR (CCU): Vmax/cm1 = 3300-3500 m, br (v OH); 1090 w (v C-OH); 3439 w (volná) a 3344 w (vázaná) (v NH); 1635 m (amid I); 1536 m (amid II); 2956 m, sh (vas CH3); 2873 m, sh (vs CH3); 2927 vs (vas CH2); 2855 s (vs CH2); 1378 w (ds CH3); 2808 w, sh (vs CH2NR2); 721 w (βδ CH2). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro Cio3H2o3Ne09 [M + H]+ 1668,5612; nalezeno 1668,5628.
Příklad 9
Linoleylaldehyd 10
K roztoku linoleylalkoholu (2,50 ml, 8,07 mmol) v DCM (120 ml) ochlazenému na 0 °C ledovou lázní byl přidán Dess-Martinův perjodinan (4,45 g, 10,49 mmol, 1,3 ekv.), a směs byla míchána 4 h při teplotě 0 °C. Poté byla reakce zastavena přídavkem roztoku thiosíranu sodného (20 g Na2S203.5H20/100 ml H2O) a nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (50 ml), a byla míchána 1 h za rt (teploty místnosti), až se původně mléčný roztok změnil na čilý'. Roztok byl přelit do 1000ml dělicí baňky, naředěn vodou (150 ml), a produkt byl extrahován DCM (150 ml, 2x50 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (150 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surová látka byla přečištěna chromatografň na silikagelové koloně (isokratické podmínky, 5 % ethylacetátu v cyklohexanu). Byl získán aldehyd 10 (1,271 g, 59,6 %; ///().36 v mobilní fázi CE5, detekce KMnCE) ve formě bezbarvého oleje.
/^,/^-01((97,12Z)-oktadeka-9,12-dien-l-yl)hexan-l,6-diamin 12
Amin 11 byl připraven z aminu le (0,345 g, 1,59 mmol), aldehydu 10 (1,27 g, 4,78 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (1,01 g, 4,78 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 2a v příkladu 1. Amin 11 byl získán ve formě nažloutlého oleje (1,08 g, 94,9 %; Rf 0,18 v mobilní fázi CE20, detekce ninhydrinem).
Odchránění aminu 11 bylo provedeno ve směsi TFA (4 ml) a DCM (5 ml) podle procedury popsané pro látku 2a v Příkladu 1; byl získán diamin 12 (0,594 g, 64,0 %; Rf 0,13 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. Ή NMR (600 MHz, CDC13): δ = 5.SOSNO. 2,765, 2,73, 2,67, 2,59, 2,04, 1,51, 1,385, 1,37, 1,34, 1,295, 1,29, 1,28-1,34, 1,28, 0,88 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDC13): δ = 130,19, 130,06, 127,99, 127,89, 53,49, 53,45, 41,67, 32,52, 31,50, 29,62, 29,46, 29,20-29,48, 27,37, 27,20, 27,18, 26,52, 25,61, 22,56, 14,06 ppm. IR (CC14): Vm.x/cm1 = 3011 s (vas =CH); 1646-1673 m (v C=C); 3455 w (vas NH2); 3394 (vs NH2); 1620 w (βδ NH2); 1087 m (v C-NH2); 2957 s, sh (vas CH3); 2928 vs (vas CH2); 2873 s, sh (vs CH3); 2856 vs (vs CH2); 2801 m (vs N-CH2): 1467 m a 1457 m, sh (βδ CH2 a óas CH3); 1378 m (6S CH3); 721 m (β;ι?, a yas CH2). HRMS: m/z vypočítáno pro C42HsiN2 [M + H]+ 613,63943; nalezeno
- 14CZ 310613 B6
613,63899.
V.WC-Tris(6-(bis((9Z. l2Z)-oktadcka-9. l2-dicn-l-yl)amino)hcxyl)adamantan-l.3.5trikarboxamid 13
Lipidoid 13 byl připraven z adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (30 mg, 0,112 mmol), HCTU (192 mg, 0,447 mmol, 4 ekv.), DIPEA (0,312 ml, 2,39 mmol, 16 ekv.) a diaminu 12 (274 mg, 0,447 mmol, 4 ekv.) podle procedury popsané pro látku 4a v příkladu 1; byl získán lipidoid 13 (154 mg, 67,1 %; Rf 0,48 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. Ή NMR (600 MHz, CDC13): δ = 6,32, 5,37, 5,32, 3,23, 2,76, 2,31, 2,04, 1,90, 1,81, 1,52, 1,35, 1,305, 1,295, 1,29, 1,28-1,35, 1,28, 0,88 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCI3): δ = 176,42, 130,21, 129,99, 128,04, 127,87, 52,94, 41,72, 39,98, 38,99, 37,77, 31,50, 29,60, 29,18, 29,08, 29,0-29,7, 28,57, 27,18, 26,26, 25,61, 22,55, 14,07 ppm. IR (CC14): Vn^/cm1 = 3011 m (vas =CH); 1661 m (v C=C); 3464 w (volná) a 3347 w (vázaná) (v NH); 1645 m, sh (amid I); 1534 w (amid II); 2957 m, sh (vas CH3); 2873 m, sh (vs CH3); 2929 vs (vas CH2); 2856 s (vs CH2); 1378 a 1366 w (ds CH3); 1086 w, sh (v C-N); 722 w (β1?, a yas CH2). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro CngH^iNeCE [M + H]+ 2052,9667; nalezeno 2052,9672.
Příklad 10
8-((terc-Butyldifenylsilyl)oxy)oktan-l-ol 14
K roztoku 1,8-oktandiolu (10,0 g, 68,39 mmol) a imidazolu (5,59 g, 82,06 mmol, 1,2 ekv.) v DCM (250 ml) byl přidán za intenzivního míchání terc-butyldifenylchlorsilan (17,50 ml, 68,39 mmol, 1 ekv.), a reakční směs byla míchána 24 h za rt (teploty místnosti). Roztok byl přelit do 1000ml dělicí baňky, naředěn vodou (400 ml) a solankou (100 ml), a produkt byl extrahován DCM (2x100 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (100 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surový produkt byl přečištěn chromatografri na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu ethylacetátu v cyklohexanu (0 až 30 %). Byl získán alkohol 14 (13,65 g, 51,9 %; R/0,35 v mobilní fázi CE20, detekce KMnO4) ve formě bezbarvého oleje. Ή NMR (400 MHz, CDCI3): δ = 1,08 (s, 9H), 1,31-1,41 (m, 8H), 1,55-1,62 (m, 4H), 3,64-3,70 (m, 4H), 7,38-7,47 (m, 6H), 7,69-7,71 (m, 4H) ppm. 13C NMR (101 MHz, CDCI3): δ = 19,24, 25,68, 25,72, 26,89, 29,33, 29,38, 32,56, 32,79, 63,09, 63,99, 127,57, 129,48, 134,19, 135,58 ppm. IR (CC14): vmax/cm-' = 3072 m (20a); 3053 m (20b); 2529 s, sh (tBu, vas CH3); 2898 s, sh (tBu, vs CH3); 1590, 1568 (8a, 8b); 1487 m (19a); 1463 m, 1473 s (tBu, das CH3); 1428 s (19b); 1390 m, 1362 m (tBu, δ?, CH3); 1189 m; 1112 vs, 1094 vs (vas Si-Ph); 1030 m (18a); 1008 m (δ Ph-Si); 939 m (r CH3); 701 vs (vs COSi); 688 m (4); 622 m (6b); 614 s (6a); 505 s (16b); 489 m (δ Si-Ph); 2932 vs (vas CH2); 2858 vs (vs CH2); 3636 m, 3341 m, br (vs OH); 1057 m (vs C-OH). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C24H3eO2NaSi [M + Na]+ 407,23768; nalezeno 407,23742.
8-((terc-Butyldifenylsilyl)oxy)oktanová kyselina 15
K roztoku alkoholu 14 (13,63 g, 35,44 mmol) v DCM (250 ml) ochlazenému na 0 °C ledovou lázní byl přidán Dess-Martinův peijodinan (19,54 g, 46,07 mmol, 1,3 ekv.), a směs byla míchána 4 h při teplotě 0 °C. Poté byla reakce zastavena přídavkem roztoku thiosíranu sodného (50 g Na2S2O3.5H2O/150 ml H2O) a nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (100 ml), a byla míchána 1 h za rt (teploty místnosti), až se původně mléčný roztok změnil na čirý. Roztok byl přelit do 1000ml dělicí baňky, naředěn vodou (200 ml), a produkt byl extrahován DCM (200 ml, 2x50 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (200 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Bylo získáno 13,56 g bezbarvého oleje.
Získaný odparek byl rozpuštěn ve 21 baňce ve směsi acetonu (450 ml) a vody (90 ml), k roztoku byl přidán 2-methyl-2-buten (15,02 ml, 141,8 mmol, 4 ekv.) a NaH2PO4.2H2O (11,06 g,
- 15 CZ 310613 B6
70,88 mmol, 2 ekv.), a suspenze byla ochlazena na 0 °C v ledové lázni. Z přikapávací nálevky byl pak v průběhu 30 min postupně přidán roztok chloritanu sodného (9,62 g, 106,32 mmol, 3 ekv.) ve vodě (60 ml), reakční směs byla vyjmuta z chladicí lázně, a intenzivně míchána za rt (teploty místnosti) 12 h. Roztok byl přelit do 1000ml dělicí baňky, naředěn roztokem kyseliny citrónové (70 g) ve vodě (300 ml), a produkt byl extrahován diethyletherem (300 ml, 50 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (300 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surový produkt byl přečištěn chromatografň na silikagelové koloně (isokratické podmínky, 5 % methanolu v chloroformu). Byla získána kyselina 15 (12,92 g, 91,5 %; Rf 0,35 v mobilní fázi MeOH-CHCL 5:95 (v/v), detekce KMnCU) ve formě bezbarvého viskózního oleje. 1H NMR (400 MHz, CDCk): δ = 1,05 (s, 9H), 1,27-1,39 (m, 6H), 1,51-1,66 (m, 4H), 2,34 (t, J= 7,5 Hz, 2H), 3,65 (t, J= 6,5 Hz, 2H), 7,36-7,44 (m, 6H), 7,66-7,68 (m, 4H) ppm. 13C NMR (101 MHz, CDCI3): δ = 19,23, 24,63, 25,59, 26,89, 28,97, 29,02, 32,48, 33,95, 63,91, 127,57, 129,49, 134,15, 135,58, 179,60 ppm. IR (CCI4): Vmax/cm1 = 3534 w (v OH, monomer); 3100 w, 2740 w, 2674 w (v OH, dimer); 1711 vs (v C=O); 1413 w, 1289 w (v CO a δ COH); 2561 m, sh (tBu, vas CH3); 2898 m, sh (tBu, vs CH3); 1590 w; 1487 w (19a); 1463 m, 1472 m (tBu, das CH3); 1429 m (19b); 1390 w, 1362 w (tBu, δ?, CH3); 1112 s, (vas COSi); 1093 m (18b); 1030 w; 1008 w (δ Ph-Si); 940 w (r CH3); 701 s (4); 688 w (SiOC); 622 w (6b); 614 m (6a); 505 w (16b); 2932 s (vas CH2); 2858 m (vs CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro CMH33O3S1 [M + H]+ 397,22044; nalezeno 397,22018.
(Z)-Non-2-en-1 -yl-8-hydroxyoktanoát 17
K roztoku kyseliny 15 (2,50 g, 6,27 mmol) v DCM (100 ml) ochlazenému na 0 °C v ledové lázni byl přidán diisopropylkarbodiimid (1,08 ml, 6,90 mmol, 1,1 ekv.) a 4-dimethylaminopyridin (23,0 mg, 0,188 mmol, 0,03 ekv.), a směs byla míchána 30 min při 0 °C. Poté byl přidán trans-2nonen-l-ol (1,37 ml, 8,15 mmol, 1,3 ekv.), a reakční směs byla míchána 12 h za rt (teploty místnosti). Rozpouštědlo bylo odpařeno na RVO a odparek byl přečištěn chromatografň na silikagelové koloně (isokratické podmínky, 5 % ethylacetátu v cyklohexanu). Byl získán ester 16 (2,784 g, 84,9 %; Rf 0,61 v mobilní fázi CE5, detekce KMnO4) ve formě bezbarvého oleje.
K roztoku esteru 16 (2,76 g, 5,28 mmol) v tetrahydrofuranu (40 ml) byl přidán roztok monohydrátu tetrabutylamoniumfluoridu (2,95 g, 10,56 mmol, 2 ekv.) v tetrahydrofuranu (10 ml), a reakční směs byla míchána 20 h za rt. Roztok byl přelit do 500ml dělicí baňky, naředěn 10% vodným roztokem chloridu amonného (150 ml) a produkt byl extrahován diethyletherem (150 ml, 50 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (100 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surový produkt byl přečištěn chromatografň na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu ethylacetátu v cyklohexanu (0 až 45 %). Byl získán alkohol 17 (1,311 g, 87,3 %; Rf 0,61 v mobilní fázi CE50, detekce KMnO4) ve formě slabě nažloutlého oleje. Ή NMR (400 MHz, CDCls): δ = 0,87 (t, J = 6 Hz, 3H), 1,26-1,38 (m, 14H), 1,51-1,66 (m, 4H), 2,07-2,12 (m, 2H), 2,30 (t, J= 7,5 Hz, 2H), 3,63 (t, J= 6,6 Hz, 2H), 4,61-4,62 (m, 2H), 5,48-5,55 (m, 1H), 5,60-5,67 (m, 1H) ppm. 13C NMR (101 MHz, CDCls): δ = 14,07, 22,60, 24,88, 25,54, 27,54, 28,86, 29,02, 29,07, 29,39, 31,68, 32,68, 34,30, 60,22, 62,97, 123,34, 135,45, 173,75 ppm. IR (CC14): vmax/cm-' = 3637 w, 3453 w (v OH); 1056 m (v C-OH); 1736 vs (v C=O); 1238 m, 1170 s (v C-O); 3025 w (vas =CH); 1659 w (v C=C); 1419 w (p =C-H); 2955 s (vas CH3); 2931 vs (vas CH2); 2858 s (vs CH2); 2872 s, sh (vs CH3); 1466 m a 1457 m (βδ CH2 a das CH3); 1378 m (ds CH3); 722 m (β;ι?, a yas CH2). HRMS (El): m/z vypočítáno pro Ci?H32O3 [M]+ 284,2351; nalezeno 284,2355.
(Z)-Non-2-en-l-yl-8-oxooktanoát 18
K roztoku alkoholu 17 (1,27 ml, 4,46 mmol) v DCM (100 ml) ochlazenému na 0 °C ledovou lázní byl přidán Dess-Martinův peijodinan (2,46 g, 5,80 mmol, 1,3 ekv.), a směs byla míchána 4 h při teplotě 0 °C. Poté byla reakce zastavena přídavkem roztoku thiosíranu sodného (10 g Na2S2C>3.5H2O/50 ml H2O) a nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (50 ml), a byla míchána 1 h za rt (teploty místnosti), až se původně mléčný roztok změnil na čilý'. Roztok
- 16CZ 310613 B6 byl přelit do 500ml dělicí baňky, naředěn vodou (100 ml), a produkt byl extrahován DCM (100 ml, 50 ml). Spojená organická fáze byla promyta solankou (150 ml), vysušena bezvodým síranem sodným, zfiltrována přes fritu S2, a rozpouštědla byla odpařena na RVO. Surová látka byla přečištěna chromatografií na silikagelové koloně za použití lineárního gradientu ethylacetátu v cyklohexanu (0 až 30%). Byl získán aldehyd 18 (0,573 g, 45,4 %; A/0,49 v mobilní fázi CE20, detekce KMnO4) ve formě bezbarvého oleje. 1H NMR (400 MHz, CDCE): δ = 0,88 (t, J = 7 Hz, 3H), 1,26-1,38 (m, 14H), 1,59-1,67 (m, 4H), 2,07-2,12 (m, 2H), 2,30 (t, J= 7,5 Hz, 2H), 2,402,44 (m, 2H), 4,61-4,63 (m, 2H), 5,48-5,55 (m, 1H), 5,61-5,68 (m, 1H), 9,76 (t, J= 1,8 Hz, 1H) ppm. 13C NMR (101 MHz, CDC13): δ = 14,07, 21,86, 22,60, 24,71, 27,54, 28,77, 28,83, 28,86, 29,39, 31,68, 34,19, 43,79, 60,25, 123,31, 135,49, 173,59, 202,62 ppm. IR (CC14): Vn^/cnr1 = 2818 m, 2716 m (aldeh. v CH); 1733 vs (aldeh. v C=O); 1395 m, sh (aldeh. δ OCH); 1733 vs (v C=O); 1244 m, 1172 s (v C-O); 3026 m (vas =CH); 1659 w (v C=C); 2956 s (vas CH3); 2930 vs (vas CH2); 2858 s (vs CH2); 2873 s, sh (vs CH3); 1466 m a 1462 m (βδ CH2 a das CH3); 1378 m a 1373 m (δ?, CH3). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro Ci7H29O4 [Μ - H]' 297,20713; nalezeno 297,20722.
Λ'1 ,Ν1 -Bis(8-((Z)-non-2-en-1 -yl)oxy-8-oxooktyl)hexan-1,6-diamin 20
Amin 19 byl připraven z aminu le (140 mg, 0,647 mmol), aldehydu 18 (0,548 g, 1,94 mmol, 3 ekv.) a triacetoxyborohydridu sodného (0,411 g, 1,94 mmol, 3 ekv.) podle procedury popsané pro látku 2a v příkladu 1 s tím rozdílem, že reakční směs byla odpařena bez předchozí extrakce a odparek přímo přečištěn chromatografií. Amin 19 byl získán ve formě slabě nažloutlého oleje (0,446 g, 92,0 %).
Odchránění aminu 19 bylo provedeno ve směsi TFA (4 ml) a DCM (4 ml) podle procedury popsané pro látku 2a v Příkladu 1; byl získán diamin 20 (0,333 g, 86,2 %; Rf 0,16 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého oleje. 1H NMR (600 MHz, CDCls): δ = 5,63, 5,50, 4,61, 3,06, 3,02, 2,99, 2,29, 2,08, 1,82, 1,74, 1,60, 1,57, 1,42, 1,34, 1,28, 1,27, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCls): δ = 173,59, 135,39, 129,29, 60,24, 52,64, 52,19, 39,50, 34,12, 31,64, 29,34, 28,84, 28,82, 28,73, 27,51, 26,60, 25,76, 25,36, 24,69, 23,11, 22,57, 14,05 ppm. IR (CC14): Vmax/cm-1 = 3446 w (vas NH2); 1612 w (βδ NH2); 2800 m, sh (vs N-CH2); 1736 vs (v C=O); 1236 m, 1168 s (v C-O); 3024 m (vas =CH); 1679 w (v C=C); 1419 w (p =CH); 2957 s (vas CH3); 2931 vs (vas CH2); 2858 s (vs CH2); 2873 s, sh (vs CH3); 1467 m a 1457 m (βδ CH2 a das CH3); 1378 m (ós CH3); 721 w (β;ι?, a yas CH2). HRMS (ESI): m/z vypočítáno pro C4oH7704N2 [M + H]+ 649,58779; nalezeno 649,58767.
A'l.A'.AH-Tris(6-(bis(8-((Z)-non-2-cn-l-yl)oxy-8-oxooktyl)amino)hcxyl)adamantan-l.3.5trikarboxamid 21
Lipidoid 21 byl připraven z adamantan-l,3,5-trikarboxylové kyseliny (30 mg, 0,112 mmol), HCTU (192 mg, 0,447 mmol, 4 ekv.), DIPEA (0,312 ml, 1,79 mmol, 16 ekv.) a diaminu 20 (290 mg, 0,447 mmol, 4 ekv.) podle procedury popsané pro látku 4a v příkladu 1; byl získán lipidoid 21 (181 mg, 74,9 %; Rf 0,29 v mobilní fázi D2, detekce ninhydrinem) ve formě nažloutlého viskózního oleje. Ή NMR (600 MHz, CDCE): δ = 7,54, 5,63, 5,50, 4,61, 3,29, 3,00, 2,98, 2,34, 2,29, 2,23, 2,08, 1,98, 1,89, 1,76, 1,60, 1,585, 1,42, 1,38, 1,35, 1,28, 1,26, 0,87 ppm. 13C NMR (150,9 MHz, CDCE): δ = 177,29, 173,53, 135,41, 123,27, 60,25, 52,62, 52,27, 41,72, 39,57, 39,20, 37,12, 34,09, 31,64, 29,34, 28,85, 28,82, 28,74, 28,44, 28,37, 27,51, 26,63, 25,83, 25,56, 24,67, 23,11, 22,57, 14,06 ppm. IR (CC14): VnUcm1 = 3321 w (vNH); 1644 m (amid I); 1535 wm (amid II); 1736 s (v C=O); 1276 w-m, 1166 m (v C-O); 3025 w (vas =CH); 1419 w (p =CH); 2956 s, sh (vas CHs); 2930 vs (vas CH2); 2858 s (vs CH2); 2873 m, sh (vs CH3); 1467 m a 1457 m (βδ CH2 a das CHs); 1378 w-m (ds CH3). HRMS (MALDI): m/z vypočítáno pro Ci33H239N6Oi5 [M + H]+ 2160,8118; nalezeno 2160,8164.
- 17 CZ 310613 B6
Příklad 11
Příprava transfekčních činidel
Činidla byla vytvořena smísením jednotlivých složek uvedených v tabulce 1 a tabulce 2. Obě tabulky obsahují finální molámí koncentrace v transfekčním činidle. Pro přípravu byly použity zásobní 5 mM roztoky jednotlivých komponent v 99,7% ethanolu. Pouze zásobní roztok DOPECy5 měl koncentraci 0,79 mM a byl připraven v chloroformu.
Tabulka 1. Složení transfekčních činidel A01-A10.
látka Koncentrace jednotlivých složek v transfekčních činidlech (mM)
A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10
4a 1,1 — — — — — — — — —
4b — 1,1 — — — — — — — —
4c — — 1,1 — — — — — — —
4d — — — 1,1 — — — — — —
4e — — — — 1,1 — — — — —
4f — — — — — 1,1 — — — —
4g — — — — — — 1,1 — — —
9 — — — — — — — 1,1 — —
13 — — — — — — — — 1,1 —
21 — — — — — — — — — 1,1
cholest erol 2,18 2,18 2,18 2,18 2,18 2,18 2,18 2,18 2,18 2,18
DOPE 1,64 1,64 1,64 1,64 1,64 1,64 1,64 1,64 1,64 1,64
DMG- PEG2000 0,075 0,075 0,075 0,075 0,075 0,075 0,075 0,075 0,075 0,075
DOPE- Cy5 l,19x ΙΟ3 l,19x ΙΟ3 l,19x ΙΟ3 l,19x ΙΟ3 l,19x ΙΟ3 l,19x ΙΟ3 l,19x ΙΟ3 l,19x ΙΟ3 l,19x ΙΟ3 l,19x ΙΟ3
Tabulka 2. Složení transfekčních činidel A11-A15 (A13 a A14 jsou srovnávací příklady).
látka Koncentrace jednotlivých složek v transfekčních činidlech (mM)
All A12 A13 A14 A15
4e 1,1 1,1 — — 1,1
D-Lin-MC3DMA — — 2,5 — —
TT3 — — — 1,1 —
cholesterol 2,18 2,18 1,93 2,18 2,18
DOPE — — — 1,64 1,65
DOPC 1,64 — — — —
DSPC — 1,64 0,49 — —
DMG-PEG2000 0,075 0,075 0,075 0,075 0,075
DOPE-Cy5 1,19χ10-3 1,19χ10-3 1,19x10’ 3 1,19χ10-3 —
Příklad 12
Příprava lipidických nanočástic obsahujících mRNA
- 18CZ 310613 B6
DNA kódující fluorescenční protein mKate2 byla amplifíkována z plasmidu pmKate2-C (Evrogen) pomocí primerů (5’-ATCAACATATGGTGAGCGAGCTG-3’ (SEQ ID NO. 1); 5’AAGAATTCCTATCATCTGTGCCCCAG-3’ (SEQ ID NO. 2)) a nakloňována do vektoru pET24a (Invitrogen) pod promotorem T7. Mediátorová RNA (mRNA) kódující mKate2 byla transkribována in vitro s použitím transkripční soupravy Ampliscribe T7-Flash (Lucigen) podle protokolu výrobce. Do in vitro transkripční reakce byl přidán analog RNA čepičky ARCA (Jena Bioscience) a poly(A) konec byl syntetizován pomocí poly(A) polymerasy (New England Biolabs) podle standardního protokolu.
LNP obsahující mRNA (mRNA-LNP) byly připraveny následovně: 300 μΐ roztoku každého z transfekčních činidel A01-A14 připravených v příkladu 11 bylo smíseno s roztokem 120 pg mRNA v 300 μΐ 10 mM citrátového pufru (pH 3,0) pomocí mikrofluidního zařízení tvaru “ypsilon” se dvěma vstupy a jedním výstupem pro sběr vzorku. Lipidická směs a roztok mRNA byly vháněny separátně do každého vstupu lineární pumpou konstantním průtokem 300 μΐ/min. Vzniklý roztok nanočástic o objemu 600 μΐ byl jímán a ihned naředěn přídavkem 600 μΐ PBS; z transfekčních činidel A01-A14 tak vznikly odpovídající vzorky nanočástic označené B01-B14. Každý ze vzorků mRNA-LNP (B01-B14) byl připraven v triplikátu. Hydrodynamický průměr čerstvě vytvořených mRNA-LNP byl změřen pomocí dynamického rozptylu světla (NanoZS Zetasizer, Malvern, Worcestershire, UK) pod úhlem rozptylu 173° při teplotě 25 °C. Hydrodynamický průměr mRNA-LNP se pohyboval v rozmezí 73 až 108 nm (tab. 3.). V této podobě byly částice použity k následným biologickým testům.
Tabulka 3. Hydrodynamický průměr mRNA-LNP včetně směrodatné odchylky změřený pomocí dynamického rozptylu světla.
LNP Průměr (nm) LNP Průměr (nm)
B01 81,5 ± 8,0 B06 72,9 ± 8,6
B02 99,3 ± 2,7 B07 73,6 ± 3,9
B03 85,1 ± 4,1 B08 108,0 ± 18,3
B04 107,7 ± 4,2 B09 90,8 ± 5,5
B05 76,1 ± 1,9 BIO 89,5 ± 5,0
Příklad 13
Srovnání transfekce mRNA pomocí nových LNP in vitro s použitím různých pomocných lipidů v lipidické směsi
LNP B05 a B11-B12 obsahující mRNA kódující fluorescenční protein mKate2 připravené v triplikátech v Příkladu 12 byly testovány na buňkách lidské buněčné linie HEK293. Buňky byly kultivovány v 96jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 μΐ kultivačního média na jamku) v IMDM médiu doplněném 10% FBS při 37°C v 5% CO2. Buňky byly transfekovány 2 μΐ mRNALNP (o finální souhrnné koncentraci všech lipidických složek 20 μΜ) a následně inkubovány 24 hodin.
Transfekce byly provedeny ve třech opakováních. Intenzita fluorescence Cy5, indikující vstup LNP do buněk, a fluorescence mKate2, značící překlad mRNA uvolněné z LNP po transfekci buněk, byly analyzovány pomocí cytometru BD LSR Fortessa.
Nové mRNA-LNP, jejichž lipidická směs obsahovala DOPE, DOPC nebo DSPC pomocný lipid, byly schopné účinně transfekovat mRNA do buněčné linie HEK293, přičemž nejúčinnější transfekce bylo dosaženo s mRNA-LNP obsahující pomocný lipid DOPE (tab. 4).
Tabulka 4. Transfekční účinnost nových mRNA-LNP obsahujících pomocné lipidy DOPE (B05), DOPC (Bil) nebo DSPC (B12). Uvedené hodnoty intenzity fluorescence Cy5 a mKate2
- 19CZ 310613 B6 jsou normalizovány na kontrolní variantu transfekce komerčním činidlem Lipofectamine® 2000.
LNP Fluorescence Cy5 Fluorescence mKate2
B05 1,00 ± 0,04 1,00 ± 0,19
Bil 0,52 ± 0,01 0,18 ± 0,01
B12 0,42 ± 0,03 0,12 ± 0,02
Příklad 14
Srovnání transfekce mRNA pomocí nových LNP a mRNA-LNP tvořených známými transfekčními činidly
Transfekční účinnost mRNA-LNP B05 byla porovnána s vybranými známými, vysoce účinnými transfekčními činidly, konkrétně D-Lin-MC3-DMA (MedChemExpress Europe) a ionizovatelným lipidoidem TT3 (Li, B.: Nano Lett. 2015, 15, 8099-8107) formulovanými v příkladu 12 jako B13-B14, a také s činidlem Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, použito dle standardního protokolu dodaného výrobcem, označeno jako Lip2000), Buňky lidské buněčné linie HEK293T byly kultivovány na 96jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 μΐ kultivačního média na jamku) v DMEM médiu doplněném 10% FBS při 37°C v 5% CCl·. Buňky byly transfekovány 2 μΐ mRNA-LNP (o finální souhrnné koncentraci všech lipidických složek 20 μΜ) a následně inkubovány 24 hodin. Transfekce byly provedeny ve třech opakováních. Intenzita fluorescence mKate2 a procento buněk exprimujících mKate2 byly analyzovány pomocí cytometru BD LSR Fortessa.
Nové mRNA-LNP (značeny B05) vykazovaly signifikantně vyšší účinnost transfekce oproti známým transfekčním činidlům (tab. 5).
Tabulka 5. Porovnání nových mRNA-LNP s mRNA-LNP tvořených komerčními ionizovatelnými lipidy D-Lin-MC3-DMA (B13), TT3 (B14) a Lipofectamine® 2000 (Lip2000). Účinnost transfekce je vyjádřená jako procento buněk exprimujících fluorescenční protein mKate2 a jako intenzita fluorescence mKate2 normalizovaná na hodnotu z kontrolní transfekce pomocí Lipofectamine® 2000.
LNP % buněk exprimujících mKate2 Fluorescence mKate2
B05 95,20 ± 0,84 13,29 ± 0,02
B13 84,22 ± 1,18 0,76 ± 0,03
B14 90,04 ± 2,43 1,96 ± 0,06
Lip2000 40,70 ± 1,13 1,00 ± 0,03
Příklad 15
Účinnost inkorporace mRNA do lipidických nanočástic
Účinnost sbalení mRNA kódující fluorescenční protein mKate2 do mRNA-LNP BOÍ-BÍO připravených v příkladu 12 byla stanovena pomocí soupravy Qubit 4 RNA HS Assay Kit (Life Technologies) podle protokolu výrobce. Účinnost inkorporace byla stanovena porovnáním koncentrace mRNA volně dostupné v roztoku nanočástic a koncentrace mRNA uvolněné z nanočástic po jejich rozložení. mRNA-LNP byly rozloženy pomocí pufiru obsahujícího Triton X-100 (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 mM EDTA, 2% Triton X-100). Byla prokázána vysoká účinnost sbalení mRNA, která se pohybovala v rozmezí 67 až 93% (tab. 6).
Tabulka 6. Účinnost sbalení mRNA kódující fluorescenční protein mKate2 do mRNA-LNP
-20CZ 310613 B6 včetně směrodatných odchylek z triplikátů.
Sbalení mRNA Sbalení mRNA (%)LW(%)
B01 92,59 ± 2,79 B06 83,74 ± 0,24
B02 82,30 ± 2,20 B07 76,49 ± 6,16
B03 90,94 ± 0,55 B08 81,22 ± 1,33
B04 93,18 ± 0,77 B09 67,51 ± 6,27
B05 80,86 ± 2,31 BIO 78,33 ± 0,79
Příklad 16
Buněčná toxicita mRNA-LNP
Lidská buněčná linie odvozená z embryonálních buněk ledvin (HEK293), tatáž linie exprimující SV40 velký T antigen (HEK293T) a buněčná linie odvozená z lidského osteosarkomu (U2OS) byly kultivovány na 96-jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 μΐ kultivačního média na jamku) v Dulbeccovu modifikovaném médiu (DMEM) nebo v IMDM médiu (z angl. Iscove’s Modified Dulbecco's medium) doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS) při 37 °C v 5% CO2. Buňky byly transfekovány 2 μΐ mRNA-LNP vytvořenými v triplikátech Příkladu 12 (finální souhrnná koncentrace všech lipidických složek v jamce byla 20 μΜ) nebo 10 μΐ mRNA-LNP (finální koncentrace všech lipidických složek v jamce byla 100 μΜ) a následně inkubovány 24 hodin. Cytotoxicita LNP byla analyzována pomocí testu životaschopnosti buněk CellTiterGlo 2,0 (Promega, USA). Životaschopnost buněk byla normalizována na netransfekované buňky (kontrola). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 7 a 8.
V případě použití mRNA-LNP o souhrnné koncentraci všech lipidických složek 20 μΜ byla maximální změřená cytotoxicita v buněčné linii HEK293 16%, naměřená pro B02 a B03. U částic B01 a B05-B07 nebyla prokázána signifikantní toxicita. V případě 5x vyšší souhrnné koncentrace všech lipidických složek 100 μΜ byl trend analogický s nej vyšší toxicitou 38% u B03, částice B04-B08 vykazovaly cytotoxicitu přibližně 20%, B09 a BIO nevykazovaly žádnou toxicitu. U linie HEK293T byla naměřena nejvyšší cytotoxicita opět u B02 a B03, u ostatních částic byla toxicita velmi nízká. Částice o souhrnné koncentrace všech lipidických složek 20 μΜ nevykazovaly téměř žádnou toxicitu na buněčné linii U2OS, v případě koncentrace 100 μΜ byla nejvyšší toxicita 35% u částic BIO. Částice tvořené lipidoidy 4a, 4b, 4d a 4e byly netoxické, částice tvořené lipidoidy 4f, 4g, 9 a 13 byly velmi málo toxické (tab. 7, tab. 8).
Tabulka 7. Cytotoxicita mRNA-LNP vyjádřená jako životaschopnost buněk (%) po přídavku 20 μΜ transfekční směsi s mRNA pro jednotlivé typy buněčných linií.
LNP HEK293 HEK293T U2OS
Kontrola 100,00 ± 6,75 100,00 ± 2,34 100,00 ± 2,65
B01 98,15 ± 1,00 95,54 ± 0,29 96,51 ± 0,47
B02 84,02 ± 1,98 80,75 ± 2,61 98,08 ± 1,38
B03 84,62 ± 0,32 75,04 ± 2,58 90,09 ± 1,64
B04 91,76 ± 0,45 89,54 ± 1,13 98,59 ± 0,88
B05 98,98 ± 1,73 93,75 ± 2,51 96,45 ± 2,97
B06 96,89 ± 4,71 92,70 ± 2,59 92,75 ± 2,53
B07 96,91 ± 5,64 93,45 ± 0,94 92,53 ± 2,70
B08 97,70 ± 5,13 95,16 ± 4,00 92,98 ± 4,65
B09 107,46 ± 6,15 84,34 ± 3,78 95,89 ± 1,87
BIO 97,13 ± 3,47 81,06 ± 2,69 98,92 ± 1,11
-21 CZ 310613 B6
Tabulka 8. Cytotoxicita mRNA-LNP vyjádřená jako životaschopnost buněk (%) po přídavku 100 μΜ transfekční směsi s mRNA pro jednotlivé typy buněčných linií.
LNP HEK293 HEK293T U2OS
Kontrola 100,00 ± 6,75 100,00 ± 2,34 100,00 ± 2,65
B01 95,98 ± 0,88 90,01 ± 0,24 94,63 ± 0,58
B02 70,24 ± 2,90 65,65 ± 2,32 91,32 ± 2,40
B03 62,00 ± 2,89 57,21 ± 2,18 75,64 ± 4,92
B04 77,44 ± 1,35 78,14 ± 1,30 97,02 ± 0,73
B05 88,00 ± 4,82 88,92 ± 1,39 96,51 ± 1,87
B06 81,58 ± 3,97 83,86 ± 0,98 83,31 ± 1,74
B07 87,19 ± 1,71 91,09 ± 1,98 85,02 ± 1,37
B08 77,93 ± 14,22 88,46 ± 2,81 84,76 ± 2,16
B09 100,44 ± 12,84 82,46 ± 5,08 84,88 ± 5,59
BIO 94,09 ± 5,58 86,73 ± 8,29 65,30 ± 7,71
Příklad 17
Transfekce mRNA pomocí nových LNP in vitro
Lidská buněčná linie odvozená z embryonálních buněk ledvin (HEK293), tatáž linie exprimující SV40 velký T antigen (HEK293T), buňky jatemího karcinomu (HepG2, Huh7) a buněčná linie odvozená z lidského osteosarkomu (U2OS), byly kultivovány na 96jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 μΐ kultivačního média na jamku) v Dulbeccovu modifikovaném médiu (DMEM) nebo v IMDM médiu doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS) při 37°C v 5% CO2. Buňky byly transfekovány 2 μΐ mRNA-LNP B01 až B05 vytvořenými v příkladu 12 (finální souhrnná koncentrace všech lipidických složek v jamce byla 20 μΜ) nesoucích mRNA kódující fluorescenční protein mKate2 a následně inkubovány 24 hodin. Jako kontrolní transfekční činidlo byl použit Lipofectamine® 2000. Transfekce byly provedeny ve třech biologických opakováních, přičemž každé biologické opakování mělo tři technická opakování. Procento buněk exprimujících fluorescenční protein mKate2 a intenzita fluorescence mKate2 byla analyzována pomocí cytometru BD LSR Fortessa. V případě intenzity fluorescence jsou data normalizována ke komerčnímu transfekčnímu činidlu Lipofectamine® 2000.
U linie HEK293 bylo procento buněk exprimujících protein mKate2 v případě všech použitých lipidoidů více než 2x vyšší ve srovnání s komerčně dostupným transfekčním činidlem. Intenzita fluorescence byla pro všechny použité lipidoidy více než 2x vyšší, v případě částic B02 tvořených lipidoidem 4d byla 3x vyšší ve srovnání s komerčně dostupným Lipofectaminem® 2000. Buněčnou linii HepG2 mRNA-LNP tvořené novými lipidoidy transfekovaly ve všech případech minimálně 2,5x lépe ve srovnání s komerčním Lipofectaminem® 2000, intenzita fluorescence byla v případě mRNA-LNP částic B03 tvořených lipidoidem 4c 4,5násobná ve srovnání s Lipofectaminem® 2000. Obdobného zlepšení transfekce novými mRNA-LNP ve srovnání s komerčním Lipofectaminem® 2000 bylo dosaženo i v dalších buněčných liniích (tab. 9, tab. 10).
Tabulka 9. Účinnost transfekce nových mRNA-LNP pro různé buněčné linie vyjádřená jako procento buněk exprimujících fluorescenční protein mKate2 z mRNA transfekované částicemi pro linie HEK293, linie HepG2, HEK293T, linie Huh7 a linie U2OS. Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p jsou vztaženy vždy na kontrolní variantu transfekce Lip2000 u příslušné buněčné linie; hodnoty p < 0,001 značeny písmenem „a“.
-22CZ 310613 B6
LNP HEK293 P HepG2 p HEK293T P Huh' 7 P U2OS p
B01 91,24 ± 4,25 a 94,57 ± 0,38 a - 97,08 ± 0,40 a -
B02 96,39 i 0,72 a. 97,10 ± 0,70 a 93,10 ± 1,63 a - -
B03 95,63 ± 0,79 a 96,93 ± 0,39 a 92,31 ± 1,56 a 88,23 ± 2,61 a 82,37 ± 1,68 a
B04 90.57 ± 1,54 a 97,56 i 0,36 a 93,53 ± 3,58 a 90,66 ± 0,79 a -
B05 91,56 ± 3,02 a 96,42 ± 0,75 a 93,53 ± 3,58 a 96,26 ± 0,37 a -
Lip2000 42,63 ± 17,56 a 38,10 ± 1,54 a 46,03 ± 1,88 a 64,67 ± 1,40 a 53,93 ± 1,93 a
Tabulka 10. Účinnost transfekce nových mRNA-LNP částic pro různé buněčné linie vyjádřená jako relativní intenzita fluorescence mKate2 z mRNA transfekované částicemi pro linie HEK293, linie HepG2, HEK293T, linie Huh7 a linie U2OS. V případě intenzity fluorescence jsou data normalizována ke komerčnímu transfekčnímu činidlu Lipofectamine® 2000. Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p jsou vztaženy vždy na kontrolní variantu transfekce Lip2000 u příslušné buněčné linie; hodnoty p < 0,001 značeny písmenem „a“, p < 0,01 značeny „b“.
LNP HEK293 P HepG2 P HEK293T P Huh 7 p U2OS p
B01 2,33 ± 0.17 a 3,05 ± 0,22 a - 2,04 ± 0,09 a -
B02 2.,74 ± 0,37 a 2,87 ± 0,17 a 3,00 ± 0,47 a - -
B03 2,92 ± 0,38 a 4,54 ± 0,22 a 3,93 ± 0,57 a 1,19 ± 0,08 b O -4 l-l·0 K; -S.J Š3
B04 3,08 ± 0,21 a 3,93 ± 0,24 a 3.50 ± 0,55 a 1,26 ± 0,08 a -
B05 2,61 ± 0,11 a 3,48 ± 0,32 a 2,87 ± 0,31 a 1,96 ± 0,13 a -
Lip2000 1,00 ± 0,30 a 1.00 ± 0,11 a 1,00 ± 0,05 a 1.00 ± 0,03 ab 1,00 ± 0,03 a
Příklad 18
Transfekce mRNA pomocí nových LNP tvořených biodegradabilními lipidoidy
Lidské buněčné linie HEK293, HEK293T a U2OS byly kultivovány v 96-jamkových destičkách (5 x 104 buněk v 100 μΐ kultivačního média na jamku) v DMEM nebo v IMDM médiu doplněném 10% FBS při 37 °C v 5% CO2. Buňky byly transfekovány 2 μΐ mRNA-LNP B05, B08, B09 a BIO připravenými v příkladu 12 (finální souhrnná koncentrace všech lipidických složek v jamce byla 20 μΜ) a následně inkubovány 24 hodin. Jako kontrolní transfekční činidlo byl použit Lipofectamine® 2000. Transfekce byly provedeny ve třech biologických opakováních, přičemž každé biologické opakování mělo tři technická opakování. Procento buněk exprimujících fluorescenční protein mKate2 a intenzita fluorescence mKate2 byly analyzovány pomocí cytometru BD LSR Fortessa.
Všechny buněčné linie transfekovaly nové mRNA-LNP signifikantně lépe v porovnání s komerčním Lipofectaminem® 2000. Lipidoidy 4e, 9, 13 a 21 měly srovnatelné účinky na procento transfekovaných buněk. Intenzita fluorescence přeložené mRNA kódující protein mKate2 pak byla u linií HEK293 a HEK293T vždy signifikantně zvýšena oproti komerčnímu Lipofectaminu® 2000. U linie U2OS srovnatelně s původním lipidoidem 4e transfekoval lipidoid 13 (tab. 11, tab. 12).
Tabulka 11. Účinnost transfekce nových mRNA-LNP částic pro různé buněčné linie vyjádřená jako procento buněk exprimujících fluorescenční protein mKate2 z mRNA transfekované částicemi. Uvedené jsou linie HEK293, HEK293T a U2OS. Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p jsou vztaženy vždy na kontrolní variantu transfekce Lip2000 u příslušné buněčné linie; hodnoty p < 0,001 značeny písmenem „a“, p < 0,01
-23 CZ 310613 B6 značeny „b“.
LNP HEK293 P HEK293T P U2OS P
B08 86,50 ± 0,71 a 95,63 ± 4,50 a 86,87 ± 4,72 a
B09 87,50 ± 2,15 a 96,03 ± 4,79 a 88,65 ± 0,93 a
BIO 86,50 ± 0,71 a 96,83 ± 3,52 a 86,85 ± 2,32 a
B05 89,20 ± 0,34 a 98,57 ± 0,23 a 90,15 ± 2,10 a
Lip2000 36,73 ± 1,86 a 59,40 ± 2,78 a 38,87 ± 3,18 a
Tabulka 12. Účinnost transfekce nových mRNA-LNP částic pro různé buněčné linie vyjádřená jako relativní intenzita fluorescence mKate2 vztažená na kontrolní variantu transfekce Lip2000. Uvedené jsou linie HEK293, HEK293T a U2OS. Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p jsou vztaženy vždy na kontrolní variantu transfekce Lip2000 u příslušné buněčné linie; hodnoty p < 0,001 značeny písmenem „a“, p < 0,01 značeny „b“.
LNP HEK293 P HEK293T P U2OS P
B08 3,11 ± 0,49 a 1,37 ± 0,08 b 1,08 ± 0,12 b
B09 4,31 ± 0,62 a 1,49 ± 0,13 a 1,93 ± 0,05 a
BIO 2,96 ± 0,19 a 1,77 ± 0,26 b 1,06 ± 0,11 b
B05 8,54 ± 0,44 a 2,93 ± 0,15 a 2,14 ± 0,10 a
Lip2000 1,00 ± 0,09 a 1,00 ± 0,11 ab 1,00 ± 0,15 ab
Příklad 19
Transfekce siRNA pomocí nových LNP in vitro
LNP obsahující malou interferující RNA (siRNA, katalogové číslo AM4626, Ambion) způsobující degradaci mRNA kódující zelený fluorescenční protein (GFP) byly připraveny následovně: 300 μΐ roztoku transfekčního činidla A15 připraveného v Příkladu 11 bylo smíseno s roztokem 1,20 nmol siRNA v 300 μΐ lOmM citrátového pufiru (pH 3,0) pomocí mikrofluidického zařízení analogicky jako v příkladu 12. Vzniklé siRNA-LNP byly ihned naředěny do 600 μΐ PBS; z transfekčního činidla A15 tak vznikly odpovídající nanočástice označené B15 Analogicky byly připraveny LNP nesoucí kontrolní (scrambled; 4390843, Ambion) siRNA, která nečilí na žádnou endogenně buňkou přepisovanou mRNA (B16). Jako kontrolní transfekční činidlo určené specificky pro transfekci siRNA byl použit Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen) dle standardního protokolu výrobce. Pro knock-down siRNA-LNP byla použita lidská buněčná linie U2OS stabilně exprimující zelený fluorescenční protein GFP. Buňky byly kultivovány na 96jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 μΐ kultivačního média na jamku) v DMEM médiu doplněném 10% FBS při 37 °C v 5% CO2. Buňky byly transfekovány 2 μΐ siRNA-LNP finální souhrnná koncentrace všech lipidických složek v jamce byla 20 μΜ; finální koncentrace siRNA byla 16 nM) a následně inkubovány 24 hodin. Transfekce byly provedeny ve třech biologických opakováních. Procento buněk exprimujících zelený fluorescenční protein GFP a intenzita fluorescence GFP byly analyzovány pomocí cytometru BD LSR Fortessa.
V případě použití nových siRNA-LNP (B15) bylo pozorováno snížení exprese GFP až na 1% buněk exprimujících GFP, v případě komerčního RNAiMax byla detegována exprese GFP stále u 13,6% buněk. Intenzita fluorescence GFP v případě použití nových siRNA-LNP (B15) klesla ve srovnání s komerčním RNAiMax činidlem l,25násobně (tab. 13).
Tabulka 13. Snížení hladiny mRNA kódující GFP v buněčné linii U2OS pomocí siRNA-LNP (B15) vyjádřené jako procento buněk exprimujících GFP a intenzita fluorescence GFP
-24CZ 310613 B6 v porovnání s komerčním transfekčním činidlem RNAiMAx a siRNA-LNP nesoucích kontrolní siRNA (B16). Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p jsou vztaženy na testovanou transfekční směs B15; hodnoty p < 0,001 značeny písmenem „a“, p < 0,01 značeny „b“.
LNP % buněk exprimujících GFP P Intenzita fluorescence GFP P
Kontrola 82,30 ± 1,60 0,86 ± 0,02
B15 1,00 ± 0,30 a 0,26 ± 0,03 ab
B16 83,60 ± 0,90 a 0,92 ± 0,06 a
RNAiMax 13,60 ± 1,20 a 0,32 ± 0,03 b
Částice siRNA-LNP obsahující malou interferující RNA (siRNA, katalogové číslo 4392420, Ambion) způsobující degradaci mRNA kódující tyrosyl-DNA fosfodiesterasu 2 (TDP2) byly připraveny stejným způsobem jako částice B15 v tomto příkladu. Z transfekčního činidla A15 tak vznikly odpovídající nanočástice označené B17. Analogicky byly připraveny LNP nesoucí kontrolní (scrambled; 4390843, Ambion) siRNA, která nečilí na žádnou endogenně buňkou přepisovanou mRNA (B18). Jako kontrolní transfekční činidlo určené specificky pro transfekci siRNA byl použit Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen). Pro knock-down siRNA-LNP byly použity lidská buněčná linie HEK293 a dále dvě linie odvozené od lidského mnohočetného myelomu, které jsou velmi obtížně transfekovatelné dostupnými transfekčními činidly (Brito J.L.R., Brown N., Morgan G.J. (2010) Transfection of siRNAs in Multiple Myeloma Cell Lines. In: Min WP., Ichim T. (eds) RNA Interference. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols), vol 623. Humana Press). Buňky byly kultivovány na 96-jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 μΐ kultivačního média na jamku) v DMEM médiu doplněném 10% FBS při 37 °C v 5% CO2. Buňky byly transfekovány 2 μΐ siRNA-LNP (o finální souhrnné koncentraci všech lipidických složek 20 μΜ a finální koncentraci siRNA 16 nM) a následně inkubovány 24 hodin. Transfekce byly provedeny ve třech biologických opakováních. RNA byla izolována pomocí RNAeasy Plus Micro Kit (Qiagen). cDNA byla připravena za použití TATAA GrandScript cDNA Supermix (TATAAbiocenter) podle doporučení výrobce. Kvantitativní RTPCR byla provedena za použití LightCycler 480 (Roche Life Science). Primery pro amplifikaci mRNA kódující TDP2 byly následující: 5‘-CGAGAGGAGGGTCTCAAAGAG-3‘ (SEQ ID NO. 3) a 5‘-ATTTCGGGAAGGCTGCTGTC-3‘ (SEQ ID NO. 4). Pro normalizaci dat byla použita mRNA kódující GAPDH (Primery: 5‘-AATCCCATCACCATCTTCCA-3‘ (SEQ ID NO. 5) a 5‘TGGACTCCACGACGTACTCA-3‘ (SEQ ID NO. 6)).
Ve všech uvedených případech signifikantně snížily nové siRNA-LNP hladinu mRNA TDP2 v buňkách oproti komerčnímu transfekčnímu činidlu RNAiMax. V buněčné linii HEK293 2,86krát, v myelomové linii OPM-2 4,3krát a v myelomové linii RPMI8226 6,7krát v porovnání s komerčním činidlem určeným pro transfekci siRNA (tab. 14).
Tabulka 14. Snížení hladiny mRNA endogenně exprimované TDP2 v buňkách pomocí nových siRNA-LNP (B17) v porovnání s komerčním transfekčním činidlem RNAiMax a v porovnání s kontrolními siRNA-LNP (B18) v buněčné linii HEK293, OPM-2 a RPMI8226.
Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p jsou vztaženy na testovanou transfekční směs B17; hodnoty p < 0,001 značeny písmenem „a“.
-25CZ 310613 B6
LNP HEK293 P OPM-2 P RPMI8226 P
Kontrola 1,00 ± 0,10 1,00 ± 0,01 1,00 ± 0,03
B17 0,03 ± 0,01 a 0,14 ± 0,02 a 0,13 ± 0,00 a
B18 0,99 ± 0,17 a 1,09 ± 0,01 a 0,78 ± 0,01 a
RNAiMax 0,09 ± 0,01 a 0,58 ± 0,02 a 0,87 ± 0,11 a
Příklad 20
Transfekce plasmidové DNA pomocí nových LNP in vitro
LNP obsahující plasmidovou DNA o velikosti 4706 bp (Evrogen, kat.č. FP181) kódující fluorescenční protein mKate2 byly připraveny následovně: 300 μΐ roztoku transfekčního činidla A15 připraveného v Příkladu 11 bylo smíseno s roztokem 120 pg plasmidové DNA v 300 μΐ lOmM citrátového pufru (pH 3,0) pomocí mikrofluidického zařízení analogicky jako v příkladu 12. Vzniklé DNA-LNP byly ihned naředěny do 600 μΐ PBS; z transfekčního činidla A15 tak vznikly odpovídající nanočástice označené B19. Transfekce byly provedeny na lidské buněčné linii HEK293T. Buňky byly kultivovány v 96-jamkových destičkách (5 x 104 buněk ve 100 μΐ kultivačního média na jamku) v DMEM médiu doplněném 10% FBS při 37 °C v 5% CO2. Buňky byly transfekovány 2 μΐ DNA-LNP (o finální souhrnné koncentraci všech lipidických složek 20 μΜ) a následně inkubovány 24 hodin. Jako kontrolní transfekční činidlo byl použit Lipofectamine® 2000 (Lip2000, Invitrogen). Transfekce byly provedeny ve třech biologických opakováních, přičemž každé biologické opakování mělo tři technická opakování. Procento buněk exprimujících fluorescenční protein mKate2 a intenzita fluorescence mKate2 byla analyzována pomocí cytometru BD LSR Fortessa.
Procento buněk exprimujících fluorescenční protein mKate2 bylo v případě použití nových DNA-LNP 3,8krát vyšší v porovnání s komerčním transfekčním činidlem. Intenzita fluorescence byla 2,9krát vyšší oproti komerčnímu činidlu (tab. 15).
Tabulka 15. Transfekční účinnost nových DNA-LNP (B19) v porovnání s komerčním Lipofectaminem® 2000 (Lip2000) u buněčné linie HEK293T vyjádřená jako % buněk exprimujích mKate2 a jako intenzita fluorescence mKate2. V případě intenzity fluorescence jsou data normalizována ke komerčnímu transfekčnímu činidlu Lipofectamine® 2000. Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p < 0,001 jsou značeny písmenem „a“.
LNP % buněk exprimujících mKate2 P Intenzita fluorescence mKate2 P
B19 91,16 ± 0,98 a 2,93 ± 0,36 a
Lip2000 24,30 ± 1,00 a 1,00 ± 0,07 a
Příklad 21
Transfekce mRNA pomocí nových LNP do lidských primárních hepatocytů
Gen kódující bioluminiscenční protein NanoLuc byl amplifikován z plasmidu pET51b(+)_SLuc CLIP (Addgene, kat. č. 113923; získán jako dar od Kai Johnssona) pomocí primerů: (5’TAATACGACTCACTATAGGG-‘3 (SEQ ID NO. 7); 5‘-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3‘ (SEQ ID NO. 8)). Mediátorová RNA (mRNA) byla připravena in vitro analogicky jako v Příkladu 12 a zabalena do LNP následovně: vzorek transfekčního činidla A15 o objemu 300 pl, a 120 pg mRNA v 300 μΐ lOmM citrátového pufru (pH 3,0) byly složeny do LNP pomocí mikrofluidického zařízení analogicky dle příkladu 12. Vzniklé mRNA-LNP byly ihned naředěny
-26CZ 310613 B6 do 600 μΐ PBS; z transfekčního činidla A15 tak vznikly odpovídající nanočástice označené B20. Primární hepatocyty byly izolovány z lidského dárce dle publikovaného protokolu (LeCluyse, E.L.: Methods in Molecular Biology 2005; 290, 207-230). Buňky byly transfekovány 2 μΐ mRNA-LNP (o finální souhrnné koncentraci všech lipidických složek 20 μΜ) a inkubovány 24 hodin. Pro kontrolu bylo použito transfekční činidlo Lipofectamine® 2000. Poté byl k buňkám přidán substrát obsažený v kitu Nano-Gio® Luciferase Assay System (Promega) a intenzita luminiscence byla analyzována pomocí fluorescenční čtečky Microplate Reader: Infinite® Μ1000 PRO (Tecan).
Nové mRNA-LNP účinně transfekovaly lidské primární hepatocyty, ve srovnání s netransfekovanou kontrolou došlo k signifikantnímu nárůstu luminiscence 2,Okřát (tab. 16).
Tabulka 16. Transfekční účinnost nových mRNA-LNP (B20) v primární linii lidských hepatocytů v porovnání s komerčním transfekčním činidlem Lipofectamine® 2000 vyjádřená jako intenzita bioluminiscence normalizovaná na hodnotu z kontrolní transfekce. Statistika byla vyhodnocena Studentovým nepárovým t-testem. Hodnoty p < 0,05 statistické významnosti jsou značeny písmenem „c“).
LNP Intenzita bioluminiscence P
B20 1,97 ± 0,60 c
Lip2000 1,00 ± 0,12 c
Příklad 22
Transfekce cyklických dinukleotidů pomocí nových LNP in vitro
Cyklický dinukleotid (2',3'cGAMP) (Sigma, kat.č. SML1229-.5UMO) byl zabalen do LNP následovně: vzorky transfekčních činidel A01-A06 o objemu 300 μΐ, a 120 nmol cGAMP v 300 μΐ lOmM citrátového pufru (pH 3,0) bylo složeno do LNP pomocí mikrofluidického zařízení analogicky dle příkladu 13. Vzniklé cGAMP-LNP byly ihned naředěny do 600 μΐ PBS; z transfekčních činidel A01-A06 tak vznikly odpovídající vzorky nanočástic označené B21-B26. Pro analýzu účinnosti transfekce částicemi cGAMP-LNP byla použita reportérová esej vykazující míru indukce interferonové odpovědi cyklickým dinukleotidem cGAMP závislé na dráze STING. K tomu byla použita buněčná reportérová linie HEK293T exprimující běžný typ proteinu STING a reportérový gen luciferasu pod IRF3 interferonem stimulovaným (ISRE) promotorem dle Novotná a kolektiv (Novotná, B.: J. Med. Chem. 2019, 62 (23), 10676-10690). Buňky byly vysety na poly-D-lysinem (Sigma-Aldrich) potažené 96jamkové destičky (Greiner Bio-One) v hustotě 2,5 x 104 v DMEM médiu obsahujícím glukózu (obsahující L-glutamin; Biowest) doplněným o 10% FBS (Capricorn Scientific) a 1% penicilin-streptomycin (Biowest). Po inkubaci při 37 °C v atmosféře 5% CO? přes noc byly sériově naředěné sloučeniny přidány k buňkám na dobu 7 hodin. Paralelně byly buňky HEK293T inkubovány pouze s testovanými sloučeninami po dobu 30 minut, dvakrát promyty čerstvým médiem a poté kultivovány dalších 6,5 hodiny. Nakonec bylo 50 μΐ média pro buněčnou kulturu smícháno s 30 μΐ činidla Bright-Glo Luciferase Assay System Assay System (Promega) v bílých 96jamkových destičkách a luminiscence byla odečtena pomocí spektrofotometru Spark® (TECAN, Gródig). Hodnoty 50% účinné koncentrace (EC50) byly vypočteny pomocí GraphPad Prism (La Jolla), jak bylo popsáno v Novotná a kolektiv (Novotná, B.: J. Med. Chem. 2019, 62 (23), 10676-10690) (tab. 17).
Cyklický dinukleotid 2',3'cGAMP vykazoval hodnoty EC50 aktivace STING ±30 μΜ. Všechny nové cGAMP-LNP tvořené ionizovatelnými lipidoidy 4a-4f účinně transfekovaly buňky HEK293T a aktivovaly STING v nanomolámí oblasti, čímž zvýšily účinnost transfekce 200015000x. Nejúčinnější byl lipidoid 4d vykazující EC50 2,00 ±0,36 nM.
-27CZ 310613 B6
Tabulka 17. Hodnoty ECso aktivace STING pro 2',3'cGAMP transfekovaným pomocí nových cGAMP-LNP (B21-B26) tvořených ionizovatelnými lipidoidy 4a-4f.
LNP ECso aktivace STING, nm
B21 9,00 ± 1,75
B22 12,00 ± 1,80
B23 10,00 ± 6,42
B24 2,00 ± 0,36
B25 4,00 ± 1,12
B26 14,00 ± 2,61
Příklad 23
Toxicita nových mRNA-LNP in vivo
Mediátorová RNA (mRNA) kódující protein NanoLuc byla připravena a sbalena do částic analogicky jako v Příkladu 21. Vzniklé mRNA-LNP (B20) byly podány intraperitoneálně třem C57B1/6 myším (chov BIOCEV, Vestec) v koncentraci 0,5 mg mRNA/kg, přičemž třem kontrolním C57B1/6 myším byl intraperitoneálně podán PBS. Stejným způsobem byly podány mRNA-LNP o 5krát vyšší koncentraci (2,5 mg mRNA/kg) taktéž třem C57B1/6 myším. Analogicky byly totožné dávky mRNA-LNP podány opět 3 C57B1/6 myším (0,5 mg mRNA/kg) a 3 C57B1/6 myším (2,5 mg mRNA/kg) intravenózním způsobem, přičemž zvířata byla před aplikací uspána (2,5 mg/myš ketaminum, 0,4 mg/myš xylazinum, Bioveta). Myši byly následně pozorovány po dobu 48 hodin a ani u jedné z nich nebyly zaznamenány známky jakékoliv toxicity či změn fenotypu v porovnání s kontrolními zvířaty.
Příklad 24
Biodistribuce nových mRNA-LNP in vivo
Gen kódující protein CRE rekombinázu byl amplifikován z plasmidu pCAG-Cre-IRES2-GFP (Addgene, katalogové číslo 26646, dar od Anjen Chenn) pomocí primem: (5’TAATACGACTCACTATAGAATTTACT-‘3 (SEQIDNO. 9); 5‘CTAATCGCCATCTTCCAGCA-3‘ (SEQ ID NO. 10)). Mediátorová RNA (mRNA) byla připravena in vitro analogicky jako v příkladu 12 a zabalena do LNP následovně: vzorek transfekčního činidla A15 o objemu 300 μΐ, a 120 pg mRNA v 300 μΐ lOmM citrátového pufru (pH 3,0) byly složeny do LNP pomocí mikrofluidického zařízení analogicky dle příkladu 12. Vzniklé mRNA-LNP byly ihned naředěny do 600 μΐ PBS; z transfekčního činidla A15 tak vznikly odpovídající nanočástice označené B27. mRNA-LNP (B27) byly podány intravenózně v koncentraci 0,5 mg mRNA/kg až 2,5 mg mRNA/kg vždy 3 myším s globálním duálním Cre reportérem (Mazumdar, M.D.: Genesis 2007, 45:593-605) (chov BIOCEV, Vestec) umožňujícím analýzu úspěšné rekombinace. V buňkách, do kterých byly mRNA-LNP nesoucí mRNA pro Cre rekombinázu úspěšně dopraveny, nastala chromozomální rekombinace a následné vystřižení genu pro membránový červený protein (tzv. red tomato) a „zapnutí“ transkripce genu pro membránový zelený protein (GFP). Myši, včetně myší bez aplikace částic, byly po 3 dnech po aplikaci částic usmrceny a veškeré orgány byly podrobeny histologické analýze dle standardizovaného protokolu. Z histologických snímků vyplývá kompletní distribuce částic do jater, která po 3 dnech po aplikaci vedla k 30 až 50% konverzi buněk exprimujících červený membránový protein na buňky exprimující membránový zelený protein (obr. 5).

Claims (13)

1. Lipidoid obecného vzorce I
Y
N
R R (I), kde X je zvoleno ze skupiny, sestávající z -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -C(=S)O-, -C(=O)S-,
-C(=S)S-, -C(=0)NHNH-, -CH2-, -0-, -S-, -NH-, -NHNH-, -NHC(=O)-, -NHNHC(=0)-, -C=C-, -CH=CH-, -CH2C(=O)NH-, -CH2C(=O)O-, CH2C(=S)O-, CH2C(=S)S-, -CH2C(=O)NHNH-, -N=CH-, -CH=N-;
Y je nezávisle zvoleno ze skupiny alkylenových řetězců C2-Cio;
Z je atom vodíku;
a R jsou vzájemně stejné nebo různé, přičemž každé R je zvoleno ze skupiny alkyl C8-C2o, alkenyl C8-C20, alkynyl C8-C2o, přičemž v uvedeném alkylu, alkenylu nebo alkynylu může být volitelně jedna nebo více -CH2- skupin nahrazeno jednou nebo více skupinami vybranými z -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-, -SS-, -C(=O)NH-, -NHC(=O)-, -0-, -S-;
a jeho farmaceuticky pňjatelné soli, adiční soli a solváty.
2. Lipidoid podle nároku 1, kde X je vybráno z -C(=0)NH-, -C(=O)O-.
3. Lipidoid podle nároku 1 nebo 2, kde Rjsou nezávisle vybrány ze skupiny alkyl C8-C2o a alkenyl C8-C20, přičemž v uvedeném alkylu nebo alkenylu může být volitelně jedna nebo více -CH2- skupin nahrazeno jednou nebo více skupinami vybranými z -CH(OH)-, -OC(=O)-, -C(=O)O-.
4. Lipidoid podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde všechna Rjsou stejná, nebo jsou všechny atomy dusíku substituovány shodně dvěma stejnými R nebo dvěma různými R.
5. Transfekční činidlo, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 v množství 10 až 50 molámích procent, a alespoň jeden pomocný lipid v celkovém množství 50 až 90 molámích procent.
6. Transfekční činidlo podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I v množství 15 až 30 molámích procent, cholesterol v množství 30 až 55 molámích procent, a alespoň jeden další pomocný lipid v množství 20 až 50 molámích procent.
7. Transfekční částice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, alespoň jednu nukleovou kyselinu a/nebo její kratší úsek vybrané z oligonukleotidů, cyklických dinukleotidů, antisenzních oligonukleotidů, jednořetězcové DNA, dvouřetězcové DNA, cDNA, plasmidové DNA kódující gen nebo geny, mediátorové RNA, transferové RNA, malé interferující RNA, dvouřetězcové RNA, mikro-RNA, piwi-RNA, antisensní RNA, tzv. guide RNA systému CRISPR a jejich kombinací, a/nebo derivát nukleové kyseliny obsahující substituci vybranou z 2’-O-methyl, 2’-O-methoxy-ethyl, 2’-fluoro, methylenový můstek
-29 CZ 310613 B6 mezi 2’-kyslíkem a 4’-uhlíkem pentosového kruhu, fosforylaci na 5’ a/nebo 3’ konci vlákna, boranofosfonáty, fosforothioáty, a s výhodou transfekční částice dále obsahuje alespoň jeden pomocný lipid.
8. Použití lipidoidu obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro in vitro transfekci buněk či tkání nukleovou kyselinou a/nebo jejím kratším úsekem a/nebo jejím derivátem, jak jsou definovány v nároku 7.
9. Použití podle nároku 8 pro umlčení či aktivaci chromozomálního/ch genu/ů, umlčení nebo aktivaci imunogenů, inhibici či aktivaci signálních drah, editaci genomu nebo transkriptomu, či umožnění exprese proteinu/ů kódovaného nukleovou kyselinou.
10. Lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití pro in vivo transfekci buněk či tkání nukleovou kyselinou a/nebo jejím kratším úsekem a/nebo jejím derivátem, jak jsou definovány v nároku 7, kromě transfekce lidských embryí, a kromě modifikace lidské zárodečné linie.
11. Lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití podle nároku 10 pro umlčení či aktivaci chromozomálních genu/ů, umlčení nebo aktivaci imunogenů, inhibici či aktivace signálních drah, editace genomu nebo transkriptomu, či umožnění exprese daného proteinu/ů kódovaného nukleovou kyselinou.
12. Lipidoid obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití jako léčivo, zejména pro genovou terapii, s výhodou pro léčbu malignit a/nebo genetických poruch.
13. Použití lipidoidu obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 v kosmetických přípravcích pro doručení aktivní látky na místo účinku.
CZ2020-529A 2020-09-23 2020-09-23 Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití CZ310613B6 (cs)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2020-529A CZ310613B6 (cs) 2020-09-23 2020-09-23 Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
PCT/CZ2021/050079 WO2022063350A1 (en) 2020-09-23 2021-07-23 Lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
EP21762590.4A EP4031522B1 (en) 2020-09-23 2021-07-23 Lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
IL291097A IL291097B2 (en) 2020-09-23 2021-07-23 Lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
BR112022024346A BR112022024346A2 (pt) 2020-09-23 2021-07-23 Lipidóides, agente e partícula de transfecção, e, uso do lipidóide ou do agente de transfecção ou da partícula de transfecção
CN202180008677.8A CN114945556B (zh) 2020-09-23 2021-07-23 用于核酸转染的类脂质及其用途
MX2022013522A MX2022013522A (es) 2020-09-23 2021-07-23 Lipidoides para la transfeccion de acidos nucleicos y su uso.
US18/015,254 US12559450B2 (en) 2020-09-23 2021-07-23 Lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
KR1020227011339A KR102827114B1 (ko) 2020-09-23 2021-07-23 핵산 형질감염을 위한 리피도이드 및 그 용도
AU2021348717A AU2021348717B2 (en) 2020-09-23 2021-07-23 Lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
JP2022530325A JP7260717B2 (ja) 2020-09-23 2021-07-23 核酸トランスフェクションのためのリピドイドおよびその使用
CA3154983A CA3154983C (en) 2020-09-23 2021-07-23 Lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
ZA2022/03990A ZA202203990B (en) 2020-09-23 2022-04-07 Lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2020-529A CZ310613B6 (cs) 2020-09-23 2020-09-23 Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2020529A3 CZ2020529A3 (cs) 2022-03-30
CZ310613B6 true CZ310613B6 (cs) 2026-01-28

Family

ID=77543261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2020-529A CZ310613B6 (cs) 2020-09-23 2020-09-23 Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití

Country Status (13)

Country Link
US (1) US12559450B2 (cs)
EP (1) EP4031522B1 (cs)
JP (1) JP7260717B2 (cs)
KR (1) KR102827114B1 (cs)
CN (1) CN114945556B (cs)
AU (1) AU2021348717B2 (cs)
BR (1) BR112022024346A2 (cs)
CA (1) CA3154983C (cs)
CZ (1) CZ310613B6 (cs)
IL (1) IL291097B2 (cs)
MX (1) MX2022013522A (cs)
WO (1) WO2022063350A1 (cs)
ZA (1) ZA202203990B (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ310613B6 (cs) 2020-09-23 2026-01-28 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
US12508225B2 (en) 2021-05-28 2025-12-30 Beijing Tricisionbio Therapeutics Inc. Lipid compound and use thereof in delivery of nucleic acid
CZ310443B6 (cs) * 2021-07-19 2025-06-25 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
WO2025128871A2 (en) * 2023-12-13 2025-06-19 Renagade Therapeutics Management Inc. Lipid nanoparticles comprising coding rna molecules for use in gene editing and as vaccines and therapeutic agents
WO2025166238A1 (en) * 2024-01-31 2025-08-07 Orna Therapeutics, Inc. Fast-shedding polyethylene glycol lipids
WO2025250751A1 (en) * 2024-05-31 2025-12-04 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020024760A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 Huawei Technologies Co., Ltd. Interactive system for visualizing and maintaining large networks

Family Cites Families (176)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA879102A (en) 1971-08-24 P. Krimmel Carl Dialkylaminoalkyl amides and esters of adamantanecarboxylic acid
US3374244A (en) 1966-06-13 1968-03-19 Searle & Co N-(dialkylaminoalkyl)adamantanecarboxamides and related compounds
US3452082A (en) 1967-04-17 1969-06-24 Searle & Co Adamantyl dialkylaminoalkylcarbamates
US3625985A (en) 1968-05-08 1971-12-07 Searle & Co Adamantanecarboxamidoalkanoic acids and related compounds
US3573312A (en) 1968-10-09 1971-03-30 Searle & Co Piperazine derivatives of adamantane-1,3-dicarboxylic acid
US3534086A (en) 1968-10-16 1970-10-13 Squibb & Sons Inc Adamantylamino - 5,8 - dihydronaphthyloxypropanols and related compounds
US3682922A (en) 1969-01-16 1972-08-08 Searle & Co N-acyl-n-{8 (n{40 ,n{40 -disubstituted amino)-alkyl{9 -1-adamantylmethylamines
US3816509A (en) 1969-07-02 1974-06-11 Searle & Co Esters of 3-phenyladamantane-1-carboxylic acid
US3663565A (en) 1969-07-02 1972-05-16 Searle & Co Esters and amides of 3-phenyladamantane-1-carboxylic acid
US3624086A (en) 1969-11-10 1971-11-30 Searle & Co Adamantanecarboxamidoalkanoic acid amides
US3704306A (en) 1970-01-26 1972-11-28 Searle & Co Adamantane-1,3-dicarboxylic acid esters
US3657273A (en) 1970-05-01 1972-04-18 Searle & Co Adamantane-1 3-dicarboxamides
US3671527A (en) 1970-07-06 1972-06-20 Searle & Co Dialkylaminoalkyl esters of adamantanethiocarboxylic acids
GB1310652A (en) 1971-05-04 1973-03-21 Searle & Co Adamantane 1,3- dicarboxylic and diacetic acid esters
US3705141A (en) 1971-05-17 1972-12-05 Searle & Co Adamantanecarboxamidoalkanoic acids and related compounds
US4448972A (en) 1982-02-22 1984-05-15 Smithkline Beckman Corporation Adamantyl containing intermediates
FR2798655B1 (fr) 1999-09-21 2001-11-16 Oreal Composition comprenant un compose derive de cyclohexane, compose et utilisation dudit compose pour structurer une composition
US6511832B1 (en) 1999-10-06 2003-01-28 Texas A&M University System In vitro synthesis of capped and polyadenylated mRNAs using baculovirus RNA polymerase
US7074596B2 (en) 2002-03-25 2006-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues
US7901708B2 (en) 2002-06-28 2011-03-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Liposomal apparatus and manufacturing methods
US20050245534A1 (en) 2004-04-29 2005-11-03 Link James T Inhibitors of the 11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase Type 1 enzyme
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
EP3192788A1 (en) 2006-10-03 2017-07-19 Arbutus Biopharma Corporation Lipid containing formulations
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
WO2009126933A2 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
AU2009238175C1 (en) 2008-04-15 2023-11-30 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
CA2722183C (en) 2008-04-25 2018-09-18 Northwestern University Nanostructures suitable for sequestering cholesterol and other molecules
DE102008032594A1 (de) * 2008-07-11 2010-01-14 Qiagen Gmbh Transfektionslösung
ES2613498T3 (es) 2009-07-01 2017-05-24 Protiva Biotherapeutics Inc. Nuevas formulaciones de lípidos para el suministro de agentes terapéuticos a tumores sólidos
CA2816925C (en) 2009-11-04 2023-01-10 The University Of British Columbia Nucleic acid-containing lipid particles and related methods
HUE042177T2 (hu) 2009-12-01 2019-06-28 Translate Bio Inc Szteroidszármazék mRNS szállítására humán genetikai betegségekben
WO2011071860A2 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions for nucleic acid delivery
WO2011091065A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Northwestern University Synthetic nanostructures including nucleic acids and/or other entities
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
WO2011141705A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel cationic lipids and methods of use thereof
WO2012000104A1 (en) 2010-06-30 2012-01-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
HUE047796T2 (hu) 2010-07-06 2020-05-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNS bevitele több immunútvonal bekapcsolására
HUE026646T2 (en) 2010-07-06 2016-07-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Preferred liposomes containing lipids of PKA value for delivery of RNA
PL2591114T3 (pl) 2010-07-06 2017-08-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunizacja dużych ssaków małymi dawkami rna
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US8466122B2 (en) 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
US8691750B2 (en) 2011-05-17 2014-04-08 Axolabs Gmbh Lipids and compositions for intracellular delivery of biologically active compounds
EP3354644A1 (en) 2011-06-08 2018-08-01 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
PL3586861T3 (pl) 2011-06-08 2022-05-23 Translate Bio, Inc. Kompozycje nanocząstek lipidowych i sposoby dostarczania mrna
CN102513023B (zh) * 2011-10-31 2014-04-02 广东工业大学 一种三聚表面活性剂及其合成方法
EP2788006B1 (en) 2011-12-07 2026-01-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
CN104114572A (zh) 2011-12-16 2014-10-22 现代治疗公司 经修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物
CZ303963B6 (cs) 2012-01-13 2013-07-17 Ústav organické chemie a biochemie Akademie ved CR, v.v.i. Lipopolyaminy sperminového typu pro konstrukci liposomálních transfekcních systému
SG11201405157PA (en) 2012-02-24 2014-10-30 Protiva Biotherapeutics Inc Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
HK1206644A1 (en) 2012-03-29 2016-01-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
GB201215289D0 (en) 2012-08-28 2012-10-10 Medical Res Council Nanoparticle formulation
US9687448B2 (en) 2012-12-07 2017-06-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid lipid particle formulations
EP3608308B1 (en) * 2013-03-08 2021-07-21 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
WO2015011633A1 (en) 2013-07-23 2015-01-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
SG10201912038TA (en) 2014-04-23 2020-02-27 Modernatx Inc Nucleic acid vaccines
EP3160959B1 (en) 2014-06-24 2023-08-30 Translate Bio, Inc. Stereochemically enriched compositions for delivery of nucleic acids
SMT202200502T1 (it) 2014-06-25 2023-01-13 Acuitas Therapeutics Inc Nuovi lipidi e formulazioni di nanoparticelle lipidiche per l'erogazione di acidi nucleici
BR112016030852A2 (pt) 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
JP6240570B2 (ja) 2014-07-17 2017-11-29 富士フイルム株式会社 脂質粒子および核酸送達キャリア
WO2016021683A1 (ja) * 2014-08-07 2016-02-11 武田薬品工業株式会社 カチオン性脂質
EP3253373B1 (en) 2015-02-08 2020-03-18 Tongli Biomedical Co., Ltd. Lipid nanoparticles and uses thereof
JP6764870B2 (ja) 2015-02-24 2020-10-07 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア 連続フローマイクロ流体システム
WO2016155809A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Lipid particle formulations for delivery of rna and water-soluble therapeutically effective compounds to a target cell
DK3297637T3 (da) 2015-05-21 2021-08-02 Ohio State Innovation Foundation Benzen-1,3,5-tricarboxamidderivater og anvendelser deraf
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
LT3313829T (lt) 2015-06-29 2024-08-12 Acuitas Therapeutics Inc. Lipidai ir lipidų nanodalelių sudėtys, skirtos nukleorūgščių tiekimui
EP3319976B1 (en) 2015-07-09 2021-09-01 Insmed Incorporated Compositions and methods for treating lung diseases and lung injury
CN108350455A (zh) 2015-07-29 2018-07-31 阿布特斯生物制药公司 用于使b型肝炎病毒基因表达沉默的组合物和方法
WO2017031232A1 (en) 2015-08-17 2017-02-23 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
US10325026B2 (en) 2015-09-25 2019-06-18 International Business Machines Corporation Recombination techniques for natural language generation
TW201729835A (zh) 2015-10-22 2017-09-01 現代公司 呼吸道病毒疫苗
EP3368089B1 (en) 2015-10-26 2025-11-05 Translate Bio Ma, Inc. Nanoparticle formulations for delivery of nucleic acid complexes
IL243285A0 (en) 2015-12-22 2016-04-21 Yeda Res & Dev Analogues of lipids and liposomes containing them
EP3397613A1 (en) 2015-12-30 2018-11-07 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
GB201604235D0 (en) * 2016-03-11 2016-04-27 Ucl Business Plc Lipids and complexes for the delivery of biologically-active material to cells
WO2017176974A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Ohio State Innovation Foundation Biodegradable amino-ester nanomaterials for nucleic acid delivery
KR102469450B1 (ko) 2016-05-18 2022-11-22 모더나티엑스, 인크. 인터류킨-12 (il12)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
SG11201903674YA (en) 2016-10-26 2019-05-30 Modernatx Inc Messenger ribonucleic acids for enhancing immune responses and methods of use thereof
ES3063077T3 (en) 2016-10-26 2026-04-15 Acuitas Therapeutics Inc Lipid nanoparticle formulations
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
EP3538515B1 (en) * 2016-11-08 2022-07-20 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Cationic lipids for nucleic acid delivery and preparation thereof
MX2019005470A (es) 2016-11-10 2019-11-21 Translate Bio Inc Formulación de nanopartículas lipídicas basadas en ice mejorada para el suministro de arnm.
JP7102423B2 (ja) 2017-02-16 2022-07-19 イェダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド リポソームの薬物送達ビヒクル
WO2019018185A1 (en) 2017-07-15 2019-01-24 Arisan Therapeutics Inc. ENANTIOMERICALLY PURE ADAMATANE DERIVATIVES FOR THE TREATMENT OF FILOVIRUS INFECTIONS
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
AU2018330208B2 (en) 2017-09-08 2025-04-17 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle formulations of non-viral, capsid-free DNA vectors
JP6826014B2 (ja) 2017-09-13 2021-02-03 株式会社東芝 生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット
BR112020006256A2 (pt) 2017-09-29 2020-10-20 Intellia Therapeutics, Inc. método in vitro de administração de mrna usando nanopartículas de lipídio
TW201927288A (zh) 2017-10-20 2019-07-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 適用於治療之微脂體ｒｎａ配製物的製備及儲存
EP3704262B1 (en) 2017-10-30 2024-03-20 Georgia Tech Research Corporation Multiplexed analysis of materials for tissue delivery
WO2019099501A1 (en) 2017-11-14 2019-05-23 Ohio State Innovation Foundation Benzene-1,3,5-tricarboxamide derived ester lipids and uses thereof
WO2019210394A1 (en) 2018-04-29 2019-11-07 Precision Nanosystems Inc. Compositions for transfecting resistant cell types
WO2019226650A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Modernatx, Inc. Delivery of dna
KR20210056331A (ko) 2018-07-23 2021-05-18 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 전령 rna의 건조 분말 제형
KR20210091120A (ko) 2018-08-29 2021-07-21 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 Mrna-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 공정
CN113271926A (zh) 2018-09-20 2021-08-17 摩登纳特斯有限公司 脂质纳米颗粒的制备及其施用方法
US12419965B2 (en) 2018-10-01 2025-09-23 BioNTech SE RNA particles comprising polysarcosine
ES3046484T3 (en) 2018-10-01 2025-12-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc Biodegradable lipids for the delivery of active agents
CN113166783B (zh) 2018-10-09 2024-10-11 不列颠哥伦比亚大学 包含无有机溶剂和去污剂的转染活性囊泡的组合物和系统以及与之相关的方法
CA3112837A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Translate Bio, Inc. Pumpless encapsulation of messenger rna
US20220001029A1 (en) 2018-11-09 2022-01-06 Arbutus Biopharma Corporation Lipid nanoparticle formulations
EP3877444A1 (en) 2018-11-09 2021-09-15 Translate Bio, Inc. Multi-peg lipid compounds
MX2021005462A (es) 2018-11-09 2021-08-24 Arbutus Biopharma Corp Lipidos cationicos que contienen silicio.
WO2020097379A2 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Translate Bio, Inc. Peg lipidoid compounds
JP7635131B2 (ja) 2019-01-31 2025-02-25 モデルナティエックス インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子の調製方法
DK3934673T3 (da) 2019-03-08 2026-04-07 Massachusetts Inst Technology Syntetisk onkolytisk lnp-replikon-rna og anvendelser til cancerimmunterapi
EP3942050A4 (en) 2019-03-19 2023-02-22 Arcturus Therapeutics, Inc. PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF LIPID-COATED RNA NANOPARTICLES
EP3956459A4 (en) 2019-04-15 2023-01-11 Precision Nanosystems Inc NONVIRAL MODIFICATION OF T LYMPHOCYTE GENE EXPRESSION
AU2020262437A1 (en) 2019-04-26 2021-12-23 Genevant Sciences Gmbh Lipid nanoparticles
JP2022532078A (ja) 2019-05-08 2022-07-13 アストラゼネカ アクチボラグ 皮膚及び創傷のための組成物並びにその使用の方法
KR20220017466A (ko) 2019-06-04 2022-02-11 트러스티즈 오브 터프츠 칼리지 Mrna 전달을 위한 합성 지질
US12503432B2 (en) 2019-06-20 2025-12-23 Global Life Sciences Solutions Canada Ulc Ionizable lipids for nucleic acid delivery
JP7420841B2 (ja) * 2019-06-29 2024-01-23 プレシジョン ナノシステムズ ユーエルシー 核酸送達のためのイオン化可能な脂質
WO2021008708A1 (en) 2019-07-18 2021-01-21 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Method for determining at least one parameter of a sample composition comprising nucleic acid, such as rna, and optionally particles
US12569438B2 (en) 2019-07-29 2026-03-10 Georgia Tech Research Corporation Nanomaterials containing constrained lipids and uses thereof
US20220280639A1 (en) 2019-07-31 2022-09-08 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of rna interference agents to immune cells
CA3150061A1 (en) 2019-08-07 2021-02-11 Modernatx, Inc. Compositions and methods for enhanced delivery of agents
US20230097090A1 (en) 2019-08-14 2023-03-30 Acuitas Therapeutics, Inc. Improved lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
JP7700101B2 (ja) 2019-09-06 2025-06-30 ジェネレーション バイオ カンパニー 閉端ｄｎａおよび切断可能脂質を含む脂質ナノ粒子組成物ならびにそれらの使用方法
EP4048287A4 (en) 2019-10-25 2023-12-06 The Johns Hopkins University POLYMERIC NANOPARTICLES FOR INTRACELLULAR PROTEIN DELIVERY
JP7699128B2 (ja) 2019-12-06 2025-06-26 ガイド セラピューティクス，エルエルシー ナノマテリアル
US20230285297A1 (en) 2020-01-31 2023-09-14 Modernatx, Inc. Methods of preparing lipid nanoparticles
US12194089B2 (en) 2020-02-04 2025-01-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
WO2021175405A1 (en) 2020-03-02 2021-09-10 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Composite rna particles
EP4126069A1 (en) 2020-03-25 2023-02-08 BioNTech SE Rna particles comprising polysarcosine
WO2021231901A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle formulations for mrna delivery
TWI713280B (zh) 2020-05-20 2020-12-11 奇源科技有限公司 用於可攜式電子裝置的充電供電電路及可攜式電子裝置
AU2021305214A1 (en) 2020-07-10 2023-02-23 Genevant Sciences Gmbh Lipid nanoparticles for delivering therapeutics to lungs
KR20230087443A (ko) 2020-08-06 2023-06-16 모더나티엑스, 인크. 페이로드 분자를 기도 상피로 전달하기 위한 조성물
KR20230167008A (ko) 2020-08-06 2023-12-07 모더나티엑스, 인크. 지질 나노입자의 제조 방법
US12178921B2 (en) 2020-08-14 2024-12-31 Arcturus Therapeutics, Inc. Method of lyophilizing lipid nanoparticles
WO2022056413A1 (en) 2020-09-13 2022-03-17 Arcturus Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles encapsulation of large rna
TW202227478A (zh) 2020-09-15 2022-07-16 德商拜恩迪克公司 對細胞靶向遞送的藥劑及方法
CZ310613B6 (cs) 2020-09-23 2026-01-28 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
US20220133631A1 (en) 2020-10-12 2022-05-05 Translate Bio, Inc. Process of preparing ice-based lipid nanoparticles
KR20230087536A (ko) 2020-10-12 2023-06-16 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 Mrna-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 프로세스
WO2022099003A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Sanofi Lipid nanoparticles for delivering mrna vaccines
AU2021379090A1 (en) 2020-11-16 2023-06-15 BioNTech SE Lnp compositions comprising rna and methods for preparing, storing and using the same
AU2021376893A1 (en) 2020-11-16 2023-06-15 BioNTech SE Enhanced formulation stabilization and improved lyophilization processes
US20240041785A1 (en) 2020-11-16 2024-02-08 BioNTech SE Compositions and methods for stabilization of lipid nanoparticle mrna vaccines
IL303195A (en) 2020-11-25 2023-07-01 Akagera Medicines Inc Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and related methods of use
JP2023550644A (ja) 2020-11-25 2023-12-04 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 安定な液状脂質ナノ粒子製剤
AU2021395736A1 (en) 2020-12-09 2023-07-27 BioNTech SE Rna manufacturing
US20240115730A1 (en) 2020-12-18 2024-04-11 Omega Therapeutics, Inc. Tissue-specific nucleic acid delivery by 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (dotap) lipid nanoparticles
JP2024503441A (ja) 2021-01-20 2024-01-25 ビーム セラピューティクス インク． イオン化可能な脂質を含むナノ材料
JP2024506908A (ja) 2021-02-12 2024-02-15 モデルナティエックス インコーポレイテッド インビボ療法のためのペイロードを含むｌｎｐ組成物
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
WO2022216787A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 City Of Hope Lipid nanoparticles and methods of use
US20250073351A1 (en) 2021-04-19 2025-03-06 Translate Bio, Inc. Improved compositions for delivery of mrna
AU2022262355A1 (en) 2021-04-22 2023-10-12 Flagship Labs 114, Inc. Tissue-specific nucleic acid delivery by mixed cationic lipid particles
US20240238211A1 (en) 2021-04-23 2024-07-18 Modernatx, Inc. Isoquinoline-stabilized lipid nanoparticle formulations
CA3219053A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Arcturus Therapeutics, Inc. Lipid compositions comprising peptide-lipid conjugates
EP4346901A4 (en) 2021-06-01 2025-04-23 The University of British Columbia MRNA DELIVERY USING LIPID NANOPARTICLES
CN117642155A (zh) 2021-06-01 2024-03-01 内诺维什疗法股份有限公司 使用脂质纳米颗粒的dna载体递送
CA3222851A1 (en) 2021-06-22 2022-12-29 Roy VAN DER MEEL Nucleic acid containing nanoparticles
CZ310443B6 (cs) 2021-07-19 2025-06-25 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i. Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
US20240335393A1 (en) 2021-07-26 2024-10-10 Modernatx, Inc. Processes for preparing lipid nanoparticle compositions
JP2024527940A (ja) 2021-07-26 2024-07-26 モデルナティエックス インコーポレイテッド ペイロード分子を気道上皮に送達するための脂質ナノ粒子組成物を調製するプロセス
WO2023021427A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Freeze-drying of lipid nanoparticles (lnps) encapsulating rna and formulations thereof
WO2023031392A2 (en) 2021-09-03 2023-03-09 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine
JP2024535246A (ja) 2021-09-17 2024-09-30 サムスン ディスプレイ カンパニー リミテッド 新規なキャッピング層用化合物およびそれを含む有機発光素子
EP4426266A4 (en) 2021-11-03 2025-11-05 Arcturus Therapeutics Inc LIPID FORMULATIONS CONTAINING NUCLEIC ACIDS AND METHODS OF TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS
AU2023238223A1 (en) 2022-03-23 2024-10-10 Nanovation Therapeutics Inc. High sterol-containing lipid nanoparticles
CN119654166A (zh) 2022-04-01 2025-03-18 内诺维什疗法股份有限公司 mRNA递送方法及其组合物
US20250248939A1 (en) 2022-04-18 2025-08-07 City Of Hope Lipid nanoparticles, nucleic acids, and methods of use
US20250313860A1 (en) 2022-05-20 2025-10-09 The University Of British Columbia Expression of exogenous proteins in donor platelets treated with lipid nanoparticles
EP4531819A2 (en) 2022-05-25 2025-04-09 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and methods of use thereof
EP4536197A1 (en) 2022-06-07 2025-04-16 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2024006863A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Precision NanoSystems ULC Lipid nanoparticle formulations for vaccines
WO2024026475A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Modernatx, Inc. Compositions for delivery to hematopoietic stem and progenitor cells (hspcs) and related uses
KR20250094676A (ko) 2022-10-25 2025-06-25 나노베이션 테라퓨틱스 인크. 안티-센스 올리고뉴클레오티드 전달을 위한 지질 나노입자 제형
EP4629972A1 (en) 2022-12-07 2025-10-15 The University of British Columbia Compositions and methods for peptide or protein delivery to the delivery to the central nervous system
KR102921785B1 (ko) 2022-12-19 2026-02-03 주식회사 녹십자 핵산 전달용 사이클로알칸계 지질 화합물 및 이를 포함하는 지질 나노입자
IL321425A (en) 2022-12-23 2025-08-01 Biontech Delivery Tech Gmbh compound

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020024760A1 (en) * 2018-08-01 2020-02-06 Huawei Technologies Co., Ltd. Interactive system for visualizing and maintaining large networks

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DRAŠAR, LUKÁŠ; LEDVINA, Miroslav. Gene therapy: Cationic lipids for construction of nonviral vectors of nucleic acids. Chemické listy, 2012, 106.7; ISSN: 0009-2770 *
GAN, Zubao, et al. Nanoparticles containing constrained phospholipids deliver mRNA to liver immune cells in vivo without targeting ligands. Bioengineering & Translational Medicine, 26.04.2020, 5.3: e10161; ISSN: 2380-6761 *
GRILLAUD, Maxime; RUSSIER, Julie; BIANCO, Alberto. Polycationic adamantane-based dendrons of different generations display high cellular uptake without triggering cytotoxicity. Journal of the American Chemical Society, 2014, 136.2: 810-819; ISSN: 0002-7863 *
MARTIN, B., et al. The design of cationic lipids for gene delivery. Current pharmaceutical design, 2005, 11.3: 375-394; ISSN 1381-6128 *
ŠEKUTOR, Marina, et al. Syntheses and characterization of liposome-incorporated adamantyl aminoguanidines. Organic & biomolecular chemistry, 2014, 12.31: 6005-6013; ISSN: 1477-0520 *
ŠTIMAC, Adela, et al. Adamantane in Drug Delivery Systems and Surface Recognition. Molecules, 2017, 22: 297;ISSN: 1420-3049 *
WANKA, Lukas; IQBAL, Khalid; SCHREINER, Peter R. The lipophilic bullet hits the targets: medicinal chemistry of adamantane derivatives. Chemical reviews, 2013, 113.5: 3516-3604; ISSN: 0009-2665 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2020529A3 (cs) 2022-03-30
EP4031522B1 (en) 2026-04-22
KR20220057605A (ko) 2022-05-09
BR112022024346A2 (pt) 2023-04-04
IL291097A (en) 2022-05-01
JP2022554024A (ja) 2022-12-27
CN114945556A (zh) 2022-08-26
JP7260717B2 (ja) 2023-04-18
ZA202203990B (en) 2022-12-21
AU2021348717A1 (en) 2022-05-19
CA3154983A1 (en) 2022-03-31
WO2022063350A1 (en) 2022-03-31
EP4031522A1 (en) 2022-07-27
US20230265049A1 (en) 2023-08-24
MX2022013522A (es) 2022-11-16
CN114945556B (zh) 2024-08-27
CA3154983C (en) 2023-01-31
AU2021348717B2 (en) 2023-04-06
US12559450B2 (en) 2026-02-24
KR102827114B1 (ko) 2025-06-27
IL291097B1 (en) 2023-09-01
IL291097B2 (en) 2024-01-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ310613B6 (cs) Lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
CZ310443B6 (cs) Cyklohexanové lipidoidy pro transfekci nukleových kyselin a jejich použití
EP3778572B1 (en) Novel cationic lipid exhibiting improved intracellular dynamics
ES2799409T3 (es) Lípido catiónico
Hattori et al. siRNA delivery into tumor cells by lipid-based nanoparticles composed of hydroxyethylated cholesteryl triamine
WO2010062502A1 (en) Carriers for the delivery of nucleic acids to cells and methods of use thereof
KR20240117084A (ko) 멀티-모티프 덴드론 및 이의 초분자 구조체 그리고 이들의 용도
EP4506337A1 (en) Cationic lipid having disulfide bond, lipid membrane structure including same, nucleic acid introduction agent and pharmaceutical composition containing any one of same, method for introducing nucleic acid into cell or target cell, and method for producing cellular pharmaceutical
EA049632B1 (ru) Липидоиды для трансфекции нуклеиновой кислотой и их применение
US12539279B2 (en) Supramolecular ionizable lipid molecules with heteroatomic tuning for nucleic acid delivery
ES2657282B1 (es) Dendrones carbosilano funcionalizados con ácidos grasos: formación de micelas y usos
IL309214A (en) Cyclohexane lipidoids for nucleic acid delivery and their use
EA050970B1 (ru) Циклогексановые липидоиды для трансфекции нуклеиновой кислоты и их применение
HK40074143A (en) Lipidoids for nucleic acid transfection and use thereof
Qian et al. Synthesis of novel cholesterol-based ionizable lipids for mRNA delivery
Falamarzian et al. LIPID-SUBSTITUTED POLYETHYLENEIMINE POLYPLEXES OF STAT3 siRNA FOR SENSITIZATION OF BREAST TUMOR CELLS TO CONVENTIONAL CHEMOTHERAPY
WO2023216232A1 (zh) 一种含有二硫键的脂质化合物及其组合物
HK40074143B (zh) 用於核酸转染的类脂质及其用途